Summary
본 프로토콜은 예쁜 꼬마선충 아세틸콜린 수용체의 한 부류의 약리학적 작용제인 레바미솔에 대한 반응을 결정하기 위한 검정을 기술한다. 이 액체 레바미솔 수영 분석에서 연구자들은 24 웰 플레이트에서 재배 된 동물의 시간 의존적 마비를 시각적으로 관찰하고 정량화합니다.
Abstract
신경근 접합부 (NMJ)에서, 흥분성 신경 전달 물질 인 아세틸 콜린 (ACh)과 시냅스 후 수용체의 결합은 근육 수축을 유도합니다. 척추동물 골격근에서와 같이, 모델 유기체인 예쁜꼬마선충의 체벽 근육에서의 콜린성 신호전달 은 운동에 필요하다. 체벽 근육에 ACh 수용체의 한 부류의 약리학 적 작용제 인 레바 미솔에 노출되면 야생형 동물의 시간 의존적 마비가 발생합니다. 레바미솔에 대한 변화된 민감성은 NMJ 또는 근육 기능에서의 신호전달의 결함을 시사한다. 여기에서, 24-웰 플레이트에서 성장한 C. 엘레 간스 에 대해 수행된 액체 레바미솔 분석을 위한 프로토콜이 제시된다. 액체에서 동물의 격렬한 수영은 물리적 조작을 필요로하지 않고 한 시간 동안 수백 마리의 웜에서 레바미솔로 인한 마비를 평가하고 정량화 할 수있게합니다. 이 절차는 NMJ에서 변경된 신호 전달의 기능적 결과를 입증하기 위해 레바미솔에 대한 민감성을 변경한 야생형 및 돌연변이체 모두와 함께 사용할 수 있습니다.
Introduction
골격근에서 시냅스 후 아세틸콜린 수용체 (AChRs)의 활성화는 근육 수축으로 이어지는 전기 신호를 초래합니다. 신경 근육 기능의 붕괴는 중증 증후군과 인간의 근육 영양 실증을 초래합니다 1,2,3,4. 선충류 Caenorhabditis elegans는 진화적으로 보존 된 근본적인 생물학적 과정과 질병의 메커니즘에 대해 배우기 위해 광범위하게 사용되었습니다. 척추 동물 골격근과 C. elegans 체벽 근육은 운동5의 제어에서 기능적으로 동등합니다. 여기에서는 야생형 C. 엘레간을 신경근 신호전달 또는 근육 기능을 변경한 돌연변이체와 비교하는데 사용할 수 있는 간단한 분석법이 제시된다.
콜린성 및 GABAergic 운동 뉴런으로부터 각각 수신되는 흥분성 및 억제성 입력은 C. elegans 신체의 한쪽에 있는 근육이 수축하는 동안 다른 쪽의 근육이 이완되어 조정된 운동6을 가능하게 한다. 기생충 선충류 감염을 치료하는 데 사용되는 구충제 인 Levamisole은 체벽 근육의 AChRs의 한 클래스에 결합하고 구성적으로 활성화시켜 시간 의존적 마비를 일으킵니다 7. 따라서, 레바미솔에 대한 변경된 민감성은 흥분성 및 억제 신호전달 7,8,9,10,11,12,13,14,15 의 균형에 결함이 있는 C. elegans를 확인하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, UNC-63과 같은 레바미솔 민감성 AChR(L-AChR)의 서브유닛에서의 돌연변이는 시냅스에서의 L-AChR 클러스터링에 요구되는 쿠빌린, LEV-10의 C. 엘레간 상동체뿐만 아니라, 흥분성 신호전달에 영향을 미치고 레바미솔 내성 7,8을 초래한다. GABAA 수용체 UNC-49의 돌연변이는 억제 신호전달을 감소시키고 레바미솔12에 과민증을 유발한다.
레바미솔에 대한 과민성 또는 내성은 전통적으로 동물을 레바미솔이 들어있는 한천 플레이트로 옮긴 다음 정기적으로 웜을 엿보고 마비가 발생하는 시점을 결정함으로써 평가되었습니다13,14,15. 우리는 동물의 물리적 조작의 필요성을 제거하고 단 1 시간 만에 수백 마리의 동물을 선별 할 수있는 액체 레바 미솔 수영 분석을 개발했습니다. 여기에서, 야생형, unc-63(x26), lev-10(x17), 및 unc-49(e407) 동물과 함께 이 검정의 용도가 기재되어 있다. 그러나, 이 프로토콜은 변경된 레바미솔 민감도(11)에 대한 게놈 전체 RNAi 스크린에서 확인된 녹다운을 검증하기 위해 행해진 바와 같이, RNAi에 노출된 C. elegans에 대해서도 수행될 수 있다.
이 약리학적 분석을 위해, 웜을 24-웰 플레이트에서 성인기까지 성장시키고, M9 완충액 중의 0.4 mM 레바미솔을 각 웰에 첨가하고, 1시간 동안 매 5분마다 움직이는 동물의 수를 기록하였다. 레바미솔-유도된 마비는 시간에 따라 육안으로 관찰되었고, 분석의 완료 후, 데이터는 정량화되었다. 야생형 C. elegans 와 함께 돌연변이를 평가하면 학생들은 먼저 잠재적 표현형 효과에 대한 예측을 한 다음 가설을 테스트하기위한 실험을 수행 할 수 있습니다. 결론적으로, 이 간단하고 저렴하며 액체 레바미솔 분석은 NMJ 기능에 대한 특정 유전자의 손실의 영향을 입증하는 이상적인 방법입니다.
Protocol
1. 레바미솔 분석용 플레이트의 제조
- 교반 막대가 있는 플라스크에서 3 g의 NaCl, 2.5 g의 펩톤 및 17 g의 한천을 1 L의 탈이온화(DI) 물과 조합함으로써 선충류 성장 배지(NGM) 배지를 제조하였다.
- 오토클레이빙 후, 배지를 70°C로 설정된 핫플레이트 상에 놓고 1 h 동안 적당한 속도로 교반한다.
- 침전을 방지하기 위해 5 mg/mL 콜레스테롤 1 mL, 1 MCaCl2 1 mL, 1 M MgSO4 1 mL, 및 25 mL의 1 M pH 6.0 인산칼륨 완충액을 배지에 적가하십시오.
- NGM 배지 2mL를 멸균 혈청학적 피펫이 있는 24웰 플레이트의 각 웰에 옮깁니다(그림 1).
- 박테리아로 씨를 뿌리기 전에 접시를 벤치 탑에서 2 일 동안 말리십시오. 장기간 보관하려면 4 °C에 두십시오.
- OP50 대장균 을 리소겐 브로스(LB) 플레이트 상에 스트레킹하고 37°C에서 밤새 성장시킨다.
- 단일 OP50 콜로니를 B-브로스 (1 L의DIH2O중 트립톤 10 g 및 5 g의 NaCl)에 넣고 밤새 37°C에서 진탕 배양물을 설정하였다.
- 멸균 피펫을 사용하여 30 μL의 OP50 현탁액을 각 웰의 중앙에 있는 한천 상에 떨어뜨린다(그림 1).
참고 : 한천 표면이 웜 굴로 이어질 수 있으므로 손상시키지 마십시오. - 박테리아 잔디밭이 형성 될 수 있도록 파종 후 적어도 2 일 동안 플레이트를 실온에서 앉히십시오.
참고: 중앙 웰의 박테리아가 2일 후에도 건조되지 않으면 플레이트를 후드에서 20분 동안 열어 두십시오(그림 1). 플레이트는 분석 1-2 주 전에 박테리아를 부어 뿌려야합니다.
2. C. elegans 동기화 (1 일째)
- 야생형, unc-63 (x26), lev-10 (x17) 및 unc-49 (e407) C. elegans 를 6cm 플레이트에서 성인으로 성장시켜 균주 당 적어도 8 개의 플레이트를 준비하십시오. 접시에 굶주리지 않은 gravid 성인이 많이 있는지 확인하십시오.
참고 : 이것은 필요한만큼 두 배나 많은 플레이트입니다. 그러나 표백 중에 계란의 첫 번째 배치가 파괴 될 경우를 대비하여 백업 플레이트를 갖는 것이 중요합니다. - 교반하면서 59.6 g의Na2HPO4(이염기성), 29.9 g의 KH2PO4 (단염기성),12.8g의 NaCl, 및 2.5 g의 MgSO4를 교반하면서 DI 물 750 mL에 용해시켜 10x M9 완충액을 만든다. 일단 용해되면 부피를 1L까지 가져 와서 필터를 멸균하십시오. 1:10을 희석하고 오토클레이브하여 1x M9 버퍼를 만듭니다.
참고: 1x M9 버퍼는 몇 주 또는 몇 달 전에 만들 수 있습니다. - 동기화 당일에 후드 아래에 표백 용액을 준비하십시오. 표백제 10mL(표 자료), 2.5mL의 10N NaOH 및 37.5mL의 DI 물을 50mL 원뿔형 튜브에 섞는다. 표백 용액으로 작업 할 때마다 고글, 장갑 및 실험실 코트를 착용하십시오.
- 플라스틱 이송 피펫을 사용하여 1x M9 버퍼로 적어도 네 개의 플레이트에서 gravid 성인 웜을 씻어 15mL 원뿔형 튜브로 옮깁니다.
- 실온에서 1분 동안 716 x g 에서 스핀한 다음, 전사 피펫을 사용하여 상청액을 제거하였다.
- 표백 용액 10 mL를 첨가한다. 웜 시체의 대부분이 녹을 때까지 튜브를 뒤집거나 부드럽게 흔들어 ~ 4 분 동안 흔들어 라.
참고 : 웜을 과도하게 표백하지 않도록주의하십시오.이 웜은 알을 파괴 할 것입니다. 특정 돌연변이는 계란 분리의 어려움을 증가시킬 수 있습니다. - 1 분 동안 716 x g 에서 회전하십시오.
- 표백제 용액을 한 동작으로 붓습니다. 이 시점에서 튜브가 흔들리지 않는 한, 계란은 튜브의 측면에 달라 붙을 것입니다.
- 15mL의 1x M9 버퍼를 추가하고 반전시킵니다. 716 x g 에서 1분 동안 회전하고 M9 버퍼를 한 번의 부드러운 동작으로 붓습니다.
- 단계 2.9에 설명된 대로 1x M9 버퍼로 총 세 번의 세척을 수행합니다.
- 최종 세척 후, 신선한 1x M9 10 mL를 첨가하고, 15°C에서 하룻밤 동안 회전기 상에 놓고, 굶주린 제1 유충(L1) 단계 동물의 동기화된 집단을 분리한다.
참고: 회전기를 착용하기 전에 M9 버퍼에 계란이 있는지 확인하십시오. 그렇지 않은 경우 백업 플레이트와 표백제로 준비를 더 짧은 시간 동안 반복하십시오.
3. 도금 동기화 된 C. elegans (2 일째)
- 24웰 플레이트 맵을 인쇄하고 무작위 장소에 균주를 할당합니다. 각 균주는 24-웰 플레이트에 적어도 여섯 번 나타내야 한다.
- 표백제 준비 후 약 24시간 후, 부화한 굶주린 L1 웜을 실온에서 1분 동안 716 x g 의 M9 버퍼로 스핀다운한다.
- 플라스틱 이송 피펫으로 ~9mL의 M9 버퍼를 제거한 다음, 굶주린 첫 번째 애벌레 단계 웜(L1s)을 나머지 M9 버퍼에 부드럽게 섞는다.
- 즉시 M9 완충액 중의 웜 3 μL를 현미경 슬라이드 상에 피펫팅하고 L1s의 수를 결정하고; 원하는 수는 3 μL에서 20-30 L1s입니다. 웜 농도가 너무 낮 으면 M9를 내리고 M9를 제거하고 농도가 너무 높으면 M9를 추가하십시오.
참고: 3μL당 웜 수를 최소 2배 이상 확인하고 매번 튜브를 뒤집습니다. - 미리 만들어진 플레이트 맵에 따라 3 μL의 L1s(총 20-30개의 웜)를 각 웰에 피펫팅한다(단계 3.1; 그림 1).
참고: M9의 L1로 튜브를 자주 반전시켜 웜이 바닥에 정착할 때 균일한 분포를 유지합니다. 이것이 완료되지 않으면 일부 우물에는 너무 적은 웜이 있고 다른 우물에는 너무 많은 웜이 있습니다. 또한 피펫 팁으로 한천을 관통하지 마십시오.이 경우 동물이 파묻히게됩니다. - 웜이 20 °C에서 3 일 동안 성인기까지 자라게하십시오.
참고 : 다른 성장 온도와 특정 돌연변이를 사용하면 성숙 속도에 영향을 줄 수 있으므로 C. elegans 수명주기를 고려해야합니다.
4. 레바미솔 분석 수행(5일째)
- 빈 데이터시트를 인쇄하면 1시간 동안 5분마다 각 웰에서 이동하는 웜의 수를 기록하는 데 사용됩니다.
참고 : 학생들은 5 분마다 최대 12 개의 우물에서 웜을 계산할 수 있습니다. 상위 12개의 웰은 첫 번째 시간에 분석되고, 하위 12개의 웰은 다음 시간에 분석됩니다. - 24 웰 플레이트의 웜을 확인하십시오. 마커를 사용하여 오염이 있거나, 굶주리거나, 너무 많은 웜 (>40)이있는 우물 위에 플레이트 뚜껑에 "X"를 만들어 계산이 어려워집니다.
- 1x M9의 50 mL에 100 mM 레바미솔 스톡 200 μL를 첨가하여 0.4 mM 레바미솔 용액을 만든다. 240.76 mg의 레바미솔 염산염을 10 mL의H2O에 용해시켜 100 mM 레바미솔 스톡을 제조하고 이를 -20°C에서 보관한다.
참고 : Levamisol은 M9에서 희석해야합니다. H2O에서의 희석은 마비를 가속화한다. 학생들은 장갑을 착용해야합니다. 고농도의 레바미솔을 섭취하는 것은 독성이 있습니다. - 타이머를 시작한 다음 트랜스퍼 피펫을 사용하여 1 mL의 0.4 mM 레바미솔을 처음 두 웰에 첨가하여 동물들이 자유롭게 수영하도록하십시오. 인접한 웰에 레바미솔을 계속 첨가하고, 분석될 웰의 수에 따라 시간을 비틀어씁니다.
참고: 예를 들어, 10개의 웰이 분석되는 경우, 레바미솔은 다음과 같은 방식으로 첨가될 것이다: 웰 1 및 2는 시간 0, 웰 3 및 4는 1분 후, 웰 5 및 6은 2분 후, 웰은 3분 후에 웰 7 및 8, 웰은 4분 후에 웰 9 및 10이다. - 5분에 첫 번째 웰부터 시작하여 각 웰에서 움직이는 웜의 수만 수동으로 계산하고 데이터시트에 해당 숫자를 기록합니다(그림 1). 카운터는 사용할 수 있지만 움직이는 웜의 수를 정확하게 결정할 필요는 없습니다.
참고 : 학생들은 많은 웜이 마비되기 전에 초기 시간대에 때때로 뒤쳐지기 때문에 타이머를 주시해야합니다. 시간 포인트의 수를 조정할 수 있거나, 필요한 경우 각 시점에서 더 적은 웰을 분석할 수 있습니다. - 1 시간 동안 5 분마다 각 우물에서 움직이는 웜의 수를 계속 계산하십시오.
참고: M9에 침지하면 이 1시간 분석 과정에서 지속적인 수영 운동이 유도되므로 마비를 평가하기 위해 웜을 엿볼 필요가 없습니다(그림 2A). 0.4 mM 레바미솔 용액에 대한 노출은 수영의 중단에 의해 관찰되는 바와 같이 시간 의존적 마비를 유도한다; 마비 된 웜은 회복되지 않습니다. - 4.4.-4.6단계를 반복합니다. 접시에있는 우물의 나머지 부분.
- 분석이 끝날 때 또는 시간이 허락하면 각 웰의 총 웜 수를 기록하십시오.
5. 데이터 분석
- 플레이트 맵을 획득하고(단계 3.1.) 각 웰에 해당하는 변형을 기록한다.
참고: 수집된 데이터의 양으로 인해 데이터에 대한 후속 분석 및 토론에는 최소 몇 시간이 소요됩니다. - 데이터를 스프레드시트에 입력하고, 각 웰의 총 웜 수부터 시작하여 유전자형별로 구성합니다.
- 우물에서 데이터를 결합하여 모든 균주에 대해 각 시점에서 이동하는 웜의 수를 결정합니다.
- 이러한 데이터를 사용하여 통계 소프트웨어(Table of Materials)에서 "생존 곡선"을 작성하여 집단의 시간 의존적 마비를 시각적으로 표시합니다(그림 2B).
- 왼쪽 열은 시간을 나타내고 후속 열에는 각 변형에 대한 데이터가 포함되도록 데이터 테이블을 만듭니다. 처음 5 분 이내에 마비 된 각 동물에 대해 행을 만들고 5 분 동안 "1"을 입력하십시오. 각 시점에 대해 이 작업을 반복합니다. 분석이 끝날 때까지 마비되지 않는 모든 동물의 경우 60 분 동안 "0"을 입력하십시오.
- 통계 소프트웨어(Table of Materials)에서 로그-랭크(Mantel-Cox) 검정을 사용하여 쌍 비교를 수행하여 두 균주 간에 통계적으로 유의한 차이가 있는지 확인합니다.
- 추가/대체 분석을 위해 5.3단계를 수행하는 대신 수행합니다. 단계 5.4., 각 시점에서 각 웰에서 이동하는 동물의 백분율을 결정한다. 스프레드시트 프로그램 또는 통계 소프트웨어를 사용하여 분석된 모든 균주에 대해 각 시점에서 표준 오차가 있는 평균을 플로팅합니다(그림 2C).
Representative Results
AChRs 및 GABA 수용체를 통한 신호 전달은 C. elegans 신체의 한쪽에있는 근육이 수축하는 동안 다른 쪽의 근육이 이완되어 조정 된 운동6,16을 가능하게합니다. 이온성 L-AChRs에 결합하는 레바미솔은 수축을 일으켜 야생형 동물의 시간 의존적 마비를 일으킨다. 여기에서, 우리는 야생형, unc-63 L-AChR 돌연변이체, lev-10 L-AChR 클러스터링 돌연변이체, 및 unc-49 GABAA 수용체 돌연변이체 C. 엘레간스에서 레바미솔에 대한 민감성을 평가하였다. L-AChR의 서브유닛에서의 돌연변이는 L-AChRs를 근육 원형질막으로 밀매하고, 시냅스 후 L-AChRs의 클러스터링, 및 하류Ca2+ 신호전달에 필요한 유전자에서 뿐만 아니라, unc-63 및 lev-10 돌연변이에서 관찰된 바와 같이 레바미솔-유도된 마비7,8,9,10,11,16,17에 대한 내성을 야기한다(도 2B ,C). GABA-게이티드 이온 채널 UNC-49의 손실은 콜린성 및 GABAergic 신호전달12의 적절한 균형의 붕괴로 인해 레바미솔 과민증(도 2B,C)을 야기하였다. 이 분석이 최근 고급 유전학 실험실에서 학부생들에 의해 수행되었을 때, 100 %의 학생들이 unc-63 및 lev-10 돌연변이체에 대한 레바미솔 내성을 관찰했으며 88 %는 unc-49 돌연변이로 레바미솔 과민증을 관찰했습니다. 액체 레바미솔 수영 분석으로 수집된 이들 데이터는 전통적인 플레이트 기반 레바미솔 검정 7,8,11,12,13에서 관찰된 표현형과 일치한다.
도 1: 레바미솔 분석 제제 및 구현의 개략도. 24-웰 NGM 플레이트가 부어진다; 2 일 후, OP50 에스케리치아 콜라이가 우물에 시딩됩니다. C. 엘레간은 표백제 준비 및 제1 유충 단계(L1)를 통해 동기화되어 분석될 각 균주에 대한 동물(야생형, 검정; unc-63 (x26), 자홍색; 레프 -10 (x17), 녹색; unc-49(e407), 파란색)은 다음 날 소정의 플레이트 맵에 따라 웰 내로 피펫팅된다. 20ºC에서 3 일간 성장한 후 또는 동물이 성인이 될 때 M9 완충액의 0.4 mM 레바 미솔이 각 웰에 첨가되고 움직이는 동물의 수는 1 시간 동안 5 분마다 계산됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 2: 레바미솔-유도된 마비 야생형 및 대표적인 돌연변이체 C. 엘레간스. (a) 0.4 mM 레바미솔에 노출되면 시간 의존적 마비가 유발되고; 이것은 레바미솔 수영 분석에서 1x M9 버퍼에서 1시간 동안 수영하는 동물에 대해서는 관찰되지 않는다. (B) 야생형(검정), unc-63(x26 )(마젠타), lev-10(x17 )(녹색 ) 및 unc-49(e407)( 파란색) 동물의 시간 의존적 마비. L-AChR 서브유닛 UNC-63 또는 L-AChR 클러스터링 단백질 LEV-10의 손실은 레바미솔 내성을 초래하고, GABA A 수용체 UNC-49의 손실은 레바미솔 과민증을 야기하였다. n≥ 유전자형 당 50개, p< 0.0001로 야생형과 비교하여 본 대표적인 실험에서 야생형과 비교하였다. (c) 패널 (B)에서와 동일한 데이터를 사용하여, 각 시점에서의 이동 동물의 백분율 (SE를 ± 각 웰에 대한 백분율의 평균)을 각 균주에 대해 결정하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Discussion
레바미솔에 대한 변경된 반응은 시냅스 후 콜린성 신호전달 및 근육 기능에 필요한 유전자를 확인할 수 있다. 여기서 프로토콜은 1 h 기간에 걸쳐 시간 의존적 마비를 정량화하기 위해 사용되는 액체 레바미솔 검정을 기술한다. 학생들은 특정 유전 적 돌연변이의 영향에 대해 예측하고, 큰 표본 크기로 실험을 수행 한 다음 결과를 정량화합니다. 이 분석은 동물을 따거나 찌르지 않고 레바미솔로 인한 마비를 정량화하는 간단하고 효율적인 방법이므로 학부 실험실뿐만 아니라 신경 근육 전달을 연구하는 연구원에게도 적합합니다. 여기에서 논의되는 것은 가장 일반적인 함정 중 일부, 분석의 한계 및 RNAi 녹다운 동물과의 사용을 가능하게 하는 프로토콜에 대한 변형이다; 또한이 분석이 코스 기반 학부 연구 경험에 포함될 수있는 방법에 대해서도 논의됩니다.
24-웰 플레이트의 적절한 준비는 필수적입니다. 첫째, 박테리아 잔디밭은 우물에서 L1 동물을 발견하기 전에 완전히 건조해야합니다. 충분히 건조되지 않으면 박테리아가 분석 중에 레바 미솔 용액과 혼합되어 액체가 흐려지고 개인이 웜을 셀 수 없게됩니다. 둘째, 표백제 준비를 통해 웜을 동기화 할 때 계란의 보호 코팅이 분해되기 때문에 동물은 표백제 용액에 너무 오랫동안 노출되어서는 안됩니다. 셋째, 우물 당 20-30 L1 만 발견하는 것이 중요하며, 우물에 너무 많은 웜이 있으면 할당 된 시간에 움직이는 수를 정확하게 계산하기가 매우 어렵습니다. 마지막으로, 오염 된 우물을 분석 할 수 없으므로 플레이트를 준비하는 동안 무균 기술을 유지하는 것이 중요합니다.
이 분석을 수행할 때 고려해야 할 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 첫째, 매 5 분마다 각 우물에서 움직이는 웜의 수를 세는 것은 이전의 실험실 경험이 부족한 개인에게는 압도적 일 수 있으며 이로 인해 부정확한 데이터 수집이 발생할 수 있습니다. 약물 민감도18,19를 결정하기 위해 사용되는 다른 검정에 관해서는, 이 실험은 더 적은 시간 포인트로 수행될 수 있다. 둘째, 표백제 준비물로부터 분리된 굶주린 L1s의 도금은 동기화된 모집단을 얻는 쉬운 방법이다; 그러나 분석되는 균주간에 발달 타이밍이 다른 경우 조정해야합니다. 이 분석을 위해 후기 4 개의 애벌레 단계 동물 (L4s)을 24-웰 플레이트로 선택할 수 있습니다. 그러나 많은 접시를 준비 할 때 이것은 너무 노동 집약적입니다. 또는 각 변형이 L4에 도달하는 데 걸리는 시간을 결정한 다음 성숙 속도의 차이를 조정하기 위해 L1을 다른 시간에 웰에 배치해야합니다. 마지막으로, 이 분석이 시냅스 후 근육 기능(11)에 중요한 새로운 유전자를 확인하는데 사용될 수 있지만, 변경된 레바미솔 반응은 또한 시냅스 전 유전자(12)의 돌연변이 또는 RNAi 녹다운에 의해 야기될 수 있다. 변경된 레바미솔 민감도가 관찰되면 이 표현형의 이유를 결정하기 위해 추가 실험을 수행해야 합니다.
24-웰 플레이트에 약간의 변형을 행함으로써, 기술된 레바미솔 수영 검정은 또한 RNAi 녹다운 동물(11)에 대해 수행될 수 있다. RNAi를 통한 유전자 녹다운은 관심있는 유전자(20)에 상응하는 이중 가닥 RNA를 발현하는 C. 엘레간스 박테리아에게 먹이를 줌으로써 달성될 수 있다. RNAi 플레이트를 제조하기 위해, 오토클레이브에서 제거한 후 배지 1리터당 1M IPTG 1mL와 25mg/mL 카베니실린 1mL를 첨가해야 합니다. 박테리아 배양물은 단일 콜로니를 3 mL의 LB 브로스와 25 mg/mL의 카베니실린 3 μL로 따고, 37°C에서 하룻밤 동안 진탕함으로써 성장시키고, 상이한 박테리아가 웰에서 발견될 때 플레이트 맵을 만든다. C. 엘레간은 기재된 바와 같이 표백제 프렙에 의해 동기화되고; 그러나, RNAi 과민성 eri-1(mg366) 균주는 유전자 녹다운을 증가시키기 위해 야생형 대신 사용되어야 한다. RNAi 녹다운은 기능 상실 돌연변이체11에 대해 관찰된 동일한 레바미솔 표현형을 초래한다.
여기에 제시된 프로토콜은 실험실 연구, 학부 실험실에서의 독립형 실험 또는 기본 C. elegans 기술 및 신경 근육 기능에 대한 소개로 고급 학부 과정의 시작 주에 사용할 수 있습니다. 보다 진보 된 발견 기반 과정에서 학생들은이 분석을 사용하여 중증 증후군, 근육 영양 장애 또는 근병증이있는 개인에서 돌연변이 된 유전자의 C. elegans 상동체의 손실이 레바 미솔 감도를 변경하는지 여부를 결정할 수 있습니다. 결론적으로,이 간단하고 저렴한 레바미솔 감도 분석은 NMJ에서 신호 전달에 대해 배우고 C. elegans 모델 시스템으로 작업 한 경험을 쌓을 수있는 실습 접근법을 제공합니다.
Disclosures
저자는 이해 상충이 없습니다.
Acknowledgments
델라웨어 대학의 BISC413 Advanced Genetics Laboratory (Spring 2022)에서 유전자형에 눈이 먼 그림 2B,C 의 데이터를 수집 한 Riya Dattani와 Lauren Hogstrom에게 감사드립니다. BISC413 과정 기반 학부 연구 경험 (CURE)에 대한 추가 정보와 J. Tanis가 설계 한 실험실 매뉴얼에 대한 액세스는 요청시 제공됩니다. 선충류 균주는 NIH-ORIP (P40 OD010440)에 의해 뒷받침되는 Caenorhabditis Genetics Center에 의해 제공되었다. 이 작품은 P20 GM103446 Delaware INBRE Mentored CURE Award (J.E.T.)의 지원을 받았습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 60 mm non-vented, sharp edge Petri Dishes | TriTech Research | Cat #: T3308 | |
| BD Difco Bacto Agar | Fisher Scientific | Cat#: DF0140-01-0 | |
| BioLite 24 Well Multidish | Fisher Scientific | Cat#:12-556-006 | |
| Calcium Chloride Dihydrate | Fisher Scientific | Cat#: BP510-500 | |
| Cholesterol | MP Biomedicals | Cat#: 02101382-CF | |
| eri-1(mg366) | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | GR1373 | |
| Gibco Bacto Peptone | Fisher Scientific | Cat#: DF0118-17-0 | |
| Gibco Bacto Tryptone | Fisher Scientific | Cat#: DF0123-17-3 | |
| GraphPad Prism (Statistical software) | GraphPad Software, Inc. | ||
| lev-10(x17) | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | ZZ17 | |
| Levamisole hydrochloride | Fisher Scientific | Cat#: AC187870100 | |
| Low Splash Regular Bleach - 121oz - up & up | Target | Search target.com | |
| Magnesium Sulfate Heptahydrate | Fisher Scientific | Cat#: BP213-1 | |
| Microsoft Excel | Microsoft, Inc | ||
| N2 wild type | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | Bristol N2 | |
| OP50 E. coli | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | OP50 | |
| Potassium Phosphate Dibasic | Fisher Scientific | Cat#: BP363-1 | |
| Potassium Phosphate Monobasic | Fisher Scientific | Cat#: BP362-500 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Fisher Scientific | Cat#: BP358-1 | |
| Sodium Hydroxide 10N | Fisher Scientific | Cat#: SS255-1 | |
| Sodium Phosphate Dibasic | Fisher Scientific | Cat#: BP332-1 | |
| unc-49(e407) | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | CB407 | |
| unc-63(x26) | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | ZZ26 |
References
- Engel, A. G., Shen, X. M., Selcen, D., Sine, S. M. Congenital myasthenic syndromes: Pathogenesis, diagnosis, and treatment. The Lancet Neurology. 14 (4), 420-434 (2015).
- Mahjneh, I., Lochmüller, H., Muntoni, F., Abicht, A. DOK7 limb-girdle myasthenic syndrome mimicking congenital muscular dystrophy. Neuromuscular Disorders. 23 (1), 36-42 (2013).
- Rodríguez Cruz, P. M., et al. Congenital myopathies with secondary neuromuscular transmission defects; A case report and review of the literature. Neuromuscular Disorders. 24 (12), 1103-1110 (2014).
- Montagnese, F., et al. Two patients with GMPPB mutation: The overlapping phenotypes of limb-girdle myasthenic syndrome and limb-girdle muscular dystrophy dystroglycanopathy. Muscle and Nerve. 56 (2), 334-340 (2017).
- Gieseler, K., Qadota, H., Benian, G. M. Development, structure, and maintenance of C. elegans body wall muscle. WormBook. , 1-59 (2017).
- Richmond, J. E., Jorgensen, E. M. One GABA and two acetylcholine receptors function at the C. elegans neuromuscular junction. Nature Neuroscience. 2 (9), 791-797 (1999).
- Lewis, J. A., Wu, C. H., Berg, H., Levine, J. H. The genetics of levamisole resistance in the nematode Caenorhabditis elegans. Genetics. 95 (4), 905-928 (1980).
- Gally, C., Eimer, S., Richmond, J. E., Bessereau, J. L. A transmembrane protein required for acetylcholine receptor clustering in Caenorhabditis elegans. Nature. 431 (7008), 578-582 (2004).
- Eimer, S., et al. Regulation of nicotinic receptor trafficking by the transmembrane Golgi protein UNC-50. The EMBO Journal. 26 (20), 4313-4323 (2007).
- Gendrel, M., Rapti, G., Richmond, J. E., Bessereau, J. L. A secreted complement-control-related protein ensures acetylcholine receptor clustering. Nature. 461 (7266), 992-996 (2009).
- Chaya, T., et al. A C. elegans genome-wide RNAi screen for altered levamisole sensitivity identifies genes required for muscle function. G3: Genes, Genomes, Genetics. 11 (4), 047 (2021).
- Vashlishan, A. B., et al. An RNAi screen identifies genes that regulate GABA synapses. Neuron. 58 (3), 346-361 (2008).
- Krajacic, P., Pistilli, E. E., Tanis, J. E., Khurana, T. S., Lamitina, S. T. FER-1/Dysferlin promotes cholinergic signaling at the neuromuscular junction in C. elegans and mice. Biology Open. 2 (11), 1245-1252 (2013).
- Gottschalk, A., et al. Identification and characterization of novel nicotinic receptor-associated proteins in Caenorhabditis elegans. The EMBO Journal. 24 (14), 2566-2578 (2005).
- Loria, P. M., Hodgkin, J., Hobert, O. A conserved postsynaptic transmembrane protein affecting neuromuscular signaling in Caenorhabditis elegans. The Journal of Neuroscience. 24 (9), 2191-2201 (2004).
- Treinin, M., Jin, Y. Cholinergic transmission in C. elegans: Functions, diversity, and maturation of ACh-activated ion channels. Journal of Neurochemistry. 158 (6), 1274-1291 (2021).
- Rapti, G., Richmond, J., Bessereau, J. L. A single immunoglobulin-domain protein required for clustering acetylcholine receptors in C. elegans. The EMBO Journal. 30 (4), 706-718 (2011).
- Kim, S., Sieburth, D. A receptor tyrosine kinase network regulates neuromuscular function in response to oxidative stress in Caenorhabditis elegans. Genetics. 211 (4), 1283-1295 (2019).
- Oh, K., Kim, H. Aldicarb-induced paralysis assay to determine defects in synaptic transmission in Caenorhabditis elegans. Bio-Protocol. 7 (14), 2400 (2017).
- Timmons, L., Court, D. L., Fire, A. Ingestion of bacterially expressed dsRNAs can produce specific and potent genetic interference in Caenorhabditis elegans. Gene. 263 (1-2), 103-112 (2001).
