Den nuværende protokol beskriver et assay for at bestemme respons på levamisol, en farmakologisk agonist af en klasse af Caenorhabditis elegans acetylcholinreceptorer. I dette flydende levamisolsvømmeassay observerer og kvantificerer forskere visuelt den tidsafhængige lammelse af dyr dyrket i 24-brøndplader.
Ved det neuromuskulære kryds (NMJ) fører bindingen af den excitatoriske neurotransmitter acetylcholin (ACh) til postsynaptiske receptorer til muskelkontraktion. Som i hvirveldyr skeletmuskulatur er kolinerge signalering i kropsvægsmusklerne i modelorganismen Caenorhabditis elegans nødvendig for bevægelse. Eksponering for levamisol, en farmakologisk agonist af en klasse af ACh-receptorer på kroppens vægmuskler, forårsager tidsafhængig lammelse af vildtypedyr. Ændret følsomhed over for levamisol antyder defekter i signalering ved NMJ eller muskelfunktion. Her præsenteres en protokol for et flydende levamisolassay udført på C. elegans dyrket i 24-brøndplader. Kraftig svømning af dyrene i væske giver mulighed for vurdering og kvantificering af levamisolinduceret lammelse i hundredvis af orme over en times tidsperiode uden at kræve fysisk manipulation. Denne procedure kan anvendes med både vildtype og mutanter, der har ændret følsomhed over for levamisol for at demonstrere de funktionelle konsekvenser af ændret signalering ved NMJ.
Aktivering af postsynaptiske acetylcholinreceptorer (AChR’er) på skeletmuskulatur resulterer i et elektrisk signal, der fører til muskelkontraktion. Forstyrrelse af neuromuskulær funktion resulterer i myastheniske syndromer og muskeldystrofier hos mennesker 1,2,3,4. Nematoden Caenorhabditis elegans er blevet brugt i vid udstrækning til at lære om evolutionært bevarede grundlæggende biologiske processer og sygdomsmekanismer. Hvirveldyr skeletmuskler og C. elegans kropsvægsmuskler er funktionelt ækvivalente i kontrollen af bevægelse5. Her præsenteres et simpelt assay, der kan bruges til at sammenligne vildtype C. elegans med mutanter, der har ændret neuromuskulær signalering eller muskelfunktion.
Excitatoriske og hæmmende input modtaget fra henholdsvis kolinerge og GABAerge motorneuroner får musklerne på den ene side af C. elegans krop til at trække sig sammen, mens musklerne på den anden side slapper af, hvilket muliggør koordineret bevægelse6. Levamisol, et anthelmintisk middel, der anvendes til behandling af parasitære nematodeinfektioner, binder sig til og aktiverer konstitutivt en klasse af AChR’er på kropsvægsmusklerne, hvilket resulterer i tidsafhængig lammelse7. Således kan ændret følsomhed over for levamisol anvendes til at identificere C. eleganer med defekter i balancen mellem excitatorisk og hæmmende signalering 7,8,9,10,11,12,13,14,15. For eksempel påvirker mutationer i underenheder af den levamisolfølsomme AChR (L-AChR), såsom UNC-63, såvel som C. elegans homolog af Cubilin, LEV-10, som er nødvendig for L-AChR-klyngedannelse ved synapsen, excitatorisk signalering og resulterer i levamisolresistens 7,8. Mutationer i GABAA-receptoren UNC-49 reducerer hæmmende signalering og forårsager overfølsomhed over for levamisol12.
Overfølsomhed eller resistens over for levamisol er traditionelt blevet vurderet ved at overføre dyr til agarplader indeholdende levamisol og derefter regelmæssigt stikke ormene for at bestemme det tidspunkt, hvor lammelse forekommer 13,14,15. Vi har udviklet et flydende levamisol svømmeassay, der eliminerer behovet for fysisk manipulation af dyrene og giver mulighed for screening af hundredvis af dyr på bare 1 time. Her beskrives brugen af dette assay med vildtype, unc-63(x26), lev-10(x17) og unc-49(e407) dyr. Denne protokol kan dog også udføres på C. eleganer udsat for RNAi, som det blev gjort for at validere knockdowns identificeret i en genom-dækkende RNAi-skærm for ændret levamisolfølsomhed11.
Til dette farmakologiske assay blev orme dyrket til voksenalderen i 24-brøndplader, 0,4 mM levamisol i M9-buffer blev tilsat til hver brønd, og antallet af bevægelige dyr blev registreret hvert 5. minut i 1 time. Levamisolinduceret lammelse blev visuelt observeret over tid, og efter afslutningen af analysen blev data kvantificeret. Evalueringen af mutanter sammen med vildtype C. elegans giver eleverne mulighed for først at forudsige potentielle fænotypiske effekter og derefter udføre eksperimenter for at teste deres hypoteser. Afslutningsvis er dette enkle, billige, flydende levamisolassay en ideel måde at demonstrere virkningen af tabet af specifikke gener på NMJ-funktionen.
Ændret respons på levamisol kan identificere gener, der kræves til postsynaptisk kolinerg signalering og muskelfunktion. Protokollen beskriver her et flydende levamisolassay, der bruges til at kvantificere tidsafhængig lammelse over en 1 times tidsperiode. Studerende forudsiger virkningerne af visse genetiske mutationer, udfører et eksperiment med stor prøvestørrelse og kvantificerer derefter deres resultater. Dette assay er en enkel, effektiv måde at kvantificere levamisolinduceret lammelse uden at plukke eller stikke dyr, hvilket gør den velegnet til bachelorlaboratorier samt forskere, der studerer neuromuskulær transmission. Diskuteret her er nogle af de mest almindelige faldgruber, begrænsningerne i analysen og en variation til protokollen, der muliggør dens anvendelse med RNAi knockdown-dyr; også diskuteret her er, hvordan dette assay kan indlejres i en kursusbaseret bachelorforskningserfaring.
Korrekt forberedelse af pladerne med 24 brønde er afgørende. For det første skal bakterieplæner være helt tørre, før de spotter L1-dyr i brøndene. Hvis de ikke tørres nok, blandes bakterierne med levamisolopløsningen under analysen, hvilket gør væsken uklar og forhindrer enkeltpersoner i at kunne tælle ormene. For det andet, når de synkroniserer orme gennem blegemiddelforberedelse, må dyrene ikke udsættes for blegemiddelopløsningen for længe, da dette vil få den beskyttende belægning på æggene til at gå i opløsning. For det tredje er det afgørende kun at få øje på 20-30 L1’er pr. Brønd, da for mange orme i brøndene gør det ekstremt vanskeligt at tælle antallet, der bevæger sig nøjagtigt inden for den tildelte tid. Endelig er det vigtigt at opretholde en aseptisk teknik under fremstillingen af pladerne, da forurenede brønde ikke kan analyseres.
Der er et par begrænsninger, der skal overvejes, når du udfører dette assay. For det første kan det være overvældende at tælle antallet af bevægelige orme i hver brønd hvert 5. minut for personer, der mangler forudgående laboratorieerfaring, og dette kan føre til upræcis dataindsamling. Hvad angår andre assays, der bruges til at bestemme lægemiddelfølsomhed18,19, kan dette eksperiment udføres med færre tidspunkter. For det andet er plettering af sultne L1’er isoleret fra en blegemiddelforberedelse en nem metode til at opnå en synkroniseret population; Der skal dog foretages justeringer, hvis udviklingstidspunktet varierer mellem de stammer, der analyseres. Det er muligt at plukke sene fjerde larvestadiedyr (L4’er) i en 24-brøndplade til dette assay; Men når man forbereder mange plader, er dette for arbejdskrævende. Alternativt bør man bestemme, hvor lang tid det tager for hver stamme at nå L4 og derefter placere L1’erne i brøndene på forskellige tidspunkter for at justere for forskelle i modningshastighed. Endelig, mens dette assay kan bruges til at identificere nye gener, der er vigtige for postsynaptisk muskelfunktion11, kan ændret levamisolrespons også være forårsaget af mutation eller RNAi knockdown af præsynaptiske gener12. Hvis der observeres ændret levamisolfølsomhed, skal der udføres yderligere forsøg for at bestemme årsagen til denne fænotype.
Ved at foretage et par ændringer af pladerne med 24 brønde kan den beskrevne levamisol svømmeassay også udføres på RNAi knockdown dyr11. Gen knockdown gennem RNAi kan opnås ved at fodre C. elegans bakterier, der udtrykker dobbeltstrenget RNA svarende til genet af interesse20. Til fremstilling af RNAi-plader skal der tilsættes 1 ml 1 ml IPTG og 1 ml 25 mg/ml carbenicillin pr. liter medie efter fjernelse fra autoklaven. Bakteriekulturer dyrkes ved at plukke en enkelt koloni i 3 ml LB bouillon plus 3 μL 25 mg/mlcarbenicillin og ryste ved 37 °C natten over, og pladekortet laves, når de forskellige bakterier ses i brøndene. C. elegans synkroniseres ved blegemiddelforberedelse som beskrevet; dog bør den RNAi overfølsomme eri-1 (mg366) stamme anvendes i stedet for vildtypen for at øge gen knockdown. RNAi knockdowns resulterer i de samme levamisolfænotyper observeret for funktionstab mutanter11.
Protokollen, der præsenteres her, kan bruges i laboratorieforskning, som et selvstændigt eksperiment i bachelorlaboratoriet eller i de første uger af et avanceret bachelorkursus som en introduktion til grundlæggende C. elegans teknikker og neuromuskulær funktion. I et mere avanceret opdagelsesbaseret kursus kan eleverne bruge dette assay til at afgøre, om tabet af C. elegans homologer af gener muteret hos personer med myastheniske syndromer, muskeldystrofier eller myopatier ændrer levamisolfølsomhed. Afslutningsvis giver dette enkle, billige levamisolfølsomhedsassay en praktisk tilgang til at lære om signalering ved NMJ og få erfaring med at arbejde med C. elegans-modelsystemet .
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Riya Dattani og Lauren Hogstrom, der indsamlede dataene i figur 2B, C blind for genotype i BISC413 Advanced Genetics Laboratory (forår 2022) ved University of Delaware. Yderligere oplysninger om BISC413 kursusbaseret bachelorforskningserfaring (CURE) samt adgang til laboratoriemanualen designet af J. Tanis er tilgængelig efter anmodning. Nematodestammer blev leveret af Caenorhabditis Genetics Center, som understøttes af NIH-ORIP (P40 OD010440). Dette arbejde blev støttet af en P20 GM103446 Delaware INBRE Mentored CURE Award (til J.E.T.).
60 mm non-vented, sharp edge Petri Dishes | TriTech Research | Cat #: T3308 | |
BD Difco Bacto Agar | Fisher Scientific | Cat#: DF0140-01-0 | |
BioLite 24 Well Multidish | Fisher Scientific | Cat#:12-556-006 | |
Calcium Chloride Dihydrate | Fisher Scientific | Cat#: BP510-500 | |
Cholesterol | MP Biomedicals | Cat#: 02101382-CF | |
eri-1(mg366) | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | GR1373 | |
Gibco Bacto Peptone | Fisher Scientific | Cat#: DF0118-17-0 | |
Gibco Bacto Tryptone | Fisher Scientific | Cat#: DF0123-17-3 | |
GraphPad Prism (Statistical software) | GraphPad Software, Inc. | ||
lev-10(x17) | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | ZZ17 | |
Levamisole hydrochloride | Fisher Scientific | Cat#: AC187870100 | |
Low Splash Regular Bleach – 121oz – up & up | Target | Search target.com | |
Magnesium Sulfate Heptahydrate | Fisher Scientific | Cat#: BP213-1 | |
Microsoft Excel | Microsoft, Inc | ||
N2 wild type | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | Bristol N2 | |
OP50 E. coli | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | OP50 | |
Potassium Phosphate Dibasic | Fisher Scientific | Cat#: BP363-1 | |
Potassium Phosphate Monobasic | Fisher Scientific | Cat#: BP362-500 | |
Sodium Chloride (NaCl) | Fisher Scientific | Cat#: BP358-1 | |
Sodium Hydroxide 10N | Fisher Scientific | Cat#: SS255-1 | |
Sodium Phosphate Dibasic | Fisher Scientific | Cat#: BP332-1 | |
unc-49(e407) | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | CB407 | |
unc-63(x26) | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | ZZ26 |