Summary
Ici, nous présentons un protocole pour réduire significativement le nombre de copies d’ADN mitochondrial dans un ovocyte bovin (P < 0,0001). Cette méthode utilise la centrifugation et la bisection pour réduire considérablement les mitochondries des ovocytes et peut permettre d’augmenter les chances de développement dans les embryons de transfert nucléaire de cellules somatiques interespèces reconstruits.
Abstract
Le transfert nucléaire de cellules somatiques interespèces (iSCNT) peut être utilisé pour sauver des espèces menacées, mais deux populations distinctes d’ADN mitochondrial (ADNmt) existent dans l’embryon reconstruit : une dans l’ooplasme receveur et une dans la cellule somatique donneuse. Cette hétéroplasmie mitochondriale peut entraîner des problèmes de développement chez l’embryon et le fœtus. Les protocoles de clonage faits à la main comprennent la bisection ovocytaire, qui peut être utilisée pour diminuer le nombre de copies d’ADNmt, réduisant ainsi le degré d’hétéroplasmie mitochondriale dans un embryon reconstruit. La centrifugation d’ovocytes bovins matures et dénudés a produit une fraction visible dense en mitochondries à un pôle de l’ovocyte. Les pellucidés de la zone des ovocytes ont été éliminés par exposition à une solution de pronase. La bisection a été réalisée à l’aide d’une microlame pour éliminer la fraction visible des mitochondries. La qPCR a été utilisée pour quantifier l’ADNmt présent dans les échantillons d’ADN extraits d’ovocytes entiers et d’ooplastes coupés en deux, fournissant une comparaison des nombres de copies d’ADNmt avant et après la bisection. Les nombres de copies ont été calculés à l’aide de valeurs seuils de cycle, de la formule de la ligne de régression d’une courbe standard et d’un ratio qui comprenait les tailles respectives des produits de PCR d’ADNmt et des produits de PCR génomique. Un ovocyte bovin avait un nombre moyen de copies d’ADNmt (± écart-type) de 137 904 ± 94 768 (n = 38). Un ooplast appauvri en mitochondries avait un nombre moyen de copies d’ADNmt de 8 442 ± 13 806 (n = 33). Les copies moyennes d’ADNmt présentes dans un ooplast riche en mitochondries étaient de 79 390 ± de 58 526 copies d’ADNmt (n = 28). Les différences entre ces moyennes calculées indiquent que la centrifugation et la bisection subséquente peuvent diminuer considérablement le nombre de copies d’ADNmt présent dans l’ooplaste appauvri en mitochondries par rapport à l’ovocyte d’origine (P < 0,0001, déterminé par une ANOVA unidirectionnelle). La réduction de l’ADNmt devrait diminuer le degré d’hétéroplasmie mitochondriale dans un embryon reconstruit, favorisant éventuellement le développement embryonnaire et fœtal standard. La supplémentation en extrait mitochondrial de la cellule donneuse somatique peut également être essentielle pour réussir le développement embryonnaire.
Introduction
Le transfert nucléaire de cellules somatiques (SCNT) comprend la fusion d’un ovocyte énucléé d’un animal et d’une cellule somatique d’un animal de la même espèce. Dans la plupart des cas, l’ovocyte et la cellule somatique proviennent de la même espèce et les taux de naissances vivantes sont inférieurs à 6 %1. Certaines recherches impliquent l’utilisation de SCNT interespèces (iSCNT), qui comprend la fusion d’une cellule somatique et d’un ovocyte provenant de deux espèces différentes. Dans ces études, les taux de naissances vivantes sont encore plus bas que dans le SCNT - généralement inférieur à 1%1. Cependant, l’iSCNT a la capacité d’être utilisé comme méthode de sauvetage d’espèces menacées, car les cellules somatiques de ces animaux sont plus accessibles que leurs cellules germinales1. Les ovocytes receveurs utilisés dans l’iSCNT sont souvent des espèces de laboratoire domestiques ou communes, telles que les vaches, les porcs et les souris. Certaines tentatives faites jusqu’à présent ont réussi à produire des jeunes vivants, bien que la progéniture produite ait été des animaux intragénériques (les espèces d’ovocytes receveurs et les espèces de cellules donneuses étaient membres du même genre)2,3,4. Les modèles intergénériques (qui utilisent un ovocyte et une cellule somatique d’animaux de différents genres) n’ont pas encore produit d’animaux vivants, et la majorité des embryons reconstruits s’arrêtent au stade 8-16 cellules du développement in vitro 5,6,7,8. Une explication possible de cet arrêt du développement embryonnaire est l’apparition d’une hétéroplasmie mitochondriale dans les embryons - la présence de plus d’un type d’ADN mitochondrial (ADNmt) dans une seule cellule. L’hétéroplasmie peut entraîner des problèmes tels que l’inefficacité du développement ou l’échec de l’embryon ou de l’animal vivant1. La pathogenèse peut également survenir plus tard dans la vie de l’animal9. Bien que ce problème soit également présent chez la progéniture SCNT, la composante interspécifique des embryons iSCNT exacerbe le problème.
Lorsque l’ADNmt embryonnaire provient de deux espèces différentes, les mitochondries ovocytaires receveuses, qui représentent la majorité, ne fonctionnent pas efficacement avec le noyau1,10 de la cellule donneuse. Des écarts taxonomiques plus importants entre les deux espèces utilisées dans l’iSCNT intensifient probablement ce problème; La progéniture vivante intragénérique produite (progéniture Bos gaurus et Bos indicus utilisant les ovocytes Bos taurus), ainsi que la progéniture produite via la SCNT traditionnelle (par exemple, la progéniture Ovis aries utilisant des ovocytes Ovis aries) se sont révélées être des chimères (l’ADNmt de deux individus était présent chez ces animaux 11,12,13). Pourtant, ils se sont développés beaucoup plus loin que les embryons SCNT intergénériques14,15. L’échange d’informations entre les mitochondries de l’ovocyte et le noyau de la cellule donneuse pourrait être plus efficace dans l’embryon intragénérique que dans l’embryon intergénérique16.
La quantité d’ADNmt dans un ovocyte bovin mature est environ 100 fois supérieure à la quantité trouvée dans une cellule somatique12. La réduction de ce ratio pourrait encourager les mitochondries des cellules somatiques à proliférer dans l’embryon reconstruit, ce qui permettrait à une plus grande population de mitochondries productives d’être présente16. Cela pourrait à son tour fournir plus d’énergie pour répondre aux besoins de l’embryonen développement 15. Les tentatives précédentes faites pour réduire le nombre de copies d’ADNmt de l’ovocyte ou de l’embryon comprennent l’application chimique, la micromanipulation et la supplémentation de l’ovocyte ou de l’embryon avec des mitochondries supplémentaires de l’espèce de cellule donneuse 16,17,18,19,20. Cependant, l’application chimique (comme la 2',3'-didéoxycytidine) n’est pas idéale pour le développement embryonnaire et a réduit le nombre de copies d’ADNmt ovocyte d’environ la moitiéde 18. La réduction antérieure de l’ADNmt ovocyte par micromanipulation n’a éliminé en moyenne que 64% de l’ADNmt17 de l’ovocyte. Bien que la supplémentation en mitochondries de cellules donneuses puisse être une option viable, son utilisation n’a pas encore produit d’animal intergénérique vivant dans les études iSCNT21.
L’utilisation de la bisection pour réduire le nombre de copies de l’ADNmt ovocyte n’a pas encore été utilisée dans les études publiées. La coupe en deux des ovocytes dans l’intention de fusionner les ooplastes avec une cellule somatique est la prémisse du clonage fait à la main (HMC), qui utilise généralement la bisection comme méthode pour éliminer le corps polaire et la plaque de métaphase de l’ovocyte de métaphase II (MII). HMC a produit avec succès une progéniture chez plusieurs espèces, y compris les chèvres, les bovins, les porcs, les moutons et les chevaux 22,23,24,25,26, mais n’inclut généralement pas d’étape de centrifugation avant la bisection. L’intégration de la centrifugation à grande vitesse de l’ovocyte permet l’isolement des mitochondries (et donc de l’ADNmt) à un pôle de l’ovocyte, qui peut ensuite être coupé en deux à l’aide d’une microlame pour éliminer ces fractions denses en mitochondries. Deux ooplastes appauvris en mitochondries peuvent ensuite être fusionnés avec une cellule somatique, comme c’est le cas dans le HMC, pour former un embryon reconstruit qui contient beaucoup moins d’ADNmt de l’espèce ovocytaire.
La question à laquelle nous tentons de répondre avec ce protocole est de savoir comment réduire l’ADNmt dans l’ovocyte bovin afin de produire un embryon reconstruit viable qui contient moins d’ADNmt hétéroplasmique. Dans ce protocole, les ovocytes ont été centrifugés et coupés en deux. Le nombre de copies d’ooplast et d’ADNmt ovocytaire intact a été calculé pour déterminer l’efficacité de cette technique dans la réduction du nombre de copies d’ADNmt de l’ovocyte bovin.
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Protocol
Le protocole suivant suit les directives en matière de soins aux animaux et d’éthique fournies par l’Université d’État de l’Utah.
1. Préparation des médias
- Avant la manipulation des ovocytes, préparer les solutions suivantes, comme décrit dans le tableau 1 : 400 μL de solution de hyaluronidase, 500 μL de milieu T2, 1 020 μL de milieu T20 et 800 μL de milieu T10.
- Divisez le milieu T10 en deux puits d’une plaque de quatre puits, 400 μL par puits. Étiquetez un puits avec « M » et le second puits avec « MR ». Placer dans un incubateur à 5% de CO2 jusqu’après la bisection.
- Préparer 500 μL de cytochalasine B (CB)/liquide oviductal synthétique avec HEPES (HSOF). Aliquote 50 μL de solution CB/HSOF dans un tube centrifuge séparé de 1,5 mL.
- Préparer 40 μL de solution de pronase. Centrifugeuse pendant au moins 30 s à 2 680 x g. Mélanger 20 μL du surnageant avec 20 μL de T2 dans un nouveau tube de centrifugeuse; cela forme une solution diluée de pronase à 5 mg/mL.
- Préparer 3 mL de HSOF. Sur une plaque de recherche, déposez séparément quatre gouttes de 400 μL; placez cette plaque sous un stéréomicroscope.
- Préparer 500 μL de solution de CB/T20.
2. Maturation in vitro (IVM) des ovocytes bovins
- IVM : Culture de complexes cumulus-ovocytes (COC) aspirés à 38,5 °C dans un incubateur à 5 % de CO2 pendant 21 h dans une boîte à quatre puits de milieux de maturation contenant 10 % de FBS, 0,26 UI/mL de FSH et 100 U/mL de pénicilline/streptomycine.
- Effectuez les étapes suivantes pour dénuder les ovocytes.
- Collectez le nombre souhaité de COC à l’aide d’une pipette de 200 μL et déposez-les au fond d’un tube centrifuge de 1,5 μL.
- Ajouter le même volume de 0,6 mg/mL de hyaluronidase dans le tube de centrifugeuse avec les ovocytes (c.-à-d. si le volume d’ovocytes et de milieux IVM est de 100 μL, ajouter 100 μL de hyaluronidase).
- Pipettez la solution de haut en bas sans créer de bulles, jusqu’à ce que toutes les cellules du cumulus aient été retirées.
- Vérifiez la maturation des ovocytes.
- Utilisez la pipette pour ajouter 200 μL de HSOF de l’une des quatre gouttes de HSOF sur la plaque de recherche à la solution d’ovocyte/hyaluronidase.
- Transférer les ovocytes de la goutte hyaluronidase/HSOF et les placer dans 400 μL inutilisés de goutte HSOF. Lavez-les avec deux gouttes HSOF supplémentaires pour aider à éliminer les restes de cellules hyaluronidase et cumulus.
- À l’aide d’une pipette buccale (ou d’une pipette et d’une pointe de 10 μL) et d’un grossissement microscopique élevé, roulez et sélectionnez les ovocytes en fonction de la présence du corps polaire.
- Après avoir trié les ovocytes, prélever le nombre souhaité d’ovocytes MII à couper en deux et les placer dans 400 μL de goutte de HSOF.
REMARQUE: Si les ovocytes sont à l’extérieur de l’incubateur depuis plus de 30 minutes, les ovocytes peuvent être replacés dans un puits de milieu de maturation et placés dans un incubateur contrôlé au CO2 pour se reposer pendant au moins 30 minutes. Limitez le nombre d’ovocytes à couper en deux à une quantité qui est possible pour terminer la coupe en deux en environ 30 minutes afin de minimiser le temps en dehors de l’incubation. Si les ooplastes doivent être fusionnés avec une cellule somatique, activés et cultivés sous forme d’embryons, les ovocytes doivent être énucléés à ce moment-là.
3. Centrifugation des ovocytes
REMARQUE: Si des ovocytes ont été placés dans l’incubateur dans un milieu de maturation, déplacez-les vers la goutte HSOF à partir de laquelle ils ont été collectés le plus récemment.
- À l’aide d’une pipette buccale, prélever les ovocytes matures sélectionnés dans la goutte de HSOF et les placer dans le tube de 1,5 mL contenant 50 μL de la solution de HSOF/CB. Centrifuger les ovocytes à 15 000 x g pendant 12 min.
REMARQUE: Il n’est pas préjudiciable que des bulles soient présentes dans le tube de centrifugeuse. - Pendant que les ovocytes sont en cours de centrifugation, préparez la plaque de bisection.
- Faites le motif comme indiqué à la figure 1 sur le couvercle d’une boîte de Pétri de 60 mm (20 μL par goutte) et couvrez complètement les gouttes avec de l’huile minérale.
- À l’aide d’un marqueur à pointe mince, marquez les lignes sous le plat, comme illustré à la figure 2.
- Dessinez une boîte autour de la goutte de pronase et une ligne entre les gouttes CB/T20 et la rangée inférieure des gouttes T20.
- Couvrir le plat avec un couvercle opaque jusqu’à ce que la centrifugation soit terminée pour éviter les changements d’osmolarité des microgouttes.
- Dès que la centrifugation est terminée, utilisez une pipette de 200 μL pour recueillir les ovocytes dans la solution et déplacez-les dans une partie vide d’une nouvelle plaque de recherche avec quatre gouttes HSOF de 400 μL.
- Recueillir et laver les ovocytes à travers les quatre gouttes HSOF.
Figure 1 : Plaque de bisection. Toutes les gouttes montrées ont un volume de 20 μL. La plaque a un diamètre de 60 mm. Les gouttes ont été complètement recouvertes d’huile minérale. Les ovocytes seront d’abord placés dans la goutte T2 la plus haute et la plus à gauche (indiquée ici avec une étoile). PRO/T2 : 10 μL de pronase et 10 μL de T2, combinés avant la création de microgouttes. CB/T20 : 1 μL de cytochalasine B pour 1 mL de T20, combiné avant la création de microgouttes. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Plaque de bisection marquée. Les lignes sont tracées avec un marqueur à pointe mince sur le fond de la plaque, afin de fournir des références de localisation pour les observations et les transferts d’ovocytes et d’ooplastes effectués sous le microscope. Les ovocytes seront d’abord placés dans la goutte T2 la plus haute et la plus à gauche (indiquée ici avec une étoile). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
4. Préparation de l’ovocyte pour la bisection
REMARQUE: Le processus suivant implique la préparation des ovocytes pour la bisection.
- Allumez l’étage de chauffage à 37 °C.
- Utilisez une pipette buccale pour déplacer les ovocytes centrifugés de la goutte HSOF vers la goutte T2 supérieure gauche de la plaque de bisection, puis lavez les ovocytes à travers les trois gouttes suivantes sur la rangée supérieure (T2, T20, T20).
- Déposez les ovocytes dans l’une des gouttes de pronase, en assurant qu’il y a peu ou pas de contact entre eux.
REMARQUE: L’élimination de la zone pellucide peut prendre des quantités variables de temps, mais se produit généralement entre 30-120 s avec l’utilisation d’un étage de chauffage. L’absence d’une étape de chauffage prolongera ce temps. - Observez les ovocytes jusqu’à ce qu’il y ait une déformation claire des zonae pellucidae (voir figure 3).
- Une fois qu’une seule zone ovocytaire pellucide s’est déformée, déplacez cet ovocyte vers la goutte T2 voisine. Répétez l’opération lorsque d’autres ovocytes se déforment, jusqu’à ce que tous les ovocytes aient été retirés de la pronase et placés dans la goutte de T2.
- Observez les ovocytes jusqu’à ce qu’il ne reste qu’une fine couche de la zone pellucide.
- Lavez les ovocytes à travers les trois gouttes suivantes dans la rangée (T2, T20, T20), puis déposez-les dans des lignes verticales dans les gouttes CB/T20 (voir la figure 4).
- Commencez avec moins d’ovocytes dans les lignes verticales et augmentez le nombre d’ovocytes par goutte à mesure que les compétences de bisection progressent.
Figure 3 : Ablation de la zone pellucide à l’aide de la pronase. (80x) Une zone pellucide ovocytaire commencera à apparaître déformée lorsque la pronase aura affecté la zone pellucide suffisamment pour que l’ovocyte soit déplacé vers la goutte T2 adjacente. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Orientation des ovocytes dans les gouttes de bisection. (80x) Les ovocytes sans zone sont déposés dans une orientation presque verticale dans chaque goutte CB/T20 avant la bisection. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
5. Bisection des ovocytes
- Concentrez-vous sur la première goutte CB/T20 (bisection) la plus à gauche qui contient des ovocytes et utilisez une pipette buccale pour faire pivoter les ovocytes, de sorte que la partie dense en mitochondries de chaque ovocyte soit tournée vers ou loin du bras du microscope.
REMARQUE: La partie dense en mitochondries ne contiendra pas de lipides, qui apparaissent comme la partie la plus sombre de l’ovocyte après la centrifugation. - Placez la pointe de la microlame à gauche de l’ovocyte supérieur, en ligne avec l’espace directement au-dessus de la partie dense en mitochondries. En gardant l’extrémité de la lame au même endroit, abaissez soigneusement la lame pour la couper tout au long de l’ovocyte.
- Assurez-vous que l’ooplast dense en mitochondries et l’ooplast réduit en mitochondries sont de taille similaire; la bisection doit couper chaque ovocyte en deux pour produire deux ooplastes.
REMARQUE: Les tailles comparatives des ooplastes produits à partir d’un seul ovocyte peuvent varier en fonction des objectifs de recherche; si les ooplastes réduits en mitochondries doivent être fusionnés avec une cellule somatique, leur volume doit être supérieur à celui des ooplastes denses en mitochondries. - Assurez-vous que la lame coupe l’ovocyte en deux au-dessus de la partie dense en mitochondries et en dessous de la partie dense en lipides, dans le segment le plus clair de l’ovocyte centrifugé.
- Assurez-vous que l’ooplast dense en mitochondries et l’ooplast réduit en mitochondries sont de taille similaire; la bisection doit couper chaque ovocyte en deux pour produire deux ooplastes.
- Lorsque vous soulevez la lame, assurez-vous que la même ligne est maintenue et que la pointe de la lame reste au même endroit, puis soulevez doucement la pointe de la plaque.
- Répétez les étapes de bisection pour tous les ovocytes dans la première goutte de bisection. Si des ovocytes sont présents dans des gouttes supplémentaires, orientez et coupez en deux les ovocytes restants.
- À l’aide d’une pipette buccale, recueillir les ooplastes réduits en mitochondries de la première goutte de bisection. Placez-les dans la goutte T20 de gauche située dans la rangée inférieure de la plaque. Répétez l’opération pour toutes les gouttes de bisection restantes.
REMARQUE: Les ooplastes réduits en mitochondries contiendront des lipides de couleur plus foncée que le reste de l’ovocyte. - À l’aide d’une pipette buccale, prélever les ooplastes denses en mitochondries de la première goutte de bisection. Placez-les dans la goutte T20 de droite située dans la rangée inférieure de la plaque. Répétez l’opération pour toutes les gouttes de bisection restantes.
REMARQUE: Les régions denses en mitochondries auront un conglomérat visible d’organites qui seront gris clair en apparence. - Récupérez la boîte à quatre puits T10 de l’incubateur. À l’aide d’une pipette buccale, déplacez tous les ooplastes réduits en mitochondries vers le bien étiqueté « MR » et déplacez les ooplastes denses en mitochondries vers le bien étiqueté « M ».
- Replacez la plaque à quatre puits dans l’incubateur contrôlé au CO2. Laisser les ooplastes reposer pendant au moins 30 minutes avant la quantification de l’ADNmt.
6. Quantification de l’ADNmt
- Utilisez un kit d’extraction d’ADN conçu pour extraire du matériel d’un petit échantillon afin d’extraire l’ADN d’échantillons individuels (ovocytes uniques, ooplastes simples denses en mitochondries, ooplastes uniques appauvris en mitochondries).
- Utilisez une méthode de quantification de l’ADN de votre choix pour vous assurer que l’ADN a été extrait avec succès de chaque échantillon. Si la réaction en chaîne quantitative par polymérase (qPCR) n’est pas terminée à ce moment-là, congeler l’ADN extrait dans un tube marqué dans un congélateur à -80 °C.
- Effectuer qPCR
- Reportez-vous au tableau 2 pour déterminer le volume de chaque réactif à ajouter à chaque tube qPCR, ainsi que les séquences d’amorce. Ces amorces sont conçues pour amplifier la région 12S de l’ADNmt bovin.
- Réglez le temps de dénaturation initial sur 10 min, suivi de 35 cycles de : 30 s de dénaturation à 94 °C, 15 s de recuit à 60 °C et 15 s d’extension à 72 °C. Lorsque la réaction est terminée, enregistrez les valeurs du seuil de cycle (Ct).
REMARQUE: Afin d’obtenir des valeurs relatives de nombre de copie d’ADNmt, une courbe standard doit être produite à l’aide d’échantillons avec des quantités connues de nombres de copies d’ADNmt, qui augmentent de manière exponentielle. Les valeurs seuils du cycle doivent ensuite être manipulées à l’aide des formules suivantes pour déterminer le nombre relatif de copies d’ADNmt. - Obtenez la concentration de l’ADN en utilisant l’équation ci-dessous:
Concentration d’ADN = (10(Ct-intercept/pente)) x volume testé - Obtenez le numéro de copie à l’aide de l’équation ci-dessous :
Numéro de copie =
- Obtenez le numéro de copie à l’aide de l’équation ci-dessous :
Nombre de copies par cellule = 2 x
Figure 5 : Courbe standard de l’ADNmt des cellules somatiques. Cette courbe standard a été créée grâce à la quantification par l’ADNmt des concentrations logarithmiques de cellules somatiques bovines à l’aide des réactifs et du programme qPCR décrits à l’étape 6.3 du protocole. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
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Representative Results
Les résultats quantitatifs de la PCR (qPCR) sont utilisés pour déterminer les quantités relatives d’ADNmt présentes dans chaque ooplaste. La réaction décrite est conçue pour amplifier la région 12S de l’ADNmt bovin.
Si la bisection a réussi, les échantillons d’ovocytes entiers et d’ooplastes denses en mitochondries auront des valeurs Ct similaires. Les échantillons d’ooplastes réduits aux mitochondries auront des valeurs de Ct plus élevées que les échantillons des deux autres groupes. Un graphique Ct montrant les résultats de bisection réussis est présenté ci-dessous. Ces résultats indiquent que la bisection a effectivement réduit la teneur en ADNmt dans les ooplastes réduits par les mitochondries (Figure 6).
Figure 6 : Résultats réussis de la qPCR de bisection. Le graphique comparant le nombre de cycles et la fluorescence affiche les valeurs seuils de cycle des ovocytes simples, des ooplastes réduits en mitochondries (représentés par des lignes violettes) et des ooplastes denses en mitochondries. Les valeurs Ct des ooplastes réduits aux mitochondries ont une moyenne de 29,931 (lignes violettes), tandis que la valeur Ct moyenne des ovocytes uniques est de 20,802 (lignes rouges et vertes), et la valeur Ct moyenne des ooplastes denses en mitochondries est de 21,389 (lignes bleues et dorées). L’augmentation des valeurs Ct des échantillons d’ooplast réduits par les mitochondries indique une diminution du nombre de copies d’ADNmt dans ces échantillons. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Un graphique Ct montrant les résultats de la bisection infructueuse est illustré à la figure 7. Ces résultats indiquent que la bisection n’a pas réduit efficacement la teneur en ADNmt dans les ooplastes réduits par les mitochondries :
Figure 7 : Résultats de la qPCR de bisection infructueuse. Le graphique linéaire comparant le nombre de cycles et la fluorescence affiche les valeurs seuils de cycle des ovocytes uniques (lignes vert foncé et vert clair), des ooplastes réduits en mitochondries (lignes violettes) et des ooplastes denses en mitochondries (lignes bleues et dorées), qui ont tous des valeurs Ct comprises entre 20,232 et 20,757. Cela indique l’absence d’un changement significatif dans le nombre de copies d’ADNmt dans les échantillons d’ooplast réduits aux mitochondries. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Suite à la production d’une courbe standard et à l’utilisation des formules de nombre de copies d’ADNmt fournies, une réduction moyenne de l’ADNmt ovocyte de 93,88 % a été obtenue à l’aide de ce protocole (Figure 8).
Figure 8 : Boxplot comparant le nombre relatif de copies d’ADN mitochondrial obtenues à partir d’ovocytes entiers, d’ooplastes réduits en mitochondries et d’ooplastes denses en mitochondries. Ovocytes entiers (n = 38), ooplastes réduits en mitochondries (n = 34) et ooplastes denses en mitochondries (n = 29). Les ooplastes réduits en mitochondries ont significativement moins de nombre de copies par rapport aux deux autres groupes (P < 0,001). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
| Solution | Total Volume | Solvant | Soluté |
| Hyaluronidase Solution | 400 μL | 1 mL M-199 | 0,6 mg de hyaluronidase |
| T2 Médias | 500 μL | M-199 | 2 % Sérum bovin fœtal (v/v) |
| T20 Médias | 1020 μL | M-199 | 20% Sérum fœtal bovin (v/v) |
| T10 Médias | 800 μL | 400 μL T2 | 400 μL T20 |
| CB/HSOF | 500 μL | 499,5 μL de fluide oviductal synthétique avec HEPES (HSOF) | 0,5 μL de 10 mg/mL de cytochalasine B (CB) |
| Pronase Solution | 40 μL | 1 mL M-199 | 10 mg de pronase |
| T20/CB | 500 μL | 499,5 μL T20 | 0,5 μL de 10 mg/mL CB |
Tableau 1 : Solutions requises. Fournit des volumes de solutés et de solvants pour chaque solution requise dans le protocole.
| Réactif | Volume |
| Mélange maître qPCR | 10 μL |
| Amorce avant | 0,6 μL |
| Amorce inversée | 0,6 μL |
| Échantillon d’ADN | 4,4 μL |
| Eau sans DNase | 4,4 μL |
| Total Volume | 20 μL |
| Introduction à l’avant GGGCTACATTCTCTACACCAAG | |
| Amorce inversée GTGCTTCATGGCCTAATTCAAC | |
Tableau 2 : Composition quantitative de la PCR. Fournit des séquences d’amorces avant et arrière et des volumes de tous les réactifs nécessaires pour chaque tube pcR quantitatif.
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Discussion
Les méthodes précédemment utilisées pour diminuer le nombre de copies d’ADNmt dans les ovocytes ont leurs inconvénients respectifs. L’élimination des mitochondries des ovocytes par micromanipulation diminue le nombre de copies d’ADNmt de 64 % en moyenne27. Une méthode unique, précédemment utilisée pour l’énucléation, implique l’utilisation de pipettes Pasteur de petit diamètre et la division d’un ovocyte sans zone pellucide à la frontière entre une microgoutte de milieu et l’huile minérale environnante. Parallèlement à l’utilisation de la centrifugation ovocytaire, cette approche pourrait produire des ooplastes viables réduits en mitochondries28. Cependant, la combinaison de la centrifugation et de cette méthode de division des ovocytes n’a pas encore été rapportée pour produire des embryons. Les méthodes chimiques de réduction des mitochondries (telles que l’exposition des ovocytes à la 2′,3′-didéoxycytidine (ddC), un inhibiteur de la synthèse de l’ADNmt) ont réduit le nombre de copies d’ADNmt des ovocytes jusqu’à 50% et nécessitent que les COC soient exposés au produit chimique pendant plus de 40 h pendant la maturation in vitro (IVM)16,27. Bien que l’incubation d’ovocytes porcins dans un milieu supplémenté en ddC pendant 40 h n’ait pas posé de problèmes pour les embryons reconstruits16, il n’existe pas encore de données publiées concernant l’exposition des ovocytes bovins au ddC au cours de leur MIV de 20 à 22 h ou de tout développement embryonnaire ultérieur. La méthode décrite dans cet article réduit le nombre relatif de copies d’ADNmt d’environ 93,88 %, passant d’une moyenne de 45 565 ± 37 169 copies (moyenne ± SD) à 8 396 ± 13 287.
Plusieurs étapes du protocole sont essentielles pour obtenir des résultats satisfaisants en termes de réduction efficace du nombre de copies de l’ADN mitochondrial (ADNmt) d’un ovocyte. La centrifugation des ovocytes à la vitesse optimisée (15 000 x g) et au temps (12 min) créera une fraction mitochondriale plus concentrée à un pôle de chaque ovocyte. Le volume correct de cytochalasine B/liquide oviductal synthétique avec une solution HEPES (CB/HSOF) (50 μL) éliminera probablement la lyse des ovocytes due à la centrifugation. Après centrifugation, la zone pellucide (ZP) est éliminée par exposition à une solution de pronase; l’élimination complète du ZP assurera une bisection plus précise et devrait également séparer les cellules de cumulus restantes des ovocytes. L’utilisation d’un étage chauffant sur le microscope lors du retrait du ZP est facultative, mais accélère l’élimination du ZP d’au moins 1 min. L’orientation des ovocytes sans pellucide (ZF) dans les gouttes de bisection est essentielle pour les couper en deux avec précision. La fraction mitochondriale, trouvée à un pôle de chaque ovocyte, doit être clairement visible et située en haut ou en bas de l’ovocyte avant la bisection. Le pôle opposé contiendra des gouttelettes lipidiques sombres. Après la bisection, la sélection et la classification correcte des ooplastes (comme mitochondries denses ou appauvries en mitochondries) sont cruciales pour obtenir une évaluation précise de la bisection. Il est également important de sélectionner les ovocytes de la métaphase II (MII) à couper en deux. S’assurer que les ovocytes utilisés sont sphériques et ont un cytoplasme homogène fera probablement une différence dans le nombre de copies d’ADNmt contenues dans chaque ovocyte et ooplaste. Lors de la conception et de la synthèse de réactions en chaîne quantitatives de polymérase (qPCR) individuelles, il est important de s’assurer que les amorces et les concentrations de réactifs correctes sont utilisées dans chaque réaction pour obtenir des résultats précis. Si une courbe standard est produite, elle doit être créée aussi précisément que possible et toutes les réactions doivent être effectuées en trois exemplaires pour obtenir une plus grande précision. Les temps et les températures de chaque phase de qPCR doivent rester les mêmes pour chaque exécution.
Certains problèmes peuvent survenir lors du respect du protocole. Lorsque vous ajoutez de l’huile à la plaque de bisection, assurez-vous que les gouttes sont juste couvertes; trop d’huile rendra l’utilisation de la pipette moins efficace, tandis qu’une trop faible quantité entraînera l’évaporation des gouttes. Cette évaporation provoquerait une modification de l’osmolarité des solutions, ce qui peut être nocif pour les ovocytes et les ooplastes. Si les ovocytes se lysent après la digestion du ZP, cela est probablement dû à l’un ou aux deux des éléments suivants, d’après l’expérience personnelle et l’observation: les ovocytes n’ont pas été centrifugés pendant le temps et la vitesse prescrits, et / ou les ovocytes ont été exposés à la pronase pendant trop longtemps. Certains ovocytes ZF peuvent ne pas retrouver une forme complètement sphérique dans les gouttes de bisection. Gardez à l’esprit que tous les ovocytes ZF ne pourront pas être positionnés de manière optimale pour la bisection. Dans ce cas, il existe trois options: donner aux ovocytes ZF plus de temps pour retrouver une forme sphérique; maintenir doucement les ovocytes dans une position plus droite avec la microlame avant la bisection; ne coupez pas en deux les ovocytes qui ne peuvent pas être positionnés correctement. Déterminer quels ooplastes sont denses en mitochondries ou appauvris en mitochondries après la bisection affectera les résultats de la quantification. Si la classification des ooplastes est difficile, positionnez les ovocytes qui seront coupés en deux de manière à ce que la fraction mitochondriale soit toujours pointée vers le haut ou le bas de la goutte, et/ou recherchez une partie sombre de l’ovocyte à l’un de ses pôles (ces gouttelettes lipidiques sont concentrées au pôle opposé de la fraction mitochondriale). Parfois, les ooplastes peuvent coller les uns aux autres et/ou à l’indentation faite par la microlame dans la plaque. Parfois, donner aux ooplasts plus de temps pour retrouver une forme sphérique aidera à la séparation. D’autres options incluent le tapotement doux de la plaque, l’aspiration douce dans et hors de la pipette et / ou l’utilisation du bord de la pipette pour séparer doucement les ooplasts.
Cette méthode de réduction du nombre de copies de l’ADNmt a ses limites; l’un est basé sur la source d’ovocytes, et l’autre est dû à l’élimination du ZP de l’ovocyte. La source d’ovocytes (l’animal lui-même, l’ovaire spécifique et le follicule spécifique) influencera grandement le nombre de copies d’ADNmt dans cet ovocyte spécifique. Il existe un grand écart-type autour du nombre moyen de copies d’ADNmt d’un seul ovocyte, indiquant à quel point le nombre de copies peut être variable. De nombreuses réactions de quantification d’ovocytes uniques sont nécessaires pour avoir un nombre de copies standard robuste d’un seul ovocyte qui sera comparé aux ooplastes et autres ovocytes. L’écart-type important rend également la comparaison de l’ooplaste à l’ovocyte moins absolue, car le nombre de copies de l’ooplaste ne peut pas être comparé à son ovocyte d’origine.
La digestion des pellucidae de la zone de l’ovocyte rend l’ovocyte ZF et les ooplastes résultants beaucoup plus fragiles qu’ils ne l’étaient avant l’ablation de leurs pellucidae de la zone. Cette fragilité conduit à des taux de lyse plus élevés des ooplastes et des ovocytes ZF eux-mêmes, en particulier avec l’utilisation d’une microlame - une grande quantité de soin et de précision doit être utilisée. Si les ooplasts sont utilisés pour la fusion, ils nécessitent un repos après bisection avant de pouvoir tenter la fusion. Sinon, beaucoup d’ooplasts vont probablement se lyser. Les ooplastes appauvris en mitochondries ont tendance à être plus délicats que leurs homologues denses en mitochondries. Les microtubules de l’ovocyte ont tendance à migrer avec les mitochondries vers le même pôle de l’ovocyte pendant la centrifugation, ce qui laisse les ooplastes appauvris en mitochondries avec moins de composants structurels29. Des recherches et des colorations supplémentaires sont nécessaires pour déterminer si d’autres organites ovocytaires sont affectés négativement par la combinaison de centrifugation et de bisection utilisée pour produire des ooplastes dans ce protocole.
La réduction des mitochondries ovocytaires réduirait les mitochondries de l’espèce ocytaire dans un embryon iSCNT résultant, diminuant ainsi l’incidence de l’hétéroplasmie des mitochondries dans cet embryon reconstruit. Les chances de développement de l’embryon augmenteraient comparativement, mais nécessiteraient probablement une supplémentation en mitochondries de l’espèce de cellule donneuse pour répondre aux besoins énergétiques pendant le développement. Jusqu’à présent, les tentatives d’iSCNT qui ont utilisé des croisements intergénériques n’ont pas produit de progéniture vivante. La diminution de l’hétéroplasmie chez les embryons d’iSCNT peut augmenter la probabilité de grossesses réussies. iSCNT est une méthode qui pourrait aider à sauver certaines des 40 000 espèces classées commemenacées 30. Étant donné que les cellules somatiques de ces espèces sont généralement plus accessibles que leurs cellules germinales, iSCNT peut utiliser ces cellules somatiques, ainsi que des ovocytes d’espèces domestiques. Les tentatives intragénériques ont réussi à produire des animaux vivants 31,32,33, bien que la progéniture soit généralement chimérique pour l’ADNmt, et trouver une source d’ovocytes intragénériques n’est pas toujours possible. La bisection d’ovocytes dans le but de réduire le nombre de copies d’ADNmt, suivie de la fusion de ces ooplastes avec une cellule somatique interspécifique, réduirait le chimérisme et l’hétéroplasmie dans les embryons d’iSCNT. En raison de ces réductions, l’utilisation de la méthode décrite permet un plus grand potentiel de naissances vivantes intergénériques et la poursuite d’espèces en voie de disparition.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Les auteurs souhaitent remercier leurs collègues de l’Université d’État de l’Utah, les chercheurs en sciences de la reproduction du zoo de San Diego et le Dr Rebecca Krisher du genre PLC.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL centrifuge tubes | Fisher Scientific | 5408129 | |
| 60 mm dish | Sigma-Aldrich | D8054 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424 | |
| Cytochalasin B | Sigma-Aldrich | C6762 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F2442 | |
| M199 Media | Sigma-Aldrich | M4530 | |
| Mineral Oil | Sigma-Aldrich | M8410 | |
| Mini Centrifuge | SCILOGEX | D1008 | |
| mtDNA Primer: Forward (12S) | GGGCTACATTCTCTACACCAAG | ||
| mtDNA Primer: Reverse (12S) | GTGCTTCATGGCCTAATTCAAC | ||
| NanoDrop Spectrophotometer | Thermo Scientific | ND2000 | |
| Opthalmic Scalpel with Aluminum Handle | PFM Medical | 207300633 | Microblade for bisection |
| Protease/pronase | Sigma-Aldrich | P5147 | |
| QIAamp DNA Micro Kit | Qiagen | 56304 | |
| QuantStudio™ 3 - 96-Well 0.2-mL | ThermoFisher | A28567 | |
| Search plate | Fisher Scientific | FB0875711A | |
| SYBR Green qPCR Master Mix | ThermoFisher | K0221 | qPCR master mix |
| Synthetic Oviductal Fluid with HEPES (HSOF) | |||
| ThermoPlate | Tokai Hit | TPi-SMZSSX | Heating stage |
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