Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Behavior
Click here for the English version

Behavior

Крупномасштабный гравитационный анализ личинок Caenorhabditis Dauer

Published: May 31, 2022 doi: 10.3791/64062
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Molecular Cellular and Developmental Biology, University of California

Summary

В настоящем протоколе изложены методы проведения крупномасштабного гравитаксисового анализа с личинками Caenorhabditis dauer. Этот протокол позволяет лучше обнаруживать поведение гравитаксиса по сравнению с анализом на основе пластин.

Abstract

Ощущение гравитации является важным и относительно недостаточно изученным процессом. Ощущение гравитации позволяет животным ориентироваться в окружающей среде и облегчает движение. Кроме того, гравитационное ощущение, которое возникает во внутреннем ухе млекопитающих, тесно связано со слухом - таким образом, понимание этого процесса имеет значение для слуховых и вестибулярных исследований. Гравитаксисовые анализы существуют для некоторых модельных организмов, включая дрозофилу. Одиночные черви ранее были проанализированы на предмет их предпочтения ориентации, когда они оседают в растворе. Тем не менее, надежный и надежный анализ для Caenorhabditis gravitaxis не был описан. Настоящий протокол описывает процедуру выполнения гравитаксис-анализов, которые могут быть использованы для тестирования сотен caenorhabditis dauers одновременно. Этот крупномасштабный, дальний анализ позволяет собирать подробные данные, выявляя фенотипы, которые могут быть пропущены в стандартном анализе на основе пластин. Движение Dauer вдоль вертикальной оси сравнивается с горизонтальными элементами управления, чтобы гарантировать, что направленное смещение обусловлено гравитацией. Затем гравитактическое предпочтение можно сравнить между штаммами или экспериментальными условиями. Этот метод может определить молекулярные, клеточные и экологические требования к гравитакси у червей.

Introduction

Ощущение гравитационного притяжения Земли имеет решающее значение для ориентации, движения, координации и равновесия многих организмов. Однако молекулярные механизмы и нейросхема гравитационного ощущения плохо изучены по сравнению с другими органами чувств. У животных гравитационное ощущение взаимодействует и может быть вытеснено другими стимулами для влияния на поведение. Визуальные сигналы, проприоцептивная обратная связь и вестибулярная информация могут быть интегрированы для создания чувства осознания тела относительно окружения животного 1,2. И наоборот, гравитактическое предпочтение может быть изменено при наличии других раздражителей 3,4,5. Таким образом, гравитактическое поведение идеально подходит для изучения гравитационного ощущения и понимания сложной сенсорной интеграции нервной системы и принятия решений.

C. elegans является особенно полезным модельным организмом для изучения гравитаксиса из-за его полифенического жизненного цикла. При воздействии стрессоров во время развития, включая тепло, перенаселенность или недостаток пищи, личинки C. elegans развиваются в дауэров, которые очень устойчивы к стрессу6. Как дауэры, черви выполняют характерное поведение, такое как придирка, при которой черви «стоят» на хвостах и машут головой, что может способствовать расселению в лучшие места обитания7. Анализы Гравитаксиса C. elegans и C. japonica позволяют предположить, что личинки дауэра отрицательно гравитакс, и что такое поведение легче наблюдается у дауэров, чем у взрослых 8,9. Тестирование гравитаксиса в других штаммах Caenorhabditis может выявить естественные изменения в гравитактическом поведении.

Механизмы гравитационного ощущения были охарактеризованы у Euglena, Drosophila, Ciona и различных других видов с использованием анализов гравитаксиса 3,10,11. Между тем, исследования гравитаксиса при caenorhabditis первоначально дали смешанные результаты. Исследование ориентационного предпочтения C. elegans показало, что черви ориентируются с опущенной головой в растворе, предполагая положительное гравитактическое предпочтение12. Между тем, хотя C. japonica dauers были идентифицированы на ранней стадии как отрицательно гравитактические8, это поведение только недавно было описано в C. elegans9. Несколько проблем возникает при разработке репрезентативного анализа гравитаксиса у червей. Штаммы Caenorhabditis сохраняются на агаровых пластинах; по этой причине поведенческие анализы обычно используют агаровые пластины как часть их экспериментального дизайна 13,14,15. Самый ранний зарегистрированный анализ гравитаксиса в Caenorhabditis был выполнен путем стояния пластины на боку под углом 90° к горизонтальной управляющей пластине8. Однако поведение гравитаксиса не всегда устойчиво в этих условиях. В то время как взрослые черви могут быть проанализированы на предмет ориентационного предпочтения в решении12, это направленное предпочтение также может зависеть от контекста, что приводит к различному поведению, если черви ползают, а не плавают. Кроме того, C. elegans чувствителен к другим раздражителям, включая свет и электромагнитные поля16,17, которые мешают их реакциям на гравитацию9. Поэтому обновленный анализ гравитаксиса, который защищает от других переменных окружающей среды, важен для анализа механизмов этого сенсорного процесса.

В настоящем протоколе описан анализ для наблюдения Caenorhabditis gravitaxis. Установка для этого исследования частично основана на методе, разработанном для изучения нервно-мышечной целостности18,19. Личинки Dauer культивируют и изолируют с помощью стандартных процедур20. Затем они вводятся в камеры, изготовленные из двух серологических пипеток по 5 мл, наполненных агаром. Эти камеры могут быть ориентированы вертикально или горизонтально и помещены в темную клетку Фарадея на 12-24 часа для защиты от света и электромагнитных полей. Местоположение каждого червя в камерах регистрируется и сравнивается с вертикальными такси эталонного штамма, такого как C. elegans N2.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Штаммами, используемыми в настоящем исследовании, являются C. elegans (N2) и C. briggsae (AF16) (см. Таблицу материалов). Для каждого анализа использовалась разнополая популяция дауэров.

1. Подготовка камеры

  1. Работайте в вытяжном шкафу. Настройте рабочее пространство с горелкой Бунзена, 1-2 бритвенными лезвиями, плоскогубцами, пинцетом и пластиковой режущей поверхностью (см. Таблицу материалов).
  2. Для каждой камеры соберите две серологические пипетки по 5 мл. Снимите ватную пробку с одной пипетки пинцетом. Держите лезвие бритвы над горелкой Бунзена до нагревания плоскогубцами. Используйте нагретое лезвие, чтобы отрезать конический конец второй пипетки так, чтобы вся пипетка имела равномерный диаметр (рисунок 1A).
  3. Работая быстро, поднесите два модифицированных конца пипетки близко к пламени, слегка расплавив их. Соедините эти концы, плотно прижав их друг к другу, гарантируя, что стенки обеих пипеток непрерывны. Если после соединения видны какие-либо зазоры, разбейте их на части и повторите этот шаг (рисунок 1A,B).

2. Заполнение камер агаром

  1. Готовят NGM с 4% агаром в соответствии со стандартными глистными процедурами21. Пока агар еще расплавлен, заполните каждую камеру, прикрепив ее к серологическому пипетру и медленно вытягивая раствор. Запечатайте наконечник парафиновой пленкой перед извлечением камеры из пипетки. Уложите камеру плоско (параллельно столешнице) для охлаждения.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Покрытие колбы пищевой пленкой (см. Таблицу материалов) после автоклавирования помогает предотвратить образование пузырьков в растворе18.
    1. Чтобы свести к минимуму любые изменения консистенции агара из-за неравномерного охлаждения, держите пипетку (см. Таблицу материалов) параллельно столешнице при составлении агара. Положите камеры плашмя на столешницу и дайте агару затвердеть перед перемещением.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Процент агара и медиаконтент могут быть адаптированы к эксперименту. 4% агар жестче, чем примерно 2% концентрация, используемая для заливки тарелок, и предотвращает проникновение червей через среду в наших руках. Тем не менее, другие экспериментаторы наблюдали роющее поведение взрослых червей в до 9% агара18,19.
  2. После охлаждения нагрейте 3-миллиметровый шестигранный ключ (или другой металлический инструмент того же размера, см. Таблица материалов) над горелкой Бунзена. Плотно вдавите его в стенку каждой камеры примерно на 5 мм в одну сторону от средней линии, создав небольшое отверстие в пластике (рисунок 1С). Используйте нагретое лезвие, чтобы удалить хлопчатобумажные и конические концы камеры и запечатать эти концы парафиновой пленкой.
    ПРИМЕЧАНИЕ: После приготовления каждая камера должна использоваться в течение 1 дня или храниться при температуре 4 °C в течение нескольких дней. Закройте все открытые отверстия парафиновой пленкой, чтобы предотвратить высыхание агара.

3. Выделение личинок дауэра

  1. За 10-15 дней до эксперимента разложите каждый штамм на 2-3 больших пластины NGM с бактериями OP50 и оберните парафиновой пленкой. Через 10-15 дней каждая пластина должна быть полностью голодна с тысячами личинок дауэра, присутствующих на агаре, стенках и крышках.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Сделайте тарелки заранее, используя толстый рецепт OP50 для максимальной скученности (см. Таблицу материалов). Образование Дауэра также может быть индуцировано с помощью других методов, включая добавление феромонов или путем выращивания при более высоких температурах22.
  2. Собирайте червей, промыв крышки и пластины буфером M9 и пипеткой раствора в трубки центрифуги объемом 15 мл. Вращайте при 1 600 х г в течение 30-60 с при комнатной температуре и аспирируйте большую часть буфера M9 пипеткой или вакуумным аспиратором.
  3. Изолируйте дауэры, обрабатывая 1% SDS с последующим 30% градиентом флотации сахарозы в соответствии с ранее опубликованным отчетом20.
    1. Добавьте 7 мл 1% раствора SDS к каждой грануле червя. Оставьте червей в SDS на 30 мин; Непрерывно вращайте трубки в течение этого времени, чтобы обеспечить аэрацию. Смойте 3-5x с M9, чтобы удалить моющее средство.
    2. Далее добавляют 5 мл М9 с последующим 5 мл холодного, фильтрованного 60% раствора сахарозы. Тщательно перемешайте, а затем центрифугируйте при 1 600 х г в течение 5 мин при комнатной температуре, чтобы создать градиент разделения.
  4. Заполните новые 15 мл центрифужных трубок буфером M9 по 2 мл. Раздавите концы стеклянных пипеток Пастера, чтобы расширить отверстие, и используйте эти пипетки для переноса верхнего слоя раствора (содержащего изолированные дауэры) из градиента сахарозы в новые трубки. Промойте дауэры 3-5x с помощью M9.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В этот момент в растворе будут находиться тысячи изолированных дауэров. Они могут быть использованы немедленно или поддерживаться аэрированными путем вращения в 5-7 мл M9 в течение ночи.

4. Добавление дауэров в камеру

  1. Центрифуги дают при 1 600 х г в течение 5 мин при комнатной температуре и аспирируют большую часть раствора М9 пипеткой или вакуумным аспиратором. Чтобы оценить плотность червей, вручную подсчитайте количество червей в трех отдельных каплях по 1 мкл под рассекающим микроскопом. Используйте среднее значение этих подсчетов, чтобы приблизить количество червей на мкл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Некоторые пипетки небольшого объема могут быть не в состоянии достичь дна 15-литровой центрифужной трубки; в этом случае концентрированную каплю червей можно перенести сначала на кусок парафиновой пленки.
  2. Вырежьте конец наконечника пипетки объемом 10, 20 или 200 мкл, чтобы расширить отверстие. Установите микропипетку на немного больший объем, чем предполагаемый объем аспирации. Аспирировать приблизительно 1-2 мкл концентрированного раствора червя (в идеале между 100-300 червями) и дать небольшому количеству воздуха войти в кончик.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Большое количество червей (1000+) в одной камере может увеличить диапазон пройденных расстояний из-за переполненности9.
  3. Осторожно вдавите наконечник пипетки в агар, одновременно нажимая на микропипетку. Это позволит создать место инъекции в агаре, не забивая наконечник. Отпустите червей в агар. Используйте парафиновую пленку, чтобы запечатать отверстие.

5. Бег и подсчет очков

ПРИМЕЧАНИЕ: Гравитаксис может быть протестирован в различных условиях, которые могут повлиять на поведение9.

  1. Чтобы устранить как можно больше переменных, поместите камеры в темную клетку Фарадея (см. Таблицу материалов) при комнатной температуре.
  2. Пометьте каждую камеру и повесьте ее вертикально в клетку Фарадея (выполните это с помощью этикетировочной ленты). Одновременное тестирование горизонтальных органов управления путем укладки некоторых камер в одинаковых условиях окружающей среды. Протестируйте экспериментальные штаммы против вертикально ориентированных червей N2 в качестве положительного контроля. Используйте горизонтально ориентированные камеры, содержащие N2 dauers, в качестве дополнительного отрицательного контроля.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Горизонтальные и вертикальные анализы должны выполняться в одной и той же обстановке в лаборатории, чтобы свести к минимуму изменчивость окружающей среды между двумя условиями. Большой инкубатор может быть использован для размещения обеих клеток Фарадея.
  3. Дауэры начинают рассеиваться от стартовой площадки через несколько часов и им требуется несколько часов, чтобы достичь обоих концов камеры. Оставьте камеры нетронутыми в течение этого времени и наберите в течение 12-24 ч после инъекции.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не используйте паралитический (например, азид натрия) для обездвиживания червей, которые достигли концов камер. Поскольку общее распределение червей измеряется вместо индекса предпочтений (как в анализе с двумя вариантами выбора), азид натрия не нужен и может изменить результаты.
  4. Снимайте и забивайте камеры гравитаксиса по одной. Ищите живых дауэров под рассекающим микроскопом и отмечайте их местоположение чернилами (рисунок 1C,D). Не забивайте червей в пределах 2,5 см по обе стороны от места инъекции, так как эти черви вряд ли продемонстрируют направленное предпочтение.
    1. Кроме того, избегайте забивания червей, которые кажутся мертвыми или попадают в ловушку в жидкости. Выбросьте любые камеры, содержащие >50% мертвых или плавающих червей.
      ПРИМЕЧАНИЕ: После того, как камера была удалена из испытательной зоны, она должна быть быстро оценена на точность. Дауэры должны быть видны только между поверхностью агара и стенкой пипетки. Если наблюдается закапывающее поведение, рассмотрите возможность увеличения концентрации агара в будущих анализах.
  5. Чтобы количественно оценить результаты, используйте маркер, чтобы разделить каждую половину камеры на семь секций по 3,5 см, начиная с расстояния 2,5 см от места инъекции (на некоторых пипетках объем 3,5 см = 1 мл). Используйте ручной счетчик (см. Таблицу материалов), чтобы подсчитать количество червей, наблюдаемых в каждом разделе.
    ПРИМЕЧАНИЕ: На каждой стороне начала координат должно быть семь секций, которые могут быть пронумерованы от -7 (снизу) до +7 (сверху). Эти числа должны соответствовать одному и тому же относительному расположению в зависимости от того, как были построены камеры; агар рисуется от конца -7 до конца +7 на шаге 2.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Сравнение гравитаксиса между видами
Следуя процедуре, описанной выше, C. briggsae dauer gravitaxis можно сравнить с C. elegans gravitaxis и горизонтальными регуляторами. Вертикальное распределение (бордовый) C. briggsae dauers наклонено к вершинам камер, при этом большой процент червей достигает +7 (рисунок 2A). В отличие от горизонтальных элементов управления (aqua), в которых дауэры распределены по примерно колоколообразной кривой вокруг центра камер, эта тенденция указывает на отрицательное гравитактическое поведение. Эти данные можно сравнить с гравитаксисом C. elegans , выполненным в те же экспериментальные дни (рисунок 2В).

Тест Крускала-Уоллиса, за которым последовал тест Данна с поправкой Бонферрони для многократных сравнений, определил любые существенные различия между анализами 9,23. В этом эксперименте 1 108 C. briggsae dauers были оценены в трех вертикальных камерах за два независимых экспериментальных дня. Эти черви мигрировали значительно выше, чем горизонтальные контрольные группы (p < 0,001; 1 639 дауэров в трех горизонтальных камерах в течение 2 экспериментальных дней). Более того, вертикальные распределения C. briggsae и вертикальные C. elegans не различались (p > 0,05; 386 C. elegans dauers в двух вертикальных камерах в течение 2 экспериментальных дней). Эти результаты свидетельствуют о том, что C. briggsae dauers демонстрируют отрицательное поведение гравитаксиса, аналогичное поведению C. elegans dauers.

Figure 1
Рисунок 1: Установка камеры для анализа Gravitaxis. Фотографии, на которых изображены этапы подготовки камеры гравитаксиса. (A) Отдельные пипетки по 5 мл были подготовлены для объединения в одну камеру. Снятие хлопчатобумажной пробки обозначено черным наконечником стрелы; снятие наконечника обозначено белым наконечником стрелки. Трубы, используемые в этом исследовании, имеют внутренний диаметр 6 мм и имеют длину 34,5 см (до резки). (B) Заполненная камера до добавления агара NGM. Пипетки были сплавлены при первом плавлении на горелке Бунзена. (C) Примеры камер, заполненных агаром NGM. Место инъекции обозначено стрелкой и увеличено во вставке. Черви были отмечены чернилами, и линии нарисованы, чтобы различать расстояния вместе с камерой, а также для облегчения подсчета очков. (D) Вид камер во всей их полноте (взятый после подсчета очков). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2: Гравитаксис в C. briggsae vs. C. elegans. Результаты гравитаксиса у C. briggsae и C. elegans. (A) Гистограмма C. briggsae gravitaxis. Движение в вертикальных камерах (бордовый) сравнивается с горизонтальными органами управления (аква). Расстояние от точки впрыска (-7 является самым дальним ниже, +7 дальше всего выше) строится как процент от общего количества проанализированных червей (ось X). Данные о происхождении (+0) не отображаются, так как черви не учитываются в пределах 2,5 см по обе стороны от места инъекции. N = 1 639 червей по трем трубам в горизонтальном состоянии; вертикальный N = 1 108 червей в трех трубах. (B) Boxplots, сравнивающие распределение горизонтальных и вертикальных червей C. briggsae с вертикальными червями C. elegans . Размеры выборки C. briggsae приведены выше. C. elegans вертикальный N = 386 червей в двух трубах. Средства обозначены белыми бриллиантами; вертикальные условия окрашены в бордовый цвет и обозначены буквой «V», а горизонтальные условия («H») — в аква. Сравнения были сделаны с использованием теста Крускала-Уоллиса, за которым последовал тест Данна с поправкой Бонферрони для нескольких сравнений. Нет звезд = p > 0,05, **** = p < 0,0001. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Сравнение с предыдущими методами
В отличие от хемотаксиса, гравитаксис при кенорхабдите не может быть надежно обнаружен с использованием традиционной экспериментальной конструкции агаровой пластины. Стандартная чашка Петри имеет диаметр 150 мм, в результате чего только 75 мм доступны в любом направлении для dauers, чтобы продемонстрировать предпочтения гравитаксиса. Хотя ориентационные предпочтения C. elegans могут быть проанализированы в растворе12, этот метод имеет низкую пропускную способность, поскольку черви должны анализироваться по одному. Кроме того, гравитактические предпочтения и поведение могут отличаться между червями, плавающими в среде, и ползающими по поверхности. По этим причинам мы разработали высокопроизводительный анализ с повышенной чувствительностью, который можно использовать для анализа поведения гравитаксиса у ползающих или лазающих червей. Поскольку C. elegans чувствительны к свету и электромагнитным полям, которые влияют на гравитактическое предпочтение9, эти анализы должны выполняться без какого-либо стимула. Если используется самодельная клетка Фарадея, проверка прочности клетки и ее укрепление необходимы и рекомендуются.

Пробирные камеры, описанные в этом протоколе, имеют длину около 54 см и помещены в клетки Фарадея для защиты от света и электромагнитных полей. Установлено, что смена «арены» для наблюдения за поведением гравитаксиса имеет ряд преимуществ. Во-первых, он позволяет проводить детальную количественную оценку и описательный анализ. Относительные пройденные расстояния и общее распределение червей можно собирать и сравнивать, а не подсчитывать количество отрицательно или положительно гравитактических червей. Во-вторых, замкнутая среда наполненной агаром пипетки более точно повторяет условия, которые могут способствовать гравитации в дикой природе. Как указано выше, стадия дауэра является фазой рассеивания, которая позволяет вырваться из неблагоприятных условий6. Поскольку Caenorhabditis живут в компосте, где направляющие сигналы, такие как свет, могут быть недоступны, гравитация может позволить червям перемещаться на поверхность 6,9. Двумерные пластинчатые анализы вряд ли воспроизведут эти условия, даже если они протестированы без других стимулов. Наконец, этот более крупный аппарат тестирует большее количество червей в одном анализе.

Ограничения и другие соображения
Хотя этот протокол эффективно измеряет гравитактическое предпочтение в большом количестве дауэров, он непрактичен для небольших или одиночных экспериментов с червями из-за времени и материалов, необходимых для строительства каждой камеры. Комбинируя подсчеты в испытаниях, а не используя индекс гравитаксиса, статистическая мощность увеличивается, потому что каждый червь рассматривается как независимое событие. Хотя эта повышенная чувствительность полезна для дифференциации гравитактических и негравитактических червей, важно отметить, что C. elegans dauers демонстрируют социальное поведение 7,24, которое может повлиять на общую гравитацию. Мы обнаружили, что более высокая плотность червей коррелирует с большим диапазоном расстояния, пройденного по крупномасштабному анализу, хотя этот эффект минимален, когда общее количество составляет менее примерно 1000 червей9. Эффекты взаимодействия, возникающие в результате таких факторов, как общее количество червей в каждой камере, должны контролироваться при анализе данных. Как и во всех поведенческих анализах, оценка должна быть ослеплена, когда это возможно.

Нахождение средней плотности червей в растворе может свести к минимуму изменчивость количества червей, вводимых из камеры в камеру. Черви быстро оседают в растворе, поэтому важно смешивать червей перед пипеткой, либо щелкая трубками, либо пипеткой вверх и вниз с помощью широкого наконечника. Даже когда достигается постоянная плотность, количество добавляемых червей может варьироваться, потому что черви, вероятно, будут прилипать к внутренней поверхности пластиковых наконечников пипеток. Покрытие наконечников пипеток BSA или другими растворами может свести к минимуму этот эффект. Глистам необходимо вводить как можно меньше раствора; если в камеру добавить слишком много жидкости, черви попадут в ловушку в растворе и могут даже дрейфовать. По этой причине могут быть забиты только живые, ползающие черви, и любая камера, содержащая более 50% мертвых или плавающих червей, не должна использоваться. Камеры должны быть удалены из клетки Фарадея по одному и забиты в течение 10-15 минут для наибольшей точности.

Потенциальные области применения
Этот анализ может быть использован для проверки экологических, генетических и клеточных требований к гравитаксису у различных штаммов Caenorhabditis. До сих пор световые и электромагнитные поля были идентифицированы как стимулы, которые мешают гравитаксису9. Однако C. elegans чувствителен к другим раздражителям, включая температуру, летучие и нелетучие химические вещества, текстуру, влажность и звук, которые влияют на их поведение 25,26,27,28. Понимание того, как различные сенсорные входы интегрируются в нервную систему, является нерешенным вопросом в нейробиологии, особенно когда интеграция происходит на уровне отдельных нейронов 9,29,30,31,32. Сенсорная интеграция особенно важна в проприоцепции, которая сама по себе является интегративной модальностью, которая опирается на несколько сенсорных сигналов1.

Понимание ощущения гравитации при канорхабдите имеет последствия для здоровья человека. Миллионы людей страдают от вестибулярной дисфункции только в Соединенных Штатах33, и многие из этих расстройств имеют основные генетические причины34,35. По этой причине идентификация генных кандидатов и таргетной терапии является активной областью исследований36. Кроме того, поскольку вестибулярная и слуховая системы позвоночных тесно связаны в развитии и эволюционно 33,36,37, выяснение гравитационного ощущения также может дать представление о слухе и нарушениях слуха.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих интересов.

Acknowledgments

Это исследование было поддержано исследовательскими грантами от Национальных институтов здравоохранения для JHR (#R01 5R01HD081266 и #R01GM141493). Некоторые штаммы были предоставлены CGC, который финансируется Управлением исследовательских инфраструктурных программ NIH (P40 OD010440). Мы хотели бы поблагодарить Прадипа Джоши (UCSB) за его редакционный вклад. Статистические консультации, предоставляемые UCSB DATALAB.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1% Sodium Dodecyl Sulfate solution From stock 10% (w/v) SDS in DI water
15 mL Centrifuge tubes Falcon 14-959-53A
3 mm Hex key Other similar sized metal tools may be used
4% Agar in Normal Growth Medium (NGM) - 1 L Prior to autoclaving: 3 g NaCl, 40 g Agar, 2.5 g Peptone, 2 g Dextrose, 10 mL Uracil (2 mg/mL), 500 μL Cholesterol (10 mg/mL), 1 mL CaCl2, 962 mL DI water; After autoclaving: 24.5 mL Phosphate Buffer, 1 mL 1 MgSO4 (1 M), 1 mL Streptomycin (200 mg/mL)
5 mL Serological pipettes Fisherbrand S68228C Polystyrene, not borosilicate glass
60% Cold sucrose solution 60% sucrose (w/v) in DI water; sterilize by filtration (0.45 μm filter). Keep at 4 °C
AF16 C. briggsae or other experimental strain Available from the CGC (Caenorhabditis Genetics Center)
Bunsen burner
Cling-wrap Fisherbrand 22-305654
Clinical centrifuge
Disposable razor blades Fisherbrand 12-640
Faraday cage Can be constructed using cardboard and aluminum foil; 30" L x 6" W x 26" H or larger
Ink markers Sharpie or other brand for marking on plastic
Labeling tape Carolina 215620
M9 buffer 22 mM KH2PO4, 42 mM Na2HPO4, 86 mM NaCl
N2 C. elegans strain Available from the CGC (Caenorhabditis Genetics Center)
NGM plates with OP50 1.7% (w/v) agar in NGM (see description: 4% agar in NGM). Seed with OP50
Paraffin film Bemis 13-374-10
Plastic cutting board
Pliers
Rotating vertical mixer BTLab SYSTEMS BT913 With 22 x 15 mL tube bar
Serological pipettor Corning 357469
Stereo Microscope Laxco S2103LS100
Tally counter ULINE H-7350
Thick NGM/agar plate media - 1 L See 4% Agar in NGM recipe; replace 40 g Agar with 20 g Agar
Tweezers

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Peterka, R. J. Sensory integration for human balance control. Handbook of Clinical Neurology. 159, 27-42 (2018).
  2. Lacquaniti, F., et al. Multisensory Integration and Internal Models for Sensing Gravity Effects in Primates. BioMed Research International. 2014, 61584 (2014).
  3. Bostwick, M., et al. Antagonistic inhibitory circuits integrate visual and gravitactic behaviors. Current Biology. 30 (4), 600-609 (2020).
  4. Ntefidou, M., Richter, P., Streb, C., Lebert, M., Hader, D. -P. High light exposure leads to a sign change in gravitaxis of the flagellate Euglena gracilis. Journal of Gravitational Physiology. 9 (1), 277-278 (2002).
  5. Fedele, G., Green, E. W., Rosato, E., Kyriacou, C. P. An electromagnetic field disrupts negative geotaxis in Drosophila via a CRY-dependent pathway. Nature Communications. 5, 4391 (2014).
  6. Frézal, L., Félix, M. -A. C. elegans outside the Petri dish. eLife. 4, 05849 (2015).
  7. Lee, H., et al. a dispersal behavior of the nematode Caenorhabditis elegans, is regulated by IL2 neurons. Nature Neuroscience. 15 (1), 107-112 (2012).
  8. Okumura, E., Tanaka, R., Yoshiga, T. Negative gravitactic behavior of Caenorhabditis japonica dauer larvae. The Journal of Experimental Biology. 216, 1470-1474 (2013).
  9. Ackley, C., et al. Parallel mechanosensory systems are required for negative gravitaxis in C. elegans. bioRxiv. , (2022).
  10. Häder, D. -P., Hemmersbach, R. Gravitaxis in Euglena. Euglena: Biochemistry, Cell and Molecular Biology. Schwartzbach, S. D., Shigeoka, S. , Springer International Publishing. 237-266 (2017).
  11. Sun, Y., et al. TRPA channels distinguish gravity sensing from hearing in Johnston's organ. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (32), 13606-13611 (2009).
  12. Chen, W. -L., Ko, H., Chuang, H. -S., Raizen, D. M., Bau, H. H. Caenorhabditis elegans exhibits positive gravitaxis. BMC Biology. 19 (1), 186 (2021).
  13. Ward, S. Chemotaxis by the nematode Caenorhabditis elegans: Identification of attractants and analysis of the response by use of mutants. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 70 (3), 817-821 (1973).
  14. Bargmann, C. I., Hartwieg, E., Horvitz, H. R. Odorant-selective genes and neurons mediate olfaction in C. elegans. Cell. 74 (3), 515-527 (1993).
  15. Margie, O., Palmer, C., Chin-Sang, I. C. elegans chemotaxis assay. Journal of Visualized Experiments. (74), e50069 (2013).
  16. Ward, A., Liu, J., Feng, Z., Xu, X. Z. S. Light-sensitive neurons and channels mediate phototaxis in C. elegans. Nature Neuroscience. 11 (8), 916-922 (2008).
  17. Vidal-Gadea, A., et al. Magnetosensitive neurons mediate geomagnetic orientation in Caenorhabditis elegans. eLife. 4, 07493 (2015).
  18. Bainbridge, C., Schuler, A., Vidal-Gadea, A. G. Method for the assessment of neuromuscular integrity and burrowing choice in vermiform animals. Journal of Neuroscience Methods. 264, 40-46 (2016).
  19. Beron, C., et al. The burrowing behavior of the nematode Caenorhabditis elegans: a new assay for the study of neuromuscular disorders. Genes, Brain and Behavior. 14 (4), 357-368 (2015).
  20. Ow, M. C., Hall, S. E. A Method for obtaining large populations of synchronized Caenorhabditis elegans dauer larvae. Methods in Molecular Biology. , 209-219 (2015).
  21. Chaudhuri, J., Parihar, M., Pires-daSilva, A. An introduction to worm lab: from culturing worms to mutagenesis. Journal of Visualized Experiments. (47), e2293 (2011).
  22. Karp, X. Working with dauer larvae. WormBook. , 1-19 (2018).
  23. Dinno, A. Nonparametric pairwise multiple comparisons in independent groups using Dunn's test. The Stata Journal. 15 (1), 292-300 (2015).
  24. Gray, J. M., et al. Oxygen sensation and social feeding mediated by a C. elegans guanylate cyclase homologue. Nature. 430 (6997), 317-322 (2004).
  25. Goodman, M. B., Sengupta, P. How Caenorhabditis elegans senses mechanical stress, temperature, and other physical stimuli. Genetics. 212 (1), 25-51 (2019).
  26. Iliff, A. J., Xu, X. Z. S. C. elegans: a sensible model for sensory biology. Journal of Neurogenetics. 34 (3-4), 347-350 (2020).
  27. Russell, J., Vidal-Gadea, A. G., Makay, A., Lanam, C., Pierce-Shimomura, J. T. Humidity sensation requires both mechanosensory and thermosensory pathways in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (22), 8269-8274 (2014).
  28. Iliff, A. J., et al. The nematode C. elegans senses airborne sound. Neuron. 109 (22), 3633-3646 (2021).
  29. Metaxakis, A., Petratou, D., Tavernarakis, N. Multimodal sensory processing in Caenorhabditis elegans. Open Biology. 8 (6), 180049 (2018).
  30. Wicks, S., Rankin, C. Integration of mechanosensory stimuli in Caenorhabditis elegans. The Journal of Neuroscience. 15, 3 Pt 2 2434-2444 (1995).
  31. Chen, X., Chalfie, M. Modulation of C. elegans touch sensitivity is integrated at multiple levels. The Journal of Neuroscience. 34 (19), 6522-6536 (2014).
  32. Stockand, J. D., Eaton, B. A. Stimulus discrimination by the polymodal sensory neuron. Commun. Integrative Biology. 6 (2), 23469 (2013).
  33. Mackowetzky, K., Yoon, K. H., Mackowetzky, E. J., Waskiewicz, A. J. Development and evolution of the vestibular apparatuses of the inner ear. Journal of Anatomy. 239 (4), 801-828 (2021).
  34. Eppsteiner, R. W., Smith, R. J. H. Genetic disorders of the vestibular system. Current Opinion in Otolaryngology & Head and Neck Surgery. 19 (5), 397-402 (2011).
  35. Roman-Naranjo, P., Gallego-Martinez, A., Lopez Escamez, J. A. Genetics of vestibular syndromes. Current Opinion in Neurology. 31 (1), 105-110 (2018).
  36. Mei, C., et al. Genetics and the individualized therapy of vestibular disorders. Frontiers in Neurology. 12, 633207 (2021).
  37. Weghorst, F. P., Cramer, K. S. The evolution of hearing and balance. eLife. 8, 44567 (2019).

Tags

Поведение выпуск 183
Крупномасштабный гравитационный анализ личинок <em>Caenorhabditis</em> Dauer
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ackley, C., Washiashi, L.,… More

Ackley, C., Washiashi, L., Krishnamurthy, R., Rothman, J. H. Large-Scale Gravitaxis Assay of Caenorhabditis Dauer Larvae. J. Vis. Exp. (183), e64062, doi:10.3791/64062 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter