Storskala gravitakseanalyse av Caenorhabditis dauer larver

Summary

Denne protokollen skisserer metoder for å gjennomføre en storskala gravitakseanalyse med Caenorhabditis dauer larver. Denne protokollen muliggjør bedre påvisning av gravitaksisoppførsel sammenlignet med en platebasert analyse.

Abstract

Gravitasjonsfølelse er en viktig og relativt understudert prosess. Å føle tyngdekraften gjør det mulig for dyr å navigere i omgivelsene og letter bevegelsen. I tillegg er tyngdekraften, som oppstår i pattedyrets indre øre, nært knyttet til hørsel – og dermed har forståelse av denne prosessen implikasjoner for auditiv og vestibulær forskning. Gravitaxisanalyser finnes for noen modellorganismer, inkludert Drosophila. Enkle ormer har tidligere blitt analysert for deres orienteringspreferanse når de bosetter seg i løsning. En pålitelig og robust analyse for Caenorhabditis gravitaxis er imidlertid ikke beskrevet. Denne protokollen skisserer en prosedyre for å utføre gravitakseanalyser som kan brukes til å teste hundrevis av Caenorhabditis dauers om gangen. Denne storskala, langdistanseanalysen tillater detaljert datainnsamling, og avslører fenotyper som kan gå glipp av på en standard platebasert analyse. Dauer-bevegelse langs den vertikale aksen sammenlignes med horisontale kontroller for å sikre at retningsskjevhet skyldes tyngdekraften. Gravitaktisk preferanse kan deretter sammenlignes mellom stammer eller eksperimentelle forhold. Denne metoden kan bestemme molekylære, cellulære og miljømessige krav til gravitakse i ormer.

Introduction

Å føle jordens gravitasjonskraft er avgjørende for mange organismers orientering, bevegelse, koordinering og balanse. Imidlertid er de molekylære mekanismene og nevrokretsene av tyngdekraftfølelse dårlig forstått sammenlignet med andre sanser. Hos dyr samhandler tyngdekraften med og kan utkonkurreres av andre stimuli for å påvirke atferd. Visuelle signaler, proprioceptiv tilbakemelding og vestibulær informasjon kan integreres for å generere en følelse av kroppsbevissthet i forhold til dyrets omgivelser ^1,2. Omvendt kan gravitaktisk preferanse endres i nærvær av andre stimuli ^3,4,5. Derfor er gravitaktisk oppførsel ideell for å studere tyngdekraftfølelse og forstå nervesystemets komplekse sensoriske integrasjon og beslutningstaking.

C. elegans er en spesielt nyttig modellorganisme for å studere gravitakse på grunn av sin polyfeniske livssyklus. Når de utsettes for stressorer under utvikling, inkludert varme, overbefolkning eller mangel på mat, utvikler C. elegans larver seg til dauers, som er svært stressbestandige⁶. Som dauers utfører ormer karakteristisk oppførsel, for eksempel nictation, der ormer “står” på halene og vinker hodet, som kan lette spredning til bedre habitater⁷. Gravitaxisanalyser av C. elegans og C. japonica antyder at dauer larver negativt gravitax, og at denne oppførselen lettere observeres hos dauers enn hos voksne ^8,9. Testing av gravitakse i andre Caenorhabditis-stammer kan avsløre naturlig variasjon i gravitaktisk oppførsel.

Mekanismer for gravitasjonsfølelse har blitt karakterisert i Euglena, Drosophila, Ciona og forskjellige andre arter ved hjelp av gravitaxisanalyser 3,10,11. I mellomtiden ga gravitaxisstudier i Caenorhabditis i utgangspunktet blandede resultater. En studie av C. elegans orienteringspreferanse fant at ormer orienterer seg med hodet ned i løsning, noe som tyder på positiv gravitaktisk preferanse¹². I mellomtiden, selv om C. japonica dauers tidlig ble identifisert som negativt gravitactic⁸, har denne oppførselen bare nylig blitt beskrevet i C. elegans⁹. Flere utfordringer oppstår ved å utvikle en representativ gravitakseanalyse i ormer. Caenorhabditis stammer opprettholdes på agar plater; Av denne grunn bruker atferdsanalyser vanligvis agarplater som en del av deres eksperimentelle design^13,14,15. Den tidligste rapporterte gravitaxisanalysen i Caenorhabditis ble utført ved å stå en plate på siden i en 90 ° vinkel mot den horisontale kontrollplaten⁸. Gravitaksisadferd er imidlertid ikke alltid robust under disse forholdene. Mens voksne ormer kan analyseres for orienteringspreferanse i løsning¹², kan denne retningspreferansen også være kontekstavhengig, noe som fører til forskjellig atferd hvis ormene kryper i stedet for å svømme. I tillegg er C. elegans følsom for andre stimuli, inkludert lys og elektromagnetiske felt^16,17, som forstyrrer deres respons på tyngdekraften⁹. Derfor er en oppdatert gravitakseanalyse som skjold mot andre miljøvariabler viktig for å dissekere mekanismene i denne sensoriske prosessen.

I denne protokollen er en analyse for å observere Caenorhabditis gravitaxis beskrevet. Oppsettet for denne studien er delvis basert på en metode utviklet for å studere nevromuskulær integritet^18,19. Dauerlarver dyrkes og isoleres ved hjelp av standardprosedyrer²⁰. De injiseres deretter i kamre laget av to 5 ml serologiske pipetter fylt med agar. Disse kamrene kan orienteres vertikalt eller horisontalt og plasseres i et mørkt Faraday-bur i 12-24 timer for å beskytte mot lys og elektromagnetiske felt. Plasseringen av hver orm i kamrene registreres og sammenlignes med de vertikale taksisene til en referansestamme som C. elegans N2.

Protocol

Stammene som er brukt i denne studien er C. elegans (N2) og C. briggsae (AF16) (se materialtabell). En blandet kjønn befolkning av dauers ble brukt for hver analyse. 1. Kammer forberedelse Arbeid i en avtrekksvifte. Sett opp arbeidsområdet med en Bunsen-brenner, 1-2 barberblader, tang, pinsett og en skjæreflate i plast (se Materialfortegnelse). For hvert kammer samles to 5 ml serologiske pipetter. Fjern…

Representative Results

Sammenligning av gravitakse på tvers av arterEtter prosedyren som er skissert ovenfor, kan C. briggsae dauer gravitaxis sammenlignes med C. elegans gravitakse og horisontale kontroller. Den vertikale fordelingen (rødbrun) av C. briggsae dauers er skjev mot toppen av kamrene, med en stor prosentandel ormer som når +7 (figur 2A). I motsetning til horisontale kontroller (aqua), der dauers er fordelt i en omtrent klokkeformet kurve rundt midten …

Discussion

Sammenligning med tidligere metoder
I motsetning til kjemotaksi kan gravitakse i Caenorhabditis ikke observeres pålitelig ved hjelp av en tradisjonell agarplate eksperimentell design. En standard petriskål er 150 mm i diameter, noe som resulterer i bare 75 mm tilgjengelig i begge retninger for dauers for å demonstrere gravitaxis preferanse. Selv om C. elegans orienteringspreferanse kan analyseres i løsning¹², er denne metoden lav gjennomstrømning da ormer…

Materials

1% Sodium Dodecyl Sulfate solution			From stock 10% (w/v) SDS in DI water
15 mL Centrifuge tubes	Falcon	14-959-53A
3 mm Hex key			Other similar sized metal tools may be used
4% Agar in Normal Growth Medium (NGM) – 1 L			Prior to autoclaving: 3 g NaCl, 40 g Agar, 2.5 g Peptone, 2 g Dextrose, 10 mL Uracil (2 mg/mL), 500 μL Cholesterol (10 mg/mL), 1 mL CaCl2, 962 mL DI water; After autoclaving: 24.5 mL Phosphate Buffer, 1 mL 1 MgSO4 (1 M), 1 mL Streptomycin (200 mg/mL)
5 mL Serological pipettes	Fisherbrand	S68228C	Polystyrene, not borosilicate glass
60% Cold sucrose solution			60% sucrose (w/v) in DI water; sterilize by filtration (0.45 μm filter). Keep at 4 °C
AF16 C. briggsae or other experimental strain			Available from the CGC (Caenorhabditis Genetics Center)
Bunsen burner
Cling-wrap	Fisherbrand	22-305654
Clinical centrifuge
Disposable razor blades	Fisherbrand	12-640
Faraday cage			Can be constructed using cardboard and aluminum foil; 30" L x 6" W x 26" H or larger
Ink markers			Sharpie or other brand for marking on plastic
Labeling tape	Carolina	215620
M9 buffer			22 mM KH2PO4, 42 mM Na2HPO4, 86 mM NaCl
N2 C. elegans strain			Available from the CGC (Caenorhabditis Genetics Center)
NGM plates with OP50			1.7% (w/v) agar in NGM (see description: 4% agar in NGM). Seed with OP50
Paraffin film	Bemis	13-374-10
Plastic cutting board
Pliers
Rotating vertical mixer	BTLab SYSTEMS	BT913	With 22 x 15 mL tube bar
Serological pipettor	Corning	357469
Stereo Microscope	Laxco	S2103LS100
Tally counter	ULINE	H-7350
Thick NGM/agar plate media – 1 L			See 4% Agar in NGM recipe; replace 40 g Agar with 20 g Agar
Tweezers