Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Behavior
Click here for the English version

Behavior

בדיקת גרביטקסיס בקנה מידה גדול של זחלי Caenorhabditis Dauer

Published: May 31, 2022 doi: 10.3791/64062
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Molecular Cellular and Developmental Biology, University of California

Summary

הפרוטוקול הנוכחי מתווה שיטות לביצוע בדיקת גרביטקסיס בקנה מידה גדול עם זחלי Caenorhabditis dauer. פרוטוקול זה מאפשר זיהוי טוב יותר של התנהגות גרביטקסיס בהשוואה לבדיקה מבוססת צלחת.

Abstract

תחושת הכבידה היא תהליך חשוב ויחסית לא מובן מאליו. חישת כוח המשיכה מאפשרת לבעלי חיים לנווט בסביבתם ומקלה על התנועה. בנוסף, תחושת הכבידה, המתרחשת באוזן הפנימית של היונקים, קשורה קשר הדוק לשמיעה - ולכן, להבנת תהליך זה יש השלכות על מחקר שמיעתי ושיווי משקל. מבחני גרביטקסיס קיימים עבור כמה אורגניזמי מודל, כולל דרוזופילה. תולעים בודדות נבדקו בעבר על העדפת האוריינטציה שלהן כשהן שוקעות בתמיסה. עם זאת, בדיקה אמינה וחזקה עבור Caenorhabditis gravitaxis לא תואר. הפרוטוקול הנוכחי מתווה הליך לביצוע מבחני גרביטקסיס שניתן להשתמש בהם כדי לבחון מאות דאוארים של Caenorhabditis בכל פעם. בדיקה ארוכת טווח בקנה מידה גדול זו מאפשרת איסוף נתונים מפורט, וחושפת פנוטיפים שעלולים להתפספס בבדיקה סטנדרטית מבוססת צלחת. תנועת דאואר לאורך הציר האנכי מושווית לבקרות אופקיות כדי להבטיח שהטיית הכיוון נובעת מכוח הכבידה. לאחר מכן ניתן להשוות את העדפת הכבידה בין זנים או תנאי ניסוי. שיטה זו יכולה לקבוע דרישות מולקולריות, תאיות וסביבתיות עבור גרביטקסיס בתולעים.

Introduction

חישת כוח המשיכה של כדור הארץ חיונית להתמצאות, לתנועה, לקואורדינציה ולאיזון של אורגניזמים רבים. עם זאת, המנגנונים המולקולריים והנוירו-מעגלים של תחושת הכבידה אינם מובנים היטב בהשוואה לחושים אחרים. אצל בעלי חיים, תחושת הכבידה מתקשרת עם גירויים אחרים ויכולה להיות מוגברת על ידי גירויים אחרים כדי להשפיע על ההתנהגות. ניתן לשלב רמזים חזותיים, משוב פרופריוצפטיבי ומידע שיווי משקל כדי ליצור תחושה של מודעות לגוף ביחס לסביבתו של בעל החיים 1,2. לעומת זאת, ניתן לשנות את העדפת הכבידה בנוכחות גירויים אחרים 3,4,5. לכן, התנהגות כבידתית היא אידיאלית לחקר תחושת הכבידה ולהבנת האינטגרציה החושית המורכבת של מערכת העצבים וקבלת ההחלטות.

C. elegans הוא אורגניזם מודל שימושי במיוחד לחקר גרביטקסיס בגלל מחזור החיים הפוליפני שלו. כאשר הם נחשפים לגורמי עקה במהלך ההתפתחות, כולל חום, צפיפות או מחסור במזון, זחלי C. elegans מתפתחים לדאוארים, שהם עמידים מאוד ללחץ6. בתור דאוארים, תולעים מבצעות התנהגויות אופייניות, כגון ניקוטציה, שבה תולעים "עומדות" על זנבן ומנופפות בראשן, שעשויות להקל על פיזור לבתי גידול טובים יותר7. מבחני גרביטקסיס של C. elegans ו- C. japonica מצביעים על כך שזחלי דאואר הם בעלי כבידה שלילית, וכי התנהגות זו נצפית בקלות רבה יותר אצל דאוארים מאשר אצל מבוגרים 8,9. בדיקת גרביטקסיס בזנים אחרים של Caenorhabditis עשויה לגלות שונות טבעית בהתנהגות הכבידה.

מנגנונים לתחושת הכבידה אופיינו באוגלנה, דרוזופילה, סיונה ומינים שונים אחרים באמצעות מבחני גרביטקסיס 3,10,11. בינתיים, מחקרי גרביטקסיס ב- Caenorhabditis סיפקו בתחילה תוצאות מעורבות. מחקר על העדפת האוריינטציה של C. elegans מצא כי תולעים מכוונות עם ראשן למטה בתמיסה, מה שמרמז על העדפה גרביטקטית חיובית12. בינתיים, למרות ש-C. japonica dauers זוהו בשלב מוקדם כבעלי כבידה שלילית8, התנהגות זו תוארה רק לאחרונה ב-C. elegans9. מספר אתגרים מתעוררים בפיתוח בדיקת גרביטקסיס מייצגת בתולעים. זני Caenorhabditis נשמרים על צלחות אגר; מסיבה זו, מבחנים התנהגותיים משתמשים בדרך כלל בלוחות אגר כחלק מתכנון הניסוישלהם 13,14,15. בדיקת הכבידה המוקדמת ביותר שדווחה ב- Caenorhabditis בוצעה על ידי העמדת צלחת על צדה בזווית של 90° ללוח הבקרה האופקי8. עם זאת, התנהגות גרביטקסיס אינה תמיד חזקה בתנאים אלה. בעוד שניתן לבחון תולעים בוגרות להעדפה אוריינטלית בתמיסה12, העדפה כיוונית זו עשויה להיות גם תלוית הקשר, מה שמוביל להתנהגויות שונות אם התולעים זוחלות במקום לשחות. בנוסף, C. elegans רגישים לגירויים אחרים, כולל אור ושדות אלקטרומגנטיים16,17, אשר מפריעים לתגובותיהם לכוח הכבידה9. לכן, מבחן גרביטקסיס מעודכן המגן מפני משתנים סביבתיים אחרים חשוב לניתוח המנגנונים של תהליך חושי זה.

בפרוטוקול הנוכחי מתוארת בדיקה לתצפית על Caenorhabditis gravitaxis. המערך למחקר זה מבוסס בחלקו על שיטה שפותחה כדי לחקור שלמות נוירומוסקולרית18,19. זחלי דאואר מתורבתים ומבודדים באמצעות נהלים סטנדרטיים20. לאחר מכן הם מוזרקים לתאים העשויים משני פיפטות סרולוגיות של 5 מ"ל מלאות באגר. תאים אלה יכולים להיות מכוונים אנכית או אופקית וממוקמים בתוך כלוב פאראדיי חשוך למשך 12-24 שעות כדי להגן מפני אור ושדות אלקטרומגנטיים. מיקומה של כל תולעת בתאים נרשם ומושווה למוניות האנכיות של זן ייחוס כגון C. elegans N2.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

הזנים המשמשים במחקר הנוכחי הם C. elegans (N2) ו - C. briggsae (AF16) (ראו טבלת חומרים). אוכלוסייה מעורבת של דאוארים שימשה לכל בדיקה.

1. הכנת הלשכה

  1. עבודה במכסה אדים. הגדר את סביבת העבודה עם מבער Bunsen, 1-2 סכיני גילוח, צבת, פינצטה ומשטח חיתוך מפלסטיק (ראה טבלת חומרים).
  2. עבור כל תא, לאסוף שני פיפטות סרולוגיות 5 מ"ל. הסר את תקע הכותנה מפיפטה אחת עם פינצטה. החזיקו סכין גילוח מעל מבער הבונזן עד שהוא חם בעזרת צבת. השתמשו בלהב המחומם כדי לחתוך את הקצה המחודד של הפיפטה השנייה, כך שלפיפטה כולה יהיה קוטר אחיד (איור 1A).
  3. בעבודה מהירה, מקרבים את שני קצוות הפיפטה המותאמים ללהבה, וממיסים אותם מעט. חברו את הקצוות הללו על ידי לחיצה חזקה זה לזה, כדי להבטיח שהקירות של שני הפיפטות יהיו רציפים. אם רווחים כלשהם נראים לעין לאחר ההצטרפות, פרקו אותם זה מזה וחזרו על שלב זה (איור 1A,B).

2. מילוי התאים באגר

  1. הכינו NGM עם 4% אגר לפי נהלי התולעת הסטנדרטיים21. בזמן שהאגר עדיין מותך, מלאו כל תא על ידי חיבורו לפיפטור סרולוגי ושרטוט איטי של התמיסה. אטמו את הקצה עם סרט פרפין לפני הסרת התא מהפיפטור. הניחו את התא שטוח (במקביל לספסל) כדי להתקרר.
    הערה: כיסוי הבקבוקון בעטיפת דבק (ראו טבלת חומרים) לאחר אוטוקלאבינג מסייע במניעת היווצרות בועות בתמיסה18.
    1. כדי למזער את השינויים בעקביות האגר עקב קירור לא אחיד, החזיקו את הפיפטור (ראו טבלת חומרים) במקביל למשטח הספסל תוך כדי שרטוט האגר. הניחו את התאים שטוחים על הספסל ואפשרו לאגר להתקשות לפני המעבר.
      הערה: ניתן להתאים את אחוז האגר ותוכן המדיה לניסוי. 4% אגר נוקשה יותר מהריכוז של כ-2% המשמש למזיגת צלחות ומונע מתולעים להתחפר דרך המדיום שבידינו. עם זאת, נסיינים אחרים הבחינו בהתנהגות מחילה של תולעים בוגרות בשיעור של עד 9% אגר18,19.
  2. לאחר הקירור, מחממים מקש הקסדצימלי בקוטר 3 מ"מ (או כלי מתכת אחר באותו גודל, ראו טבלת חומרים) מעל מבער בונזן. לחצו אותו בחוזקה לתוך הדופן של כל תא כ-5 מ"מ לצד אחד של קו האמצע, וצרו פתח קטן בפלסטיק (איור 1C). השתמש בלהב מחומם כדי להסיר את הכותנה ואת הקצוות המחודדים של התא ולאטום קצוות אלה עם סרט פרפין.
    הערה: לאחר ההכנה, יש להשתמש בכל תא תוך יום אחד או לשמור אותו בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך מספר ימים. כסו את כל הפתחים החשופים בסרט פרפין כדי למנוע מהאגר להתייבש.

3. בידוד זחלי דאואר

  1. 10-15 ימים לפני הניסוי, חתכו כל זן על 2-3 צלחות NGM גדולות עם חיידקי OP50 ועטפו בסרט פרפין. לאחר 10-15 ימים, כל צלחת חייבת להיות מורעבת לחלוטין עם אלפי זחלי דאואר שנמצאים על האגר, הקירות והמכסים.
    הערה: הכינו צלחות מראש באמצעות מתכון OP50 עבה לצפיפות מרבית (ראו טבלת חומרים). היווצרות דאואר יכולה להיות מושרית גם באמצעות שיטות אחרות, כולל תוספת של פרומונים או על ידי גידול בטמפרטורות גבוהות יותר22.
  2. אסוף תולעים על ידי שטיפת המכסים והצלחות עם מאגר M9 והזרמת התמיסה לצינורות צנטריפוגה של 15 מ"ל. סובבו בעוצמה של 1,600 x גרם במשך 30-60 שניות בטמפרטורת החדר ושאפו את רוב מאגר M9 באמצעות פיפטה או שואב אבק.
  3. יש לבודד דאוארים על ידי טיפול עם 1% SDS ואחריו שיפוע ציפה של 30% סוכרוז בעקבות דו"ח20 שפורסם קודם לכן.
    1. יש להוסיף תמיסת SDS של 7 מ"ל 1% לכל כדור תולעת. השאירו את התולעים ב- SDS למשך 30 דקות; סובב את הצינורות ברציפות במהלך זמן זה כדי לאפשר אוורור. יש לשטוף 3-5x עם M9 כדי להסיר את חומר הניקוי.
    2. לאחר מכן, הוסף 5 מ"ל M9 ואחריו 5 מ"ל של תמיסת סוכרוז קרה ומסוננת 60%. מערבבים היטב, ולאחר מכן צנטריפוגה בגודל 1,600 x גרם למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר כדי ליצור שיפוע הפרדה.
  4. מלא צינורות צנטריפוגה חדשים של 15 מ"ל עם 2 מ"ל של חיץ M9. מרסקים את קצוות הפיפטות של פסטר מזכוכית כדי להרחיב את הבור ומשתמשים בפיפטות אלה כדי להעביר את השכבה העליונה של התמיסה (המכילה דאוארים מבודדים) משיפוע הסוכרוז לצינורות החדשים. שטפו את הדאוארים 3-5x עם M9.
    הערה: בשלב זה יהיו אלפי דאוארים מבודדים בתמיסה. ניתן להשתמש בהם באופן מיידי או לשמור על אוורור על ידי סיבוב ב-M9 של 5-7 מ"ל למשך הלילה.

4. הוספת דאוארים לחדר

  1. צנטריפוגות בגודל 1,600 x גרם למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר ושואפות את רוב תמיסת M9 עם פיפטה או שואב אבק. כדי להעריך את צפיפות התולעים, ספרו ידנית את מספר התולעים בשלוש טיפות נפרדות של 1 μL תחת מיקרוסקופ מנתח. השתמש בממוצע של ספירות אלה כדי להעריך את מספר התולעים לכל μL.
    הערה: ייתכן שחלק מהפיפטורים בנפח קטן לא יוכלו להגיע לתחתית צינור צנטריפוגה של 15 מ"ל; במקרה זה, טיפה מרוכזת של תולעים ניתן להעביר הראשון חתיכת סרט פרפין.
  2. חותכים את הקצה של קצה פיפטה של 10, 20 או 200 μL כדי להרחיב את הבור. הגדר את המיקרופיפטה לנפח מעט גדול יותר מנפח השאיפה המיועד. שאפו כ-1-2 מיקרון של תמיסת התולעים המרוכזת (באופן אידיאלי בין 100-300 תולעים) ואפשרו לכמות קטנה של אוויר להיכנס לקצה.
    הערה: מספר גדול של תולעים (1,000+) בתא אחד עשוי להגדיל את טווח המרחקים שעברו עקב צפיפות9.
  3. דחפו בעדינות את קצה הפיפטה לתוך האגר תוך כדי דיכוי המיקרופיפטה. פעולה זו תיצור אתר הזרקה באגר מבלי לסתום את הקצה. משחררים את התולעים לתוך האגר. השתמשו בסרט פרפין כדי לאטום את הפתח.

5. ריצה וניקוד הבדיקה

הערה: ניתן לבדוק גרביטקסיס בתנאים שונים שעשויים להשפיע על התנהגות9.

  1. כדי למנוע כמה שיותר משתנים, מקמו את התאים בתוך כלוב פאראדיי חשוך (ראו טבלת חומרים) בטמפרטורת החדר.
  2. תייג כל תא ותלה אותו אנכית בתוך כלוב פאראדיי (בצע זאת באמצעות סרט תיוג). בדוק בקרות אופקיות במקביל על ידי הנחת חלק מהתאים שטוחים באותם תנאים סביבתיים. בדוק את הזנים הניסיוניים נגד תולעי N2 בכיוון אנכי כבקרה חיובית. השתמש בתאים אופקיים המכילים דאוארים N2 כבקרה שלילית נוספת.
    הערה: יש לבצע בדיקות אופקיות ואנכיות באותה הגדרה בתוך המעבדה כדי למזער את השונות הסביבתית בין שני התנאים. ניתן להשתמש באינקובטור גדול כדי לשכן את שני כלובי פאראדיי.
  3. דאוארים מתחילים להתפזר מאתר ההתחלה לאחר מספר שעות ולוקח כמה שעות להגיע לשני קצות החדר. השאירו את התאים ללא הפרעה במהלך תקופה זו והבקיע תוך 12-24 שעות לאחר ההזרקה.
    הערה: אין להשתמש במשותק (כגון נתרן אזיד) כדי לשתק תולעים שהגיעו לקצות התאים. מכיוון שההתפלגות הכוללת של התולעים נמדדת במקום מדד העדפה (כמו בבדיקה של שתי אפשרויות), נתרן אזיד הוא מיותר ועלול לשנות את התוצאות.
  4. הסר והבקיע תאי גרביטקסיס בזה אחר זה. חפשו דאוארים חיים מתחת למיקרוסקופ מנתח וסמנו את מיקומם בדיו (איור 1C,D). אין לדרג תולעים בטווח של 2.5 ס"מ לאף אחד מהצדדים של אתר ההזרקה, מכיוון שתולעים אלה אינן צפויות להפגין העדפה כיוונית.
    1. כמו כן, הימנעו מניקוד תולעים שנראות מתות או לכודות בנוזל. יש להשליך את כל התאים המכילים >50% תולעים מתות או תולעים שוחות.
      הערה: לאחר הסרת התא מאזור הבדיקה, יש לדרג אותו מיד לדיוק. דאוארים חייבים להיות גלויים רק בין פני השטח של האגר לבין קיר הפיפטה. אם נצפתה התנהגות מחילה, שקול להגדיל את ריכוז האגר במבחנים עתידיים.
  5. כדי לכמת את התוצאות, השתמש בסמן כדי לחלק כל מחצית של התא לשבעה חלקים של 3.5 ס"מ החל ממרחק של 2.5 ס"מ ממקום ההזרקה (בחלק מהפיפטות, 3.5 ס"מ = 1 מ"ל נפח). השתמש במונה ידני (ראה טבלת חומרים) כדי לספור את מספר התולעים שנצפו בכל סעיף.
    הערה: צריכים להיות שבעה חלקים בכל צד של המקור, אשר ניתן למספר מ -7 (למטה) ל +7 (למעלה). מספרים אלה חייבים להתאים לאותם מיקומים יחסיים בהתבסס על האופן שבו נבנו התאים; אגר נמשך מהקצה -7 לקצה +7 בשלב 2.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

השוואת גרביטקסיס בין מינים שונים
בעקבות ההליך המתואר לעיל, C. briggsae dauer gravitaxis ניתן להשוות עם C. elegans gravitaxis ובקרות אופקיות. ההתפלגות האנכית (maroon) של C . briggsae dauers מוטה לכיוון צמרות התאים, כאשר אחוז גדול של תולעים מגיע ל-+7 (איור 2A). בניגוד לבקרות אופקיות (אקווה), שבהן הדאוארים מפוזרים בעקומה בצורת פעמון בערך סביב מרכז התאים, מגמה זו מצביעה על התנהגות כבידתית שלילית. ניתן להשוות את הנתונים האלה עם C . elegans gravitaxis שבוצעו באותם ימי ניסוי (איור 2B).

מבחן קרוסקל-וואליס ואחריו המבחן של דאן עם תיקון בונפרוני להשוואות מרובות קבעו הבדלים משמעותיים בין מבחנים 9,23. בניסוי זה, 1,108 C. briggsae dauers הובקעו על פני שלושה תאים אנכיים משני ימי ניסוי עצמאיים. תולעים אלה נדדו באופן משמעותי כלפי מעלה מאשר בקרות אופקיות (p < 0.001; 1,639 דאוארים בשלושה תאים אופקיים במשך 2 ימי ניסוי). יתר על כן, התפלגויות C. briggsae ו- C. elegans אנכיות לא היו שונות (p > 0.05; 386 C. elegans dauers בשני תאים אנכיים במשך 2 ימי ניסוי). תוצאות אלה מציעות כי C. briggsae dauers מראים התנהגות גרביטקסיס שלילית הדומה לזו של C. elegans dauers.

Figure 1
איור 1: מערך תא הבדיקה של Gravitaxis. תמונות המתארות שלבים של הכנת תא בדיקה של גרביטקסיס. (A) פיפטות בודדות של 5 מ"ל הוכנו לאיחוי לתא יחיד. הסרת תקע כותנה מסומן עם ראש חץ שחור; הסרת קצה מסומן עם ראש חץ לבן. הצינורות ששימשו במחקר זה הם בקוטר פנימי של 6 מ"מ וכל אחד מהם באורך 34.5 ס"מ (לפני החיתוך). (ב) חדר שהושלם לפני הוספת אגר NGM. פיפטות התמזגו על ידי התכה ראשונה מעל מבער בונזן. (C) תאים לדוגמה מלאים באגר NGM. אתר ההזרקה מסומן בחץ ומוגדל בכניסה. תולעים סומנו בדיו, וקווים משורטטים כדי להבחין במרחקים יחד עם התא, כמו גם כדי להקל על הניקוד. (D) מבט על התאים בשלמותם (נלקח לאחר הניקוד). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 2
איור 2: גרביטקסיס ב-C. briggsae לעומת C. elegans. תוצאות של גרביטקסיס ב- C. briggsae ו- C. elegans. (A) היסטוגרמה של C. briggsae gravitaxis. התנועה בתאים אנכיים (maroon) מושווית עם פקדים אופקיים (אקווה). המרחק מנקודת ההזרקה (-7 הוא הרחוק ביותר מתחת, +7 הרחוק ביותר מעל) מסומן כאחוז מכלל התולעים שנבדקו (ציר x). אין נתונים על המקור (+0) מכיוון שתולעים אינן נספרות בטווח של 2.5 ס"מ לאף אחד מהצדדים של אתר ההזרקה. N = 1,639 תולעים על פני שלושה צינורות במצב אופקי; אנכי N = 1,108 תולעים על פני שלושה צינורות. (B) Boxplots המשווים את התפלגות התולעים האופקיות והאנכיות C. briggsae לעומת התולעים האנכיות של C. elegans. ג. גודל המדגם של briggsae מובא לעיל. C. elegans אנכי N = 386 תולעים על פני שני צינורות. האמצעים מסומנים ביהלומים לבנים; התנאים האנכיים הם במארון ומסומנים "V", והתנאים האופקיים ("H") נמצאים באקווה. ההשוואות נעשו באמצעות מבחן קרוסקל-וואליס, ולאחר מכן מבחן דאן עם תיקון בונפרוני להשוואות מרובות. אין כוכבים = p > 0.05, **** = p < 0.0001. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

השוואה עם שיטות קודמות
שלא כמו כימוטקסיס, לא ניתן לצפות באופן מהימן בגרביטקסיס בקאנורהבדיטיס באמצעות תכנון ניסיוני מסורתי של צלחת אגר. קוטרה של צלחת פטרי סטנדרטית הוא 150 מ"מ, וכתוצאה מכך רק 75 מ"מ זמינים בשני הכיוונים עבור דאוארים כדי להדגים את העדפת הגרביטקסיס. למרות שניתן לבחון את העדפת האוריינטציה של C. elegans בתמיסה12, שיטה זו היא תפוקה נמוכה מכיוון שיש לנתח תולעים בזו אחר זו. בנוסף, העדפות והתנהגויות גרביטקטיות עשויות להיות שונות בין תולעים המרחפות במדיה לעומת זחילה על משטח. מסיבות אלה, פיתחנו בדיקת תפוקה גבוהה עם רגישות משופרת שניתן להשתמש בה כדי לנתח התנהגות גרביטקסיס בזחילה או בטיפוס על תולעים. מכיוון ש-C. elegans רגישים לאור ולשדות אלקטרומגנטיים, ששניהם מפריעים להעדפת הכבידה9, בדיקות אלה צריכות להתבצע ללא אף אחד מהגירויים. אם נעשה שימוש בכלוב פאראדיי ביתי, בדיקת חוזק הכלוב וחיזוקו נחוצים ומומלצים.

אורכם של תאי הבדיקה המתוארים בפרוטוקול זה הוא כ-54 ס"מ והם ממוקמים בתוך כלובי פאראדיי כדי להגן מפני אור ושדות אלקטרומגנטיים. נמצא כי לשינוי "הזירה" להתבוננות בהתנהגות גרביטקסיס יש מספר יתרונות. ראשית, הוא מאפשר כימות מפורט וניתוח תיאורי. את המרחקים היחסיים שעברו, ואת ההתפלגות הכוללת של התולעים ניתן לאסוף ולהשוות במקום לספור את מספר התולעים השליליות לעומת התולעים הכבידתיות החיוביות. שנית, הסביבה הסגורה של פיפטה מלאה באגר משכפלת באופן הדוק יותר את התנאים שעשויים לקדם גרביטקסיס בטבע. כאמור, שלב הדאואר הוא שלב פיזור המאפשר בריחה מתנאים שליליים6. מאחר ש-Caenorhabditis חיה בקומפוסט, שבו רמזים מנחים כמו אור עשויים שלא להיות זמינים, כוח הכבידה עשוי לאפשר לתולעים לנווט אל פני השטח 6,9. בדיקות דו-ממדיות מבוססות צלחת אינן צפויות לשכפל תנאים אלה גם אם הן נבדקות ללא גירויים אחרים. לבסוף, מנגנון גדול יותר זה בודק כמויות גדולות יותר של תולעים בבדיקה אחת.

מגבלות ושיקולים אחרים
בעוד שפרוטוקול זה מודד ביעילות את העדפת הכבידה במספר גדול של דאוארים, הוא אינו מעשי עבור ניסויים בתולעים קטנות או בודדות בשל הזמן והחומרים הדרושים לבניית כל תא. על ידי שילוב ספירות בין ניסויים במקום להשתמש במדד גרביטקסיס, הכוח הסטטיסטי גדל מכיוון שכל תולעת מטופלת כאירוע עצמאי. בעוד שרגישות מוגברת זו שימושית בהבחנה בין תולעים כבידתיות לתולעים שאינן כבידתיות, חשוב לציין כי C. elegans dauers מפגינים התנהגויות חברתיות 7,24 שיכולות להשפיע על הכבידה הכוללת. מצאנו שצפיפות תולעים גבוהה יותר מתואמת עם טווח גדול יותר במרחק הנסיעה במבחן בקנה מידה גדול, אם כי השפעה זו היא מינימלית כאשר הספירה הכוללת היא פחות מכ-1,000 תולעים9. יש לעקוב אחר השפעות אינטראקציה הנובעות מגורמים כגון סך התולעים בכל תא בעת ניתוח הנתונים. כמו בכל המבחנים ההתנהגותיים, הניקוד צריך להיות עיוור במידת האפשר.

מציאת צפיפות ממוצעת של תולעים בתמיסה יכולה למזער את השונות במספר התולעים המוזרקות מתא לתא. התולעים מתיישבות במהירות בתמיסה, ולכן חשוב לערבב את התולעים לפני הפיפטות, בין אם על ידי הזזת הצינורות או על ידי צנרת למעלה ולמטה עם קצה רחב ראש. גם כאשר מושגת צפיפות עקבית, מספר התולעים שנוספו עשוי להשתנות מכיוון שתולעים עשויות להידבק לפני השטח הפנימיים של קצות הפיפטה מפלסטיק. ציפוי טיפים פיפטה עם BSA או פתרונות אחרים יכול למזער את האפקט הזה. תולעים יש להזריק עם פתרון קטן ככל האפשר; אם מוסיפים יותר מדי נוזלים לתא, התולעים יילכדו בתמיסה ואף עלולות להיסחף. מסיבה זו, ניתן להבקיע רק תולעים חיות וזוחלות, ואין להשתמש בכל תא המכיל יותר מ-50% תולעים מתות או שוחות. יש להוציא את התאים מכלוב פאראדיי בזה אחר זה ולהבקיע תוך 10-15 דקות לדיוק הרב ביותר.

יישומים פוטנציאליים
בדיקה זו עשויה לשמש לבדיקת הדרישות הסביבתיות, הגנטיות והתאיות לגרביטקסיס במגוון זנים של Caenorhabditis. עד כה זוהו אור ושדות אלקטרומגנטיים כגירויים המפריעים לגרביטקסיס9. עם זאת, C. elegans רגישים לגירויים אחרים, כולל טמפרטורה, כימיקלים נדיפים ולא נדיפים, מרקם, לחות וצליל, המשפיעים על התנהגותם25,26,27,28. הבנת האופן שבו קלטים חושיים שונים משולבים במערכת העצבים היא שאלה יוצאת דופן במדעי המוח, במיוחד כאשר האינטגרציה מתרחשת ברמה של נוירונים בודדים 9,29,30,31,32. אינטגרציה חושית חשובה במיוחד בפרופריוספציה, שהיא עצמה שיטה אינטגרטיבית השואבת ממספר רמזים חושיים1.

להבנת תחושת הכבידה ב-Caenorhabditis יש השלכות על בריאות האדם. מיליוני אנשים סובלים מתפקוד לקוי של שיווי המשקל בארצות הברית לבדה33, ולרבים מההפרעות הללו יש סיבות גנטיות בסיסיות34,35. מסיבה זו, זיהוי מועמדים לגנים וטיפולים ממוקדי מטרה הוא תחום מחקר פעיל36. בנוסף, מכיוון שמערכות שיווי המשקל והשמיעה של בעלי חוליות קשורות קשר הדוק מבחינה התפתחותית ואבולוציונית33,36,37, הבהרת תחושת הכבידה יכולה גם לספק תובנה לגבי הפרעות שמיעה ושמיעה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים מצהירים שאין אינטרסים מתחרים.

Acknowledgments

מחקר זה נתמך על ידי מענקי מחקר של המכונים הלאומיים לבריאות ל- JHR (#R01 5R01HD081266 ו- #R01GM141493). חלק מהזנים סופקו על ידי CGC, הממומן על ידי משרד תוכניות תשתית המחקר של NIH (P40 OD010440). ברצוננו להודות לפראדיפ ג'ושי (UCSB) על תגובת המערכת שלו. ייעוץ סטטיסטי הניתן על ידי UCSB DATALAB.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1% Sodium Dodecyl Sulfate solution From stock 10% (w/v) SDS in DI water
15 mL Centrifuge tubes Falcon 14-959-53A
3 mm Hex key Other similar sized metal tools may be used
4% Agar in Normal Growth Medium (NGM) - 1 L Prior to autoclaving: 3 g NaCl, 40 g Agar, 2.5 g Peptone, 2 g Dextrose, 10 mL Uracil (2 mg/mL), 500 μL Cholesterol (10 mg/mL), 1 mL CaCl2, 962 mL DI water; After autoclaving: 24.5 mL Phosphate Buffer, 1 mL 1 MgSO4 (1 M), 1 mL Streptomycin (200 mg/mL)
5 mL Serological pipettes Fisherbrand S68228C Polystyrene, not borosilicate glass
60% Cold sucrose solution 60% sucrose (w/v) in DI water; sterilize by filtration (0.45 μm filter). Keep at 4 °C
AF16 C. briggsae or other experimental strain Available from the CGC (Caenorhabditis Genetics Center)
Bunsen burner
Cling-wrap Fisherbrand 22-305654
Clinical centrifuge
Disposable razor blades Fisherbrand 12-640
Faraday cage Can be constructed using cardboard and aluminum foil; 30" L x 6" W x 26" H or larger
Ink markers Sharpie or other brand for marking on plastic
Labeling tape Carolina 215620
M9 buffer 22 mM KH2PO4, 42 mM Na2HPO4, 86 mM NaCl
N2 C. elegans strain Available from the CGC (Caenorhabditis Genetics Center)
NGM plates with OP50 1.7% (w/v) agar in NGM (see description: 4% agar in NGM). Seed with OP50
Paraffin film Bemis 13-374-10
Plastic cutting board
Pliers
Rotating vertical mixer BTLab SYSTEMS BT913 With 22 x 15 mL tube bar
Serological pipettor Corning 357469
Stereo Microscope Laxco S2103LS100
Tally counter ULINE H-7350
Thick NGM/agar plate media - 1 L See 4% Agar in NGM recipe; replace 40 g Agar with 20 g Agar
Tweezers

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Peterka, R. J. Sensory integration for human balance control. Handbook of Clinical Neurology. 159, 27-42 (2018).
  2. Lacquaniti, F., et al. Multisensory Integration and Internal Models for Sensing Gravity Effects in Primates. BioMed Research International. 2014, 61584 (2014).
  3. Bostwick, M., et al. Antagonistic inhibitory circuits integrate visual and gravitactic behaviors. Current Biology. 30 (4), 600-609 (2020).
  4. Ntefidou, M., Richter, P., Streb, C., Lebert, M., Hader, D. -P. High light exposure leads to a sign change in gravitaxis of the flagellate Euglena gracilis. Journal of Gravitational Physiology. 9 (1), 277-278 (2002).
  5. Fedele, G., Green, E. W., Rosato, E., Kyriacou, C. P. An electromagnetic field disrupts negative geotaxis in Drosophila via a CRY-dependent pathway. Nature Communications. 5, 4391 (2014).
  6. Frézal, L., Félix, M. -A. C. elegans outside the Petri dish. eLife. 4, 05849 (2015).
  7. Lee, H., et al. a dispersal behavior of the nematode Caenorhabditis elegans, is regulated by IL2 neurons. Nature Neuroscience. 15 (1), 107-112 (2012).
  8. Okumura, E., Tanaka, R., Yoshiga, T. Negative gravitactic behavior of Caenorhabditis japonica dauer larvae. The Journal of Experimental Biology. 216, 1470-1474 (2013).
  9. Ackley, C., et al. Parallel mechanosensory systems are required for negative gravitaxis in C. elegans. bioRxiv. , (2022).
  10. Häder, D. -P., Hemmersbach, R. Gravitaxis in Euglena. Euglena: Biochemistry, Cell and Molecular Biology. Schwartzbach, S. D., Shigeoka, S. , Springer International Publishing. 237-266 (2017).
  11. Sun, Y., et al. TRPA channels distinguish gravity sensing from hearing in Johnston's organ. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (32), 13606-13611 (2009).
  12. Chen, W. -L., Ko, H., Chuang, H. -S., Raizen, D. M., Bau, H. H. Caenorhabditis elegans exhibits positive gravitaxis. BMC Biology. 19 (1), 186 (2021).
  13. Ward, S. Chemotaxis by the nematode Caenorhabditis elegans: Identification of attractants and analysis of the response by use of mutants. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 70 (3), 817-821 (1973).
  14. Bargmann, C. I., Hartwieg, E., Horvitz, H. R. Odorant-selective genes and neurons mediate olfaction in C. elegans. Cell. 74 (3), 515-527 (1993).
  15. Margie, O., Palmer, C., Chin-Sang, I. C. elegans chemotaxis assay. Journal of Visualized Experiments. (74), e50069 (2013).
  16. Ward, A., Liu, J., Feng, Z., Xu, X. Z. S. Light-sensitive neurons and channels mediate phototaxis in C. elegans. Nature Neuroscience. 11 (8), 916-922 (2008).
  17. Vidal-Gadea, A., et al. Magnetosensitive neurons mediate geomagnetic orientation in Caenorhabditis elegans. eLife. 4, 07493 (2015).
  18. Bainbridge, C., Schuler, A., Vidal-Gadea, A. G. Method for the assessment of neuromuscular integrity and burrowing choice in vermiform animals. Journal of Neuroscience Methods. 264, 40-46 (2016).
  19. Beron, C., et al. The burrowing behavior of the nematode Caenorhabditis elegans: a new assay for the study of neuromuscular disorders. Genes, Brain and Behavior. 14 (4), 357-368 (2015).
  20. Ow, M. C., Hall, S. E. A Method for obtaining large populations of synchronized Caenorhabditis elegans dauer larvae. Methods in Molecular Biology. , 209-219 (2015).
  21. Chaudhuri, J., Parihar, M., Pires-daSilva, A. An introduction to worm lab: from culturing worms to mutagenesis. Journal of Visualized Experiments. (47), e2293 (2011).
  22. Karp, X. Working with dauer larvae. WormBook. , 1-19 (2018).
  23. Dinno, A. Nonparametric pairwise multiple comparisons in independent groups using Dunn's test. The Stata Journal. 15 (1), 292-300 (2015).
  24. Gray, J. M., et al. Oxygen sensation and social feeding mediated by a C. elegans guanylate cyclase homologue. Nature. 430 (6997), 317-322 (2004).
  25. Goodman, M. B., Sengupta, P. How Caenorhabditis elegans senses mechanical stress, temperature, and other physical stimuli. Genetics. 212 (1), 25-51 (2019).
  26. Iliff, A. J., Xu, X. Z. S. C. elegans: a sensible model for sensory biology. Journal of Neurogenetics. 34 (3-4), 347-350 (2020).
  27. Russell, J., Vidal-Gadea, A. G., Makay, A., Lanam, C., Pierce-Shimomura, J. T. Humidity sensation requires both mechanosensory and thermosensory pathways in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (22), 8269-8274 (2014).
  28. Iliff, A. J., et al. The nematode C. elegans senses airborne sound. Neuron. 109 (22), 3633-3646 (2021).
  29. Metaxakis, A., Petratou, D., Tavernarakis, N. Multimodal sensory processing in Caenorhabditis elegans. Open Biology. 8 (6), 180049 (2018).
  30. Wicks, S., Rankin, C. Integration of mechanosensory stimuli in Caenorhabditis elegans. The Journal of Neuroscience. 15, 3 Pt 2 2434-2444 (1995).
  31. Chen, X., Chalfie, M. Modulation of C. elegans touch sensitivity is integrated at multiple levels. The Journal of Neuroscience. 34 (19), 6522-6536 (2014).
  32. Stockand, J. D., Eaton, B. A. Stimulus discrimination by the polymodal sensory neuron. Commun. Integrative Biology. 6 (2), 23469 (2013).
  33. Mackowetzky, K., Yoon, K. H., Mackowetzky, E. J., Waskiewicz, A. J. Development and evolution of the vestibular apparatuses of the inner ear. Journal of Anatomy. 239 (4), 801-828 (2021).
  34. Eppsteiner, R. W., Smith, R. J. H. Genetic disorders of the vestibular system. Current Opinion in Otolaryngology & Head and Neck Surgery. 19 (5), 397-402 (2011).
  35. Roman-Naranjo, P., Gallego-Martinez, A., Lopez Escamez, J. A. Genetics of vestibular syndromes. Current Opinion in Neurology. 31 (1), 105-110 (2018).
  36. Mei, C., et al. Genetics and the individualized therapy of vestibular disorders. Frontiers in Neurology. 12, 633207 (2021).
  37. Weghorst, F. P., Cramer, K. S. The evolution of hearing and balance. eLife. 8, 44567 (2019).

Tags

התנהגות בעיה 183
בדיקת גרביטקסיס בקנה מידה גדול של זחלי <em>Caenorhabditis</em> Dauer
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ackley, C., Washiashi, L.,… More

Ackley, C., Washiashi, L., Krishnamurthy, R., Rothman, J. H. Large-Scale Gravitaxis Assay of Caenorhabditis Dauer Larvae. J. Vis. Exp. (183), e64062, doi:10.3791/64062 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter