Summary
本协议概述了用 Caenorhabditis dauer幼虫进行大规模重力测定的方法。与基于平板的测定相比，该协议可以更好地检测重症行为。
Abstract
重力感觉是一个重要且相对研究不足的过程。感知重力使动物能够驾驭周围环境并促进运动。此外，发生在哺乳动物内耳的重力感觉与听力密切相关 - 因此，了解这一过程对听觉和前庭研究具有影响。一些模式生物（包括 果蝇）存在重力测定。先前已经对单个蠕虫在溶液中沉淀时的方向偏好进行了测定。然而，尚未描述妊娠 盲肠 炎的可靠和稳健的测定方法。本协议概述了进行重症测定的程序，该程序可用于一次测试数百个 Caenorhabditis dauers。这种大规模、长距离检测允许详细的数据收集，揭示标准板检测中可能遗漏的表型。将沿垂直轴的Dauer运动与水平控制进行比较，以确保方向偏差是由于重力引起的。然后可以在菌株或实验条件之间比较重力偏好。该方法可以确定蠕虫中趋重物的分子、细胞和环境要求。
Introduction
感知地球的引力对于许多生物的方向、运动、协调和平衡至关重要。然而，与其他感官相比，人们对重力感觉的分子机制和神经回路知之甚少。在动物中，重力感觉与其他刺激相互作用，并且可以被其他刺激所取代，从而影响行为。视觉线索、本体感觉反馈和前庭信息可以整合在一起，以产生相对于动物周围环境的身体意识感1，2。相反，引力偏好可以在存在其他刺激的情况下改变3，4，5。因此，引力行为是研究重力感觉和理解神经系统复杂的感觉统合和决策的理想选择。
秀丽隐杆线虫是一种特别有用的模式生物，用于研究重症，因为它具有多酚生命周期。当在发育过程中暴露于压力源时，包括高温、过度拥挤或缺乏食物，秀丽隐杆线虫幼虫会发育成具有高度抗压性的dauers6。作为dauers，蠕虫执行特征性行为，例如nictation，其中蠕虫“站立”尾巴并挥舞头部，这可能有助于扩散到更好的栖息地7。秀丽隐杆线虫和日本梭菌的重力测定表明，dauer幼虫的重力为负，并且这种行为在dauers中比在成虫中更容易观察到8，9。在其他Caenorhabditis菌株中测试重量性可能会揭示重力行为的自然变化。
重力感觉的机制已经在Euglena，果蝇，Ciona和其他各种物种中使用gravitaxis测定3，10，11进行了表征。同时，对Caenorhabditis的妊娠研究最初提供了不同的结果。一项对秀丽隐杆线虫定向偏好的研究发现，蠕虫在溶液中低头定向，表明正重力偏好12。同时，尽管C. japonica dauers很早就被确定为负引力8，但这种行为直到最近才在秀丽隐杆线虫9中得到描述。在蠕虫中开发具有代表性的妊娠测定时出现了一些挑战。Caenorhabditis菌株维持在琼脂平板上;出于这个原因，行为测定通常使用琼脂平板作为其实验设计的一部分13，14，15。最早报道的Caenorhabditis的重症测定是通过将板侧立与水平对照板成90°角来进行的8。然而，在这些条件下，趋重性行为并不总是稳健的。虽然可以在解决方案12中测定成虫的方向偏好，但这种定向偏好也可能与上下文相关，如果蠕虫在爬行而不是游泳，则会导致不同的行为。此外，秀丽隐杆线虫对其他刺激敏感，包括光和电磁场16，17，这些刺激会干扰它们对重力9的反应。因此，一种更新的重症测定法可以抵御其他环境变量，这对于剖析这种感觉过程的机制非常重要。
在本协议中，描述了用于观察妊娠 盲肠炎 的测定。这项研究的设置部分基于一种研究神经肌肉完整性的方法18，19。使用标准程序20培养和分离Dauer幼虫。然后将它们注入由两个装有琼脂的 5 mL 血清移液器制成的腔室中。这些腔室可以垂直或水平定向，并放置在黑暗的法拉第笼内12-24小时，以屏蔽光和电磁场。记录每个蠕虫在腔室中的位置，并与参考菌株（如 秀丽隐杆线虫 N2）的垂直分类进行比较。
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Protocol
本研究中使用的菌株是 秀丽隐杆线虫 （N2）和 C. briggsae （AF16）（见 材料表）。每次测定都使用dauers的混合性别群体。
1. 腔室准备
- 在通风橱中工作。使用本生燃烧器、1-2 个剃须刀片、钳子、镊子和塑料切割表面设置工作区（见 材料表）。
- 对于每个腔室，收集两个 5 mL 血清移液器。用镊子从一个移液器上取下棉塞。用钳子将剃须刀片放在本生燃烧器上，直到变热。使用加热刀片切掉第二个移液器的锥形端，使整个移液器具有均匀的直径（图1A）。
- 快速工作，使两个改进的移液器末端靠近火焰，使它们稍微融化。通过将它们牢固地压在一起来连接这些末端，确保两个移液器的壁是连续的。如果连接后有任何间隙可见，请将它们分开并重复此步骤（图1A，B）。
2. 用琼脂填充腔室
- 根据标准蠕虫程序制备含有4%琼脂的NGM21。当琼脂仍处于熔融状态时，将其连接到血清移液器并缓慢吸取溶液来填充每个腔室。在从移液器中取出腔室之前，用石蜡膜密封吸头。将腔室平放（平行于工作台）冷却。
注意：高压灭菌后用粘附包装（参见 材料表）覆盖烧瓶有助于防止溶液中形成气泡18。- 为了尽量减少由于冷却不均匀而导致琼脂稠度的任何变化，请在吸取琼脂时将移液器（见 材料表）与工作台平行。将腔室平放在工作台上，让琼脂变硬，然后再移动。
注意：琼脂百分比和培养基含量可以根据实验进行定制。4%琼脂比用于平板倾倒的大约2%浓度更硬，并防止蠕虫在我们手中的培养基中挖洞。然而，其他实验者观察到成虫在高达9%琼脂18，19中的穴居行为。
- 为了尽量减少由于冷却不均匀而导致琼脂稠度的任何变化，请在吸取琼脂时将移液器（见 材料表）与工作台平行。将腔室平放在工作台上，让琼脂变硬，然后再移动。
- 冷却后，在本生燃烧器上加热 3 毫米六角扳手（或其他相同尺寸的金属工具，请参阅 材料表）。将其牢固地压入中线一侧约5毫米的每个腔室壁中，在塑料中形成一个小开口（图1C）。使用加热刀片去除腔室的棉和锥形端，并用石蜡膜密封这些端部。
注意：准备好后，每个腔室必须在1天内使用或在4°C下保持数天。用石蜡膜覆盖任何暴露的开口，以防止琼脂变干。
3.分离道尔幼虫
- 在实验前10-15天，将每个菌株用OP50细菌分块到2-3个大的NGM板上，并用石蜡膜包裹。10-15天后，每个盘子必须完全饥饿，琼脂，壁和盖子上存在数千只dauer幼虫。
注意：使用较厚的OP50配方提前制作板，以最大程度地拥挤（请参阅 材料表）。Dauer的形成也可以通过其他方法诱导，包括添加信息素或通过在较高温度下生长22。 - 通过用 M9 缓冲液冲洗盖子和板并将溶液移液到 15 mL 离心管中来收集蠕虫。在室温下以1，600× g 旋转30-60秒，并用移液器或真空吸液器吸出大部分M9缓冲液。
- 根据先前发表的报告 20，用 1% SDS 处理，然后用30% 蔗糖浮选梯度处理来分离 dauers。
- 向每个蠕虫颗粒中加入 7 mL 1% SDS 溶液。将蠕虫留在SDS中30分钟;在此期间连续旋转管子以允许曝气。用 M9 冲洗 3-5 次以去除洗涤剂。
- 接下来，加入 5 mL M9，然后加入 5 mL 冷的过滤 60% 蔗糖溶液。充分混合，然后在室温下以1，600× g 离心5分钟以产生分离梯度。
- 用 2 mL M9 缓冲液填充新的 15 mL 离心管。压碎玻璃巴斯德移液器的末端以扩大孔，并使用这些移液器将溶液的顶层（包含分离的道尔）从蔗糖梯度转移到新管中。用 M3 冲洗 5-9 倍。
注意：此时，溶液中将有数千个分离的道尔。它们可以立即使用，也可以通过在 5-7 mL M9 中旋转过夜来保持充气。
4. 将道尔添加到腔室中
- 在室温下以1，600× g 离心dauers5分钟，并用移液器或真空吸液器吸出大部分M9溶液。要估计蠕虫密度，请在解剖显微镜下手动计数三个单独的 1 μL 液滴中的蠕虫数量。使用这些计数的平均值来估算每μL的蠕虫数量。
注意：某些小容量移液器可能无法到达 15 mL 离心管的底部;在这种情况下，可以首先将浓缩的蠕虫液滴转移到一块石蜡膜上。 - 切开 10、20 或 200 μL 移液器吸头的末端以扩大孔径。将微量移液器的体积设置为略大于预期的吸液体积。吸出大约 1-2 μL 的浓缩蠕虫溶液（理想情况下在 100-300 个蠕虫之间），并让少量空气进入吸头。
注意：由于过度拥挤，一个腔室中的大量蠕虫（1，000+）可能会增加行进的距离范围9。 - 轻轻地将移液器吸头推入琼脂中，同时按下微量移液器。这将在琼脂中创建一个注射部位，而不会堵塞尖端。将蠕虫释放到琼脂中。使用石蜡膜密封开口。
5. 运行和评分测定
注意：可以在可能影响行为的各种条件下测试重量9.
- 为了消除尽可能多的变量，请在室温下将腔室放置在黑暗的法拉第笼内（见 材料表）。
- 标记每个腔室并将其垂直悬挂在法拉第笼内（使用标签胶带执行此操作）。通过在相同的环境条件下平放一些腔室来同时测试水平控制。测试针对垂直定向N2蠕虫的实验菌株作为阳性对照。使用含有 N2 dauer 的水平定向腔室作为额外的阴性对照。
注意：水平和垂直测定必须在实验室内的相同环境中进行，以最大程度地减少两种条件之间的环境差异。大型培养箱可用于容纳两个法拉第笼。 - 几个小时后，Dauers开始从起始地点分散，需要几个小时才能到达腔室的两端。在此期间保持腔室不受干扰，并在注射后12-24小时内得分。
注意：不要使用麻痹剂（如叠氮化钠）来固定已到达腔室末端的蠕虫。由于测量的是蠕虫的总体分布而不是偏好指数（如在双选测定中），叠氮化钠是不必要的，并且可能会改变结果。 - 一次取出一个重症室并评分。在解剖显微镜下寻找活的dauers，并在墨水中标记它们的位置（图1C，D）。不要对注射部位两侧 2.5 cm 范围内的蠕虫进行评分，因为这些蠕虫不太可能表现出定向偏好。
- 此外，避免对看似死亡或被困在液体中的蠕虫进行评分。丢弃任何含有>50%死亡或游泳蠕虫的腔室。
注意：一旦腔室从测试区域移开，就需要及时对其进行评分以确保准确性。Dauers 只能在琼脂表面和移液器壁之间可见。如果观察到穴居行为，请考虑在以后的测定中增加琼脂浓度。
- 此外，避免对看似死亡或被困在液体中的蠕虫进行评分。丢弃任何含有>50%死亡或游泳蠕虫的腔室。
- 为了量化结果，使用标记将腔室的每一半分成七个3.5 cm部分，从距离进样部位2.5 cm开始（在某些移液器上，3.5 cm = 1 mL体积）。使用手动计数计数器（参见 材料表）来统计每个部分中观察到的蠕虫数量。
注意：原点的每一侧应有七个部分，可以从 -7（底部）到 +7（顶部）编号。这些数字必须对应于基于腔室构造方式的相同相对位置;琼脂在步骤 2 中从 -7 端到 +7 端绘制。
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Representative Results
比较不同物种的重物
按照上述程序，可以将C . briggsae dauer gravitaxis与 秀丽隐杆线虫 和水平对照进行比较。 C. briggsae dauers的垂直分布（栗色）向室顶部倾斜，大部分蠕虫达到+7（图2A）。与水平控制（aqua）相反，其中dauers在腔室中心周围以大致钟形曲线分布，这种趋势表明负重力行为。这些数据可以与在同一实验日进行的秀 丽隐杆线虫 进行比较（图2B）。
Kruskal-Wallis检验，然后是Dunn测试与Bonferroni校正的多重比较，确定了测定9，23之间的任何显着差异。在这个实验中，在两个独立的实验日中，在三个垂直室中对1，108个 C. briggsae dauers进行了评分。这些蠕虫比水平对照明显向上迁移（p < 0.001;在2个实验日内在三个水平室中迁移了1，639个dauers）。此外 ，垂直秀 丽隐杆线虫和 垂直秀丽隐杆线虫 分布没有差异（p > 0.05; 在2个实验日内，两个垂直室中的386个 秀丽隐杆线虫 分布）。这些结果表明， C. briggsae dauers表现出与 秀丽隐杆线虫 相似的负性趋重行为。
图 1：重力测量室设置。 照片描绘了重症测定室制备步骤。（A） 制备单个 5 mL 移液器以融合到单个腔室中。取下用黑色箭头指示的棉塞;去除带有白色箭头的尖端。本研究中使用的管子的内径为 6 毫米，每根管长 34.5 厘米（切割前）。（B）在添加NGM琼脂之前完成的腔室。移液器首先通过在本生燃烧器上熔化来融合。（C）装满NGM琼脂的示例室。注射部位用箭头表示并在插图中放大。蠕虫用墨水标记，并绘制线条以区分与腔室的距离以及便于评分。（D） 整个房间的视图（得分后拍摄）。 请点击此处查看此图的大图。
图2：C. briggsae与秀丽隐杆线虫的Gravitaxis。C. briggsae和C. elegans的妊娠趋性结果。（A）C. briggsae gravitaxis的直方图。将垂直腔室（栗色）中的运动与水平控制（水绿色）进行比较。与注射点的距离（-7 表示下方最远，+7 表示上方最远）绘制为测定的总蠕虫的百分比（x 轴）。没有绘制原点（+0）的数据，因为在注射部位两侧2.5厘米内没有计数蠕虫。N = 1，639 条蠕虫在水平条件下横跨三个管子;垂直N = 1，108个蠕虫横跨三个管子。（B）箱线图比较了C. briggsae水平和垂直蠕虫与秀丽隐杆线虫垂直蠕虫的分布。C. briggsae样本量如上所示。秀丽隐杆线虫垂直N = 386个蠕虫横跨两个管子。均值用白色菱形表示;垂直条件为栗色，标记为“V”，水平条件（“H”）为浅绿色。使用Kruskal-Wallis检验进行比较，然后使用Bonferroni校正的邓恩检验进行多重比较。没有星星 = p > 0.05， **** = p < 0.0001。请点击此处查看此图的大图。
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Discussion
与先前方法的比较
与趋化性不同，使用传统的琼脂平板实验设计无法可靠地观察 Caenorhabditis 中的重症。标准培养皿的直径为 150 毫米，因此在任一方向上只有 75 毫米可供 dauers 展示对重力的偏好。尽管秀 丽隐杆线 虫的定向偏好可以在溶液12中测定，但这种方法的通量很低，因为必须一次分析一个蠕虫。此外，漂浮在介质中的蠕虫与在表面上爬行的蠕虫之间的引力偏好和行为可能有所不同。出于这些原因，我们开发了一种具有增强灵敏度的高通量测定方法，可用于分析爬行或攀爬蠕虫的重症行为。由于 秀丽隐杆线虫 对光和电磁场敏感，这两者都会干扰引力偏好9，因此这些测定需要在没有任何刺激的情况下进行。如果使用自制的法拉第笼，检查笼子的强度并加固它是必要的，建议这样做。
本协议中描述的测定室长度约为54厘米，并放置在法拉第笼内以屏蔽光和电磁场。研究发现，改变观察重力行为的“竞技场”有几个优点。首先，它允许详细的量化和描述性分析。可以收集和比较蠕虫的相对行进距离和总体分布，而不是计算负重力蠕虫和正重力蠕虫的数量。其次，充满琼脂的移液管的封闭环境更接近地复制了可能在野外促进妊娠的条件。如上所述，dauer阶段是一个分散阶段，允许从不利条件6中逃逸。由于 Caenorhabditis 生活在堆肥中，其中可能无法获得诸如光之类的引导线索，因此重力可以使蠕虫导航到表面6，9。基于平板的二维测定不太可能复制这些条件，即使它们在没有其他刺激的情况下进行测试。最后，这种更大的设备在单次测定中测试更多的蠕虫。
限制和其他注意事项
虽然该协议有效地测量了大量dauers的重力偏好，但由于构建每个腔室所需的时间和材料，对于小型或单个蠕虫实验是不切实际的。通过合并试验中的计数而不是使用重力指数，统计功效得以提高，因为每个蠕虫都被视为一个独立的事件。虽然这种增强的灵敏度有助于区分重力和非重力蠕虫，但重要的是要注意秀 丽隐杆线虫 表现出可能影响整体重力的社交行为7，24 。我们发现，较高的蠕虫密度与在大规模测定中行进的距离的更大范围相关，尽管当总数小于大约 1，000 条蠕虫9 时，这种影响很小。在分析数据时，应监测由每个腔室中的蠕虫总数等因素引起的相互作用效应。与所有行为测定一样，评分应尽可能盲法。
找到溶液中蠕虫的平均密度可以最大限度地减少从一个腔室到另一个腔室注射的蠕虫数量的变化。蠕虫会迅速沉降在溶液中，因此在移液前通过轻弹试管或用宽口径吸头上下移液来混合蠕虫非常重要。即使达到一致的密度，添加的蠕虫数量也可能有所不同，因为蠕虫可能会粘附在塑料移液器吸头的内表面上。用BSA或其他溶液涂覆移液器吸头可以最大限度地减少这种影响。蠕虫必须注射尽可能少的溶液;如果向腔室中添加过多的液体，蠕虫将被困在溶液中，甚至可能漂移。出于这个原因，只能对活的爬行蠕虫进行评分，并且不得使用任何含有超过 50% 的死亡或游泳蠕虫的腔室。腔室应一次从法拉第笼中取出一个，并在 10-15 分钟内评分以获得最大精度。
潜在应用
该测定可用于测试各种Caenorhabditis菌株中妊娠动物的环境，遗传和细胞需求。到目前为止，光场和电磁场已被确定为干扰重力9的刺激。然而，秀丽隐杆线虫对其他刺激敏感，包括温度、挥发性和非挥发性化学物质、质地、湿度和声音，这会影响它们的行为25，26，27，28。了解各种感觉输入如何在神经系统内整合是神经科学中的一个悬而未决的问题，特别是当整合发生在单个神经元的水平上时9，29，30，31，32。感觉统合在本体感觉中尤为重要，本体感觉本身就是一种从多种感觉线索中汲取的整合方式1.
了解Caenorhabditis的重力感觉对人类健康有影响。仅在美国就有数百万人患有前庭功能障碍33，其中许多疾病具有潜在的遗传原因34，35。因此，基因候选物和靶向治疗的鉴定是一个活跃的研究领域36。此外，由于脊椎动物前庭和听觉系统在发育和进化上密切相关33，36，37，阐明重力感觉也可以提供对听力和听力障碍的洞察。
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Disclosures
作者声明没有竞争利益。
Acknowledgments
这项研究得到了美国国立卫生研究院对JHR的研究资助（#R01 5R01HD081266和#R01GM141493）。一些菌株由CGC提供，CGC由NIH研究基础设施计划办公室（P40 OD010440）资助。我们要感谢Pradeep Joshi（UCSB）的编辑投入。统计咨询由UCSB DATALAB提供。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1% Sodium Dodecyl Sulfate solution | From stock 10% (w/v) SDS in DI water | ||
| 15 mL Centrifuge tubes | Falcon | 14-959-53A | |
| 3 mm Hex key | Other similar sized metal tools may be used | ||
| 4% Agar in Normal Growth Medium (NGM) - 1 L | Prior to autoclaving: 3 g NaCl, 40 g Agar, 2.5 g Peptone, 2 g Dextrose, 10 mL Uracil (2 mg/mL), 500 μL Cholesterol (10 mg/mL), 1 mL CaCl2, 962 mL DI water; After autoclaving: 24.5 mL Phosphate Buffer, 1 mL 1 MgSO4 (1 M), 1 mL Streptomycin (200 mg/mL) | ||
| 5 mL Serological pipettes | Fisherbrand | S68228C | Polystyrene, not borosilicate glass |
| 60% Cold sucrose solution | 60% sucrose (w/v) in DI water; sterilize by filtration (0.45 μm filter). Keep at 4 °C | ||
| AF16 C. briggsae or other experimental strain | Available from the CGC (Caenorhabditis Genetics Center) | ||
| Bunsen burner | |||
| Cling-wrap | Fisherbrand | 22-305654 | |
| Clinical centrifuge | |||
| Disposable razor blades | Fisherbrand | 12-640 | |
| Faraday cage | Can be constructed using cardboard and aluminum foil; 30" L x 6" W x 26" H or larger | ||
| Ink markers | Sharpie or other brand for marking on plastic | ||
| Labeling tape | Carolina | 215620 | |
| M9 buffer | 22 mM KH2PO4, 42 mM Na2HPO4, 86 mM NaCl | ||
| N2 C. elegans strain | Available from the CGC (Caenorhabditis Genetics Center) | ||
| NGM plates with OP50 | 1.7% (w/v) agar in NGM (see description: 4% agar in NGM). Seed with OP50 | ||
| Paraffin film | Bemis | 13-374-10 | |
| Plastic cutting board | |||
| Pliers | |||
| Rotating vertical mixer | BTLab SYSTEMS | BT913 | With 22 x 15 mL tube bar |
| Serological pipettor | Corning | 357469 | |
| Stereo Microscope | Laxco | S2103LS100 | |
| Tally counter | ULINE | H-7350 | |
| Thick NGM/agar plate media - 1 L | See 4% Agar in NGM recipe; replace 40 g Agar with 20 g Agar | ||
| Tweezers |
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