Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Behavior
Click here for the English version

Behavior

Saggio gravitazionale su larga scala delle larve di Caenorhabditis dauer

Published: May 31, 2022 doi: 10.3791/64062
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Molecular Cellular and Developmental Biology, University of California

Summary

Il presente protocollo delinea i metodi per condurre un test gravitazionale su larga scala con larve di Caenorhabditis dauer. Questo protocollo consente una migliore rilevazione del comportamento della gravitassi rispetto a un test basato su piastra.

Abstract

La sensazione di gravità è un processo importante e relativamente poco studiato. Il rilevamento della gravità consente agli animali di navigare nell'ambiente circostante e facilita il movimento. Inoltre, la sensazione di gravità, che si verifica nell'orecchio interno dei mammiferi, è strettamente correlata all'udito - quindi, la comprensione di questo processo ha implicazioni per la ricerca uditiva e vestibolare. Esistono saggi di gravitassi per alcuni organismi modello, tra cui Drosophila. I singoli vermi sono stati precedentemente analizzati per la loro preferenza di orientamento mentre si depositano in soluzione. Tuttavia, non è stato descritto un test affidabile e robusto per Caenorhabditis gravitaxis. Il presente protocollo delinea una procedura per l'esecuzione di saggi di gravitasi che possono essere utilizzati per testare centinaia di caenorhabditis alla volta. Questo test su larga scala e a lunga distanza consente una raccolta dettagliata dei dati, rivelando fenotipi che potrebbero non essere rilevati in un test standard basato su piastra. Il movimento Dauer lungo l'asse verticale viene confrontato con i controlli orizzontali per garantire che la polarizzazione direzionale sia dovuta alla gravità. La preferenza gravitattica può quindi essere confrontata tra ceppi o condizioni sperimentali. Questo metodo può determinare i requisiti molecolari, cellulari e ambientali per la gravitassi nei vermi.

Introduction

Percepire l'attrazione gravitazionale della Terra è cruciale per l'orientamento, il movimento, la coordinazione e l'equilibrio di molti organismi. Tuttavia, i meccanismi molecolari e i neurocircuiti della sensazione di gravità sono poco compresi rispetto ad altri sensi. Negli animali, la sensazione di gravità interagisce e può essere superata da altri stimoli per influenzare il comportamento. Segnali visivi, feedback propriocettivi e informazioni vestibolari possono essere integrati per generare un senso di consapevolezza del corpo rispetto all'ambiente circostante di un animale 1,2. Al contrario, la preferenza gravitattica può essere alterata in presenza di altri stimoli 3,4,5. Pertanto, il comportamento gravitattico è ideale per studiare la sensazione di gravità e comprendere la complessa integrazione sensoriale e il processo decisionale del sistema nervoso.

C. elegans è un organismo modello particolarmente utile per lo studio della gravitassi a causa del suo ciclo di vita polifenico. Se esposte a fattori di stress durante lo sviluppo, tra cui calore, sovraffollamento o mancanza di cibo, le larve di C. elegans si sviluppano in dauers, che sono altamente resistenti allo stress6. Come dauers, i vermi svolgono comportamenti caratteristici, come la nictazione, in cui i vermi "stanno in piedi" sulla coda e agitano la testa, che possono facilitare la dispersione verso habitat migliori7. I saggi di gravitaxis di C. elegans e C. japonica suggeriscono che le larve di dauer gravitassano negativamente e che questo comportamento è più facilmente osservato nei pazienti che negli adulti 8,9. Il test della gravitassi in altri ceppi di Caenorhabditis può rivelare variazioni naturali nel comportamento gravitattico.

I meccanismi per la sensazione di gravità sono stati caratterizzati in Euglena, Drosophila, Ciona e varie altre specie usando i saggi di gravitaxis 3,10,11. Nel frattempo, gli studi sulla gravitaxis a Caenorhabditis inizialmente hanno fornito risultati contrastanti. Uno studio sulla preferenza orientativa di C. elegans ha scoperto che i vermi si orientano a testa bassa in soluzione, suggerendo una preferenza gravitattica positiva12. Nel frattempo, sebbene i dauers di C. japonica siano stati identificati precocemente come gravitattici negativi8, questo comportamento è stato descritto solo recentemente in C. elegans9. Diverse sfide sorgono nello sviluppo di un saggio di gravitaxis rappresentativo nei vermi. I ceppi di Caenorhabditis sono mantenuti su piastre di agar; Per questo motivo, i saggi comportamentali utilizzano tipicamente piastre di agar come parte del loro disegno sperimentale13,14,15. Il primo test di gravitassi riportato in Caenorhabditis è stato eseguito posizionando una piastra su un lato con un angolo di 90 ° rispetto alla piastra di controllo orizzontale8. Tuttavia, il comportamento della gravitassi non è sempre robusto in queste condizioni. Mentre i vermi adulti possono essere saggiati per la preferenza orientativa nella soluzione12, questa preferenza direzionale può anche essere dipendente dal contesto, portando a comportamenti diversi se i vermi strisciano piuttosto che nuotare. Inoltre, C. elegans è sensibile ad altri stimoli, tra cui la luce e i campi elettromagnetici16,17, che interferiscono con le loro risposte alla gravità9. Pertanto, un test di gravitassi aggiornato che scherma contro altre variabili ambientali è importante per sezionare i meccanismi di questo processo sensoriale.

Nel presente protocollo viene descritto un saggio per l'osservazione della Caenorhabditis gravitaxis. La configurazione di questo studio si basa in parte su un metodo sviluppato per studiare l'integrità neuromuscolare18,19. Le larve di Dauer sono coltivate e isolate con procedure standard20. Vengono quindi iniettati in camere costituite da due pipette sierologiche da 5 ml riempite con agar. Queste camere possono essere orientate verticalmente o orizzontalmente e posizionate all'interno di una gabbia di Faraday buia per 12-24 ore per schermare dalla luce e dai campi elettromagnetici. La posizione di ciascun verme nelle camere viene registrata e confrontata con i taxi verticali di un ceppo di riferimento come C. elegans N2.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

I ceppi utilizzati nel presente studio sono C. elegans (N2) e C. briggsae (AF16) (vedi tabella dei materiali). Per ogni test è stata utilizzata una popolazione mista di dauers.

1. Preparazione della camera

  1. Lavora in una cappa aspirante. Impostare l'area di lavoro con un bruciatore Bunsen, 1-2 lamette da barba, pinze, pinzette e una superficie di taglio in plastica (vedere Tabella dei materiali).
  2. Per ogni camera, raccogliere due pipette sierologiche da 5 ml. Rimuovere il tappo di cotone da una pipetta con una pinzetta. Tenere una lametta sul bruciatore Bunsen fino a quando non è caldo usando le pinze. Utilizzare la lama riscaldata per tagliare l'estremità affusolata della seconda pipetta in modo che l'intera pipetta abbia un diametro uniforme (Figura 1A).
  3. Lavorando rapidamente, avvicinare le due estremità della pipetta modificate alla fiamma, sciogliendole leggermente. Unire queste estremità premendole saldamente insieme, assicurandosi che le pareti di entrambe le pipette siano continue. Se dopo l'unione sono visibili degli spazi vuoti, spezzarli e ripetere questo passaggio (Figura 1A,B).

2. Riempire le camere con agar

  1. Preparare NGM con agar al 4% secondo le procedure standard di vite senza fine21. Mentre l'agar è ancora fuso, riempire ogni camera collegandola ad un pipettor sierologico e aspirando lentamente la soluzione. Sigillare la punta con pellicola di paraffina prima di rimuovere la camera dal pipettatore. Appoggiare la camera piatta (parallela al piano di lavoro) per raffreddare.
    NOTA: Coprire il matraccio con pellicola trasparente (vedere Tabella dei materiali) dopo l'autoclave aiuta a prevenire la formazione di bolle nella soluzione18.
    1. Per ridurre al minimo eventuali variazioni nella consistenza dell'agar dovute a un raffreddamento irregolare, tenere il pipettatore (vedere la tabella dei materiali) parallelo al piano del banco mentre si disegna l'agar. Appoggiare le camere piatte sul piano di lavoro e lasciare che l'agar si indurisca prima di muoversi.
      NOTA: la percentuale di agar e il contenuto multimediale possono essere adattati all'esperimento. L'agar al 4% è più rigido della concentrazione di circa il 2% utilizzata per il versamento delle piastre e impedisce ai vermi di scavare attraverso il mezzo nelle nostre mani. Tuttavia, altri sperimentatori hanno osservato il comportamento di scavare da parte di vermi adulti fino al 9% di agar18,19.
  2. Una volta raffreddato, riscaldare una chiave esagonale da 3 mm (o un altro strumento metallico delle stesse dimensioni, vedi Tabella dei materiali) su un bruciatore Bunsen. Premerlo saldamente nella parete di ciascuna camera a circa 5 mm da un lato della linea mediana, creando una piccola apertura nella plastica (Figura 1C). Utilizzare una lama riscaldata per rimuovere il cotone e le estremità affusolate della camera e sigillare queste estremità con pellicola di paraffina.
    NOTA: Una volta preparata, ogni camera deve essere utilizzata entro 1 giorno o mantenuta a 4 °C per diversi giorni. Coprire eventuali aperture esposte con pellicola di paraffina per evitare che l'agar si secchi.

3. Larve di dauer isolanti

  1. 10-15 giorni prima dell'esperimento, suddividere ogni ceppo su 2-3 grandi piastre NGM con batteri OP50 e avvolgere con pellicola di paraffina. Dopo 10-15 giorni, ogni piatto deve essere completamente affamato con migliaia di larve di dauer presenti sull'agar, sulle pareti e sui coperchi.
    NOTA: Prepara i piatti in anticipo usando una ricetta OP50 spessa per il massimo affollamento (vedi Tabella dei materiali). La formazione di Dauer può anche essere indotta attraverso altri metodi, tra cui l'aggiunta di feromoni o crescendo a temperature più elevate22.
  2. Raccogliere i vermi sciacquando i coperchi e le piastre con tampone M9 e pipettando la soluzione in provette da centrifuga da 15 ml. Girare a 1.600 x g per 30-60 s a temperatura ambiente e aspirare la maggior parte del tampone M9 con una pipetta o un aspiratore a vuoto.
  3. Isolare i pazienti trattando con SDS all'1% seguito da un gradiente di flottazione del 30% di saccarosio seguendo il rapporto20 precedentemente pubblicato.
    1. Aggiungere 7 mL di soluzione SDS all'1% a ciascun pellet di verme. Lasciare i worm in SDS per 30 minuti; Ruotare continuamente i tubi durante questo periodo per consentire l'aerazione. Risciacquare 3-5 volte con M9 per rimuovere il detergente.
    2. Quindi, aggiungere 5 ml di M9 seguiti da 5 ml di soluzione fredda filtrata al 60% di saccarosio. Mescolare accuratamente, quindi centrifugare a 1.600 x g per 5 minuti a temperatura ambiente per creare un gradiente di separazione.
  4. Riempire le nuove provette da centrifuga da 15 mL con 2 mL di tampone M9. Schiacciare le estremità delle pipette Pasteur di vetro per allargare il foro e utilizzare queste pipette per trasferire lo strato superiore della soluzione (contenente dauers isolati) dal gradiente di saccarosio ai nuovi tubi. Risciacquare i dauers 3-5x con M9.
    NOTA: Ci saranno migliaia di dauers isolati in soluzione a questo punto. Possono essere utilizzati immediatamente o mantenuti aerati ruotando in 5-7 mL M9 durante la notte.

4. Aggiunta di dauers alla camera

  1. Centrifugare a 1.600 x g per 5 minuti a temperatura ambiente e aspirare la maggior parte della soluzione M9 con una pipetta o un aspiratore a vuoto. Per stimare la densità dei vermi, contare manualmente il numero di vermi in tre goccioline separate da 1 μL al microscopio da dissezione. Utilizzare la media di questi conteggi per approssimare il numero di vermi per μL.
    NOTA: alcuni pipettatori di piccolo volume potrebbero non essere in grado di raggiungere il fondo di una provetta da centrifuga da 15 ml; In questo caso, una goccia concentrata di vermi può essere trasferita prima su un pezzo di film di paraffina.
  2. Tagliare l'estremità di una punta di pipetta da 10, 20 o 200 μL per allargare il foro. Impostare la micropipetta su un volume leggermente maggiore rispetto al volume di aspirazione previsto. Aspirare circa 1-2 μL della soluzione concentrata di vite senza fine (idealmente tra 100-300 vermi) e lasciare entrare una piccola quantità di aria nella punta.
    NOTA: Un gran numero di worm (1.000+) in una camera può aumentare la gamma di distanze percorse a causa del sovraffollamento9.
  3. Spingere delicatamente la punta della pipetta nell'agar mentre si preme la micropipetta. Questo creerà un sito di iniezione nell'agar senza intasare la punta. Rilascia i vermi nell'agar. Utilizzare la pellicola di paraffina per sigillare l'apertura.

5. Esecuzione e assegnazione del punteggio del test

NOTA: La gravitassi può essere testata in varie condizioni che possono influenzare il comportamento9.

  1. Per eliminare il maggior numero possibile di variabili, posizionare le camere all'interno di una gabbia di Faraday buia (vedi Tabella dei materiali) a temperatura ambiente.
  2. Etichettare ogni camera e appenderla verticalmente all'interno della gabbia di Faraday (eseguire questa operazione utilizzando nastro adesivo). Testare i controlli orizzontali contemporaneamente posizionando alcune camere piatte nelle stesse condizioni ambientali. Testare i ceppi sperimentali contro i vermi N2 orientati verticalmente come controllo positivo. Utilizzare camere orientate orizzontalmente contenenti Dauers N2 come controllo negativo aggiuntivo.
    NOTA: I saggi orizzontali e verticali devono essere eseguiti nello stesso ambiente all'interno del laboratorio per ridurre al minimo la variabilità ambientale tra le due condizioni. Una grande incubatrice può essere utilizzata per ospitare entrambe le gabbie di Faraday.
  3. I Dauer iniziano a disperdersi dal sito di partenza dopo poche ore e impiegano diverse ore per raggiungere entrambe le estremità della camera. Lasciare le camere indisturbate durante questo periodo e segnare entro 12-24 ore dopo l'iniezione.
    NOTA: Non utilizzare un paralitico (come l'azoturo di sodio) per immobilizzare i vermi che hanno raggiunto le estremità delle camere. Poiché viene misurata la distribuzione complessiva dei vermi invece di un indice di preferenza (come in un test a due scelte), l'azoturo di sodio non è necessario e può alterare i risultati.
  4. Rimuovere e segnare le camere gravitaxis una alla volta. Cerca i dauers vivi al microscopio da dissezione e segna le loro posizioni con l'inchiostro (Figura 1C, D). Non segnare i vermi entro 2,5 cm da entrambi i lati del sito di iniezione, poiché è improbabile che questi vermi dimostrino una preferenza direzionale.
    1. Inoltre, evitare di segnare vermi che sembrano morti o sono intrappolati nel liquido. Eliminare eventuali camere contenenti >50% di vermi morti o nuotatori.
      NOTA: una volta che la camera è stata rimossa dall'area di prova, deve essere valutata prontamente per la precisione. I dauer devono essere visibili solo tra la superficie dell'agar e la parete della pipetta. Se si osserva un comportamento di scavatura, considerare l'aumento della concentrazione di agar nei test futuri.
  5. Per quantificare i risultati, utilizzare un marcatore per dividere ciascuna metà della camera in sette sezioni di 3,5 cm a partire da 2,5 cm di distanza dal sito di iniezione (su alcune pipette, 3,5 cm = 1 mL di volume). Utilizzare un contatore di conteggio manuale (vedere Tabella dei materiali) per calcolare il numero di vermi osservati in ogni sezione.
    NOTA: ci dovrebbero essere sette sezioni su ciascun lato dell'origine, che possono essere numerate da -7 (in basso) a +7 (in alto). Questi numeri devono corrispondere alle stesse posizioni relative in base a come sono state costruite le camere; L'agar viene estratto dall'estremità -7 all'estremità +7 nel passaggio 2.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Confronto tra gravitassi tra specie
Seguendo la procedura sopra descritta, C. briggsae dauer gravitaxis può essere confrontato con C. elegans gravitaxis e controlli orizzontali. La distribuzione verticale (marrone) dei dauers di C. briggsae è inclinata verso le sommità delle camere, con una grande percentuale di vermi che raggiunge +7 (Figura 2A). In contrasto con i controlli orizzontali (aqua), in cui i dauers sono distribuiti in una curva approssimativamente a campana attorno al centro delle camere, questa tendenza indica un comportamento gravitattico negativo. Questi dati possono essere confrontati con C. elegans gravitaxis eseguita negli stessi giorni sperimentali (Figura 2B).

Un test di Kruskal-Wallis seguito dal test di Dunn con correzione di Bonferroni per confronti multipli ha determinato differenze significative tra i saggi 9,23. In questo esperimento, 1.108 Dauers di C. briggsae sono stati valutati in tre camere verticali da due giorni sperimentali indipendenti. Questi vermi migravano significativamente verso l'alto rispetto ai controlli orizzontali (p < 0,001; 1.639 dauers in tre camere orizzontali in 2 giorni sperimentali). Inoltre, le distribuzioni verticali di C. briggsae e C. elegans verticali non differivano (p > 0,05; 386 C. elegans dauers in due camere verticali in 2 giorni sperimentali). Questi risultati suggeriscono che i dauers di C. briggsae mostrano un comportamento gravitasico negativo simile a quello di C. elegans dauers.

Figure 1
Figura 1: Configurazione della camera di analisi dei gravitaxi. Foto raffiguranti le fasi della preparazione della camera di analisi della gravitaxi. (A) Sono state preparate pipette individuali da 5 mL per la fusione in un'unica camera. Rimozione del tappo di cotone indicato con punta di freccia nera; rimozione della punta indicata con una punta di freccia bianca. I tubi utilizzati in questo studio hanno un diametro interno di 6 mm e sono lunghi ciascuno 34,5 cm (prima del taglio). (B) Camera completata prima dell'aggiunta di agar NGM. Le pipette sono state fuse prima fondendosi su un bruciatore Bunsen. (C) Esempio di camere riempite con agar NGM. Il sito di iniezione è indicato con una freccia e ingrandito nel riquadro. I vermi sono stati contrassegnati con inchiostro e le linee sono disegnate per distinguere le distanze insieme alla camera e per facilitare il punteggio. (D) Vista delle camere nella loro interezza (presa dopo il punteggio). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 2
Figura 2: Gravitaxis in C. briggsae vs. C. elegans. Risultati della gravitaxis in C. briggsae e C. elegans. (A) Istogramma di C. briggsae gravitaxis. Il movimento nelle camere verticali (marrone) viene confrontato con i controlli orizzontali (aqua). La distanza dal punto di iniezione (-7 è il più lontano sotto, +7 più lontano sopra) è tracciata come la percentuale di vermi totali saggiati (asse x). Non vengono tracciati dati per l'origine (+0) poiché i vermi non vengono contati entro 2,5 cm da entrambi i lati del sito di iniezione. N = 1.639 vermi su tre tubi nella condizione orizzontale; verticale N = 1.108 vermi su tre tubi. (B) Boxplots che confrontano la distribuzione dei vermi orizzontali e verticali di C. briggsae rispetto ai vermi verticali di C. elegans. Le dimensioni del campione di C. briggsae sono indicate sopra. C. elegans verticale N = 386 vermi su due tubi. I mezzi sono indicati con diamanti bianchi; le condizioni verticali sono in marrone e sono etichettate "V", e le condizioni orizzontali ("H") sono in acqua. I confronti sono stati effettuati utilizzando il test di Kruskal-Wallis, seguito dal test di Dunn con correzione di Bonferroni per confronti multipli. Nessuna stella = p > 0,05, **** = p < 0,0001. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Confronto con i metodi precedenti
A differenza della chemiotassi, la gravitassi in Caenorhabditis non può essere osservata in modo affidabile utilizzando un tradizionale progetto sperimentale di piastra di agar. Una capsula di Petri standard ha un diametro di 150 mm, risultando in soli 75 mm disponibili in entrambe le direzioni per i dauers per dimostrare la preferenza per la gravitaxi. Sebbene la preferenza orientativa di C. elegans possa essere saggiata nella soluzione12, questo metodo ha un basso rendimento in quanto i vermi devono essere analizzati uno alla volta. Inoltre, le preferenze e i comportamenti gravitattici possono differire tra i worm che fluttuano nei media rispetto a quelli che strisciano su una superficie. Per questi motivi, abbiamo sviluppato un test ad alto rendimento con una maggiore sensibilità che può essere utilizzato per analizzare il comportamento della gravitassi nei vermi striscianti o rampicanti. Poiché C. elegans è sensibile alla luce e ai campi elettromagnetici, entrambi i quali interferiscono con la preferenza gravitattica9, questi test devono essere eseguiti senza alcuno stimolo. Se viene utilizzata una gabbia di Faraday fatta in casa, è necessario e raccomandato controllare la forza della gabbia e rinforzarla.

Le camere di analisi descritte in questo protocollo misurano circa 54 cm di lunghezza e sono collocate all'interno di gabbie di Faraday per schermare dalla luce e dai campi elettromagnetici. Si è scoperto che cambiare l'"arena" per osservare il comportamento della gravitassi ha diversi vantaggi. In primo luogo, consente una quantificazione dettagliata e un'analisi descrittiva. Le distanze relative percorse e le distribuzioni complessive dei vermi possono essere raccolte e confrontate invece di contare il numero di vermi negativamente rispetto a quelli gravitattici positivi. In secondo luogo, l'ambiente chiuso di una pipetta riempita di agar replica più da vicino le condizioni che possono promuovere la gravitassi in natura. Come detto sopra, lo stadio dauer è una fase di dispersione che consente di fuggire da condizioni sfavorevoli6. Poiché Caenorhabditis vive nel compost, dove i segnali guida come la luce potrebbero non essere disponibili, la gravità può consentire ai vermi di navigare verso la superficie 6,9. È improbabile che i saggi bidimensionali basati su piastre replichino queste condizioni anche se vengono testati senza altri stimoli. Infine, questo apparecchio più grande testa grandi quantità di vermi in un singolo test.

Limitazioni e altre considerazioni
Mentre questo protocollo misura efficacemente la preferenza gravitattica in un gran numero di dauers, non è pratico per esperimenti di vermi piccoli o singoli a causa del tempo e dei materiali necessari per costruire ciascuna camera. Combinando i conteggi tra le prove piuttosto che utilizzando un indice di gravitaxi, la potenza statistica è aumentata perché ogni worm viene trattato come un evento indipendente. Mentre questa maggiore sensibilità è utile per differenziare i vermi gravitattici e non gravitattici, è importante notare che i Dauers di C. elegans mostrano comportamenti sociali 7,24 che potrebbero influenzare la gravitassi complessiva. Abbiamo scoperto che densità di vermi più elevate sono correlate con un intervallo maggiore nella distanza percorsa nel corso del saggio su larga scala, sebbene questo effetto sia minimo quando il conteggio totale è inferiore a circa 1.000 vermi9. Gli effetti di interazione derivanti da fattori quali i vermi totali in ciascuna camera devono essere monitorati durante l'analisi dei dati. Come con tutti i test comportamentali, il punteggio dovrebbe essere cieco quando possibile.

Trovare una densità media di vermi nella soluzione può ridurre al minimo la variabilità del numero di vermi iniettati da camera a camera. I vermi si depositano rapidamente in soluzione, quindi è importante mescolare i vermi prima del pipettaggio, facendo scorrere i tubi o pipettando su e giù con una punta a foro largo. Anche quando si raggiunge una densità costante, il numero di vermi aggiunti può variare perché è probabile che i vermi si attacchino alla superficie interna delle punte delle pipette in plastica. Il rivestimento delle punte delle pipette con BSA o altre soluzioni potrebbe ridurre al minimo questo effetto. I vermi devono essere iniettati con la minor soluzione possibile; Se viene aggiunto troppo liquido alla camera, i vermi rimarranno intrappolati nella soluzione e potrebbero persino andare alla deriva. Per questo motivo, possono essere valutati solo vermi vivi e striscianti e non devono essere utilizzate camere contenenti più del 50% di vermi morti o nuotatori. Le camere devono essere rimosse dalla gabbia di Faraday una alla volta e segnate entro 10-15 minuti per la massima precisione.

Potenziali applicazioni
Questo test può essere utilizzato per testare i requisiti ambientali, genetici e cellulari per i gravitassi in una varietà di ceppi di Caenorhabditis. Finora, la luce e i campi elettromagnetici sono stati identificati come stimoli che interferiscono con la gravitassi9. Tuttavia, C. elegans è sensibile ad altri stimoli, tra cui temperatura, sostanze chimiche volatili e non volatili, consistenza, umidità e suono, che influenzano il loro comportamento25,26,27,28. Capire come i vari input sensoriali sono integrati all'interno del sistema nervoso è una questione eccezionale nelle neuroscienze, in particolare quando l'integrazione avviene a livello dei singoli neuroni 9,29,30,31,32. L'integrazione sensoriale è particolarmente importante nella propriocezione, che è essa stessa una modalità integrativa che attinge da molteplici segnali sensoriali1.

Comprendere la sensazione di gravità in Caenorhabditis ha implicazioni per la salute umana. Milioni di individui soffrono di disfunzione vestibolare solo negli Stati Uniti33, e molti di questi disturbi hanno cause genetiche sottostanti34,35. Per questo motivo, l'identificazione di candidati genici e terapie mirate è un settore attivo della ricerca36. Inoltre, poiché i sistemi vestibolare e uditivo dei vertebrati sono strettamente collegati evolutivamente ed evolutivamente33,36,37, chiarire la sensazione di gravità potrebbe anche fornire informazioni sull'udito e sui disturbi dell'udito.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Gli autori non dichiarano interessi concorrenti.

Acknowledgments

Questa ricerca è stata sostenuta da borse di ricerca del National Institutes of Health al JHR (#R01 5R01HD081266 e #R01GM141493). Alcuni ceppi sono stati forniti dal CGC, che è finanziato dall'Ufficio NIH dei programmi di infrastruttura di ricerca (P40 OD010440). Vorremmo ringraziare Pradeep Joshi (UCSB) per il suo contributo editoriale. Consulenza statistica fornita dall'UCSB DATALAB.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1% Sodium Dodecyl Sulfate solution From stock 10% (w/v) SDS in DI water
15 mL Centrifuge tubes Falcon 14-959-53A
3 mm Hex key Other similar sized metal tools may be used
4% Agar in Normal Growth Medium (NGM) - 1 L Prior to autoclaving: 3 g NaCl, 40 g Agar, 2.5 g Peptone, 2 g Dextrose, 10 mL Uracil (2 mg/mL), 500 μL Cholesterol (10 mg/mL), 1 mL CaCl2, 962 mL DI water; After autoclaving: 24.5 mL Phosphate Buffer, 1 mL 1 MgSO4 (1 M), 1 mL Streptomycin (200 mg/mL)
5 mL Serological pipettes Fisherbrand S68228C Polystyrene, not borosilicate glass
60% Cold sucrose solution 60% sucrose (w/v) in DI water; sterilize by filtration (0.45 μm filter). Keep at 4 °C
AF16 C. briggsae or other experimental strain Available from the CGC (Caenorhabditis Genetics Center)
Bunsen burner
Cling-wrap Fisherbrand 22-305654
Clinical centrifuge
Disposable razor blades Fisherbrand 12-640
Faraday cage Can be constructed using cardboard and aluminum foil; 30" L x 6" W x 26" H or larger
Ink markers Sharpie or other brand for marking on plastic
Labeling tape Carolina 215620
M9 buffer 22 mM KH2PO4, 42 mM Na2HPO4, 86 mM NaCl
N2 C. elegans strain Available from the CGC (Caenorhabditis Genetics Center)
NGM plates with OP50 1.7% (w/v) agar in NGM (see description: 4% agar in NGM). Seed with OP50
Paraffin film Bemis 13-374-10
Plastic cutting board
Pliers
Rotating vertical mixer BTLab SYSTEMS BT913 With 22 x 15 mL tube bar
Serological pipettor Corning 357469
Stereo Microscope Laxco S2103LS100
Tally counter ULINE H-7350
Thick NGM/agar plate media - 1 L See 4% Agar in NGM recipe; replace 40 g Agar with 20 g Agar
Tweezers

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Peterka, R. J. Sensory integration for human balance control. Handbook of Clinical Neurology. 159, 27-42 (2018).
  2. Lacquaniti, F., et al. Multisensory Integration and Internal Models for Sensing Gravity Effects in Primates. BioMed Research International. 2014, 61584 (2014).
  3. Bostwick, M., et al. Antagonistic inhibitory circuits integrate visual and gravitactic behaviors. Current Biology. 30 (4), 600-609 (2020).
  4. Ntefidou, M., Richter, P., Streb, C., Lebert, M., Hader, D. -P. High light exposure leads to a sign change in gravitaxis of the flagellate Euglena gracilis. Journal of Gravitational Physiology. 9 (1), 277-278 (2002).
  5. Fedele, G., Green, E. W., Rosato, E., Kyriacou, C. P. An electromagnetic field disrupts negative geotaxis in Drosophila via a CRY-dependent pathway. Nature Communications. 5, 4391 (2014).
  6. Frézal, L., Félix, M. -A. C. elegans outside the Petri dish. eLife. 4, 05849 (2015).
  7. Lee, H., et al. a dispersal behavior of the nematode Caenorhabditis elegans, is regulated by IL2 neurons. Nature Neuroscience. 15 (1), 107-112 (2012).
  8. Okumura, E., Tanaka, R., Yoshiga, T. Negative gravitactic behavior of Caenorhabditis japonica dauer larvae. The Journal of Experimental Biology. 216, 1470-1474 (2013).
  9. Ackley, C., et al. Parallel mechanosensory systems are required for negative gravitaxis in C. elegans. bioRxiv. , (2022).
  10. Häder, D. -P., Hemmersbach, R. Gravitaxis in Euglena. Euglena: Biochemistry, Cell and Molecular Biology. Schwartzbach, S. D., Shigeoka, S. , Springer International Publishing. 237-266 (2017).
  11. Sun, Y., et al. TRPA channels distinguish gravity sensing from hearing in Johnston's organ. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (32), 13606-13611 (2009).
  12. Chen, W. -L., Ko, H., Chuang, H. -S., Raizen, D. M., Bau, H. H. Caenorhabditis elegans exhibits positive gravitaxis. BMC Biology. 19 (1), 186 (2021).
  13. Ward, S. Chemotaxis by the nematode Caenorhabditis elegans: Identification of attractants and analysis of the response by use of mutants. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 70 (3), 817-821 (1973).
  14. Bargmann, C. I., Hartwieg, E., Horvitz, H. R. Odorant-selective genes and neurons mediate olfaction in C. elegans. Cell. 74 (3), 515-527 (1993).
  15. Margie, O., Palmer, C., Chin-Sang, I. C. elegans chemotaxis assay. Journal of Visualized Experiments. (74), e50069 (2013).
  16. Ward, A., Liu, J., Feng, Z., Xu, X. Z. S. Light-sensitive neurons and channels mediate phototaxis in C. elegans. Nature Neuroscience. 11 (8), 916-922 (2008).
  17. Vidal-Gadea, A., et al. Magnetosensitive neurons mediate geomagnetic orientation in Caenorhabditis elegans. eLife. 4, 07493 (2015).
  18. Bainbridge, C., Schuler, A., Vidal-Gadea, A. G. Method for the assessment of neuromuscular integrity and burrowing choice in vermiform animals. Journal of Neuroscience Methods. 264, 40-46 (2016).
  19. Beron, C., et al. The burrowing behavior of the nematode Caenorhabditis elegans: a new assay for the study of neuromuscular disorders. Genes, Brain and Behavior. 14 (4), 357-368 (2015).
  20. Ow, M. C., Hall, S. E. A Method for obtaining large populations of synchronized Caenorhabditis elegans dauer larvae. Methods in Molecular Biology. , 209-219 (2015).
  21. Chaudhuri, J., Parihar, M., Pires-daSilva, A. An introduction to worm lab: from culturing worms to mutagenesis. Journal of Visualized Experiments. (47), e2293 (2011).
  22. Karp, X. Working with dauer larvae. WormBook. , 1-19 (2018).
  23. Dinno, A. Nonparametric pairwise multiple comparisons in independent groups using Dunn's test. The Stata Journal. 15 (1), 292-300 (2015).
  24. Gray, J. M., et al. Oxygen sensation and social feeding mediated by a C. elegans guanylate cyclase homologue. Nature. 430 (6997), 317-322 (2004).
  25. Goodman, M. B., Sengupta, P. How Caenorhabditis elegans senses mechanical stress, temperature, and other physical stimuli. Genetics. 212 (1), 25-51 (2019).
  26. Iliff, A. J., Xu, X. Z. S. C. elegans: a sensible model for sensory biology. Journal of Neurogenetics. 34 (3-4), 347-350 (2020).
  27. Russell, J., Vidal-Gadea, A. G., Makay, A., Lanam, C., Pierce-Shimomura, J. T. Humidity sensation requires both mechanosensory and thermosensory pathways in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (22), 8269-8274 (2014).
  28. Iliff, A. J., et al. The nematode C. elegans senses airborne sound. Neuron. 109 (22), 3633-3646 (2021).
  29. Metaxakis, A., Petratou, D., Tavernarakis, N. Multimodal sensory processing in Caenorhabditis elegans. Open Biology. 8 (6), 180049 (2018).
  30. Wicks, S., Rankin, C. Integration of mechanosensory stimuli in Caenorhabditis elegans. The Journal of Neuroscience. 15, 3 Pt 2 2434-2444 (1995).
  31. Chen, X., Chalfie, M. Modulation of C. elegans touch sensitivity is integrated at multiple levels. The Journal of Neuroscience. 34 (19), 6522-6536 (2014).
  32. Stockand, J. D., Eaton, B. A. Stimulus discrimination by the polymodal sensory neuron. Commun. Integrative Biology. 6 (2), 23469 (2013).
  33. Mackowetzky, K., Yoon, K. H., Mackowetzky, E. J., Waskiewicz, A. J. Development and evolution of the vestibular apparatuses of the inner ear. Journal of Anatomy. 239 (4), 801-828 (2021).
  34. Eppsteiner, R. W., Smith, R. J. H. Genetic disorders of the vestibular system. Current Opinion in Otolaryngology & Head and Neck Surgery. 19 (5), 397-402 (2011).
  35. Roman-Naranjo, P., Gallego-Martinez, A., Lopez Escamez, J. A. Genetics of vestibular syndromes. Current Opinion in Neurology. 31 (1), 105-110 (2018).
  36. Mei, C., et al. Genetics and the individualized therapy of vestibular disorders. Frontiers in Neurology. 12, 633207 (2021).
  37. Weghorst, F. P., Cramer, K. S. The evolution of hearing and balance. eLife. 8, 44567 (2019).

Tags

Comportamento Numero 183
Saggio gravitazionale su larga scala delle larve di <em>Caenorhabditis</em> dauer
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ackley, C., Washiashi, L.,… More

Ackley, C., Washiashi, L., Krishnamurthy, R., Rothman, J. H. Large-Scale Gravitaxis Assay of Caenorhabditis Dauer Larvae. J. Vis. Exp. (183), e64062, doi:10.3791/64062 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter