Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Behavior
Click here for the English version

Behavior

Storskalig gravitaxanalys av Caenorhabditis Dauer larver

Published: May 31, 2022 doi: 10.3791/64062
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Molecular Cellular and Developmental Biology, University of California

Summary

Detta protokoll beskriver metoder för att genomföra en storskalig gravitaxisanalys med Caenorhabditis dauer larver. Detta protokoll möjliggör bättre detektion av gravitaxis beteende jämfört med en plattbaserad analys.

Abstract

Gravitationssensation är en viktig och relativt understuderad process. Att känna av gravitationen gör det möjligt för djur att navigera i sin omgivning och underlättar rörelse. Dessutom är tyngdkraftskänslan, som uppträder i däggdjurets inre öra, nära besläktad med hörseln - så att förstå denna process har konsekvenser för hörsel och vestibulär forskning. Gravitaxisanalyser finns för vissa modellorganismer, inklusive Drosophila. Enstaka maskar har tidigare analyserats för sin orienteringspreferens när de bosätter sig i lösning. En tillförlitlig och robust analys för Caenorhabditis gravitaxis har dock inte beskrivits. Det nuvarande protokollet beskriver ett förfarande för att utföra gravitaxisanalyser som kan användas för att testa hundratals Caenorhabditis dauers åt gången. Denna storskaliga, långdistansanalys möjliggör detaljerad datainsamling och avslöjar fenotyper som kan missas på en standardplattbaserad analys. Dauer-rörelse längs den vertikala axeln jämförs med horisontella kontroller för att säkerställa att riktningsförspänning beror på tyngdkraften. Gravitaktisk preferens kan sedan jämföras mellan stammar eller experimentella förhållanden. Denna metod kan bestämma molekylära, cellulära och miljömässiga krav för gravitaxis i maskar.

Introduction

Att känna av jordens gravitationskraft är avgörande för många organismers orientering, rörelse, koordination och balans. De molekylära mekanismerna och neurokretsarna för gravitationssensation är emellertid dåligt förstådda jämfört med andra sinnen. Hos djur interagerar gravitationskänslan med och kan konkurreras ut av andra stimuli för att påverka beteendet. Visuella ledtrådar, proprioceptiv feedback och vestibulär information kan integreras för att skapa en känsla av kroppsmedvetenhet i förhållande till ett djurs omgivning 1,2. Omvänt kan gravitaktisk preferens ändras i närvaro av andra stimuli 3,4,5. Därför är gravitaktiskt beteende idealiskt för att studera gravitationskänsla och förstå nervsystemets komplexa sensoriska integration och beslutsfattande.

C. elegans är en särskilt användbar modellorganism för att studera gravitaxis på grund av dess polyfeniska livscykel. När de utsätts för stressfaktorer under utveckling, inklusive värme, överbeläggning eller brist på mat, utvecklas C. elegans larver till dauers, som är mycket stressresistenta6. Som dauers utför maskar karakteristiska beteenden, såsom nictation, där maskar "står" på sina svansar och viftar med huvudet, vilket kan underlätta spridning till bättre livsmiljöer7. Gravitaxisanalyser av C. elegans och C. japonica tyder på att dauerlarver negativt gravitax, och att detta beteende lättare observeras hos dauers än hos vuxna 8,9. Testning av gravitaxis i andra Caenorhabditis-stammar kan avslöja naturlig variation i gravitaktiskt beteende.

Mekanismer för gravitationskänsla har karakteriserats i Euglena, Drosophila, Ciona och olika andra arter med hjälp av gravitaxanalys 3,10,11. Samtidigt gav gravitaxisstudier i Caenorhabditis initialt blandade resultat. En studie av C. elegans orienteringspreferens fann att maskar orienterar med huvudet nedåt i lösning, vilket tyder på positiv gravitaktisk preferens12. Under tiden, även om C. japonica dauers tidigt identifierades som negativt gravitaktiska8, har detta beteende först nyligen beskrivits i C. elegans9. Flera utmaningar uppstår vid utvecklingen av en representativ gravitaxisanalys i maskar. Caenorhabditis stammar upprätthålls på agarplattor; Av denna anledning använder beteendeanalyser vanligtvis agarplattor som en del av deras experimentella design13,14,15. Den tidigaste rapporterade gravitaxisanalysen i Caenorhabditis utfördes genom att en platta stod på sidan i 90 ° vinkel mot den horisontella styrplattan8. Gravitaxis beteende är dock inte alltid robust under dessa förhållanden. Medan vuxna maskar kan analyseras för orienteringspreferens i lösning12, kan denna riktningspreferens också vara kontextberoende, vilket leder till olika beteenden om maskarna kryper snarare än simmar. Dessutom är C. elegans känslig för andra stimuli, inklusive ljus och elektromagnetiska fält16,17, som stör deras svar på tyngdkraften9. Därför är en uppdaterad gravitaxanalys som skyddar mot andra miljövariabler viktig för att dissekera mekanismerna i denna sensoriska process.

I detta protokoll beskrivs en analys för att observera Caenorhabditis gravitaxis. Upplägget för denna studie bygger delvis på en metod som utvecklats för att studera neuromuskulär integritet18,19. Dauerlarver odlas och isoleras med hjälp av standardprocedurer20. De injiceras sedan i kamrar gjorda av två 5 ml serologiska pipetter fyllda med agar. Dessa kamrar kan orienteras vertikalt eller horisontellt och placeras i en mörk Faraday-bur i 12-24 timmar för att skydda mot ljus och elektromagnetiska fält. Placeringen av varje mask i kamrarna registreras och jämförs med de vertikala taxibilarna för en referensstam som C. elegans N2.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

De stammar som används i denna studie är C. elegans (N2) och C. briggsae (AF16) (se materialförteckning). En blandad könspopulation av dauers användes för varje analys.

1. Förberedelse av kammaren

  1. Arbeta i en dragskåp. Ställ in arbetsytan med en Bunsen-brännare, 1-2 rakblad, tång, pincett och en plastskäryta (se Materialförteckning).
  2. För varje kammare, samla två 5 ml serologiska pipetter. Ta bort bomullspluggen från en pipett med pincett. Håll ett rakblad över Bunsenbrännaren tills det är varmt med en tång. Använd det uppvärmda bladet för att skära av den avsmalnande änden av den andra pipetten så att hela pipetten har en jämn diameter (figur 1A).
  3. Arbeta snabbt, ta de två modifierade pipettändarna nära lågan och smälta dem något. Gå med i dessa ändar genom att trycka dem ordentligt ihop och se till att väggarna i båda pipetterna är kontinuerliga. Om några luckor är synliga efter sammanfogningen, bryt isär dem och upprepa detta steg (figur 1A,B).

2. Fyll kamrarna med agar

  1. Förbered NGM med 4% agar enligt standardmaskprocedurer21. Medan agaren fortfarande är smält, fyll varje kammare genom att fästa den på en serologisk pipettor och långsamt dra upp lösningen. Försegla spetsen med paraffinfilm innan du tar bort kammaren från pipatorn. Lägg kammaren platt (parallellt med bänkskivan) för att svalna.
    OBS: Att täcka kolven med plastfolie (se materialförteckning) efter autoklavering hjälper till att förhindra att bubblor bildas i lösningen18.
    1. För att minimera eventuella variationer i agarens konsistens på grund av ojämn kylning, håll pipettorn (se materialtabell) parallellt med bänkskivan medan du ritar upp agar. Lägg kamrarna platt på bänkskivan och låt agarn härda innan du rör dig.
      OBS: Agarprocenten och medieinnehållet kan skräddarsys för experimentet. 4% agar är styvare än den ungefär 2% koncentration som används för platthällning och förhindrar att maskar gräver genom mediet i våra händer. Andra experimenter har dock observerat grävande beteende hos vuxna maskar i upp till 9% agar18,19.
  2. När den har svalnat, värm en 3 mm insexnyckel (eller ett annat metallverktyg av samma storlek, se Materialtabell) över en Bunsen-brännare. Tryck fast den i väggen i varje kammare ca 5 mm till ena sidan av mittlinjen, vilket skapar en liten öppning i plasten (figur 1C). Använd ett uppvärmt blad för att ta bort kammarens bomull och avsmalnande ändar och försegla dessa ändar med paraffinfilm.
    OBS: När den är beredd måste varje kammare användas inom 1 dag eller förvaras vid 4 °C i flera dagar. Täck alla utsatta öppningar med paraffinfilm för att förhindra att agaren torkar ut.

3. Isolera dauerlarver

  1. 10-15 dagar före experimentet, dela varje stam på 2-3 stora NGM-plattor med OP50-bakterier och linda med paraffinfilm. Efter 10-15 dagar måste varje platta vara helt svält med tusentals dauerlarver närvarande på agar, väggar och lock.
    OBS: Gör tallrikar i förväg med ett tjockt OP50-recept för maximal trängsel (se Materialförteckning). Dauerbildning kan också induceras genom andra metoder, inklusive tillsats av feromoner eller genom att växa vid högre temperaturer22.
  2. Samla maskar genom att skölja locken och plattorna med M9-buffert och pipettera lösningen i 15 ml centrifugrör. Snurra vid 1 600 x g i 30-60 s vid rumstemperatur och aspirera det mesta av M9-bufferten med en pipett eller vakuumsugare.
  3. Isolera dauers genom att behandla med 1% SDS följt av en 30% sackarosflotationsgradient efter den tidigare publicerade rapporten20.
    1. Tillsätt 7 ml 1% SDS-lösning till varje maskpellet. Lämna maskarna i SDS i 30 min; rotera rören kontinuerligt under denna tid för att möjliggöra luftning. Skölj 3-5x med M9 för att ta bort tvättmedlet.
    2. Tillsätt sedan 5 ml M9 följt av 5 ml kall, filtrerad 60% sackaroslösning. Blanda noggrant och centrifugera sedan vid 1 600 x g i 5 minuter vid rumstemperatur för att skapa en separationsgradient.
  4. Fyll nya 15 ml centrifugrör med 2 ml M9-buffert. Krossa ändarna av glas Pasteur-pipetter för att bredda borrningen och använd dessa pipetter för att överföra det övre lagret av lösningen (innehållande isolerade dauers) från sackarosgradienten till de nya rören. Skölj dauers 3-5x med M9.
    OBS: Det kommer att finnas tusentals isolerade dauers i lösning vid denna tidpunkt. De kan användas omedelbart eller hållas luftade genom att rotera i 5-7 ml M9 över natten.

4. Lägga till dauers i kammaren

  1. Centrifugera dauers vid 1 600 x g i 5 minuter vid rumstemperatur och aspirera det mesta av M9-lösningen med en pipett eller vakuumsugare. För att uppskatta maskdensiteten, räkna manuellt antalet maskar i tre separata 1 μL-droppar under ett dissekerande mikroskop. Använd medelvärdet av dessa räkningar för att approximera antalet maskar per μL.
    OBS: Vissa pipetter med liten volym kanske inte kan nå botten av ett 15 ml centrifugrör; I detta fall kan en koncentrerad droppe maskar överföras först till en bit paraffinfilm.
  2. Skär änden på en 10, 20 eller 200 μL pipettspets för att bredda borrningen. Ställ in mikropipetten på en något större volym än den avsedda aspirationsvolymen. Aspirera cirka 1-2 μL av den koncentrerade masklösningen (helst mellan 100-300 maskar) och låt en liten mängd luft komma in i spetsen.
    OBS: Ett stort antal maskar (1,000+) i en kammare kan öka antalet körda avstånd på grund av överbeläggning9.
  3. Tryck försiktigt in pipettspetsen i agar medan du trycker ner mikropipetten. Detta kommer att skapa ett injektionsställe i agar utan att täppa till spetsen. Släpp maskarna i agar. Använd paraffinfilm för att täta öppningen.

5. Springa och poängsätta analysen

OBS: Gravitaxis kan testas under olika förhållanden som kan påverka beteendet9.

  1. För att eliminera så många variabler som möjligt, placera kamrarna i en mörk Faraday-bur (se materialtabell) vid rumstemperatur.
  2. Märk varje kammare och häng den vertikalt i Faraday-buren (utför detta med märkningstejp). Testa horisontella kontroller samtidigt genom att lägga vissa kammare plant inom samma miljöförhållanden. Testa de experimentella stammarna mot vertikalt orienterade N2-maskar som en positiv kontroll. Använd horisontellt orienterade kamrar som innehåller N2-dauers som en ytterligare negativ kontroll.
    OBS: Horisontella och vertikala analyser måste utföras i samma inställning inom labbet för att minimera miljövariationen mellan de två förhållandena. En stor inkubator kan användas för att hysa båda Faraday-burarna.
  3. Dauers börjar sprida sig från startplatsen efter några timmar och tar flera timmar att nå vardera änden av kammaren. Lämna kamrarna ostörda under denna tid och gör poäng inom 12-24 timmar efter injektionen.
    OBS: Använd inte en paralytisk (t.ex. natriumazid) för att immobilisera maskar som har nått kamrarnas ändar. Eftersom den totala fördelningen av maskar mäts istället för ett preferensindex (som i en tvåvalsanalys) är natriumazid onödigt och kan förändra resultaten.
  4. Ta bort och poängtera gravitaxis kamrar en i taget. Leta efter levande dauers under ett dissekerande mikroskop och markera deras platser med bläck (figur 1C, D). Led inte maskar inom 2,5 cm till vardera sidan av injektionsstället, eftersom dessa maskar sannolikt inte uppvisar en riktningspreferens.
    1. Undvik också att göra maskar som verkar döda eller är fångade i vätskan. Kassera alla kamrar som innehåller >50% döda eller simmande maskar.
      OBS: När kammaren har tagits bort från testområdet måste den poängsättas omedelbart för noggrannhet. Dauers får endast vara synliga mellan agarens yta och pipettens vägg. Om grävbeteende observeras, överväg att öka agarkoncentrationen i framtida analyser.
  5. För att kvantifiera resultaten, använd en markör för att dela upp varje halva av kammaren i sju 3,5 cm sektioner som börjar 2,5 cm från injektionsstället (på vissa pipetter, 3,5 cm = 1 ml volym). Använd en manuell räknare (se Materialförteckning) för att räkna antalet maskar som observerats i varje avsnitt.
    OBS: Det ska finnas sju sektioner på varje sida av ursprunget, som kan numreras från -7 (botten) till +7 (överst). Dessa siffror måste motsvara samma relativa platser baserat på hur kamrarna konstruerades; agar dras från -7-änden till +7-änden i steg 2.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Jämförelse av gravitaxis mellan arter
Efter det ovan beskrivna förfarandet kan C. briggsae dauer gravitaxis jämföras med C. elegans gravitaxis och horisontella kontroller. Den vertikala fördelningen (rödbrun) av C. briggsae dauers är snedställd mot kamrarnas toppar, med en stor andel maskar som når +7 (figur 2A). Kontrasterad med horisontella kontroller (aqua), där dauers fördelas i en ungefär klockformad kurva runt mitten av kamrarna, indikerar denna trend negativt gravitaktiskt beteende. Dessa data kan jämföras med C. elegans gravitaxis som utfördes på samma försöksdagar (figur 2B).

Ett Kruskal-Wallis-test följt av Dunns test med Bonferroni-korrigering för flera jämförelser bestämde eventuella signifikanta skillnader mellan analyserna 9,23. I detta experiment poängsattes 1 108 C. briggsae dauers över tre vertikala kamrar från två oberoende experimentella dagar. Dessa maskar migrerade betydligt uppåt än horisontella kontroller (p < 0,001; 1 639 dauers i tre horisontella kamrar under 2 experimentella dagar). Dessutom skilde sig inte de vertikala C. briggsae- och vertikala C. elegansfördelningarna (p > 0,05; 386 C. elegans dauers i två vertikala kamrar under 2 experimentella dagar). Dessa resultat tyder på att C. briggsae dauers visar ett negativt gravitaxis beteende som liknar det hos C. elegans dauers.

Figure 1
Bild 1: Inställning av gravitaxisanalyskammare. Bilder som visar steg i gravitaxis analyskammareberedning. (A) Individuella 5 ml pipetter förbereddes för fusion i en enda kammare. Avlägsnande av bomullsplugg indikerad med svart pilspets; avlägsnande av spets indikerad med en vit pilspets. Rören som används i denna studie har en innerdiameter på 6 mm och är vardera 34,5 cm långa (före skärning). (B) Färdigställd kammare före tillsats av NGM-agar. Pipetter har smälts genom att först smälta över en Bunsenbrännare. (C) Exempel på kammare fyllda med NGM-agar. Injektionsstället indikeras med en pil och förstoras i insatsen. Maskar har markerats med bläck, och linjer dras för att skilja avstånd tillsammans med kammaren samt för att underlätta poängsättning. (D) Vy över kamrarna i sin helhet (tagna efter poängsättning). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: Gravitaxis i C. briggsae vs. C. elegans. Resultat av gravitaxis i C. briggsae och C. elegans. (A) Histogram över C. briggsae gravitaxis. Rörelse i vertikala kamrar (rödbrun) jämförs med horisontella kontroller (vatten). Avståndet från injektionspunkten (-7 är längst under, +7 längst ovan) plottas som procenten av de totala maskarna som analyseras (x-axeln). Inga data plottas för origo (+0) eftersom maskar inte räknas inom 2,5 cm till någon sida av injektionsstället. N = 1 639 maskar över tre rör i horisontellt tillstånd; vertikal N = 1 108 maskar över tre rör. (B) Boxplots som jämför fördelningen av C. briggsae horisontella och vertikala maskar mot C. elegans vertikala maskar. C. briggsae provstorlekar anges ovan. C. elegans vertikal N = 386 maskar över två rör. Medel indikeras med vita diamanter; vertikala förhållanden är i rödbruna och är märkta "V", och horisontella förhållanden ("H") är i vatten. Jämförelser gjordes med Kruskal-Wallis-testet, följt av Dunns test med Bonferroni-korrigering för flera jämförelser. Inga stjärnor = p > 0,05, **** = p < 0,0001. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Jämförelse med tidigare metoder
Till skillnad från kemotaxis kan gravitaxis i Caenorhabditis inte observeras på ett tillförlitligt sätt med hjälp av en traditionell experimentell design av agarplattor. En vanlig petriskål är 150 mm i diameter, vilket resulterar i endast 75 mm tillgängliga i båda riktningarna för dauers för att visa gravitaxispreferens. Även om C. elegans orienteringspreferens kan analyseras i lösning12, är denna metod låg genomströmning eftersom maskar måste analyseras en i taget. Dessutom kan gravitaktiska preferenser och beteenden skilja sig mellan maskar som flyter i media jämfört med att krypa på en yta. Av dessa skäl utvecklade vi en analys med hög genomströmning med förbättrad känslighet som kan användas för att analysera gravitaxis beteende vid krypning eller klättring av maskar. Eftersom C. elegans är känsliga för ljus och elektromagnetiska fält, som båda stör gravitaktisk preferens9, måste dessa analyser utföras utan någon av stimulanserna. Om en hemlagad Faraday-bur används, är det nödvändigt och rekommenderat att kontrollera burets styrka och förstärka den.

Analyskamrarna som beskrivs i detta protokoll mäter cirka 54 cm i längd och placeras i Faraday-burar för att skydda mot ljus och elektromagnetiska fält. Det visade sig att förändring av "arenan" för att observera gravitaxis beteende har flera fördelar. För det första möjliggör det detaljerad kvantifiering och beskrivande analys. De relativa avstånden reste, och den totala fördelningen av maskar kan samlas in och jämföras istället för att räkna antalet negativt kontra positivt gravitaktiska maskar. För det andra replikerar den slutna miljön hos en agarfylld pipett närmare de förhållanden som kan främja gravitaxis i naturen. Som nämnts ovan är dauer-scenen en spridningsfas som möjliggör flykt från ogynnsamma förhållanden6. Eftersom Caenorhabditis lever i kompost, där vägledande signaler som ljus kanske inte är tillgängliga, kan tyngdkraften göra det möjligt för maskar att navigera till ytan 6,9. Det är osannolikt att tvådimensionella plattbaserade analyser replikerar dessa förhållanden även om de testas utan andra stimuli. Slutligen testar denna större apparat större mängder maskar i en enda analys.

Begränsningar och andra överväganden
Även om detta protokoll effektivt mäter gravitaktisk preferens i ett stort antal dauers, är det opraktiskt för små eller enstaka maskexperiment på grund av den tid och material som krävs för att konstruera varje kammare. Genom att kombinera räkningar över försök snarare än att använda ett gravitaxisindex ökar den statistiska kraften eftersom varje mask behandlas som en oberoende händelse. Även om denna förbättrade känslighet är användbar för att skilja gravitaktiska och icke-gravitaktiska maskar, är det viktigt att notera att C. elegans dauers uppvisar sociala beteenden 7,24 som kan påverka övergripande gravitaxis. Vi fann att högre maskdensiteter är korrelerade med ett större intervall i avståndet som reste över den storskaliga analysen, även om denna effekt är minimal när det totala antalet är mindre än cirka 1 000 maskar9. Interaktionseffekter till följd av faktorer som de totala maskarna i varje kammare bör övervakas vid analys av data. Som med alla beteendeanalyser bör poängsättning förblindas när det är möjligt.

Att hitta en genomsnittlig densitet av maskar i lösningen kan minimera variationen i antalet maskar som injiceras från kammare till kammare. Ormar sätter sig snabbt i lösning, så det är viktigt att blanda maskarna innan de pipetterar, antingen genom att snärta rören eller pipettera upp och ner med en bredborrad spets. Även när en jämn densitet uppnås kan antalet tillsatta maskar variera eftersom maskar sannolikt kommer att hålla fast vid insidan av plastpipettspetsarna. Beläggningspipettspetsar med BSA eller andra lösningar kan minimera denna effekt. Ormar måste injiceras med så lite lösning som möjligt; Om för mycket vätska läggs till kammaren kommer maskar att fastna i lösningen och kan till och med driva. Av denna anledning får endast levande, krypande maskar poängsättas, och någon kammare som innehåller mer än 50% döda eller simmande maskar får inte användas. Kamrar ska tas bort från Faraday-buren en i taget och göras inom 10-15 minuter för största noggrannhet.

Potentiella tillämpningar
Denna analys kan användas för att testa miljö-, genetiska och cellulära krav för gravitaxis i en mängd olika Caenorhabditis stammar. Hittills har ljus och elektromagnetiska fält identifierats som stimuli som stör gravitaxis9. C. elegans är dock känslig för andra stimuli, inklusive temperatur, flyktiga och icke-flyktiga kemikalier, struktur, fuktighet och ljud, vilket påverkar deras beteende25,26,27,28. Att förstå hur olika sensoriska ingångar integreras i nervsystemet är en enastående fråga inom neurovetenskap, särskilt när integration sker på nivån för enskilda neuroner 9,29,30,31,32. Sensorisk integration är särskilt viktig vid proprioception, som i sig är en integrerande modalitet som drar från flera sensoriska ledtrådar1.

Att förstå gravitationssensation i Caenorhabditis har konsekvenser för människors hälsa. Miljontals individer lider av vestibulär dysfunktion i USA ensam33, och många av dessa störningar har underliggande genetiska orsaker34,35. Av denna anledning är identifiering av genkandidater och riktade terapier ett aktivt forskningsområde36. Dessutom, eftersom ryggradsdjurens vestibulära och auditiva system är nära kopplade utvecklingsmässigt och evolutionärt33,36,37, kan belysande gravitationskänsla också ge insikt i hörsel- och hörselskador.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna förklarar inga konkurrerande intressen.

Acknowledgments

Denna forskning stöddes av forskningsbidrag från National Institutes of Health till JHR (#R01 5R01HD081266 och #R01GM141493). Vissa stammar tillhandahölls av CGC, som finansieras av NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440). Vi vill tacka Pradeep Joshi (UCSB) för hans redaktionella input. Statistiskt samråd från UCSB DATALAB.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1% Sodium Dodecyl Sulfate solution From stock 10% (w/v) SDS in DI water
15 mL Centrifuge tubes Falcon 14-959-53A
3 mm Hex key Other similar sized metal tools may be used
4% Agar in Normal Growth Medium (NGM) - 1 L Prior to autoclaving: 3 g NaCl, 40 g Agar, 2.5 g Peptone, 2 g Dextrose, 10 mL Uracil (2 mg/mL), 500 μL Cholesterol (10 mg/mL), 1 mL CaCl2, 962 mL DI water; After autoclaving: 24.5 mL Phosphate Buffer, 1 mL 1 MgSO4 (1 M), 1 mL Streptomycin (200 mg/mL)
5 mL Serological pipettes Fisherbrand S68228C Polystyrene, not borosilicate glass
60% Cold sucrose solution 60% sucrose (w/v) in DI water; sterilize by filtration (0.45 μm filter). Keep at 4 °C
AF16 C. briggsae or other experimental strain Available from the CGC (Caenorhabditis Genetics Center)
Bunsen burner
Cling-wrap Fisherbrand 22-305654
Clinical centrifuge
Disposable razor blades Fisherbrand 12-640
Faraday cage Can be constructed using cardboard and aluminum foil; 30" L x 6" W x 26" H or larger
Ink markers Sharpie or other brand for marking on plastic
Labeling tape Carolina 215620
M9 buffer 22 mM KH2PO4, 42 mM Na2HPO4, 86 mM NaCl
N2 C. elegans strain Available from the CGC (Caenorhabditis Genetics Center)
NGM plates with OP50 1.7% (w/v) agar in NGM (see description: 4% agar in NGM). Seed with OP50
Paraffin film Bemis 13-374-10
Plastic cutting board
Pliers
Rotating vertical mixer BTLab SYSTEMS BT913 With 22 x 15 mL tube bar
Serological pipettor Corning 357469
Stereo Microscope Laxco S2103LS100
Tally counter ULINE H-7350
Thick NGM/agar plate media - 1 L See 4% Agar in NGM recipe; replace 40 g Agar with 20 g Agar
Tweezers

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Peterka, R. J. Sensory integration for human balance control. Handbook of Clinical Neurology. 159, 27-42 (2018).
  2. Lacquaniti, F., et al. Multisensory Integration and Internal Models for Sensing Gravity Effects in Primates. BioMed Research International. 2014, 61584 (2014).
  3. Bostwick, M., et al. Antagonistic inhibitory circuits integrate visual and gravitactic behaviors. Current Biology. 30 (4), 600-609 (2020).
  4. Ntefidou, M., Richter, P., Streb, C., Lebert, M., Hader, D. -P. High light exposure leads to a sign change in gravitaxis of the flagellate Euglena gracilis. Journal of Gravitational Physiology. 9 (1), 277-278 (2002).
  5. Fedele, G., Green, E. W., Rosato, E., Kyriacou, C. P. An electromagnetic field disrupts negative geotaxis in Drosophila via a CRY-dependent pathway. Nature Communications. 5, 4391 (2014).
  6. Frézal, L., Félix, M. -A. C. elegans outside the Petri dish. eLife. 4, 05849 (2015).
  7. Lee, H., et al. a dispersal behavior of the nematode Caenorhabditis elegans, is regulated by IL2 neurons. Nature Neuroscience. 15 (1), 107-112 (2012).
  8. Okumura, E., Tanaka, R., Yoshiga, T. Negative gravitactic behavior of Caenorhabditis japonica dauer larvae. The Journal of Experimental Biology. 216, 1470-1474 (2013).
  9. Ackley, C., et al. Parallel mechanosensory systems are required for negative gravitaxis in C. elegans. bioRxiv. , (2022).
  10. Häder, D. -P., Hemmersbach, R. Gravitaxis in Euglena. Euglena: Biochemistry, Cell and Molecular Biology. Schwartzbach, S. D., Shigeoka, S. , Springer International Publishing. 237-266 (2017).
  11. Sun, Y., et al. TRPA channels distinguish gravity sensing from hearing in Johnston's organ. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (32), 13606-13611 (2009).
  12. Chen, W. -L., Ko, H., Chuang, H. -S., Raizen, D. M., Bau, H. H. Caenorhabditis elegans exhibits positive gravitaxis. BMC Biology. 19 (1), 186 (2021).
  13. Ward, S. Chemotaxis by the nematode Caenorhabditis elegans: Identification of attractants and analysis of the response by use of mutants. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 70 (3), 817-821 (1973).
  14. Bargmann, C. I., Hartwieg, E., Horvitz, H. R. Odorant-selective genes and neurons mediate olfaction in C. elegans. Cell. 74 (3), 515-527 (1993).
  15. Margie, O., Palmer, C., Chin-Sang, I. C. elegans chemotaxis assay. Journal of Visualized Experiments. (74), e50069 (2013).
  16. Ward, A., Liu, J., Feng, Z., Xu, X. Z. S. Light-sensitive neurons and channels mediate phototaxis in C. elegans. Nature Neuroscience. 11 (8), 916-922 (2008).
  17. Vidal-Gadea, A., et al. Magnetosensitive neurons mediate geomagnetic orientation in Caenorhabditis elegans. eLife. 4, 07493 (2015).
  18. Bainbridge, C., Schuler, A., Vidal-Gadea, A. G. Method for the assessment of neuromuscular integrity and burrowing choice in vermiform animals. Journal of Neuroscience Methods. 264, 40-46 (2016).
  19. Beron, C., et al. The burrowing behavior of the nematode Caenorhabditis elegans: a new assay for the study of neuromuscular disorders. Genes, Brain and Behavior. 14 (4), 357-368 (2015).
  20. Ow, M. C., Hall, S. E. A Method for obtaining large populations of synchronized Caenorhabditis elegans dauer larvae. Methods in Molecular Biology. , 209-219 (2015).
  21. Chaudhuri, J., Parihar, M., Pires-daSilva, A. An introduction to worm lab: from culturing worms to mutagenesis. Journal of Visualized Experiments. (47), e2293 (2011).
  22. Karp, X. Working with dauer larvae. WormBook. , 1-19 (2018).
  23. Dinno, A. Nonparametric pairwise multiple comparisons in independent groups using Dunn's test. The Stata Journal. 15 (1), 292-300 (2015).
  24. Gray, J. M., et al. Oxygen sensation and social feeding mediated by a C. elegans guanylate cyclase homologue. Nature. 430 (6997), 317-322 (2004).
  25. Goodman, M. B., Sengupta, P. How Caenorhabditis elegans senses mechanical stress, temperature, and other physical stimuli. Genetics. 212 (1), 25-51 (2019).
  26. Iliff, A. J., Xu, X. Z. S. C. elegans: a sensible model for sensory biology. Journal of Neurogenetics. 34 (3-4), 347-350 (2020).
  27. Russell, J., Vidal-Gadea, A. G., Makay, A., Lanam, C., Pierce-Shimomura, J. T. Humidity sensation requires both mechanosensory and thermosensory pathways in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (22), 8269-8274 (2014).
  28. Iliff, A. J., et al. The nematode C. elegans senses airborne sound. Neuron. 109 (22), 3633-3646 (2021).
  29. Metaxakis, A., Petratou, D., Tavernarakis, N. Multimodal sensory processing in Caenorhabditis elegans. Open Biology. 8 (6), 180049 (2018).
  30. Wicks, S., Rankin, C. Integration of mechanosensory stimuli in Caenorhabditis elegans. The Journal of Neuroscience. 15, 3 Pt 2 2434-2444 (1995).
  31. Chen, X., Chalfie, M. Modulation of C. elegans touch sensitivity is integrated at multiple levels. The Journal of Neuroscience. 34 (19), 6522-6536 (2014).
  32. Stockand, J. D., Eaton, B. A. Stimulus discrimination by the polymodal sensory neuron. Commun. Integrative Biology. 6 (2), 23469 (2013).
  33. Mackowetzky, K., Yoon, K. H., Mackowetzky, E. J., Waskiewicz, A. J. Development and evolution of the vestibular apparatuses of the inner ear. Journal of Anatomy. 239 (4), 801-828 (2021).
  34. Eppsteiner, R. W., Smith, R. J. H. Genetic disorders of the vestibular system. Current Opinion in Otolaryngology & Head and Neck Surgery. 19 (5), 397-402 (2011).
  35. Roman-Naranjo, P., Gallego-Martinez, A., Lopez Escamez, J. A. Genetics of vestibular syndromes. Current Opinion in Neurology. 31 (1), 105-110 (2018).
  36. Mei, C., et al. Genetics and the individualized therapy of vestibular disorders. Frontiers in Neurology. 12, 633207 (2021).
  37. Weghorst, F. P., Cramer, K. S. The evolution of hearing and balance. eLife. 8, 44567 (2019).

Tags

Beteende utgåva 183
Storskalig gravitaxanalys av <em>Caenorhabditis</em> Dauer larver
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ackley, C., Washiashi, L.,… More

Ackley, C., Washiashi, L., Krishnamurthy, R., Rothman, J. H. Large-Scale Gravitaxis Assay of Caenorhabditis Dauer Larvae. J. Vis. Exp. (183), e64062, doi:10.3791/64062 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter