Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Behavior
Click here for the English version

Behavior

Caenorhabditis Dauer larvalarının büyük ölçekli gravitaksis testi

Published: May 31, 2022 doi: 10.3791/64062
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Molecular Cellular and Developmental Biology, University of California

Summary

Mevcut protokol, Caenorhabditis dauer larvaları ile büyük ölçekli bir gravitaksis testi yapmak için yöntemleri özetlemektedir. Bu protokol, plaka tabanlı bir tahlille karşılaştırıldığında gravitaksis davranışının daha iyi algılanmasını sağlar.

Abstract

Yerçekimi hissi önemli ve nispeten az çalışılmış bir süreçtir. Yerçekimini algılamak, hayvanların çevrelerinde gezinmelerini sağlar ve hareketi kolaylaştırır. Ek olarak, memeli iç kulağında meydana gelen yerçekimi hissi, işitme ile yakından ilgilidir - bu nedenle, bu süreci anlamanın işitsel ve vestibüler araştırmalar için etkileri vardır. Gravitaksis testleri, Drosophila da dahil olmak üzere bazı model organizmalar için mevcuttur. Tek solucanlar daha önce çözeltiye yerleştikçe oryantasyon tercihleri için test edilmiştir. Bununla birlikte, Caenorhabditis gravitaksisi için güvenilir ve sağlam bir test tanımlanmamıştır. Mevcut protokol, bir seferde yüzlerce Caenorhabditis dauerini test etmek için kullanılabilecek gravitaksis tahlilleri yapmak için bir prosedürü özetlemektedir. Bu büyük ölçekli, uzun mesafeli tahlil, standart bir plaka tabanlı tahlilde gözden kaçırılabilecek fenotipleri ortaya çıkaran ayrıntılı veri toplamaya izin verir. Dikey eksen boyunca Dauer hareketi, yön yanlılığının yerçekiminden kaynaklandığından emin olmak için yatay kontrollerle karşılaştırılır. Yerçekimi tercihi daha sonra suşlar veya deneysel koşullar arasında karşılaştırılabilir. Bu yöntem, solucanlardaki gravitaksisler için moleküler, hücresel ve çevresel gereksinimleri belirleyebilir.

Introduction

Dünya'nın yerçekimi çekimini algılamak, birçok organizmanın yönelimi, hareketi, koordinasyonu ve dengesi için çok önemlidir. Bununla birlikte, yerçekimi duyusunun moleküler mekanizmaları ve nörodevresi, diğer duyularla karşılaştırıldığında yeterince anlaşılmamıştır. Hayvanlarda, yerçekimi hissi, davranışı etkilemek için diğer uyaranlarla etkileşime girer ve onları geride bırakabilir. Görsel ipuçları, propriyoseptif geri bildirim ve vestibüler bilgi, bir hayvanın çevresine göre vücut farkındalığı duygusu oluşturmak için entegre edilebilir 1,2. Tersine, gravitaktik tercih, diğer uyaranların varlığında değiştirilebilir 3,4,5. Bu nedenle, gravitaktik davranış, yerçekimi hissini incelemek ve sinir sisteminin karmaşık duyusal entegrasyonunu ve karar verme sürecini anlamak için idealdir.

C. elegans, polifenik yaşam döngüsü nedeniyle gravitaksisi incelemek için özellikle yararlı bir model organizmadır. Isı, aşırı kalabalık veya yiyecek eksikliği de dahil olmak üzere gelişim sırasında stresörlere maruz kaldığında, C. elegans larvaları strese karşı oldukça dirençli olan dauer'lere dönüşür6. Dauers olarak, solucanlar, solucanların kuyruklarında "durdukları" ve kafalarını salladıkları niktasyon gibi karakteristik davranışlar sergilerler, bu da daha iyi habitatlara dağılmayı kolaylaştırabilir7. C. elegans ve C. japonica'nın gravitaksis tahlilleri, dauer larvalarının negatif gravitik olduğunu ve bu davranışın dauerlerde yetişkinlere göre daha kolay gözlendiğini göstermektedir 8,9. Gravitaksisin diğer Caenorhabditis suşlarında test edilmesi, gravitaktik davranışta doğal varyasyonları ortaya çıkarabilir.

Yerçekimi hissi mekanizmaları Euglena, Drosophila, Ciona ve gravitaksis tahlilleri3,10,11 kullanan diğer çeşitli türlerde karakterize edilmiştir. Bu arada, Caenorhabdisit'teki gravitaksis çalışmaları başlangıçta karışık sonuçlar verdi. C. elegans'ın oryantasyon tercihi üzerine yapılan bir araştırma, solucanların çözelti içinde başları aşağı doğru yönlendirildiğini ve pozitif yerçekimi tercihini düşündürdüğünü bulmuştur12. Bu arada, C. japonica dauers erken dönemde negatif gravitaktik8 olarak tanımlansa da, bu davranış sadece yakın zamanda C. elegans9'da tanımlanmıştır. Solucanlarda temsili bir gravitaksis testi geliştirmede çeşitli zorluklar ortaya çıkmaktadır. Caenorhabditis suşları agar plakalarında tutulur; Bu nedenle, davranışsal testler tipik olarak deneysel tasarımlarının bir parçası olarak agar plakalarını kullanır13,14,15. Caenorhabdisit'te bildirilen en erken gravitaksis testi, yatay kontrol plakası8'e 90 ° açıyla yan tarafında bir plaka durarak gerçekleştirildi. Bununla birlikte, gravitaksis davranışı bu koşullar altında her zaman sağlam değildir. Yetişkin solucanlar çözüm12'de oryantasyonel tercih için test edilebilirken, bu yön tercihi de bağlama bağlı olabilir ve solucanlar yüzmek yerine sürünüyorsa farklı davranışlara yol açabilir. Ek olarak, C. elegans, yerçekimine tepkilerine müdahale eden ışık ve elektromanyetik alanlar16,17 de dahil olmak üzere diğer uyaranlara duyarlıdır9. Bu nedenle, diğer çevresel değişkenlere karşı kalkan oluşturan güncellenmiş bir gravitaksis testi, bu duyusal sürecin mekanizmalarını incelemek için önemlidir.

Bu protokolde, Caenorhabditis gravitaksis'i gözlemlemek için bir tahlil tanımlanmıştır. Bu çalışmanın kurulumu kısmen nöromüsküler bütünlüğü incelemek için geliştirilen bir yönteme dayanmaktadır18,19. Dauer larvaları standart prosedürler20 kullanılarak kültürlenir ve izole edilir. Daha sonra agar ile doldurulmuş iki adet 5 mL serolojik pipetten yapılmış odalara enjekte edilirler. Bu odalar dikey veya yatay olarak yönlendirilebilir ve ışığa ve elektromanyetik alanlara karşı koruma sağlamak için 12-24 saat boyunca karanlık bir Faraday kafesine yerleştirilebilir. Her solucanın odalardaki yeri kaydedilir ve C. elegans N2 gibi bir referans suşunun dikey taksileriyle karşılaştırılır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Bu çalışmada kullanılan suşlar C. elegans (N2) ve C. briggsae (AF16) 'dir (bakınız Malzeme Tablosu). Her tahlil için karışık cinsiyetli bir dauer popülasyonu kullanıldı.

1. Oda hazırlığı

  1. Bir duman davlumbazında çalışın. Çalışma alanını bir Bunsen brülörü, 1-2 tıraş bıçağı, pense, cımbız ve plastik kesme yüzeyi ile ayarlayın (bkz.
  2. Her oda için iki adet 5 mL serolojik pipet toplayın. Pamuk fişini bir pipetten cımbızla çıkarın. Pense kullanarak ısınana kadar Bunsen brülörün üzerinde bir tıraş bıçağı tutun. Isıtılmış bıçağı kullanarak ikinci pipetin konik ucunu dilimleyin, böylece pipetin tamamı eşit bir çapa sahip olur (Şekil 1A).
  3. Hızlı bir şekilde çalışarak, modifiye edilmiş iki pipet ucunu aleve yaklaştırın ve hafifçe eritin. Bu uçları birbirine sıkıca bastırarak birleştirin ve her iki pipetin duvarlarının sürekli olmasını sağlayın. Birleştirmeden sonra herhangi bir boşluk görülürse, bunları ayırın ve bu adımı tekrarlayın (Şekil 1A, B).

2. Odaların agar ile doldurulması

  1. Standart solucan prosedürlerine göre %4 agar ile NGM hazırlayın21. Agar hala erimişken, her odayı serolojik bir pipetleyiciye bağlayarak ve çözeltiyi yavaşça çekerek doldurun. Odayı pipetörden çıkarmadan önce ucu parafin filmle kapatın. Soğuması için odayı düz (tezgaha paralel) yerleştirin.
    NOT: Otoklavlamadan sonra şişenin yapışkan sargı ile kaplanması (bkz. Malzeme Tablosu) çözelti18'de kabarcıkların oluşmasını önlemeye yardımcı olur.
    1. Düzensiz soğutma nedeniyle agarın kıvamındaki herhangi bir değişikliği en aza indirmek için, agar'ı hazırlarken pipettörü ( bkz. Malzeme Tablosu) tezgahın üstüne paralel tutun. Odaları tezgahın üzerine düz bir şekilde yerleştirin ve hareket etmeden önce agarın sertleşmesine izin verin.
      NOT: Agar yüzdesi ve medya içeriği denemeye göre uyarlanabilir. % 4 agar, plaka dökme için kullanılan kabaca% 2 konsantrasyondan daha serttir ve solucanların ellerimizdeki ortamdan geçmesini önler. Bununla birlikte, diğer deneyciler yetişkin solucanlar tarafından% 9'a kadar agar18,19'da yuvalama davranışını gözlemlemişlerdir.
  2. Soğutulduktan sonra, 3 mm'lik bir altıgen anahtarı (veya aynı boyutta başka bir metal aleti , bkz. Her bir odanın duvarına, orta hattın bir tarafına yaklaşık 5 mm sıkıca bastırın ve plastikte küçük bir açıklık oluşturun (Şekil 1C). Odanın pamuklu ve konik uçlarını çıkarmak için ısıtılmış bir bıçak kullanın ve bu uçları parafin film ile kapatın.
    NOT: Hazırlandıktan sonra, her oda 1 gün içinde kullanılmalı veya birkaç gün boyunca 4 ° C'de tutulmalıdır. Agarın kurumasını önlemek için açıkta kalan açıklıkları parafin film ile örtün.

3. Dauer larvalarını izole etmek

  1. Deneyden 10-15 gün önce, her bir suşu OP50 bakterisi ile 2-3 büyük NGM plakasına koyun ve parafin filmi ile sarın. 10-15 gün sonra, her plaka agar, duvarlar ve kapaklarda bulunan binlerce dauer larva ile tamamen aç bırakılmalıdır.
    NOT: Maksimum kalabalık için kalın bir OP50 tarifi kullanarak plakaları önceden yapın (bkz. Dauer oluşumu, feromonların eklenmesi veya daha yüksek sıcaklıklarda büyümesi de dahil olmak üzere diğer yöntemlerle de indüklenebilir22.
  2. Kapakları ve plakaları M9 tamponuyla durulayarak ve çözeltiyi 15 mL santrifüj tüplerine pipetleyerek solucanları toplayın. Oda sıcaklığında 30-60 s için 1.600 x g'da döndürün ve M9 tamponunun çoğunu bir pipet veya vakum aspiratörü ile aspire edin.
  3. Dauer'leri% 1 SDS ile tedavi ederek izole edin, ardından daha önce yayınlanan rapor 20'yi takiben%30'luk bir sakkaroz yüzdürme gradyanı izleyin.
    1. Her bir sonsuz pelete 7 mL% 1 SDS çözeltisi ekleyin. Solucanları 30 dakika SDS'de bırakın; havalandırmaya izin vermek için tüpleri bu süre zarfında sürekli olarak döndürün. Deterjanı çıkarmak için M9 ile 3-5x durulayın.
    2. Daha sonra, 5 mL M9 ve ardından 5 mL soğuk,filtrelenmiş% 60 sakkaroz çözeltisi ekleyin. İyice karıştırın ve ardından bir ayırma gradyanı oluşturmak için oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 1.600 x g'de santrifüj yapın.
  4. Yeni 15 mL santrifüj tüplerini 2 mL M9 tamponla doldurun. Deliği genişletmek için cam Pasteur pipetlerin uçlarını ezin ve bu pipetleri, çözeltinin üst tabakasını (izole dauers içeren) sakkaroz gradyanından yeni tüplere aktarmak için kullanın. Dauerleri M9 ile 3-5x durulayın.
    NOT: Bu noktada çözümde binlerce izole dauer olacaktır. Hemen kullanılabilir veya gece boyunca 5-7 mL M9'da döndürülerek havalandırılmış halde tutulabilirler.

4. Odaya dauer eklenmesi

  1. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 1.600 x g'da santrifüj dauerleri ve M9 çözeltisinin çoğunu bir pipet veya vakum aspiratörü ile aspire edin. Solucan yoğunluğunu tahmin etmek için, diseksiyon mikroskobu altında üç ayrı 1 μL damlacıktaki solucan sayısını manuel olarak sayın. μL başına solucan sayısını yaklaşık olarak hesaplamak için bu sayımların ortalamasını kullanın.
    NOT: Bazı küçük hacimli pipetleyiciler 15 mL'lik bir santrifüj tüpünün dibine ulaşamayabilir; Bu durumda, konsantre bir solucan damlacığı önce bir parça parafin filmine aktarılabilir.
  2. Deliği genişletmek için 10, 20 veya 200 μL pipet ucunun ucunu kesin. Mikropipeti, amaçlanan aspirasyon hacminden biraz daha büyük bir hacme ayarlayın. Konsantre solucan çözeltisinin yaklaşık 1-2 μL'sini (ideal olarak 100-300 solucan arasında) aspire edin ve uca az miktarda havanın girmesine izin verin.
    NOT: Bir odadaki çok sayıda solucan (1.000+), aşırı kalabalık nedeniyle kat edilen mesafe aralığını artırabilir9.
  3. Mikropipeti bastırırken pipet ucunu yavaşça agarın içine itin. Bu, ucu tıkamadan agarda bir enjeksiyon bölgesi oluşturacaktır. Solucanları agarın içine bırakın. Açıklığı kapatmak için parafin film kullanın.

5. Tahlilin çalıştırılması ve puanlanması

NOT: Gravitaksis, davranış9'u etkileyebilecek çeşitli koşullar altında test edilebilir.

  1. Mümkün olduğunca çok değişkeni ortadan kaldırmak için, odaları oda sıcaklığında karanlık bir Faraday kafesine yerleştirin (bkz.
  2. Her odayı etiketleyin ve Faraday kafesine dikey olarak asın (bunu etiketleme bandı kullanarak gerçekleştirin). Bazı odaları aynı çevre koşulları içinde düz bir şekilde yerleştirerek yatay kontrolleri eşzamanlı olarak test edin. Deneysel suşları dikey olarak yönlendirilmiş N2 solucanlarına karşı pozitif bir kontrol olarak test edin. Ek bir negatif kontrol olarak N2 dauer içeren yatay yönelimli odalar kullanın.
    NOT: İki koşul arasındaki çevresel değişkenliği en aza indirmek için yatay ve dikey testler laboratuvar içinde aynı ortamda yapılmalıdır. Her iki Faraday kafesini de barındırmak için büyük bir inkübatör kullanılabilir.
  3. Dauers birkaç saat sonra başlangıç bölgesinden dağılmaya başlar ve odanın her iki ucuna da ulaşması birkaç saat sürer. Bu süre zarfında odaları rahatsız etmeden bırakın ve enjeksiyondan sonraki 12-24 saat içinde puan alın.
    NOT: Odaların uçlarına ulaşan solucanları hareketsiz hale getirmek için paralitik (sodyum azid gibi) kullanmayın. Solucanların genel dağılımı bir tercih indeksi yerine ölçüldüğü için (iki seçenekli bir tahlilde olduğu gibi), sodyum azid gereksizdir ve sonuçları değiştirebilir.
  4. Gravitaksis odalarını birer birer çıkarın ve puanlayın. Diseksiyon mikroskobu altında canlı dauerleri arayın ve yerlerini mürekkeple işaretleyin (Şekil 1C, D). Solucanları enjeksiyon bölgesinin her iki tarafına 2,5 cm içinde puanlamayın, çünkü bu solucanların yön tercihi göstermesi muhtemel değildir.
    1. Ayrıca, ölü görünen veya sıvıda sıkışmış solucanları puanlamaktan kaçının. % >50 ölü veya yüzme solucanı içeren odaları atın.
      NOT: Oda test alanından çıkarıldıktan sonra, doğruluk için derhal puanlanması gerekir. Dauers sadece agarın yüzeyi ile pipetin duvarı arasında görünür olmalıdır. Yuvalama davranışı gözlenirse, gelecekteki tahlillerde agar konsantrasyonunu arttırmayı düşünün.
  5. Sonuçları ölçmek için, odanın her yarısını enjeksiyon bölgesinden 2,5 cm uzakta başlayan yedi adet 3,5 cm'lik bölüme bölmek için bir işaretleyici kullanın (bazı pipetlerde, 3,5 cm = 1 mL hacim). Her bölümde gözlemlenen solucan sayısını hesaplamak için manuel bir uyarı sinyali sayacı kullanın (bkz.
    NOT: Menşe hattının her iki tarafında -7 (alt) ile +7 (üst) arasında numaralandırılabilen yedi bölüm bulunmalıdır. Bu sayılar, odaların nasıl inşa edildiğine bağlı olarak aynı göreceli konumlara karşılık gelmelidir; agar, adım 2'de -7 ucundan +7 ucuna çekilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Türler arasında gravitaksisin karşılaştırılması
Yukarıda özetlenen prosedürü takiben, C. briggsae dauer gravitaksis, C. elegans gravitaksisi ve yatay kontrolleri ile karşılaştırılabilir. C. briggsae dauers'ın dikey dağılımı (kestane), odaların tepelerine doğru eğilir ve solucanların büyük bir yüzdesi +7'ye ulaşır (Şekil 2A). Dauerlerin odaların merkezi etrafında kabaca çan şeklinde bir eğri halinde dağıldığı yatay kontrollerle (aqua) karşılaştırıldığında, bu eğilim negatif yerçekimsel davranışı gösterir. Bu veriler aynı deney günlerinde yapılan C. elegans gravitaksisi ile karşılaştırılabilir (Şekil 2B).

Bir Kruskal-Wallis testi ve ardından Dunn'un çoklu karşılaştırmalar için Bonferroni düzeltmesi ile yaptığı test,tahliller 9,23 arasında anlamlı farklılıklar olduğunu belirledi. Bu deneyde, iki bağımsız deney gününden üç dikey odada 1.108 C. briggsae dauer puanlandı. Bu solucanlar yatay kontrollerden önemli ölçüde yukarı doğru göç ettiler (p < 0.001; 2 deney günü boyunca üç yatay odada 1.639 dauer). Ayrıca, dikey C. briggsae ve dikey C. elegans dağılımları farklı değildi (p > 0.05; 2 deney günü boyunca iki dikey odada 386 C. elegans dauers). Bu sonuçlar, C. briggsae dauers'ın C. elegans dauers'inkine benzer negatif bir gravitaksis davranışı gösterdiğini göstermektedir.

Figure 1
Resim 1: Gravitaksis tahlil odası kurulumu. Gravitaksis tahlil odası hazırlığının adımlarını gösteren fotoğraflar. (A) Tek tek 5 mL pipetler tek bir haznede füzyon için hazırlandı. Siyah ok ucu ile belirtilen pamuk tapasının çıkarılması; beyaz bir ok ucu ile belirtilen ucun çıkarılması. Bu çalışmada kullanılan tüplerin iç çapı 6 mm'dir ve her biri 34,5 cm uzunluğundadır (kesimden önce). (B) NGM agarının eklenmesinden önce tamamlanmış oda. Pipetler, önce bir Bunsen brülörü üzerinde eritilerek kaynaştırılmıştır. (C) NGM agar ile doldurulmuş örnek odalar. Enjeksiyon bölgesi bir okla gösterilir ve girişte büyütülür. Solucanlar mürekkeple işaretlenmiştir ve odayla birlikte mesafeleri ayırt etmek ve puanlamayı kolaylaştırmak için çizgiler çizilmiştir. (D) Odaların bütününün görünümü (puanlamadan sonra alınır). Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Resim 2: C. briggsae ve C. elegans'ta gravitaksis. C. briggsae ve C. elegans'ta gravitaksisin sonuçları. (A) C. briggsae gravitaksisin histogramı. Dikey odalardaki (bordo) hareket, yatay kontrollerle (aqua) karşılaştırılır. Enjeksiyon noktasından uzaklık (-7 aşağıda en uzağı, +7 en yukarıda +7) test edilen toplam solucanların yüzdesi (x ekseni) olarak çizilir. Solucanlar enjeksiyon bölgesinin her iki tarafına 2,5 cm içinde sayılmadığından, menşe (+0) için hiçbir veri çizilmez. N = yatay durumda üç tüp boyunca 1.639 solucan; dikey N = üç tüp boyunca 1.108 solucan. (B) C. briggsae yatay ve dikey solucanlarının dağılımını C. elegans dikey solucanlarına karşı karşılaştıran Boxplots. C. briggsae örneklem büyüklükleri yukarıda verilmiştir. C. elegans dikey N = iki tüp boyunca 386 solucan. Araçlar beyaz elmaslarla gösterilir; dikey koşullar kestane rengindedir ve "V" olarak etiketlenmiştir ve yatay koşullar ("H") sudadır. Kruskal-Wallis testi kullanılarak karşılaştırmalar yapıldı, ardından Dunn'un çoklu karşılaştırmalar için Bonferroni düzeltmesi ile testi yapıldı. Yıldız yok = p > 0,05, **** = p < 0,0001. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Önceki yöntemlerle karşılaştırma
Kemotaksislerin aksine, Caenorhabditis'teki gravitaksis, geleneksel bir agar plakası deney tasarımı kullanılarak güvenilir bir şekilde gözlemlenemez. Standart bir Petri kabının çapı 150 mm'dir, bu da dauers'ın gravitaksis tercihini göstermesi için her iki yönde de sadece 75 mm ile sonuçlanır. C. elegans'ın oryantasyonel tercihi çözüm12'de test edilebilse de, solucanların birer birer analiz edilmesi gerektiğinden bu yöntem düşük verimlidir. Ek olarak, yerçekimi tercihleri ve davranışları, medyada yüzen solucanlar ile bir yüzeyde sürünen solucanlar arasında farklılık gösterebilir. Bu nedenlerden dolayı, sürünen veya tırmanan solucanlarda gravitaksis davranışını analiz etmek için kullanılabilecek gelişmiş hassasiyete sahip yüksek verimli bir test geliştirdik. C. elegans , her ikisi de gravitaktiktercihe müdahale eden ışığa ve elektromanyetik alanlara duyarlı olduğundan, bu testlerin her iki uyaran olmadan da yapılması gerekir. Ev yapımı bir Faraday kafesi kullanılıyorsa, kafesin gücünü kontrol etmek ve güçlendirmek gerekli ve tavsiye edilir.

Bu protokolde açıklanan tahlil odaları yaklaşık 54 cm uzunluğundadır ve ışığa ve elektromanyetik alanlara karşı korunmak için Faraday kafeslerinin içine yerleştirilir. Gravitaksis davranışını gözlemlemek için "arenayı" değiştirmenin çeşitli avantajları olduğu bulunmuştur. İlk olarak, ayrıntılı niceleme ve tanımlayıcı analize izin verir. Kat edilen göreceli mesafeler ve solucanların genel dağılımları, negatif ve pozitif gravitaktik solucanların sayısını saymak yerine toplanabilir ve karşılaştırılabilir. İkincisi, agar dolu bir pipetin kapalı ortamı, vahşi doğada gravitaksisi teşvik edebilecek koşulları daha yakından çoğaltır. Yukarıda belirtildiği gibi, dauer aşaması, elverişsiz koşullardan kaçmaya izin veren bir dağılım aşamasıdır6. Caenorhabditis, ışık gibi yol gösterici ipuçlarının bulunmayabileceği kompostta yaşadığı için, yerçekimi solucanların yüzeye gitmesini sağlayabilir 6,9. İki boyutlu plaka tabanlı testlerin, başka uyaranlar olmadan test edilseler bile bu koşulları çoğaltması olası değildir. Son olarak, bu daha büyük aparat, tek bir tahlilde daha büyük miktarlarda solucanı test eder.

Sınırlamalar ve dikkat edilmesi gereken diğer noktalar
Bu protokol, çok sayıda dauer'de gravitaktik tercihi etkili bir şekilde ölçerken, her odayı inşa etmek için gereken zaman ve malzemeler nedeniyle küçük veya tek solucan deneyleri için pratik değildir. Bir gravitaksis indeksi kullanmak yerine denemeler arasındaki sayımları birleştirerek, istatistiksel güç artar, çünkü her solucan bağımsız bir olay olarak ele alınır. Bu gelişmiş duyarlılık, gravitaktik ve gravitaktik olmayan solucanları ayırt etmede yararlı olsa da, C. elegans dauers'ın genel gravitaksisi etkileyebilecek sosyal davranışlar 7,24 sergilediğini belirtmek önemlidir. Daha yüksek solucan yoğunluklarının, büyük ölçekli tahlil boyunca kat edilen mesafedeki daha büyük bir aralıkla ilişkili olduğunu bulduk, ancak toplam sayı yaklaşık 1.000 solucandan az olduğunda bu etki minimumdur9. Veriler analiz edilirken her odadaki toplam solucan sayısı gibi faktörlerden kaynaklanan etkileşim etkileri izlenmelidir. Tüm davranışsal tahlillerde olduğu gibi, puanlama mümkün olduğunda körleştirilmelidir.

Çözeltide ortalama bir solucan yoğunluğu bulmak, odadan odaya enjekte edilen solucan sayısındaki değişkenliği en aza indirebilir. Solucanlar hızlı bir şekilde çözeltiye yerleşirler, bu nedenle pipetlemeden önce solucanların tüpleri hafifçe sallayarak veya geniş delikli bir uçla yukarı ve aşağı pipetleme yaparak karıştırılması önemlidir. Tutarlı bir yoğunluk elde edildiğinde bile, solucanların plastik pipet uçlarının iç yüzeyine yapışması muhtemel olduğundan, eklenen solucanların sayısı değişebilir. Pipet uçlarının BSA veya diğer çözümlerle kaplanması bu etkiyi en aza indirebilir. Solucanlar mümkün olduğunca az çözelti ile enjekte edilmelidir; Odaya çok fazla sıvı eklenirse, solucanlar çözelti içinde sıkışır ve hatta sürüklenebilir. Bu nedenle, sadece canlı, sürünen solucanlar puanlanabilir ve% 50'den fazla ölü veya yüzme solucanı içeren herhangi bir oda kullanılmamalıdır. Odalar Faraday kafesinden birer birer çıkarılmalı ve en yüksek doğruluk için 10-15 dakika içinde puanlanmalıdır.

Potansiyel uygulamalar
Bu tahlil, çeşitli Caenorhabditis suşlarında gravitaksis için çevresel, genetik ve hücresel gereksinimleri test etmek için kullanılabilir. Şimdiye kadar, ışık ve elektromanyetik alanlar gravitaksis9'a müdahale eden uyaranlar olarak tanımlanmıştır. Bununla birlikte, C. elegans, davranışlarını etkileyen sıcaklık, uçucu ve uçucu olmayan kimyasallar, doku, nem ve ses dahil olmak üzere diğer uyaranlara karşı hassastır25,26,27,28. Çeşitli duyusal girdilerin sinir sistemine nasıl entegre edildiğini anlamak, özellikle entegrasyon bireysel nöronlar 9,29,30,31,32 düzeyinde gerçekleştiğinde, nörobilimde olağanüstü bir sorudur. Duyusal entegrasyon, propriyosepsiyonda özellikle önemlidir, ki bu da çoklu duyusal ipuçlarından yararlanan bütünleştirici bir yöntemdir1.

Caenorhabdisit'teki yerçekimi hissini anlamanın insan sağlığı üzerinde etkileri vardır. Sadece Amerika Birleşik Devletleri'nde milyonlarca birey vestibüler disfonksiyondan muzdariptir33 ve bu bozuklukların çoğunun altında yatan genetik nedenlervardır 34,35. Bu nedenle gen adaylarının belirlenmesi ve hedefe yönelik tedaviler aktif bir araştırma alanıdır36. Ek olarak, omurgalı vestibüler ve işitsel sistemler gelişimsel ve evrimsel olarak yakından bağlantılı olduğundan33,36,37, yerçekimi hissini aydınlatmak da işitme ve işitme bozuklukları hakkında fikir verebilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar rakip çıkarlar olmadığını beyan ederler.

Acknowledgments

Bu araştırma, Ulusal Sağlık Enstitüleri'nden JHR'ye (#R01 5R01HD081266 ve #R01GM141493) yapılan araştırma hibeleri ile desteklenmiştir. Bazı suşlar, NIH Araştırma Altyapı Programları Ofisi (P40 OD010440) tarafından finanse edilen CGC tarafından sağlanmıştır. Pradeep Joshi'ye (UCSB) editoryal katkısı için teşekkür ederiz. UCSB DATALAB tarafından sağlanan istatistiksel danışmanlık.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1% Sodium Dodecyl Sulfate solution From stock 10% (w/v) SDS in DI water
15 mL Centrifuge tubes Falcon 14-959-53A
3 mm Hex key Other similar sized metal tools may be used
4% Agar in Normal Growth Medium (NGM) - 1 L Prior to autoclaving: 3 g NaCl, 40 g Agar, 2.5 g Peptone, 2 g Dextrose, 10 mL Uracil (2 mg/mL), 500 μL Cholesterol (10 mg/mL), 1 mL CaCl2, 962 mL DI water; After autoclaving: 24.5 mL Phosphate Buffer, 1 mL 1 MgSO4 (1 M), 1 mL Streptomycin (200 mg/mL)
5 mL Serological pipettes Fisherbrand S68228C Polystyrene, not borosilicate glass
60% Cold sucrose solution 60% sucrose (w/v) in DI water; sterilize by filtration (0.45 μm filter). Keep at 4 °C
AF16 C. briggsae or other experimental strain Available from the CGC (Caenorhabditis Genetics Center)
Bunsen burner
Cling-wrap Fisherbrand 22-305654
Clinical centrifuge
Disposable razor blades Fisherbrand 12-640
Faraday cage Can be constructed using cardboard and aluminum foil; 30" L x 6" W x 26" H or larger
Ink markers Sharpie or other brand for marking on plastic
Labeling tape Carolina 215620
M9 buffer 22 mM KH2PO4, 42 mM Na2HPO4, 86 mM NaCl
N2 C. elegans strain Available from the CGC (Caenorhabditis Genetics Center)
NGM plates with OP50 1.7% (w/v) agar in NGM (see description: 4% agar in NGM). Seed with OP50
Paraffin film Bemis 13-374-10
Plastic cutting board
Pliers
Rotating vertical mixer BTLab SYSTEMS BT913 With 22 x 15 mL tube bar
Serological pipettor Corning 357469
Stereo Microscope Laxco S2103LS100
Tally counter ULINE H-7350
Thick NGM/agar plate media - 1 L See 4% Agar in NGM recipe; replace 40 g Agar with 20 g Agar
Tweezers

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Peterka, R. J. Sensory integration for human balance control. Handbook of Clinical Neurology. 159, 27-42 (2018).
  2. Lacquaniti, F., et al. Multisensory Integration and Internal Models for Sensing Gravity Effects in Primates. BioMed Research International. 2014, 61584 (2014).
  3. Bostwick, M., et al. Antagonistic inhibitory circuits integrate visual and gravitactic behaviors. Current Biology. 30 (4), 600-609 (2020).
  4. Ntefidou, M., Richter, P., Streb, C., Lebert, M., Hader, D. -P. High light exposure leads to a sign change in gravitaxis of the flagellate Euglena gracilis. Journal of Gravitational Physiology. 9 (1), 277-278 (2002).
  5. Fedele, G., Green, E. W., Rosato, E., Kyriacou, C. P. An electromagnetic field disrupts negative geotaxis in Drosophila via a CRY-dependent pathway. Nature Communications. 5, 4391 (2014).
  6. Frézal, L., Félix, M. -A. C. elegans outside the Petri dish. eLife. 4, 05849 (2015).
  7. Lee, H., et al. a dispersal behavior of the nematode Caenorhabditis elegans, is regulated by IL2 neurons. Nature Neuroscience. 15 (1), 107-112 (2012).
  8. Okumura, E., Tanaka, R., Yoshiga, T. Negative gravitactic behavior of Caenorhabditis japonica dauer larvae. The Journal of Experimental Biology. 216, 1470-1474 (2013).
  9. Ackley, C., et al. Parallel mechanosensory systems are required for negative gravitaxis in C. elegans. bioRxiv. , (2022).
  10. Häder, D. -P., Hemmersbach, R. Gravitaxis in Euglena. Euglena: Biochemistry, Cell and Molecular Biology. Schwartzbach, S. D., Shigeoka, S. , Springer International Publishing. 237-266 (2017).
  11. Sun, Y., et al. TRPA channels distinguish gravity sensing from hearing in Johnston's organ. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (32), 13606-13611 (2009).
  12. Chen, W. -L., Ko, H., Chuang, H. -S., Raizen, D. M., Bau, H. H. Caenorhabditis elegans exhibits positive gravitaxis. BMC Biology. 19 (1), 186 (2021).
  13. Ward, S. Chemotaxis by the nematode Caenorhabditis elegans: Identification of attractants and analysis of the response by use of mutants. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 70 (3), 817-821 (1973).
  14. Bargmann, C. I., Hartwieg, E., Horvitz, H. R. Odorant-selective genes and neurons mediate olfaction in C. elegans. Cell. 74 (3), 515-527 (1993).
  15. Margie, O., Palmer, C., Chin-Sang, I. C. elegans chemotaxis assay. Journal of Visualized Experiments. (74), e50069 (2013).
  16. Ward, A., Liu, J., Feng, Z., Xu, X. Z. S. Light-sensitive neurons and channels mediate phototaxis in C. elegans. Nature Neuroscience. 11 (8), 916-922 (2008).
  17. Vidal-Gadea, A., et al. Magnetosensitive neurons mediate geomagnetic orientation in Caenorhabditis elegans. eLife. 4, 07493 (2015).
  18. Bainbridge, C., Schuler, A., Vidal-Gadea, A. G. Method for the assessment of neuromuscular integrity and burrowing choice in vermiform animals. Journal of Neuroscience Methods. 264, 40-46 (2016).
  19. Beron, C., et al. The burrowing behavior of the nematode Caenorhabditis elegans: a new assay for the study of neuromuscular disorders. Genes, Brain and Behavior. 14 (4), 357-368 (2015).
  20. Ow, M. C., Hall, S. E. A Method for obtaining large populations of synchronized Caenorhabditis elegans dauer larvae. Methods in Molecular Biology. , 209-219 (2015).
  21. Chaudhuri, J., Parihar, M., Pires-daSilva, A. An introduction to worm lab: from culturing worms to mutagenesis. Journal of Visualized Experiments. (47), e2293 (2011).
  22. Karp, X. Working with dauer larvae. WormBook. , 1-19 (2018).
  23. Dinno, A. Nonparametric pairwise multiple comparisons in independent groups using Dunn's test. The Stata Journal. 15 (1), 292-300 (2015).
  24. Gray, J. M., et al. Oxygen sensation and social feeding mediated by a C. elegans guanylate cyclase homologue. Nature. 430 (6997), 317-322 (2004).
  25. Goodman, M. B., Sengupta, P. How Caenorhabditis elegans senses mechanical stress, temperature, and other physical stimuli. Genetics. 212 (1), 25-51 (2019).
  26. Iliff, A. J., Xu, X. Z. S. C. elegans: a sensible model for sensory biology. Journal of Neurogenetics. 34 (3-4), 347-350 (2020).
  27. Russell, J., Vidal-Gadea, A. G., Makay, A., Lanam, C., Pierce-Shimomura, J. T. Humidity sensation requires both mechanosensory and thermosensory pathways in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (22), 8269-8274 (2014).
  28. Iliff, A. J., et al. The nematode C. elegans senses airborne sound. Neuron. 109 (22), 3633-3646 (2021).
  29. Metaxakis, A., Petratou, D., Tavernarakis, N. Multimodal sensory processing in Caenorhabditis elegans. Open Biology. 8 (6), 180049 (2018).
  30. Wicks, S., Rankin, C. Integration of mechanosensory stimuli in Caenorhabditis elegans. The Journal of Neuroscience. 15, 3 Pt 2 2434-2444 (1995).
  31. Chen, X., Chalfie, M. Modulation of C. elegans touch sensitivity is integrated at multiple levels. The Journal of Neuroscience. 34 (19), 6522-6536 (2014).
  32. Stockand, J. D., Eaton, B. A. Stimulus discrimination by the polymodal sensory neuron. Commun. Integrative Biology. 6 (2), 23469 (2013).
  33. Mackowetzky, K., Yoon, K. H., Mackowetzky, E. J., Waskiewicz, A. J. Development and evolution of the vestibular apparatuses of the inner ear. Journal of Anatomy. 239 (4), 801-828 (2021).
  34. Eppsteiner, R. W., Smith, R. J. H. Genetic disorders of the vestibular system. Current Opinion in Otolaryngology & Head and Neck Surgery. 19 (5), 397-402 (2011).
  35. Roman-Naranjo, P., Gallego-Martinez, A., Lopez Escamez, J. A. Genetics of vestibular syndromes. Current Opinion in Neurology. 31 (1), 105-110 (2018).
  36. Mei, C., et al. Genetics and the individualized therapy of vestibular disorders. Frontiers in Neurology. 12, 633207 (2021).
  37. Weghorst, F. P., Cramer, K. S. The evolution of hearing and balance. eLife. 8, 44567 (2019).

Tags

Davranış Sayı 183
<em>Caenorhabditis</em> Dauer larvalarının büyük ölçekli gravitaksis testi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ackley, C., Washiashi, L.,… More

Ackley, C., Washiashi, L., Krishnamurthy, R., Rothman, J. H. Large-Scale Gravitaxis Assay of Caenorhabditis Dauer Larvae. J. Vis. Exp. (183), e64062, doi:10.3791/64062 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter