Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Embryo Rescue Protokoll for interspesifikk hybridisering i Squash

Published: September 12, 2022 doi: 10.3791/64071
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1UF/IFAS Tropical Research and Education Center

Summary

Artikkelen beskriver en embryoredningsprotokoll for regenerering av umodne embryoer avledet fra interspesifikk hybridisering av Cucurbita pepo og Cucurbita moschata. Protokollen kan enkelt replikeres og vil være en viktig ressurs for squash avl programmer.

Abstract

Interspesifikk hybridisering i Cucurbita-avlinger (squash) er ønskelig for å utvide genetisk variasjon og for introgresjon av nyttige alleler. Umodne embryoer generert fra disse brede kryssene må regenereres ved hjelp av passende embryoredningsteknikker. Selv om denne teknikken er godt etablert for mange avlinger, mangler en detaljert beskrivelse av riktig metodikk for squash som vil tillate rutinemessig bruk. Her beskriver vi en embryoredningsprotokoll som er nyttig for interspesifikk hybridisering av C. pepo og C. moschata. For å identifisere levedyktige kombinasjoner for embryoredning ble det utført 24 interspesifikke kryss. Fruktsett ble hentet fra tjueto kryss, noe som indikerer en suksessrate på 92%. Imidlertid var de fleste av fruktene som ble oppnådd parthenokarpiske, med frø uten embryoer (tomme frø). Bare en krysskombinasjon inneholdt umodne embryoer som kunne regenereres ved hjelp av basale plantevekstmedier. Totalt 10 embryoer ble reddet fra den interspesifikke F 1-frukten, og suksessraten for embryoredning var 80%. Embryoredningsprotokollen som er utviklet her, vil være nyttig for interspesifikk hybridisering i squashavlsprogrammer.

Introduction

Cucurbita (2n = 40) er en svært mangfoldig slekt i Cucurbitaceae-familien som inneholder 27 forskjellige arter, hvorav fem er tamme1. Blant disse er Cucurbita moschata, C. pepo og C. maxima de økonomisk viktigste over hele verden. I USA er C. moschata og C. pepo de to viktigste artene i landbruksproduksjonen. C. pepo består av fire underarter (ovifera, pepo, broderlig og gumala) som inneholder både sommer og vinter squash kultivar grupper av crookneck, straightneck, eikenøtt, kamskjell, cocozelle, vegetabilsk marg, courgette og gresskar 2,3,4,5. C. moschata består hovedsakelig av vinter squash markedstyper, inkludert butternut, Dickinson og ost gruppe1. De to artene er morfologisk og fenotypisk forskjellige, med C. pepo ansett for utbytte, earliness, bush vekstvane og forskjellige fruktegenskaper, inkludert fruktform, fruktstørrelse, kjøttfarge og skallmønster. På den annen side er C. moschata verdsatt for sin tilpasning til varme og fuktighet, samt sykdom og skadedyrsbestandighet 6,7. Interspesifikk hybridisering mellom C. moschata og C. pepo er ikke bare en viktig strategi for introgresjon av ønskelige egenskaper mellom de to artene, men gir også mulighet for utvidelse av den genetiske basen i avlsprogrammer 7,8.

Tidlige krysninger mellom C. moschata og C. pepo ble gjort for å bestemme deres kompatibilitet og / eller taksonomiske barrierer 9,10,11, mens senere studier hovedsakelig fokuserte på å overføre ønskelige egenskaper12,13,14. Interspesifikk hybridisering mellom de to artene har målrettet overføring av nye egenskaper som en busk- eller halvbuskvekstvane og forbedret utbytte fra C. pepo sammen med sykdomsresistens, tilpasningsevne til abiotisk stress og økt kraft fra C. moschata14,15,16. For eksempel har spesifikke kryss mellom C. pepo (P5) og C. moschata (MO3) resultert i høyere fruktutbytte 13, mens C. moschata-tilganger (Nigerian Local og Menina) har blitt mye brukt som den primære kilden til resistens mot potyvirus i dyrkede C. pepo-kultivarer 17,18.

Tidligere studier viste at hybridisering mellom C. moschata og C. pepo er mulig, men vanskelig 8,15. De interspesifikke kryssene kan resultere i ingen fruktsett (abort), parthenokarpiske frukter uten levedyktige frø (tomme frø), frøfrie frukter der de umodne embryoene ikke klarer å utvikle seg (stenospermocarpy), eller frukt med få umodne embryoer som kan reddes til modne planter gjennom embryoredning15,16. For eksempel ble det ikke oppnådd levedyktige frø ved å krysse C. pepo (borddronning, mors) med C. moschata (stor ost, fader), men det gjensidige korset ga 57 levedyktige frø fra 134 pollineringer9. Hayase fikk levedyktige frø fra C. moschata og C. pepo kryss bare når kryss ble gjort kl 04:00 ved bruk av pollen lagret ved 10 ° C over natten19. Baggett krysset åtte forskjellige C. moschata-varianter med C. pepo (delicata) og rapporterte at av 103 totale pollineringer ble det oppnådd 83 frukter som virket normale, men ingen av dem inneholdt levedyktige frø8. I en krysning mellom C. pepo (S179) og C. moschata (NK) oppnådde Zhang og medarbeidere 15 frukter med 2 994 frø, men bare 12 av disse frøene var levedyktige mens de resterende bare viste rudimentær utvikling. Disse studiene tyder på at selv om interspesifikk kryssing mellom C. moschata og C. pepo er svært gunstig, er det krevende16 å skaffe frukt med levedyktige frø fra kryssene.

Embryoredning har blitt foreslått som en passende metode for å overvinne problemer som oppstår ved tidlig abort eller dårlig utviklede embryoer, og er en av de tidligste og mest vellykkede in vitro-kulturteknikkene for regenerering av umodne embryoer16,20. Embryoredning innebærer in vitro-kultur av underutviklede/umodne embryoer etterfulgt av overføring til et sterilt næringsmedium for å lette utvinningen av frøplanter og til slutt modne planter21. Selv om embryo redning er ofte brukt i squash avl, en detaljert beskrivelse av riktig metodikk som ville tillate sin rutinemessige anvendelse mangler. Bruk av embryoredningsteknikk for å overvinne interspesifikke hybridiseringsbarrierer i Cucurbita-arter ble rapportert så tidlig som 195422. Imidlertid var suksessen til embryoredning i de tidlige studiene enten urapportert eller svært lav. Metwally og medarbeidere rapporterte en suksessrate på 10% (regenerering til modne planter) blant 100 interspesifikke hybridembryoer reddet fra en krysning mellom C. pepo og C. martinezii23. Sisko og medarbeidere rapporterte en variabel suksessrate for embryoregenerering blant embryoer oppnådd fra forskjellige krysskombinasjoner: regenereringsgraden av hybrider oppnådd ved å krysse C. maxima (Bos. Max) og C. pepo (Gold Rush) var 15,5%, for C. pepo (Zucchini) og C. moschata (Hokaido) var 20%, mens for C. pepo (Gold Rush) og C. moschata (Dolga) var den 37,5%24. I tillegg til genotype er media og in vitro-kulturforhold viktige faktorer for teknikkens suksess25,26. I den nåværende studien ble ulike krysskombinasjoner mellom C. moschata og C. pepo testet, og en enkel metodikk for å bruke embryoredningsteknikken i squash ble utviklet. Utviklingen av en enkel og lett reproduserbar embryoredningsteknikk vil legge til rette for interspesifikk hybridisering og germplasmforbedring i squashavlsprogrammer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Planting og pollinering

MERK: Det er viktig å identifisere kompatible genotyper hvis hybridisering vil resultere i fruktsett og produksjon av levedyktige embryoer.

  1. Planteforhold og vedlikehold
    1. Oppnå frø av squash genotyper (kultivarer / tiltredelser) for hybridisering (tabell 1).
    2. Fyll 50 celle startflater (25 cm bredde x 50 cm lengde) med pottemedium endret med komplett NPK-gjødsel som inneholder 1,38 g / kg N, 1,38 g / kg P og 1,38 g / kg K.
    3. Så frø til en dybde som er lik lengden og dekk med pottemedium. Vann leilighetene uten å skape stående vann. Etterpå, hold media fuktig ved å vanne det for hånd en gang per dag.
    4. På det andre true-leaf trinnet, transplantere plantene i 25 cm til 30 cm diameter potter endret med en komplett NPK gjødsel på 3 ss / potten. Gjødsle plantene en gang i uken med 500 ml / pott flytende gjødsel som inneholder NPK 20:20:20 tilsatt til en konsentrasjon på 1 g per liter vann.
    5. Vedlikeholde planter i drivhuset ved temperaturer mellom 22-28 °C under naturlig lysregime. For vining genotyper, gi en støtte espalier i drivhuset (figur 1).
  2. Utføre pollineringer
    1. Vanligvis starter blomstring i squash på 6 til 8 uker fra såing, avhengig av sorten (figur 2A, B). Begynn å lage kontrollert hybridisering (kryss) så snart plantene begynner å blomstre. Under drivhusforhold kan pollinering gjøres året rundt.
    2. Identifiser mannlige og kvinnelige blomster av C. pepo og C . moschata kultivarer som vil være klare for pollinering dagen etter. For å identifisere slike blomster, se etter blomster hvis kronblad har en gul nyanse, men ikke er åpne. Teip forsiktig blomstene lukket øverst ved hjelp av maskeringstape for å forhindre utilsiktet insektbestøvning (figur 2C, D).
    3. Morgenen etter er blomstene klare til å pollinere. Utfør pollinering før kl. 10.00 for å forbedre frekvensen av hybridiseringssuksess27.
    4. Åpne kvinnelige og mannlige blomster ved forsiktig å fjerne den teipede øverste delen av kronbladene. Fjern kronbladene fra hannblomsten og overfør pollen ved å forsiktig gni antheren på stigmaet til den kvinnelige blomsten (figur 3A).
    5. Etter pollinering, lukk straks den pollinerte kvinnelige blomsten med maskeringstape. Bruk en -kode for å registrere datoen for pollinering og for å indikere fars- og morsforeldrene som ble brukt i korset (figur 3B).
    6. Et vellykket kryss indikeres av en utvidet eggstokk som raskt danner en liten frukt innen 1 uke (figur 4A). Planten er da klar for høsting 45-55 dager etter pollinering28 (Figur 4B).

2. Embryo redning teknikk

  1. Forberedelse av media
    1. Forbered antibiotikalagre: For cefotaksim (natriumsalt), oppløs antibiotika i 4 ml avionisert eller destillert vann, filtrer gjennom et sterilt 0,22 μm sprøytefilter og lag 0,5 ml aliquoter. Oppbevares ved -20 °C. Den resulterende stamløsningen vil ha en konsentrasjon på 250 mg / ml.
    2. For ampicillin (natriumsalt), oppløs pulveret i 10 ml vann, filtrer gjennom et sterilt 0,22 μm sprøytefilter og aliquot i 1 ml lager med en endelig konsentrasjon på 100 mg / ml. Oppbevares ved -20 °C.
    3. Gjør Murashige og Skoog (MS) medium ved å oppløse 2,45 g medium (4,91 g / L konsentrasjon) i 500 ml destillert vann i en 1 L flaske. Tilsett 1,5 g gellangummi og autoklav ved 121 °C i 20 minutter. Gellangummiet oppløses helt under autoklavering.
    4. Avkjøl mediet etter autoklavering ved å plassere flasken i et vannbad ved 50 °C. Fjern antibiotikalagrene fra fryseren og tine dem i det laminære strømningsskapet.
    5. Overfør mediumflasken til den laminære strømningshetten. Tilsett 0,6 ml cefotaksimoppløsning (250 mg/ml) og 0,25 ml ampicillinpapir (100 mg/ml) til mediumflasken og bland godt. Hell ca. 7 ml av mediet i en steril petriskål (60 mm x 15 mm).
    6. La mediet stivne i petriskålene i ca. 15-20 min. Lukk petriskålene med tetningsinnpakning og legg dem i en oppbevaringsboks. Oppbevares ved romtemperatur.
  2. Embryo redning
    1. Før du starter, rengjør og steriliser laminær luftstrømskap med 70% etylalkohol.
    2. Høst squashfrukten ved å bryte/kutte den av hovedvintreet og desinfiser fruktoverflaten ved å vaske med flytende vaskemiddel (f.eks. 0,3 % kloroksylenol) i laboratorievasken til alt løst smuss er fjernet (figur 5A).
    3. Skyll med rikelig vann fra springen. Tørk frukten med rene papirhåndklær. Flytt frukten til laminær luftstrømskap (figur 5B).
    4. Overflatesteriliser frukten ved å sprøyte 70% etanol på frukten i det sterile laminære luftstrømskapet. Skjær frukten med en steril kniv (figur 5C) og trekk ut frøene.
    5. Bruk steril tang til å åpne frøbelegget aseptisk og eksponere de umodne embryoene (figur 6). Legg de umodne embryoene forsiktig i en petriskål med MS-medium supplert med cefotaksim og ampicillin (figur 7A). Lukk petriskålen og forsegl med innpakningsfilm.
      MERK: Avhengig av størrelsen på embryoet, er det mulig å passe fem eller seks embryoer i en petriskål.
    6. Plasser de forseglede petriskålene med embryoer i et vekstkammer under 16 timers fotoperiode ved 25 °C og 70 % relativ fuktighet. Hvis forurensning oppstår, subkultur straks de uforurensede embryoene i en ny plate med samme medium.
    7. Cotyledonene begynner å utvide seg etter 4 dager og blir grønne om 10 dager (figur 7B). På dette tidspunktet, om nødvendig, utfør subkulturering i nye plater som inneholder samme medium for å tillate vevsutvidelse. Røttene vil begynne å vises etter 14 dager (figur 7C), og ved 21 dager vil plantene ha utvidede røtter og cotyledoner (figur 7D).
      MERK: Kulturmediet som brukes i protokollen er egnet for differensiering i skudd og røtter uten supplerende vekstregulatorer.
    8. På dette stadiet fjerner du plantene fra petriskålen og vasker forsiktig av mediet fra røttene med vann fra springen (figur 8). Legg plantene i en plastbeholder (14 cm x 9 cm x 4 cm) og dekk røttene med våte papirhåndklær (figur 9A). Dekk beholderen og remoist papirhåndklærne etter behov.
    9. Oppbevar beholderne ved romtemperatur (25-28 °C) og med 16 timers fotoperiode. Dette trinnet vil akklimatisere plantlets. Etter akklimatisering i 7-10 dager i beholderen, vil plantene være ca 3-4 i lang. I løpet av denne perioden, remoisten papirhåndklærne etter behov.
    10. Overfør plantene til 50 celle startflater (25 cm bredde x 50 cm lengde) endret med gjødsel som tidligere beskrevet og flytt dem til drivhuset (figur 9B). Ikke overvann frøplanter for å unngå rotting; tilsett omtrent 10-20 ml per celle etter behov.
    11. På det andre til tredje ekte bladstadiet, transplanter plantene i potter med 30 cm diameter fylt med pottemedium endret med gjødsel som tidligere beskrevet (figur 10A). Gi espalierstøtte til vinplanter og utfør kontrollert hybridisering når plantene begynner å blomstre, som tidligere beskrevet (figur 10B).
    12. Vedlikehold plantene i drivhuset ved temperaturer mellom 22-28 °C under naturlig lysregime. Evaluer plantene for frukt og frøegenskaper.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Fruktsett og frø levedyktighet
En innledende test ble utført for å bestemme fruktsett og frø levedyktighet i en rekke krysskombinasjoner. Totalt 15 squashgenotyper, fire C. pepo og 11 C. moschata, ble valgt (tab 1). Av de 24 interspesifikke krysskombinasjonene som ble forsøkt, ble et fruktsett oppnådd for 22 (tabell 2), noe som representerte en samlet >92% suksess i fruktsettet. Ingen modne frukter ble oppnådd ved å krysse O og M og E og J, mens det høyeste antall frukter (n = 6) ble oppnådd ved å krysse F og J (tabell 2). Antall blomster pollinert for forskjellige krysskombinasjoner varierte fra en til 11, og suksessraten for pollinering varierte fra 0% til 100%. Antall blomster pollinert i forskjellige krysskombinasjoner varierte avhengig av antall blomstersett og synkronisering av blomstring blant mannlige og kvinnelige blomster. Selv om frukt ble hentet fra alle korsene unntatt to, viste evaluering av frukt etter kutting at de fleste fruktene hadde abortert embryoer uten levedyktige frø. Frukt fra de fleste korsene så normale ut, men var blottet for frø eller besto av frø med rudimentære embryoer. Totalt 44 frukter ble produsert fra alle krysskombinasjonene, og bare en frukt, utviklet ved å krysse C og J, hadde dårlig utviklede embryoer som kunne gjenopprettes gjennom embryoredningsteknikken.

Embryo redning og videre avansement
F1 interspesifikk hybrid utviklet ved å krysse C og J hadde totalt 44 frø, men bare 10 av disse hadde embryoer som kunne reddes for generasjonsutvikling. De resterende frøene hadde ingen embryoer. Alle de 10 embryoene ble dyrket i embryoredningsmediene og sjekket daglig for vekst og utvikling. Størrelsen på de 10 umodne embryoene varierte fra 3, 51 mm til 8, 26 mm. Suksessraten for embryoredning var 80%. F1 interspesifikke hybrider (brolinjer) utviklet ved å krysse C. moschata og C. pepo (C og J) inneholdt genomene til begge artene i forholdet 1: 1 (50% hver). Disse plantene ble brukt som brolinjer for innføring av økonomisk viktige egenskaper på tvers av de to artene. For eksempel vil kryssing av disse brolinjene med C. moschata resultere i hybrider med henholdsvis 75% C. moschata og 25% C. pepo genetisk bakgrunn. Fruktene hentet fra disse brolinjene hadde en blanding av unviable frø og frø med umodne embryoer som senere krevde vevskultur for regenerering. For eksempel hadde en av fruktene totalt 54 frø, hvorav 14 frø hadde umodne embryoer som ble reddet ved hjelp av protokollen beskrevet her.

Figure 1
Figur 1: Støttende espalier for vertikalt voksende squashplanter i drivhuset. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Illustrasjon av åpne og teipede blomster. Åpen (A) mannlig og (B) kvinnelig squashblomst i drivhuset. (C) En teipet hannblomst fra Cucurbita moschata farsforelder. (D) En teipet hunnblomst fra Cucurbita pepo mors forelder. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Illustrasjon av pollinering . (A) Overfør pollen fra hannblomsten ved å forsiktig gni antheren på stigmaet til den kvinnelige blomsten. (B) Etter pollinering, tape hunnblomsten og bruk en tag for å registrere datoen for pollinering og fars- og morsforeldrene som ble brukt i korset. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Fruktsett . (A) Etter pollinering vil eggstokken utvide seg raskt og danne en liten frukt innen 1 uke. (B) Frukten er klar til høsting 45 dager etter pollinering. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5: Fruktforberedelse . (A) Vask frukten med vaskemiddel. Høst og desinfiser overflaten av frukten ved å vaske den med flytende vaskemiddel i laboratorievasken. (B) Skyll og tørk frukten. Tørk frukten med rene papirhåndklær, etter skylling med rikelig vann fra springen, og flytt den til laminær luftstrømskap. (C) Skjær frukten åpen med en steril kniv. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 6
Figur 6: Trekk ut embryo fra frøene. Bruk steril tang til å åpne frøbelegget aseptisk og eksponere det umodne embryoet. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 7
Figur 7: Embryoregenerering i MS-medier . (A) Plasser umodne embryoer forsiktig i en petriskål som inneholder MS-medium. (B) Cotyledonene vil utvide seg og bli grønne innen 10 dager. (C) Røttene begynner å vises etter 14 dager. (D) Etter 21 dager vil plantene ha utvidede røtter og cotyledoner som er klare til å overføres til en plastbeholder for akklimatisering. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 8
Figur 8: Vask røttene. Fjern plantene fra petriskålen og vask forsiktig av media fra røttene med vann fra springen. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 9
Figur 9: Akklimatiser plantene . (A) Legg plantene i en plastbeholder og dekk røttene med et vått papirhåndkle i 5 dager for å akklimatisere dem. (B) Overfør plantene til cellebrett som inneholder kommersiell plantejord endret med komplett NPK-gjødsel. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 10
Figur 10: Transplanter plantene i potter. (A) På det andre til tredje sanne bladstadiet, transplanter plantene i potter med 30 cm diameter fylt med pottemedium endret med gjødsel. (B) Gi espalierstøtte til vinplanter og foreta kontrollert hybridisering når plantene begynner å blomstre. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Lab-kode Art Kilde
En C. moschata Lokale Farmers Market
B C. moschata Lokale Farmers Market
C C. moschata Lokale Farmers Market
D C. moschata Lokale Farmers Market
E C. moschata Lokale Farmers Market
F C. moschata Lokale Farmers Market
G C. moschata Universitetet i Florida Avlslinje
H C. moschata Universitetet i Florida Avlslinje
Jeg C. pepo NCRPIS (North Central Regional Plant Intruduction Station)
J C. pepo NCRPIS (North Central Regional Plant Intruduction Station)
M C. pepo NCRPIS (North Central Regional Plant Intruduction Station)
O C. moschata Universitetet i Florida Avlslinje
Q C. moschata Universitetet i Florida Avlslinje
W C. pepo Universitetet i Florida Avlslinje
Y C. moschata Burpee Frø Co

Tabell 1 Totalt 15 genotyper av squash, fire C. pepo og 11 C. moschata, ble brukt i studien for interspesifikke kryss.

Kors (Kvinne x Mann) N. av pollinerte blomster N. av frukt Frukt sett (%) N. av avbrutte frø N. av umodne embryoer N. av reddede embryoer
A (C. moschata) x I (C. pepo) 5 4 80 0 0 0
H (C. moschata) x I (C. pepo) 2 2 100 0 0 0
B (C. moschata) x J (C. pepo) 2 1 50 0 0 0
C (C. moschata) x J (C. pepo) 3 1 33.3 44 10 8
E (C. moschata) x J (C. pepo) 6 0 0 0 0 0
F (C. moschata) x J (C. pepo) 11 6 54.5 0 0 0
G (C. moschata) x J (C. pepo) 2 2 100 0 0 0
J (C. pepo) x H (C. moschata) 7 2 28.6 0 0 0
J (C. pepo) x O (C.moschata) 6 1 16.7 0 0 0
O (C. moschata) x J (C. pepo) 6 1 16.7 0 0 0
Q (C. moschata) x J (C. pepo) 1 1 100 0 0 0
C (C. moschata) x M (C. pepo) 4 3 75 0 0 0
D (C. moschata) x M (C. pepo) 1 1 100 0 0 0
F (C. moschata) x M (C. pepo) 9 5 55.6 0 0 0
G (C. moschata) x M (C. pepo) 1 1 100 0 0 0
O (C. moschata) x M (C. pepo) 22 0 0 0 0 0
Q (C. moschata) x M (C. pepo) 2 1 50 0 0 0
F (C. moschata) x W (C. pepo) 1 1 100 0 0 0
G (C. moschata) x W (C. pepo) 1 1 100 0 0 0
H (C. moschata) x W (C. pepo) 2 1 50 0 0 0
O (C. moschata) x W (C. pepo) 0 0 0 0 0 0
Y (C. moschata) x W (C. pepo) 3 2 66.7 0 0 0
M (C. pepo) x H (C.moschata) 3 2 66.7 0 0 0
M (C. pepo) x O (C.moschata) 4 4 100 0 0 0
Total 44 10 8

Tabell 2 Krysskombinasjoner forsøkt med de 15 genotypene av squash og det tilsvarende fruktsettet, antall aborterte frø, umodne embryoer og vellykkede embryoredninger.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Det er to hovedflaskehalser for vellykket interspesifikk hybridisering mellom C. moschata og C. pepo: krysskompatibilitetsbarriere, som bestemmes av genotyperespons for å produsere hybridembryoer, og postbefruktningsbarrierer, som hindrer utviklingen av hybridembryoer til normale frø. Som tidligere rapportert for squash, viste krysskompatibilitetstesten i den nåværende studien at det meste av frukten utviklet seg parthenokarpisk, med de fleste frøene unviable16. Foreldregenotype har en betydelig innflytelse på kompatibiliteten til interspesifikk hybridisering mellom C. moschata og C. pepo. Blant de 24 krysskombinasjonene som ble testet i den nåværende studien, ga bare en (C og J) umodne embryoer for embryoredning. Som sådan ble studien begrenset av mangelen på biologiske replikasjoner for å teste effektiviteten av protokollen som ble utviklet. Imidlertid ble en regenereringseffektivitet på 80% oppnådd for de 10 umodne embryoene som ble reddet fra C- og J-korset. Tidligere studier har rapportert lavere regenereringssuksess fra embryoredninger for C. pepo og C. moschata-kryss, og demonstrerer dermed effektiviteten av den nye protokollen14,15. For eksempel rapporterte De Oliveira og medarbeidere at av 26 embryoer hentet fra en krysning mellom C. pepo cv. Asmara og C. moschata cv. Piramoita, ingen regeneranter ble oppnådd. Forfatterne rapporterte imidlertid en 16% regenereringssuksess når en annen kombinasjon av genotyper (C. pepo cv. Asmara og C. moschata cv. Duda) ble brukt14. I en annen studie av interspesifikk hybridisering mellom forskjellige Cucurbita-arter rapporterte Rakha og medarbeidere en regenereringseffektivitet på henholdsvis 40% og 15% fra de umodne embryoene oppnådd ved å krysse C. ficifolia x C. pepo og C. martinezii x C. pepo, henholdsvis15. Den nåværende studien benyttet et MS-medium uten supplerende vekstregulatorer sammenlignet med tidligere etablerte protokoller som benyttet komplekse medier for embryoredning 15,29,30. Videre var tilsetningen av antibiotika cefotaksim og ampicillin tilstrekkelig til å forhindre mikrobiell kontaminering. Dermed gir mediet fordeler som billigere, er lett å forberede uten behov for høyt kvalifisert personell, og det kan vedtas av mindre avlsprogrammer med begrensede ressurser.

I den nåværende studien ble frukt høstet 45-55 dager etter pollinering (DPP) for å maksimere embryomodning og regenerering. DPP valgt for den nåværende studien var basert på en tidligere rapport som viste optimal akkumulering av energireserver (for det meste lipider og proteiner) for embryoer oppstod ved 60 DPP31,32. I muskmelon rapporterte Nunez-Palenius og medarbeidere en positiv sammenheng mellom suksessen til embryoredning og DPP30.

I den nåværende studien ga den andre generasjonen frukt utviklet ved å krysse interspesifikke F1-hybrider med C. moschata ikke normale frø. Denne observasjonen indikerer at det er vanskelig å overvinne fertilitetsbarrieren mellom C. moschata og C . pepo i en enkelt generasjon som tidligere rapportert16. Vedtakelsen av den nåværende protokollen vil imidlertid bidra til en vellykket utvikling av Cucurbita interspesifikke hybrider i avlsprogrammer. Ytterligere studier er nødvendig for å bestemme krysskompatibilitet av et bredere utvalg av genotyper for å utvide germplasm tilgjengelighet til oppdrettere

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne oppgir ingen interessekonflikter.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av USDA National Institute of Food and Agriculture, NRS Prosjekt nr. FLA-TRC-006176 og University of Florida Institute of Food and Agricultural Sciences.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ampicillin Fisher Scientific BP1760-5
autoclave Steris AMSCO LAB 250
balance
cefotaxime Sigma Alfrich C 7039
centrifuge tubes (1.5 ml) Sigma Alfrich T9661
detergent
ethanol, 95% Decon Labs 2805HC
forceps VWR 82027-408
gellan gum Caisson Laboratories G024
growth chamber or illuminated shelf
laminar hood / biosafety cabinet The Baker Company, Inc Edgegard
masking tape Uline S-11735
media bottle
Murashige & Skoog Medium Research Products International M10200
NPK fertilizer (20-20-20) BWI Companies, Inc  PR200
Osmocote Plus fertilizer BWI Companie,s Inc OS90590
Parafilm M Sigma Alfrich P7793
Petri dish (60 x 15 mm) USA Scientific, Inc 8609-0160
plant pots BWI Companies, Inc NP4000BXL
plastic food containers, reused Oscar Mayer 4470003330
plastic hang tags Amazon B07QTZRY6T
potting mix Jolly Gardener Pro-Line C/B
seedling starter trays BWI Companies Inc GPPF128S4
syringe filter (0.22 um ) ExtraGene B25CA022-S
trellis support The Home Depot  2A060006
water bath

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Paris, H. S. Genetic Resources of Pumpkins and Squash, Cucurbita spp. Genetics and Genomics of Cucurbitaceae. Plant Genetics and Genomics: Crops and Models. Grumet, R., Katzir, N., Garcia-Mas, J. 20, (2016).
  2. Gong, L., Stift, G., Kofler, R., Pachner, M., Lelley, T. Microsatellites for the genus Cucurbita and an SSR-based genetic linkage map of Cucurbita pepo L. Theoretical and Applied Genetics. 117 (1), 37-48 (2008).
  3. Paris, H. S., et al. Assessment of genetic relationships in Cucurbita pepo (Cucurbitaceae) using DNA markers. Theoretical and Applied Genetics. 106 (6), 971-978 (2003).
  4. Robinson, R. W., Decker-Walters, D. S. Cucurbits. , CAB International. Wallingford, Oxon, UK. (1997).
  5. Teppner, H. Cucurbita pepo (Cucurbitaceae)-history, seed coat types, thin coated seeds and their genetics. Phyton (Horn). 40 (1), 1-42 (2000).
  6. Hazra, P., Mandal, A. K., Dutta, A. K., Ram, H. H. Breeding pumpkin (Cucurbita moschata Duch. Ex Poir.) for fruit yield and other characters. International Journal of Plant Breeding. 1 (1), 51-64 (2007).
  7. Paris, H. S. History of the cultivar-groups of Cucurbita pepo. Horticultural Reviews-Westport Then New York. 25, 71 (2001).
  8. Baggett, J. R. Attempts to cross Cucurbita moschata (Duch.) Poir. 'Butternut and C. pepo L. 'Delicata'. The Cucurbit Genetics Cooperative. 2, 32-34 (1979).
  9. Erwin, A. T., Haber, E. S. Species and Varietal Crosses in Cucurbits. Agricultural Experiment Station, Iowa State College of Agriculture and Mechanical Arts. , (1929).
  10. Whitaker, T. W., Bohn, G. W. The taxonomy, genetics, production and uses of the cultivated species of Cucurbita. Economic Botany. 4 (1), 52-81 (1950).
  11. Bemis, W. P., Nelson, J. M. Interspecific hybridization within the genus Cucurbita I, fruit set, seed and embryo development. Journal of the Arizona Academy of Science. 2 (3), 104-107 (1963).
  12. Washek, R. L., Munger, H. M. Hybridization of Cucurbita pepo with disease resistant Cucurbita species. The Cucurbit Genetics Cooperative. 6, 92 (1983).
  13. Davoodi, S., Olfati, J. A., Hamidoghli, Y., Sabouri, A. Standard heterosis in Cucurbita moschata and Cucurbita pepo interspecific hybrids. International Journal of Vegetable Science. 22 (4), 383-388 (2016).
  14. De Oliveira, A. C. B., Maluf, W. R., Pinto, J. E. B., Azevedo, S. M. Resistance to papaya ringspot virus in summer squash Cucurbita pepo L. introgressed from an interspecific C. pepo× C. moschata cross. Euphytica. 132 (2), 211-215 (2003).
  15. Rakha, M. T., Metwally, E. I., Moustafa, S. A., Etman, A. A., Dewir, Y. H. Production of Cucurbita interspecific hybrids through cross pollination and embryo rescue technique. World Applied Sciences Journal. 20 (10), 1366-1370 (2012).
  16. Zhang, Q. I., Yu, E., Medina, A. Development of advanced interspecific-bridge lines among Cucurbita pepo, C. maxima, and C. moschata. HortScience. 47 (4), 452-458 (2012).
  17. Brown, R. N., Bolanos-Herrera, A., Myers, J. R., Miller Jahn, M. Inheritance of resistance to four cucurbit viruses in Cucurbita moschata. Euphytica. 129 (3), 253-258 (2003).
  18. Pachner, M., Paris, H. S., Winkler, J., Lelley, T. Phenotypic and marker-assisted pyramiding of genes for resistance to zucchini yellow mosaic virus in oilseed pumpkin (Cucurbita pepo). Plant Breeding. 134 (1), 121-128 (2015).
  19. Hayase, H. Cucurbita-crosses. XV. Flower pollination at 4 am in the production of C. pepo x C. moschata F1 hybrids. Japanese Journal of Breeding. 13 (2), 76-82 (1963).
  20. Reed, S. Embryo rescue. Plant development and biotechnology. , 235-239 (2004).
  21. Sharma, D. R., Kaur, R., Kumar, K. Embryo rescue in plants-a review. Euphytica. 89 (3), 325-337 (1996).
  22. Wall, J. R. Interspecific hybrids of Cucurbita obtained by embryo culture. Proceedings of the American Society of Horticultural Science. 63, 427-430 (1954).
  23. Metwally, E. I., Haroun, S. A., El-Fadly, G. A. Interspecific cross between Cucurbita pepo L. and Cucurbita martinezii through in vitro embryo culture. Euphytica. 90 (1), 1-7 (1996).
  24. Sisko, M., Ivancic, A., Bohanec, B. Genome size analysis in the genus Cucurbita and its use for determination of interspecific hybrids obtained using the embryo-rescue technique. Plant Science. 165 (3), 663-669 (2003).
  25. Giancaspro, A., et al. Optimization of an in vitro embryo rescue protocol for breeding seedless table grapes (Vitis vinifera L.) in Italy. Horticulturae. 8 (2), 121 (2022).
  26. Warchol, M., et al. The effect of genotype, media composition, pH and sugar concentrations on oat (Avena sativa L.) doubled haploid production through oat x maize crosses. Acta Physiologiae Plantarum. 40 (5), 1-10 (2018).
  27. Nepi, M., Pacini, E. Pollination, pollen viability and pistil receptivity in Cucurbita pepo. Annals of Botany. 72 (6), 527-536 (1993).
  28. Harvey, W. J., Grant, D. G., Lammerink, J. P. Physical and sensory changes during development and storage of buttercup squash. New Zealand Journal of Crop and Horticultural Science. 25 (4), 341-351 (1997).
  29. Moon, P., Meru, G. Embryo rescue of aged Cucurbita pepo seeds using squash rescue medium. Journal of Horticultural Science and Research. 2 (1), 62-69 (2018).
  30. Nuñez-Palenius, H. G., Ramírez-Malagón, R., Ochoa-Alejo, N. Muskmelon embryo rescue techniques using in vitro embryo culture. Plant Embryo Culture. , Humana Press. 107-115 (2011).
  31. Vining, K. J., Loy, J. B. Seed development and seed fill in hull-less seeded cultigens of pumpkin (Cucurbita pepo L). Cucurbitaceae 98: Evaluation and Enhancement of Cucurbit Germplasm. McCreight, J. M. , ASHS Press. Alexandria, VA. 64-69 (1998).
  32. Vining, K. J. Seed development in hull-less-seeded pumpkin (Cucurbita pepo L.). , University of New Hampshire. L.), Durham, NH. M.S. Thesis (1999).

Tags

Biologi utgave 187
Embryo Rescue Protokoll for interspesifikk hybridisering i Squash
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Fu, Y., Shrestha, S., Moon, P.,… More

Fu, Y., Shrestha, S., Moon, P., Meru, G. Embryo Rescue Protocol for Interspecific Hybridization in Squash. J. Vis. Exp. (187), e64071, doi:10.3791/64071 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter