Summary
Het artikel beschrijft een embryoreddingsprotocol voor de regeneratie van onrijpe embryo's afgeleid van de interspecifieke hybridisatie van Cucurbita pepo en Cucurbita moschata. Het protocol kan gemakkelijk worden gerepliceerd en zal een belangrijke bron zijn voor squashfokkerijprogramma's.
Abstract
Interspecifieke hybridisatie in Cucurbita-gewassen (squash) is wenselijk voor het verbreden van genetische variatie en voor de introgressie van nuttige allelen. Onrijpe embryo's die uit deze brede kruisingen worden gegenereerd, moeten worden geregenereerd met behulp van geschikte embryoreddingstechnieken. Hoewel deze techniek voor veel gewassen goed ingeburgerd is, ontbreekt een gedetailleerde beschrijving van de juiste methodologie voor squash die de routinematige toepassing ervan mogelijk zou maken. Hier beschrijven we een embryoreddingsprotocol dat nuttig is voor interspecifieke hybridisatie van C. pepo en C. moschata. Om levensvatbare combinaties voor embryoredding te identificeren, werden 24 interspecifieke kruisingen uitgevoerd. Fruitset werd verkregen uit tweeëntwintig kruisen, wat wijst op een slagingspercentage van 92%. De meeste verkregen vruchten waren echter parthenocarpisch, met zaden zonder embryo's (lege zaden). Slechts één kruiscombinatie bevatte onrijpe embryo's die konden worden geregenereerd met behulp van basale plantengroeimedia. In totaal werden 10 embryo's gered uit de interspecifieke F1-vrucht en het slagingspercentage van embryoredding was 80%. Het hier ontwikkelde embryoreddingsprotocol zal nuttig zijn voor interspecifieke hybridisatie in squashveredelingsprogramma's.
Introduction
Cucurbita (2n = 40) is een zeer divers geslacht in de Cucurbitaceae-familie die 27 verschillende soorten bevat, waarvan er vijf gedomesticeerd zijn1. Hiervan zijn Cucurbita moschata, C. pepo en C. maxima wereldwijd de economisch belangrijkste. In de VS zijn C. moschata en C. pepo de twee belangrijkste soorten in de landbouwproductie. C. pepo bestaat uit vier ondersoorten (ovifera, pepo, fraternal en gumala) die zowel zomer- als winterpompoencultivargroepen van kromhals, rechte hals, eikel, sint-jakobsschelp, cocozelle, groentemerg, courgette en pompoenbevatten 2,3,4,5. C. moschata bestaat voornamelijk uit winterpompoenmarkttypen, waaronder butternut, Dickinson en kaasgroep1. De twee soorten zijn morfologisch en fenotypisch divers, waarbij C. pepo wordt beschouwd om zijn opbrengst, gehoorzaamheid, struikgroeigewoonte en diverse fruitkenmerken, waaronder fruitvorm, vruchtgrootte, vleeskleur en korstpatroon. Aan de andere kant wordt C. moschata gewaardeerd om zijn aanpassing aan hitte en vochtigheid, evenals ziekte- en plaagresistentie 6,7. Interspecifieke hybridisatie tussen C. moschata en C. pepo is niet alleen een belangrijke strategie voor introgressie van wenselijke kenmerken tussen de twee soorten, maar maakt ook de verbreding van de genetische basis in fokprogramma's mogelijk 7,8.
Vroege kruisingen tussen C. moschata en C. pepo werden gemaakt om hun compatibiliteit en / of taxonomische barrières 9,10,11 te bepalen, terwijl latere studies zich vooral richtten op het overbrengen van wenselijke eigenschappen 12,13,14. Interspecifieke hybridisatie tussen de twee soorten is gericht op de overdracht van nieuwe eigenschappen zoals een struik- of semi-struikgroeigewoonte en verbeterde opbrengst van C. pepo, samen met ziekteresistentie, aanpassingsvermogen aan abiotische stress en verhoogde kracht van C. moschata 14,15,16. Specifieke kruisingen tussen C. pepo (P5) en C. moschata (MO3) hebben bijvoorbeeld geresulteerd in een hogere vruchtopbrengst13, terwijl C. moschata-toetredingen (Nigerian Local en Menina) op grote schaal zijn gebruikt als de primaire bron van resistentie tegen potyvirussen in gekweekte C. pepo-cultivars 17,18.
Eerdere studies toonden aan dat hybridisatie tussen C. moschata en C. pepo mogelijk is, maar moeilijk 8,15. De interspecifieke kruisingen kunnen resulteren in geen vruchtzetting (abortus), parthenocarpische vruchten zonder levensvatbare zaden (lege zaden), pitloze vruchten waar de onrijpe embryo's zich niet ontwikkelen (stenospermocarpie) of vruchten met weinig onrijpe embryo's die kunnen worden gered tot volwassen planten door embryoredding15,16. Er werden bijvoorbeeld geen levensvatbare zaden verkregen door C. pepo (tafelkoningin, moeder) te kruisen met C. moschata (grote kaas, vaderlijk), maar het wederzijdse kruis leverde 57 levensvatbare zaden op uit 134 bestuivingen9. Hayase verkreeg levensvatbare zaden van C. moschata en C. pepo kruisingen alleen wanneer kruisingen werden gemaakt om 04:00 uur met behulp van stuifmeel opgeslagen bij 10 °C 's nachts19. Baggett kruiste acht verschillende C. moschata-variëteiten met C. pepo (delicata) en meldde dat van de 103 totale bestuivingen 83 vruchten werden verkregen die normaal leken, maar geen van hen bevatte levensvatbare zaden8. In een kruising tussen C. pepo (S179) en C. moschata (NK) verkregen Zhang et al. 15 vruchten met 2.994 zaden, maar slechts 12 van die zaden waren levensvatbaar, terwijl de rest slechts rudimentaire ontwikkeling vertoonde. Deze studies suggereren dat hoewel interspecifieke kruising tussen C. moschata en C. pepo zeer gunstig is, het verkrijgen van fruit met levensvatbare zaden uit de kruisen veeleisend is16.
Embryoredding is voorgesteld als een geschikte methode om problemen te overwinnen die voortvloeien uit vroege abortering of slecht ontwikkelde embryo's en is een van de vroegste en meest succesvolle in vitro kweektechnieken voor regeneratie van onrijpe embryo's16,20. Embryoredding omvat de in vitro kweek van onderontwikkelde/onrijpe embryo's, gevolgd door overdracht naar een steriel voedingsmedium om het herstel van zaailingen en uiteindelijk volwassen planten te vergemakkelijken21. Hoewel embryoredding vaak wordt gebruikt in de squashfokkerij, ontbreekt een gedetailleerde beschrijving van de juiste methodologie die de routinematige toepassing ervan mogelijk zou maken. Het gebruik van embryoreddingstechniek om interspecifieke hybridisatiebarrières bij Cucurbita-soorten te overwinnen, werd al in 1954 gemeld22. Het succes van embryoredding in de vroege studies was echter niet gemeld of zeer laag. Metwally et al. rapporteerden een succespercentage van 10% (regeneratie in volwassen planten) onder 100 interspecifieke hybride embryo's gered uit een kruising tussen C. pepo en C. martinezii23. Sisko et al. rapporteerden een variabel succespercentage van embryoregeneratie bij embryo's verkregen uit verschillende kruiscombinaties: het regeneratiepercentage van hybriden verkregen door kruising van C. maxima (Bos. Max) en C. pepo (Gold Rush) was 15,5%, voor C. pepo (Courgette) en C. moschata (Hokaido) was 20%, terwijl voor C. pepo (Gold Rush) en C. moschata (Dolga) het 37,5% 24 was. Naast het genotype zijn media en in vitro kweekomstandigheden belangrijke factoren voor het succes van de techniek25,26. In de huidige studie werden verschillende kruiscombinaties tussen C. moschata en C. pepo getest en werd een eenvoudige methodologie ontwikkeld voor het gebruik van de embryoreddingstechniek in squash. De ontwikkeling van een eenvoudige en gemakkelijk reproduceerbare embryoreddingstechniek zal interspecifieke hybridisatie en kiemplasmaverbetering in squashveredelingsprogramma's vergemakkelijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Planten en bestuiven
OPMERKING: Het is belangrijk om compatibele genotypen te identificeren waarvan de hybridisatie zou resulteren in vruchtzetting en de productie van levensvatbare embryo's.
- Plantomstandigheden en onderhoud
- Verkrijg zaden van squashgenotypen (cultivars/toetredingen) voor hybridisatie (tabel 1).
- Vul 50-cel startplaten (25 cm breed x 50 cm lang) met potmedium aangepast met complete NPK-meststof met 1,38 g/kg N, 1,38 g/kg P en 1,38 g/kg K.
- Zaai zaden tot een diepte gelijk aan hun lengte en bedek met potmedium. Geef de flats water zonder stilstaand water te creëren. Houd daarna de media vochtig door het eenmaal per dag met de hand water te geven.
- In het tweede true-leaf stadium transplanteer je de zaailingen in potten met een diameter van 25 cm tot 30 cm, aangepast met een complete NPK-meststof op 3 eetlepels / pot. Bemest de planten eenmaal per week met 500 ml / pot vloeibare meststof met NPK 20:20:20 toegevoegd aan een concentratie van 1 g per gallon water.
- Onderhoud planten in de kas bij temperaturen tussen 22-28 °C onder natuurlijk lichtregime. Zorg voor vining genotypen voor een ondersteunend traliewerk in de kas (figuur 1).
- Bestuivingen uitvoeren
- Meestal begint de bloei in squash na 6 tot 8 weken na het zaaien, afhankelijk van de cultivar (figuur 2A, B). Begin met het maken van gecontroleerde hybridisatie (kruisingen) zodra de planten beginnen te bloeien. Onder broeikasomstandigheden kan bestuiving het hele jaar door worden gedaan.
- Identificeer mannelijke en vrouwelijke bloemen van C. pepo en C. moschata cultivars die de volgende dag klaar zullen zijn voor bestuiving. Om dergelijke bloemen te identificeren, controleert u op bloemen waarvan de bloemblaadjes een gele tint hebben maar niet open zijn. Plak de bloemen voorzichtig aan de bovenkant dicht met afplaktape om onbedoelde bestuiving van insecten te voorkomen (figuur 2C,D).
- De ochtend van de volgende dag zijn de bloemen klaar om te bestuiven. Voer bestuiving uit vóór 10:00 uur om de snelheid van hybridisatiesucces te verbeteren27.
- Open de vrouwelijke en mannelijke bloemen door voorzichtig het getapete bovenste gedeelte van de bloemblaadjes te verwijderen. Verwijder de bloemblaadjes van de mannelijke bloem en breng het stuifmeel over door de helmknop zachtjes op het stigma van de vrouwelijke bloem te wrijven (figuur 3A).
- Sluit na bestuiving onmiddellijk de bestoven vrouwelijke bloem met afplaktape. Gebruik een tag om de datum van bestuiving vast te leggen en om de vaderlijke en moederlijke ouders aan te geven die in het kruis zijn gebruikt (figuur 3B).
- Een succesvolle kruising wordt aangegeven door een uitgezette eierstok die binnen 1 week snel een kleine vrucht vormt (figuur 4A). De plant is dan 45-55 dagen na bestuiving klaar voor de oogst28 (figuur 4B).
2. Embryoreddingstechniek
- Media voorbereiding
- Bereid antibioticavoorraden voor: Voor cefotaxime (natriumzout), los het antibioticum op in 4 ml gedeïoniseerd of gedestilleerd water, filter door een steriel spuitfilter van 0,22 μm en maak 0,5 ml aliquots. Bewaren bij -20 °C. De resulterende stamoplossing heeft een concentratie van 250 mg/ml.
- Voor ampicilline (natriumzout), los het poeder op in 10 ml water, filter door een steriel spuitfilter van 0,22 μm en aliquot in 1 ml bouillon met een eindconcentratie van 100 mg / ml. Bewaren bij -20 °C.
- Maak Murashige en Skoog (MS) medium door 2,45 g medium (4,91 g/l concentratie) op te lossen in 500 ml gedestilleerd water in een fles van 1 l. Voeg gedurende 20 min 1,5 g gellanggom en autoclaaf toe bij 121 °C. De gellangom lost volledig op tijdens het autoclaveren.
- Koel na het autoclaveren het medium af door de fles in een waterbad op 50 °C te plaatsen. Haal de antibioticavoorraden uit de vriezer en ontdooi ze in de laminaire flowkast.
- Breng de medium fles over naar de laminaire stromingskap. Voeg 0,6 ml cefotaxime stockoplossing (250 mg / ml) en 0,25 ml ampicillinebouillon (100 mg / ml) toe aan de middelgrote fles en meng goed. Giet ongeveer 7 ml van het medium in een steriele petrischaal (60 mm x 15 mm).
- Laat het medium ongeveer 15-20 min stollen in de petrischaaltjes. Sluit de petrischalen met seal wrap en plaats ze in een opbergdoos. Bewaren bij kamertemperatuur.
- Redding van embryo's
- Reinig en steriliseer de laminaire luchtstroomkast voordat u begint met 70% ethylalcohol.
- Oogst het pompoenfruit door het van de hoofdrank te breken/af te snijden en desinfecteer het fruitoppervlak door het te wassen met vloeibaar wasmiddel (bijv. 0,3% chloroxylenol) in de gootsteen van het laboratorium totdat al het losse vuil is verwijderd (figuur 5A).
- Afspoelen met voldoende kraanwater. Droog het fruit af met schone papieren handdoekjes. Verplaats de vrucht naar de laminaire-luchtstroomkast (figuur 5B).
- Steriliseer het fruit door 70% ethanol op het fruit te spuiten in de steriele laminaire luchtstroomkast. Snijd de vrucht met een steriel mes (figuur 5C) en extraheer de zaden.
- Gebruik een steriele tang om de zaadlaag aseptisch te openen en de onrijpe embryo's bloot te leggen (figuur 6). Plaats de onrijpe embryo's voorzichtig in een petrischaal met MS-medium aangevuld met cefotaxime en ampicilline (figuur 7A). Sluit de petrischaal en sluit af met wikkelfolie.
OPMERKING: Afhankelijk van de grootte van het embryo is het mogelijk om vijf of zes embryo's in een petrischaaltje te plaatsen. - Plaats de verzegelde petrischalen met embryo's in een groeikamer onder 16 uur fotoperiode bij 25 °C en 70% relatieve vochtigheid. Als er besmetting optreedt, subcultureer dan onmiddellijk de niet-verontreinigde embryo's in een nieuwe plaat met hetzelfde medium.
- De zaadlobben beginnen na 4 dagen uit te zetten en worden binnen 10 dagen groen (figuur 7B). Voer op dit punt, indien nodig, subculturatie uit in nieuwe platen die hetzelfde medium bevatten om weefselexpansie mogelijk te maken. De wortels beginnen te verschijnen na 14 dagen (figuur 7C) en na 21 dagen hebben de planten verlengde wortels en zaadlobben (figuur 7D).
OPMERKING: Het kweekmedium dat in het protocol wordt gebruikt, is geschikt voor differentiatie in scheuten en wortels zonder aanvullende groeiregulatoren. - Verwijder in dit stadium de planten uit de petrischalen en was de media voorzichtig van de wortels af met kraanwater (figuur 8). Plaats de planten in een plastic bakje (14 cm x 9 cm x 4 cm) en bedek de wortels met natte papieren handdoekjes (figuur 9A). Bedek de container en verwijder de papieren handdoeken indien nodig.
- Bewaar de containers op kamertemperatuur (25-28 °C) en met een fotoperiode van 16 uur. Deze stap zal de planten acclimatiseren. Na acclimatisatie gedurende 7-10 dagen in de container, zullen de zaailingen ongeveer 3-4 lang zijn. Tijdens deze periode moet u de papieren handdoeken indien nodig opnieuw instellen.
- Breng de zaailingen over in 50 celstartplaten (25 cm breedte x 50 cm lengte) aangepast met meststof zoals eerder beschreven en verplaats ze naar de kas (figuur 9B). Geef zaailingen niet te veel water om rotting te voorkomen; voeg indien nodig ongeveer 10-20 ml per cel toe.
- In het tweede tot derde true-leaf stadium transplanteer je de zaailingen in potten met een diameter van 30 cm gevuld met potmedium aangepast met kunstmest zoals eerder beschreven (figuur 10A). Trellis-ondersteuning bieden voor viningplanten en gecontroleerde hybridisatie uitvoeren wanneer de planten beginnen te bloeien, zoals eerder beschreven (figuur 10B).
- Houd de planten in de kas op temperaturen tussen 22-28 °C onder natuurlijk lichtregime. Evalueer de planten op fruit- en zaadkenmerken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Levensvatbaarheid van vruchtzetting en zaad
Een eerste test werd uitgevoerd om de levensvatbaarheid van fruit en zaad in verschillende kruiscombinaties te bepalen. In totaal werden 15 squashgenotypen gekozen, vier C. pepo en 11 C. moschata, (tabel 1). Van de 24 interspecifieke kruisingscombinaties die werden geprobeerd, werd een vruchtzetting verkregen voor 22 (tabel 2), wat neerkomt op een totaal >92% succes in de vruchtzetting. Er werden geen rijpe vruchten verkregen door kruising van O en M en E en J, terwijl het hoogste aantal vruchten (n = 6) werd verkregen door kruising van F en J (tabel 2). Het aantal bestoven bloemen voor verschillende kruiscombinaties varieerde van één tot 11 en het slagingspercentage van bestuiving varieerde van 0% tot 100%. Het aantal bloemen dat in verschillende kruiscombinaties werd bestoven varieerde afhankelijk van het aantal bloemensets en de synchronisatie van de bloei tussen mannelijke en vrouwelijke bloemen. Hoewel vruchten werden verkregen uit alle kruisingen behalve twee, bleek uit de evaluatie van de vruchten na het snijden ervan dat de meeste vruchten embryo's hadden geaborteerd zonder levensvatbare zaden. Vruchten van de meeste kruisingen zagen er normaal uit, maar waren verstoken van zaden of bestonden uit zaden met rudimentaire embryo's. Uit alle kruisingscombinaties werden in totaal 44 vruchten geproduceerd en slechts één vrucht, ontwikkeld door kruising van C en J, had slecht ontwikkelde embryo's die konden worden teruggevonden door de embryoreddingstechniek.
Embryoredding en verdere vooruitgang
De F1 interspecifieke hybride ontwikkeld door kruising van C en J had in totaal 44 zaden, maar slechts 10 daarvan hadden embryo's die konden worden gered voor generatieontwikkeling. De resterende zaden hadden geen embryo's. Alle 10 embryo's werden gekweekt in de embryoreddingsmedia en dagelijks gecontroleerd op hun groei en ontwikkeling. De grootte van de 10 onrijpe embryo's varieerde van 3,51 mm tot 8,26 mm. Het slagingspercentage van embryoredding was 80%. De F1 interspecifieke hybriden (bruglijnen) ontwikkeld door het kruisen van C. moschata en C. pepo (C en J) bevatten de genomen van beide soorten in een verhouding van 1:1 (elk 50%). Deze planten werden gebruikt als bruglijnen voor de introgressie van economisch belangrijke eigenschappen tussen de twee soorten. Het overschrijden van deze bruglijnen met C. moschata zou bijvoorbeeld resulteren in hybriden met respectievelijk 75% C. moschata en 25% C. pepo genetische achtergrond. De vruchten verkregen uit deze bruglijnen hadden een mengsel van niet-levensvatbare zaden en zaden met onrijpe embryo's die vervolgens weefselkweek nodig hadden voor regeneratie. Een van de vruchten had bijvoorbeeld in totaal 54 zaden, waaronder 14 zaden met onrijpe embryo's die werden gered met behulp van het hier beschreven protocol.
Figuur 1: Ondersteunend traliewerk voor verticaal groeiende pompoenplanten in de kas. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Illustratie van open en getapete bloemen. Open (A) mannelijke en (B) vrouwelijke pompoenbloem in de kas. (C) Een getapete mannelijke bloem van Cucurbita moschata vaderlijke ouder. (D) Een getapete vrouwelijke bloem van Cucurbita pepo maternale ouder. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Illustratie van bestuiving. (A) Breng het stuifmeel van de mannelijke bloem over door de helmknop zachtjes op het stigma van de vrouwelijke bloem te wrijven. (B) Plak na de bestuiving de vrouwelijke bloem af en gebruik een label om de datum van bestuiving en de vaderlijke en moederlijke ouders die in het kruis zijn gebruikt, te registreren. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Vruchtzetting. (A) Na bestuiving zal de eierstok snel uitzetten en binnen 1 week een kleine vrucht vormen. (B) De vrucht is 45 dagen na de bestuiving klaar voor de oogst. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Fruitbereiding. (A) Was het fruit met wasmiddel. Oogst en desinfecteer het oppervlak van het fruit door het te wassen met vloeibaar wasmiddel in de gootsteen van het laboratorium. (B) Spoel en droog het fruit. Droog het fruit met schone papieren handdoeken, na het spoelen met voldoende kraanwater, en verplaats het naar de laminaire-luchtstroomkast. (C) Snijd de vrucht open met een steriel mes. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6: Haal embryo uit de zaden. Gebruik een steriele tang om de zaadlaag aseptisch te openen en het onrijpe embryo bloot te leggen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 7: Embryoregeneratie in de MS-media. (A) Plaats onrijpe embryo's voorzichtig in een petrischaal met MS-medium. (B) De zaadlobben zullen binnen 10 dagen uitzetten en groen worden. (C) De wortels beginnen na 14 dagen te verschijnen. (D) Na 21 dagen hebben de planten verlengde wortels en zaadlobben die klaar zijn om te worden overgebracht in een plastic container voor acclimatisatie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 8: Was de wortels. Haal de plantjes uit de petrischaaltjes en was de media voorzichtig van de wortels af met kraanwater. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 9: Acclimatiseer de planten. (A) Plaats de planten in een plastic bak en bedek de wortels gedurende 5 dagen met een natte papieren handdoek om ze te acclimatiseren. (B) Breng de planten over in celtrays met commerciële potgronden die zijn aangepast met volledige NPK-meststof. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 10: Transplanteer de zaailingen in potten. (A) In het tweede tot derde true-leaf stadium transplanteer je de zaailingen in potten met een diameter van 30 cm gevuld met potmedium dat is aangepast met kunstmest. (B) Zorg voor trellis-ondersteuning voor vining-planten en maak gecontroleerde hybridisatie wanneer de planten beginnen te bloeien. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Lab-code | Soort | Bron |
| Een | C. Moschata | Lokale boerenmarkt |
| B | C. Moschata | Lokale boerenmarkt |
| C | C. Moschata | Lokale boerenmarkt |
| D | C. Moschata | Lokale boerenmarkt |
| E | C. Moschata | Lokale boerenmarkt |
| F | C. Moschata | Lokale boerenmarkt |
| G | C. Moschata | Foklijn van de Universiteit van Florida |
| H | C. Moschata | Foklijn van de Universiteit van Florida |
| Ik | C. Pepo | NCRPIS (North Central Regional Plant Intruduction Station) |
| J | C. Pepo | NCRPIS (North Central Regional Plant Intruduction Station) |
| M | C. Pepo | NCRPIS (North Central Regional Plant Intruduction Station) |
| O | C. Moschata | Foklijn van de Universiteit van Florida |
| Q | C. Moschata | Foklijn van de Universiteit van Florida |
| W | C. Pepo | Foklijn van de Universiteit van Florida |
| Y | C. Moschata | Burpee Zaden Co |
Tabel 1: Een totaal van 15 genotypen van squash, vier C. pepo en 11 C. moschata, werden gebruikt in de studie voor interspecifieke kruisingen.
| Kruis (Vrouw x Man) | N. van bestoven bloemen | N. van vruchten | Vruchtzetting (%) | N. van geaborteerde zaden | N. van onrijpe embryo's | N. van geredde embryo's | ||
| A (C. moschata) x I (C. pepo) | 5 | 4 | 80 | 0 | 0 | 0 | ||
| H (C. moschata) x I (C. pepo) | 2 | 2 | 100 | 0 | 0 | 0 | ||
| B (C. moschata) x J (C. pepo) | 2 | 1 | 50 | 0 | 0 | 0 | ||
| C (C. moschata) x J (C. pepo) | 3 | 1 | 33.3 | 44 | 10 | 8 | ||
| E (C. moschata) x J (C. pepo) | 6 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | ||
| F (C. moschata) x J (C. pepo) | 11 | 6 | 54.5 | 0 | 0 | 0 | ||
| G (C. moschata) x J (C. pepo) | 2 | 2 | 100 | 0 | 0 | 0 | ||
| J (C. pepo) x H (C. moschata) | 7 | 2 | 28.6 | 0 | 0 | 0 | ||
| J (C. pepo) x O (C.moschata) | 6 | 1 | 16.7 | 0 | 0 | 0 | ||
| O (C. moschata) x J (C. pepo) | 6 | 1 | 16.7 | 0 | 0 | 0 | ||
| Q (C. moschata) x J (C. pepo) | 1 | 1 | 100 | 0 | 0 | 0 | ||
| C (C. moschata) x M (C. pepo) | 4 | 3 | 75 | 0 | 0 | 0 | ||
| D (C. moschata) x M (C. pepo) | 1 | 1 | 100 | 0 | 0 | 0 | ||
| F (C. moschata) x M (C. pepo) | 9 | 5 | 55.6 | 0 | 0 | 0 | ||
| G (C. moschata) x M (C. pepo) | 1 | 1 | 100 | 0 | 0 | 0 | ||
| O (C. moschata) x M (C. pepo) | 22 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | ||
| Q (C. moschata) x M (C. pepo) | 2 | 1 | 50 | 0 | 0 | 0 | ||
| F (C. moschata) x W (C. pepo) | 1 | 1 | 100 | 0 | 0 | 0 | ||
| G (C. moschata) x B (C. pepo) | 1 | 1 | 100 | 0 | 0 | 0 | ||
| H (C. moschata) x B (C. pepo) | 2 | 1 | 50 | 0 | 0 | 0 | ||
| O (C. moschata) x W (C. pepo) | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | ||
| Y (C. moschata) x W (C. pepo) | 3 | 2 | 66.7 | 0 | 0 | 0 | ||
| M (C. pepo) x H (C.moschata) | 3 | 2 | 66.7 | 0 | 0 | 0 | ||
| M (C. pepo) x O (C.moschata) | 4 | 4 | 100 | 0 | 0 | 0 | ||
| Totaal | 44 | 10 | 8 | |||||
Tabel 2: Kruiscombinaties geprobeerd met de 15 genotypen van squash en de bijbehorende vruchtzetting, aantal geaborteerde zaden, onrijpe embryo's en succesvolle embryoredding.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Er zijn twee belangrijke knelpunten voor succesvolle interspecifieke hybridisatie tussen C. moschata en C. pepo: kruiscompatibiliteitsbarrière, die wordt bepaald door genotyperesponsiviteit om hybride embryo's te produceren, en post-bevruchtingsbarrières, die de ontwikkeling van hybride embryo's naar normale zaden belemmeren. Zoals eerder gemeld voor squash, onthulde de kruiscompatibiliteitstest in de huidige studie dat het grootste deel van de vrucht zich parthenocarpisch ontwikkelde, waarbij de meeste zaden niet levensvatbaar waren16. Ouderlijk genotype heeft een aanzienlijke invloed op de compatibiliteit van interspecifieke hybridisatie tussen C. moschata en C. pepo. Van de 24 kruiscombinaties die in de huidige studie werden getest, leverde slechts één (C en J) onrijpe embryo's op voor embryoredding. Als zodanig werd de studie beperkt door het gebrek aan biologische replicaties voor het testen van de efficiëntie van het ontwikkelde protocol. Er werd echter een regeneratie-efficiëntie van 80% verkregen voor de 10 onrijpe embryo's die uit het C- en J-kruis werden gered. Eerdere studies hebben een lager regeneratiesucces gemeld van embryoredding voor C. pepo- en C. moschata-kruisingen, wat de effectiviteit van het nieuwe protocol14,15 aantoont. Zo meldden De Oliveira et al. dat van de 26 embryo's verkregen uit een kruising tussen C. pepo cv. Asmara en C. moschata cv. Piramoita, er werden geen regeneranten verkregen. De auteurs rapporteerden echter een regeneratiesucces van 16% wanneer een andere combinatie van genotypen (C. pepo cv. Asmara en C. moschata cv. Duda) werd gebruikt14. In een andere studie van interspecifieke hybridisatie tussen verschillende Cucurbita-soorten rapporteerden Rakha et al. een regeneratie-efficiëntie van 40% en 15% van de onrijpe embryo's verkregen door het kruisen van C. ficifolia x C. pepo en C. martinezii x C. pepo, respectievelijk15. De huidige studie maakte gebruik van een MS-medium zonder aanvullende groeiregulatoren in vergelijking met eerder vastgestelde protocollen die complexe media gebruikten voor embryoredding 15,29,30. Bovendien was de toevoeging van de antibiotica cefotaxime en ampicilline voldoende om microbiële besmetting te voorkomen. Het medium biedt dus voordelen omdat het goedkoper is, gemakkelijk te bereiden is zonder de noodzaak van hoogopgeleid personeel, en het kan worden overgenomen door kleinere fokprogramma's met beperkte middelen.
In de huidige studie werden vruchten 45-55 dagen na bestuiving (DPP) geoogst om de rijping en regeneratie van het embryo te maximaliseren. De DPP die voor de huidige studie werd geselecteerd, was gebaseerd op een eerder rapport waaruit bleek dat optimale accumulatie van energiereserves (meestal lipiden en eiwitten) voor embryo's optrad bij 60 DPP31,32. In muskmeloen rapporteerden Nunez-Palenius et al. een positieve correlatie tussen het succes van embryoredding en de DPP30.
In de huidige studie leverde de tweede generatie vruchten die werd ontwikkeld door interspecifieke F1-hybriden met C. moschata te kruisen, geen normale zaden op. Deze observatie geeft aan dat het moeilijk is om de vruchtbaarheidsbarrière tussen C. moschata en C. pepo in één generatie te overwinnen, zoals eerder gemeld16. De goedkeuring van het huidige protocol zal echter helpen bij de succesvolle ontwikkeling van Cucurbita interspecifieke hybriden in fokprogramma's. Verdere studies zijn nodig om de kruiscompatibiliteit van een breder scala aan genotypen te bepalen om de toegankelijkheid van kiemplasma voor fokkers te verbreden
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren geen belangenconflicten.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door het USDA National Institute of Food and Agriculture, NRS Project No. FLA-TRC-006176 en het University of Florida Institute of Food and Agricultural Sciences.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ampicillin | Fisher Scientific | BP1760-5 | |
| autoclave | Steris | AMSCO LAB 250 | |
| balance | |||
| cefotaxime | Sigma Alfrich | C 7039 | |
| centrifuge tubes (1.5 ml) | Sigma Alfrich | T9661 | |
| detergent | |||
| ethanol, 95% | Decon Labs | 2805HC | |
| forceps | VWR | 82027-408 | |
| gellan gum | Caisson Laboratories | G024 | |
| growth chamber or illuminated shelf | |||
| laminar hood / biosafety cabinet | The Baker Company, Inc | Edgegard | |
| masking tape | Uline | S-11735 | |
| media bottle | |||
| Murashige & Skoog Medium | Research Products International | M10200 | |
| NPK fertilizer (20-20-20) | BWI Companies, Inc | PR200 | |
| Osmocote Plus fertilizer | BWI Companie,s Inc | OS90590 | |
| Parafilm M | Sigma Alfrich | P7793 | |
| Petri dish (60 x 15 mm) | USA Scientific, Inc | 8609-0160 | |
| plant pots | BWI Companies, Inc | NP4000BXL | |
| plastic food containers, reused | Oscar Mayer | 4470003330 | |
| plastic hang tags | Amazon | B07QTZRY6T | |
| potting mix | Jolly Gardener | Pro-Line C/B | |
| seedling starter trays | BWI Companies Inc | GPPF128S4 | |
| syringe filter (0.22 um ) | ExtraGene | B25CA022-S | |
| trellis support | The Home Depot | 2A060006 | |
| water bath |
References
- Paris, H. S. Genetic Resources of Pumpkins and Squash, Cucurbita spp. Genetics and Genomics of Cucurbitaceae. Plant Genetics and Genomics: Crops and Models. Grumet, R., Katzir, N., Garcia-Mas, J. 20, (2016).
- Gong, L., Stift, G., Kofler, R., Pachner, M., Lelley, T. Microsatellites for the genus Cucurbita and an SSR-based genetic linkage map of Cucurbita pepo L. Theoretical and Applied Genetics. 117 (1), 37-48 (2008).
- Paris, H. S., et al. Assessment of genetic relationships in Cucurbita pepo (Cucurbitaceae) using DNA markers. Theoretical and Applied Genetics. 106 (6), 971-978 (2003).
- Robinson, R. W., Decker-Walters, D. S. Cucurbits. , CAB International. Wallingford, Oxon, UK. (1997).
- Teppner, H. Cucurbita pepo (Cucurbitaceae)-history, seed coat types, thin coated seeds and their genetics. Phyton (Horn). 40 (1), 1-42 (2000).
- Hazra, P., Mandal, A. K., Dutta, A. K., Ram, H. H. Breeding pumpkin (Cucurbita moschata Duch. Ex Poir.) for fruit yield and other characters. International Journal of Plant Breeding. 1 (1), 51-64 (2007).
- Paris, H. S.
- Baggett, J. R. Attempts to cross Cucurbita moschata (Duch.) Poir. 'Butternut and C. pepo L. 'Delicata'. The Cucurbit Genetics Cooperative. 2, 32-34 (1979).
- Erwin, A. T., Haber, E. S. Species and Varietal Crosses in Cucurbits. Agricultural Experiment Station, Iowa State College of Agriculture and Mechanical Arts. , (1929).
- Whitaker, T. W., Bohn, G. W. The taxonomy, genetics, production and uses of the cultivated species of Cucurbita. Economic Botany. 4 (1), 52-81 (1950).
- Bemis, W. P., Nelson, J. M. Interspecific hybridization within the genus Cucurbita I, fruit set, seed and embryo development. Journal of the Arizona Academy of Science. 2 (3), 104-107 (1963).
- Washek, R. L., Munger, H. M. Hybridization of Cucurbita pepo with disease resistant Cucurbita species. The Cucurbit Genetics Cooperative. 6, 92 (1983).
- Davoodi, S., Olfati, J. A., Hamidoghli, Y., Sabouri, A. Standard heterosis in Cucurbita moschata and Cucurbita pepo interspecific hybrids. International Journal of Vegetable Science. 22 (4), 383-388 (2016).
- De Oliveira, A. C. B., Maluf, W. R., Pinto, J. E. B., Azevedo, S. M. Resistance to papaya ringspot virus in summer squash Cucurbita pepo L. introgressed from an interspecific C. pepo× C. moschata cross. Euphytica. 132 (2), 211-215 (2003).
- Rakha, M. T., Metwally, E. I., Moustafa, S. A., Etman, A. A., Dewir, Y. H. Production of Cucurbita interspecific hybrids through cross pollination and embryo rescue technique. World Applied Sciences Journal. 20 (10), 1366-1370 (2012).
- Zhang, Q. I., Yu, E., Medina, A. Development of advanced interspecific-bridge lines among Cucurbita pepo, C. maxima, and C. moschata. HortScience. 47 (4), 452-458 (2012).
- Brown, R. N., Bolanos-Herrera, A., Myers, J. R., Miller Jahn, M. Inheritance of resistance to four cucurbit viruses in Cucurbita moschata. Euphytica. 129 (3), 253-258 (2003).
- Pachner, M., Paris, H. S., Winkler, J., Lelley, T. Phenotypic and marker-assisted pyramiding of genes for resistance to zucchini yellow mosaic virus in oilseed pumpkin (Cucurbita pepo). Plant Breeding. 134 (1), 121-128 (2015).
- Hayase, H. Cucurbita-crosses. XV. Flower pollination at 4 am in the production of C. pepo x C. moschata F1 hybrids. Japanese Journal of Breeding. 13 (2), 76-82 (1963).
- Reed, S.
- Sharma, D. R., Kaur, R., Kumar, K.
- Wall, J. R. Interspecific hybrids of Cucurbita obtained by embryo culture. Proceedings of the American Society of Horticultural Science. 63, 427-430 (1954).
- Metwally, E. I., Haroun, S. A., El-Fadly, G. A. Interspecific cross between Cucurbita pepo L. and Cucurbita martinezii through in vitro embryo culture. Euphytica. 90 (1), 1-7 (1996).
- Sisko, M., Ivancic, A., Bohanec, B. Genome size analysis in the genus Cucurbita and its use for determination of interspecific hybrids obtained using the embryo-rescue technique. Plant Science. 165 (3), 663-669 (2003).
- Giancaspro, A., et al. Optimization of an in vitro embryo rescue protocol for breeding seedless table grapes (Vitis vinifera L.) in Italy. Horticulturae. 8 (2), 121 (2022).
- Warchol, M., et al. The effect of genotype, media composition, pH and sugar concentrations on oat (Avena sativa L.) doubled haploid production through oat x maize crosses. Acta Physiologiae Plantarum. 40 (5), 1-10 (2018).
- Nepi, M., Pacini, E. Pollination, pollen viability and pistil receptivity in Cucurbita pepo. Annals of Botany. 72 (6), 527-536 (1993).
- Harvey, W. J., Grant, D. G., Lammerink, J. P. Physical and sensory changes during development and storage of buttercup squash. New Zealand Journal of Crop and Horticultural Science. 25 (4), 341-351 (1997).
- Moon, P., Meru, G. Embryo rescue of aged Cucurbita pepo seeds using squash rescue medium. Journal of Horticultural Science and Research. 2 (1), 62-69 (2018).
- Nuñez-Palenius, H. G., Ramírez-Malagón, R., Ochoa-Alejo, N. Muskmelon embryo rescue techniques using in vitro embryo culture. Plant Embryo Culture. , Humana Press. 107-115 (2011).
- Vining, K. J., Loy, J. B. Seed development and seed fill in hull-less seeded cultigens of pumpkin (Cucurbita pepo L). Cucurbitaceae 98: Evaluation and Enhancement of Cucurbit Germplasm. McCreight, J. M. , ASHS Press. Alexandria, VA. 64-69 (1998).
- Vining, K. J. Seed development in hull-less-seeded pumpkin (Cucurbita pepo L.). , University of New Hampshire. L.), Durham, NH. M.S. Thesis (1999).
