Visualisering af actin- og mikrotubulikoblingsdynamik in vitro ved total intern refleksionsfluorescens (TIRF) mikroskopi

Summary

Denne protokol er en vejledning til visualisering af dynamisk actin og mikrotubuli ved hjælp af et in vitro total intern fluorescens (TIRF) mikroskopiassay.

Abstract

Traditionelt er actin- og mikrotubululecytoskeletoner blevet undersøgt som separate enheder, begrænset til specifikke cellulære regioner eller processer og reguleret af forskellige suiter af bindende proteiner, der er unikke for hver polymer. Mange undersøgelser viser nu, at dynamikken i begge cytoskeletale polymerer er sammenflettet, og at denne krydstale er nødvendig for de fleste cellulære adfærd. En række proteiner involveret i actin-mikrotubulusinteraktioner er allerede blevet identificeret (dvs. Tau, MACF, GAS, formins og mere) og er godt karakteriseret med hensyn til enten actin eller mikrotubuli alene. Imidlertid viste relativt få undersøgelser assays af actin-mikrotubuluskoordinering med dynamiske versioner af begge polymerer. Dette kan okkludere nye forbindelsesmekanismer mellem actin og mikrotubuli. Her tillader en total intern refleksionsfluorescens (TIRF) mikroskopibaseret in vitro rekonstitutionsteknik visualisering af både actin- og mikrotubulusdynamik fra den ene biokemiske reaktion. Denne teknik bevarer polymerisationsdynamikken for enten actinfilament eller mikrotubuli individuelt eller i nærværelse af den anden polymer. Kommercielt tilgængeligt Tau-protein bruges til at demonstrere, hvordan actin-mikrotubuliadfærd ændrer sig i nærvær af et klassisk cytoskeletalt tværbindingsprotein. Denne metode kan give pålidelig funktionel og mekanistisk indsigt i, hvordan individuelle regulatoriske proteiner koordinerer actin-mikrotubulusdynamik ved en opløsning af enkeltfilamenter eller højere ordenskomplekser.

Introduction

Historisk set er actin og mikrotubuli blevet betragtet som separate enheder, hver med deres eget sæt regulatoriske proteiner, dynamikadfærd og forskellige cellulære placeringer. Rigelige beviser viser nu, at actin- og mikrotubulepolymerer engagerer sig i funktionelle krydstalemekanismer, der er afgørende for at udføre adskillige celleprocesser, herunder migration, mitotisk spindelpositionering, intracellulær transport og cellemorfologi 1,2,3,4. De forskellige koordinerede adfærd, der ligger til grund for disse eksempler, er afhængige af en indviklet balance mellem koblingsfaktorer, signaler og fysiske egenskaber. Imidlertid er de molekylære detaljer, der understøtter disse mekanismer, stadig stort set ukendte, fordi de fleste undersøgelser fokuserer på en enkelt cytoskeletal polymer ad gangen ^1,2,5.

Actin og mikrotubuli interagerer ikke direkte ^6,7,8. Den koordinerede dynamik af actin og mikrotubuli, der ses i celler, medieres af yderligere faktorer. Mange proteiner, der menes at regulere actin-mikrotubulus krydstale, er blevet identificeret, og deres aktiviteter er godt karakteriseret med hensyn til enten cytoskeletal polymer alene ^1,2. Voksende beviser tyder på, at denne enkeltpolymertilgang har skjult de dobbelte funktioner af nogle af proteinerne / komplekserne, der muliggør actin-mikrotubulkoblingshændelser 7,8,9,10,11,12,13. Eksperimenter, hvor begge polymerer er til stede, er sjældne og definerer ofte mekanismer med en enkelt dynamisk polymer og statisk stabiliseret version af de andre 6,8,9,10,11,14,15,16,17,18 . Der er således behov for metoder til at undersøge de nye egenskaber ved actin-mikrotubuluskoordinerende proteiner, der kun kan forstås fuldt ud i eksperimentelle systemer, der anvender begge dynamiske polymerer.

Kombinationen af direkte proteinmærkningsmetoder, genetisk kodede affinitetsmærker og TIRF-mikroskopi (total internal reflection fluorescence) er blevet anvendt med stor succes i biomimetiske rekonstitutionssystemer 19,20,21,22,23. Mange bottom-up-ordninger indeholder ikke alle de faktorer, der regulerer proteiner i celler. Imidlertid har “biokemi på et dækglas” -teknologi raffineret mange mekanismer for actin- og mikrotubulusdynamik i høje rumlige og tidsmæssige skalaer, herunder de komponenter, der kræves til polymersamling eller demontering, og motorproteinbevægelse 5,12,23,24,25,26,27 . Her beskrives en minimal komponent enkeltfilament tilgang til undersøgelse af actin-mikrotubuli kobling in vitro. Denne protokol kan bruges med kommercielt tilgængelige eller meget rene oprensede proteiner, fluorescerende mærkede proteiner, perfusionskamre og udvides til mere komplicerede ordninger indeholdende celleekstrakter eller syntetiske systemer. Her bruges kommercielt tilgængeligt Tau-protein til at demonstrere, hvordan cytoskeletal dynamik ændrer sig i nærvær af et actin-mikrotubulikoblingsprotein, men kan erstattes af andre formodede actin-mikrotubuluskoordinerende faktorer. Den største fordel ved dette system i forhold til andre tilgange er evnen til samtidig at overvåge dynamikken i flere cytoskeletale polymerer i en reaktion. Denne protokol giver også brugerne eksempler og enkle værktøjer til at kvantificere ændringer i cytoskeletale polymerer. Protokolbrugere vil således producere pålidelige, kvantitative, enkeltfilamentopløsningsdata til at beskrive mekanismer, der ligger til grund for, hvordan forskellige regulatoriske proteiner koordinerer actin-mikrotubulusdynamik.

Protocol

1. Vask af dækslips BEMÆRK: Vask (24 mm x 60 mm, #1.5) dækslips ifølge Smith et al., 201328. Arranger dækslips i en plastikglasbeholder. Nedsænkning dækkerlips sekventielt i følgende opløsninger og sonikeres i 30-60 minutter, skylles med ddH2O 10 gange mellem hver opløsning: ddH2O med en dråbe opvaskemiddel; 0,1 MIO. KOH. Opbevar dæksler i 100% ethanol i op til 6 måneder.BEMÆRK: Rør ikke ved glasoverflader med ulovne fingre. Brug pincet i stedet. 2. Belægning renset (24 mm x 60 mm, #1.5) dækslips med mPEG- og biotin-PEG-silan BEMÆRK: Denne protokol bruger specifikt et biotin-streptavidin-system til at placere actin og mikrotubuli i TIRF-billeddannelsesplanet. Andre belægninger og systemer kan anvendes (f.eks. antistoffer, poly-L-lysin, NEM myosin osv.). Optø aliquoter af PEG-silan og biotin-PEG-silanpulvere. PEG-pulvere opløses i 80 % ethanol (pH 2,0) for at generere stamopløsninger af 10 mg/ml mPEG-silan og 2-4 mg/ml biotin-PEG-silan lige før brug.BEMÆRK: PEG-pulvere forekommer ofte opløste, men er muligvis ikke på mikroskopisk niveau. Korrekt genoplivning tager ~1-2 min med konstant pipettering. Brugere opfordres til at pipettere yderligere 10 gange efter udseendet af pulveropløsning.FORSIGTIG: Brug handsker for at beskytte huden mod koncentreret HCI, når du fremstiller 80% ethanol (pH 2,0). Fjern den rene (24 mm x 60 mm, #1.5) dækslip fra ethanolopbevaring ved hjælp af tang. Tør med nitrogengas og opbevar i en ren petriskål. Overtrækslips med 100 μL belægningsopløsning: en blanding af 2 mg/ml mPEG-silan (MW 2.000) og 0,04 mg/ml biotin-PEG-silan (MW 3.400) i 80 % ethanol (pH 2,0).BEMÆRK: Til sparsom belægning (anbefales) anvendes 2 mg/ml mPEG-silan og 0,04 mg/ml biotin-PEG-silan. Til tæt belægning anvendes 2 mg/ml mPEG-silan, 4 mg/ml biotin-PEG-silan. Underruber dækslips ved 70 °C i mindst 18 timer eller indtil brug.BEMÆRK: Coatede dæksler nedbrydes, hvis de opbevares ved 70 °C i mere end 2 uger. 3. Samling af billeddannelsesflowkamre Skær 12 strimler dobbeltrygget dobbeltsidet tape til en længde på 24 mm. Fjern den ene side af båndunderlaget, og fastgør tapestykker ved siden af de seks riller, der findes på et rent billedbehandlingskammer.BEMÆRK: Tape skal være flad for korrekt montering, ellers lækker billedkamre. Fjern forsigtigt tapeunderlaget for at undgå stød. Glidende tapede kamre på en ren overflade for at glatte tape-kammerkontakter anbefales. Fjern det andet stykke tapeunderlag for at udsætte den klæbrige side af båndet langs hver kammerrille. Placer kammertape side opad på en ren overflade. Bland epoxyharpiks og hærderopløsninger 1: 1 (eller i henhold til producentens anvisninger) i en lille vejebåd. Brug en P1000-spids til at placere en dråbe blandet epoxy mellem båndstrimlerne i slutningen af hver billedkammerrille (rød pil; Figur 1A). Placer kammertape/epoxy side opad på en ren overflade. Fjern en belagt dækslip fra 70 °C inkubator. Overfladebehandlingsfladerne og de ubelagte overflader skylles med ddH2O seks gange, tørres med filtreret nitrogengas, og billedkammeret anbringes derefter på billeddannelseskammeret med dækslipbelægningssiden mod tapen. Brug en P200- eller P1000-pipettespids til at lægge pres på bånd-glas-grænsefladen for at sikre en god tætning mellem tapen og dækslen.BEMÆRK: Med en ordentlig tætning bliver dobbeltsidet tape gennemskinnelig. Billedkamre, der mangler tilstrækkelige båndkammerkontakter, lækker. Inkuber samlede kamre ved stuetemperatur i mindst 5-10 minutter for at lade epoxyen forsegle kammerbrønde fuldt ud inden brug. Perfusionskamre udløber inden for 12-18 timer efter montering.BEMÆRK: Afhængigt af tapeplacering og tykkelsen af det anvendte dobbeltsidede tape vil det samlede kammer have et endeligt volumen på 20-50 μL. 4. Konditionering af perfusionskamre Brug en perfusionspumpe (hastighed indstillet til 500 μL / min) til sekventielt at udveksle konditioneringsopløsninger i perfusionskammer som følger: Flow 50 μL 1% BSA for at prime billeddannelseskammeret. Fjern overskydende buffer fra Luer låsemonteringsbeholder. Flow 50 μL 0,005 mg / ml streptavidin. Inkuberes i 1-2 min ved stuetemperatur. Fjern overskydende buffer fra reservoiret. Flow 50 μL 1% BSA for at blokere uspecifik binding. Inkuberes i 10-30 s. Fjern overskydende buffer fra reservoiret. Flow 50 μL varm (37 °C) 1x TIRF buffer (1x BRB80, 50 mM KCl, 10 mM DTT, 40 mM glucose, 0,25% (v/v) methylcellulose (4.000 cp)).BEMÆRK: Fjern ikke overskydende buffer fra reservoiret. Dette forhindrer kammeret i at tørre ud, hvilket kan indføre luftbobler i systemet. Valgfrit: Flow 50 μL stabiliseret29 og 50% biotinylerede mikrotubulusfrø fortyndet i 1x TIRF-buffer.BEMÆRK: Den korrekte fortynding skal bestemmes empirisk og indeholde variation fra batch til batch. Protokoller fra27,29 anbefales som udgangspunkt. En fortynding, der giver 10-30 frø pr. synsfelt, fungerer godt med denne opsætning. 5. Mikroskop forberedelse BEMÆRK: Biokemiske reaktioner indeholdende dynamiske actinfilamenter og mikrotubuli visualiseres/udføres ved hjælp af et omvendt TIRF-mikroskop (Total Internal Reflection Fluorescence) udstyret med 120-150 mW faststoflasere, et temperaturkorrigeret 63x TIRF-mål for oliesænkning og et EMCCD-kamera. Proteiner i dette eksempel visualiseres ved følgende bølgelængder: 488 nm (mikrotubuli) og 647 nm (actin). Indstil fase-/målvarmeapparatet til at opretholde 35-37 °C mindst 30 minutter før billeddannelse af den første biokemiske reaktion. Indstil parametrene for billedoptagelse som følger: Indstil anskaffelsesintervallet til hver 5 s i 15-20 min. Indstil 488 og 647 lasereksponeringer til 50-100 ms ved 5%-10% effekt. Indstil passende TIRF-vinkel til mikroskop.BEMÆRK: Uanset mikroskopopsætning er den enkleste måde at indstille lasereffekt, eksponering og TIRF-vinkel på at foretage justeringer på billeder af begge polymerer alene (se 5.2.2.1 og 5.2.2.2 nedenfor). Brugere opfordres kraftigt til at bruge de laveste lasereffekt- og eksponeringsindstillinger, der stadig tillader detektion. Polymerisationsreaktionen (figur 1C) justeres for at starte actinfilamentsamling og optage billeder ved 647 nm. Foretag passende justeringer. Polymerisationsreaktionen justeres i en anden konditioneret perfusionsbrønd for at starte mikrotubulussamling (figur 1C) og visualisere ved 488 nm. Foretag passende justeringer. 6. Fremstilling af proteinreaktionsblandinger Der fremstilles stamopløsning af fluorescerende mærket tubulin. Bestem koncentrationen af hjemmelavet umærket tubulin via spektrofotometri ved Abs280 som følger: Tomt spektrofotometer med 1xBRB80 mangler GTP. Koncentrationen af tubulin beregnes ved hjælp af den bestemte uddøningskoefficient på 115.000 M-1 cm-1 og følgende formel: Resuspend kommercielt fremstillet lyofiliseret lysin-mærket 488-tubulin til 10 μM (1 mg / ml; 100% etiket) med 20 μL 1x BRB80 mangler GTP. Optø en 7,2 μL aliquot på 100 μM umærket genanvendt tubulin29 på is.BEMÆRK: Genanvendt tubulin er afgørende for vellykket mikrotubulussamling in vitro, fordi det fjerner polymerisationsinkompetente dimerer dannet i frosne proteinlagre29,30. Kombiner 3 μL 10 μM 488-tubulin med 7,2 μL aliquot på 100 μM umærket tubulin, højst 15 minutter før brug. Forbered stamopløsningen af fluorescerende mærket actin. For hjemmelavede proteiner bestemmes koncentrationen og procentetiketten for actin via spektrofotometri Abs290 og Abs650 som følger: Tomt spektrofotometer med G-buffer. Koncentrationen af umærket actin beregnes ved hjælp af den bestemte uddøningskoefficient på 25.974 M-1 cm-1 og følgende formel: Beregn koncentrationen af lysin mærket Alexa-647-actin ved hjælp af udryddelseskoefficienten for umærket actin, fluorkorrektionsfaktoren på 0,03 og følgende formel:[Alexa-647 actin], μM = (Abs290 – Beregn procentetiketten for Alexa-647-actin ved hjælp af den bestemte ε for Alexa-647 på 239.000 M-1 cm-1, som følger:% etiket af Alexa-647-actin = (Abs290 – ( Optø en 2 μL aliquot af 3 μM 100% mærket biotin-actin (mærket på lysinrester). Fortynd 10 gange ved tilsætning af 18 μL G-buffer. Kombiner 3 μL fortyndet biotinyleret actin, passende mængder umærket og mærket actin (ovenfor), således at den endelige blanding bliver 12,5 μM total actin med 10%-30% fluorescerende etiket.BEMÆRK: Større end 30% procent fluorescerende actinmonomerer (endelig) kan kompromittere billedopløsningen, da filamenter bliver vanskelige at skelne fra baggrunden. Forbered reaktionsblandinger (figur 1C). Cytoskeletblandingen (rør A) forberedes ved at kombinere 2 μL af 12,5 μM actinblandingsmaterialet (6.2.3) med tubulinbestandblandingen (6.1.4) højst 15 minutter før billeddannelse. Opbevares på is indtil brug. Forbered proteinreaktionsblanding (rør B) ved at kombinere alle andre eksperimentelle komponenter og proteiner, herunder: 2x TIRF-buffer, antiblegemiddel, nukleotider, buffere og tilbehørsproteiner. Et eksempel er vist i figur 1C.BEMÆRK: Den endelige fortynding resulterer i en 1x TIRF-buffer, der indeholder ATP, GTP og ionstyrke inden for det estimerede fysiologiske interval. Inkuber rør A og rør B separat ved 37 °C i 30-60 s. For at starte reaktionen blandes og tilsættes indholdet af rør B til rør A (nedenfor). 7. Billedaktin og mikrotubulusdynamik Tilstandsgennemfusionsbrønd (figur 1B; trin 4 ovenfor). Initier actin- og mikrotubulussamling samtidigt ved at tilsætte indholdet af rør B (reaktionsblanding) til rør A (cytoskeletblanding) (figur 1C). Flow 50 μL reaktion indeholdende 1x TIRF-buffer suppleret med 15 μM frit tubulin, 1 mM GTP og 0,5 μM actinmonomerer og passende volumener af bufferkontroller. Optag time-lapse-film ved hjælp af mikroskopsoftware til at erhverve hver 5 s i 15-20 minutter.BEMÆRK: Initiering af actin- og mikrotubulusdynamik sker inden for 2-5 minutter (figur 2). Længere forsinkelser indikerer problemer med temperaturkontrol eller koncentrationsrelaterede problemer med proteiner i reaktionsblandingen. Konditioner en ny perfusionsbrønd (trin 4), og erstat buffervolumen med regulatorisk protein (dvs. Tau) og bufferkontroller (figur 1C). Erhverv som beskrevet i trin 7 (ovenfor) for at vurdere regulatoriske proteiner til emergente actin-mikrotubulusfunktioner. 8. Behandl og analyser billeder ved hjælp af FIJI software31 Åbn gemte TIRF-film, og se dem som en sammensætning. Analyser mikrotubulusdynamik (figur 3A) som følger: Generer en tidsbaseret maksimal Z-projektion fra billedstakkemenuen. Synkroniser Z-projektionsvinduet med den originale TIRF-film fra menuen Analyser> værktøjer> Synkroniser Windows . Tegn en linje ved hjælp af det lineære værktøj langs en mikrotubulus af interesse på det projicerede billede. Åbn chefen for interesseområdet (ROI) i analysemenuen (Analysér> Værktøjer> ROI Manager). Gem individuelle mikrotubulusplaceringer ved at trykke på “t”. Gentag for alle mikrotubuli af interesse. Plot kymografer af udvalgte linjer ved hjælp af “/” eller kør multi-kymo-makroen, der genererer en video og kymograf for hver mikrotubulus i ROI manager31. Føj skalabjælker med både længde (μm) og tid (min) til kymografer i menuen Analyse> Værktøjer> Skaleringslinjer . Mål mikrotubulusvæksthastigheder fra kymografhældninger (figur 3A, 1-2; hældning af sorte linjer). Tæl dynamiske mikrotubulushændelser (katastrofe eller genvækst) fra den genererede kymograf eller ved hjælp af tilgængelige analysemakroer 5,8,18,25. Røde stiplede linjer i figur 3A, 1-2 repræsenterer katastrofe/hurtige demonteringshændelser. Analyser actindynamik (figur 3B) som følger: Mål actin nukleation som følger: Antallet af actinfilamenter, der er til stede i synsfeltet, tælles 100 s efter reaktionens initiering og udtrykkes med området (filamenter pr. μm2). Registrer og gem data i ROI manager, som i trin 8.2.3.1 ovenfor. Actinfilamentforlængelseshastigheder måles (figur 3B) som følger: Tegn en linje langs en actinfilament af interesse ved hjælp af det segmenterede linjeværktøj. Tilføj linje til ROI manager som i trin 8.2.3.1 ovenfor. Gentag ved at følge linjen (tilføj hver måling til ROI manager) i mindst fire filmbilleder.BEMÆRK: Måling af syv til otte på hinanden følgende rammer anbefales, men nogle forhold sænker actinpolymerisation under den detekterbare grænse, der kan løses ved objektive / mikroskopopsætninger. I et sådant tilfælde kan målinger foretages med jævne mellemrum over ikke-sammenhængende rammer (f.eks. hver femte ramme). Afbilde målte længdeværdier over forløbet tid. Hældningen af den genererede linje er actinforlængelseshastigheden i mikron / s. Overfør endelige beregnede satser som underenheder s-1 μM-1 ved hjælp af en korrektionsfaktor på 370 underenheder for at tage højde for antallet af actinmonomerer i en mikron filament32. Udfør korrelativ analyse for regioner med parallel actin-mikrotubulusforening (figur 3C) som følger: Tegn en linje langs en mikrotubuli af interesse på et bestemt tidspunkt (dvs. 300 s efter reaktionsinitiering) ved hjælp af lineærværktøjet. Tilføj linje til ROI manager som i trin 8.2.3.1 ovenfor. Plot fluorescensintensiteten langs linjen i hver kanal. Vælg hver kanal med billedskyderen, og plot intensiteterne langs linjen ved hjælp af “kommando k”. Gem eller eksporter værdier ved at klikke på knappen “liste” i outputvinduet. Ekspres actin-mikrotubuluskoblingshændelser som et forhold (actin overlappende med mikrotubuli) fra individuelle begivenheder eller som en optælling af begivenheder i et givet synsfelt på et konsistent tidspunkt (figur 3C). Alternativ: Brug software til at bestemme den procentvise overlapning af begge kanaler 5,12.

Representative Results

Med de ovenfor beskrevne betingelser (figur 1) skal actin- og mikrotubululepolymerer være synlige (og dynamiske) inden for 2 minutter efter billedoptagelse (figur 2). Som med enhver biokemibaseret protokol kan optimering være påkrævet for forskellige regulatoriske proteiner eller batcher af protein. Af disse grunde indstilles TIRF-vinklen og billedeksponeringerne først med reaktioner indeholdende hver enkelt polymer. Dette bekræfter, at lagrede proteiner er funktionelle, og der er nok mærket protein til stede til påvisning. Selvom det ikke altid er nødvendigt (og ikke udføres her), kan efterbehandling af film (dvs. baggrundsstraktion, gennemsnit eller Fourier-transformationer) bruges til at forbedre billedkontrasten (især af mikrotubuli)5,25,33. Den direkte visualisering af enkeltaktinfilamenter og mikrotubuli, der gives ved dette assay, understøtter kvantitativ bestemmelse af flere dynamiske mål for enten cytoskeletkomponent alene eller sammen, herunder polymerisationsparametre (dvs. kimdannelses- eller forlængelseshastighed), demonteringsparametre (dvs. krympningshastigheder eller katastrofehændelser) og polymerkuljustering / overlapning (figur 3 ). Endvidere kan disse målinger bruges som udgangspunkt for at dechiffrere bindingen eller indflydelsen af regulatoriske ligander som Tau (figur 3). Mange målinger af enkelt actinfilamenter eller mikrotubuli kan foretages fra en TIRF-film. På grund af variationer i dækslipbelægning, pipettering og andre faktorer bør pålidelige målinger imidlertid også omfatte flere tekniske replikationsreaktioner / film. Mange facetter af mikrotubulusdynamik kan bestemmes ud fra eksempler på kymografer, herunder hastigheden af mikrotubulusforlængelse samt hyppigheden af katastrofe- og redningshændelser (figur 3A). Brug af kymografer til at måle actindynamik i dette system er ikke så ligetil, fordi actinfilamenter er mere indviklede end mikrotubuli. Som følge heraf måles parametre for actinfilamentdynamik manuelt, hvilket er tidskrævende og arbejdskrævende. Kimtal måles som antallet af actinfilamenter, der er til stede på et konsistent tidspunkt for alle forhold. Disse tællinger varierer meget på tværs af TIRF-billeddannelsesfelter, men kan bruges med mange replikater eller til at supplere observationer fra andre polymerisationsassays. Kimdannelsestællinger kan også anvendes til mikrotubuli, hvis forsøgsbetingelserne mangler stabiliserede mikrotubulusfrø. Actin filament forlængelseshastigheder måles som længden af filament over tid fra mindst fire filmrammer. Hastighedsværdier overføres pr. mikromolær actin med en korrektionsfaktor på 370 underenheder for at tage højde for antallet af actinmonomerer i en mikron filament (figur 3B)32. Målinger til at definere den koordinerede adfærd mellem actin og mikrotubuli er mindre veldefinerede. Imidlertid er der anvendt korrelative analyser til at måle sammenfaldet af begge polymerer inklusive linjescanninger (figur 3C) eller overlapningssoftware 5,11,34. Data tilgængelighed:Alle datasæt, der er knyttet til dette arbejde, er blevet deponeret i Zenodo og er tilgængelige med rimelig anmodning på: 10.5281/zenodo.6368327. Figur 1. Eksperimentelle skemaer: flowkammersamling til billedoptagelse. (A) Samling af billedbehandlingskamre. Top til bund: IBIDI-billeddannelseskamre er tapet langs perfusionsbrønde (betegnet med pil); det andet (hvide) lag af tapeunderlag (venstre på billedet vist til bedre orienterende brugere) fjernes, og Epoxy påføres ved kanten af perfusionskammeret (pil). Bemærk: For lettere at orientere brugerne om, hvor epoxyen skal placeres, blev den hvide bagside efterladt på dette billede. Den rensede og belagte dækslip er fastgjort til billedkammeret med belægningssiden vendt mod indersiden af perfusionsbrønden. (B) Flowdiagram, der illustrerer trinene til konditionering af billeddannelseskamre til biotin-streptavidinforbindelser. (C) Eksempler på reaktioner, der anvendes til at erhverve TIRF-folier af dynamiske mikrotubuli og actinfilamenter. Klik her for at se en større version af denne figur. Figur 2. Billedsekvenser af voksende actinfilamenter og mikrotubuli i fravær eller tilstedeværelse af Tau. Time-lapse billedmontage fra TIRF-assays indeholdende 0,5 μM actin (10% Alexa-647-actin og 0,09% biotin-actin mærket) og 15 μM frit tubulin (4% HiLyte-488 mærket) i fravær (A) eller tilstedeværelse (B) af 250 nM Tau. Den tid, der er gået fra reaktionsinitiering (blanding af rør A og rør B), vises. Vægtstænger, 25 μm. Klik her for at se en større version af denne figur. Figur 3. Eksempelmålinger af mikrotubuli og actinfilamentdynamik. (A) Gennemsnitlig tidsprojektion af tubulinkanalen visualiserer effektivt de samlede mikrotubuluslængder for de linjescanninger, der bruges til at generere kymografdiagrammer. Sorte stiplede linjer svarer til de to eksempler på kymografer af dynamiske mikrotubuli vist til højre. Vækstfaserne (faste sorte linjer) og demonteringsfaser (stiplede lyserøde linjer; to betegnet med lyserøde pile) af mikrotubuli er vist på hver kymograf. Tidsskala bar, 3 min. Længde skala bar, 10 μm. Reaktionen indeholder 0,5 μM actin (10% 647-etiket) og 15 μM fri tubulin (4% 488-HiLyte-etiket). Kun tubulinkanalen vises. (B) To eksempler på time-lapse-billedmontager, der viser enkeltaktinfilamenter, der aktivt polymeriserer. Forlængelseshastigheder beregnes som hældningen af plots af længden af actinfilamenter over tid pr. Mikromolar actin. Således skal en korrektionsfaktor på to anvendes på 0,5 μM actinreaktioner til sammenligning for satser, der typisk bestemmes ved 1 μM actinkoncentrationen. Eksempler fra fem filamenter er vist til højre. Skalastænger, 10 μm. Reaktionen indeholder 0,5 μM actin (10% 647-etiket) og 15 μM fri tubulin (4% 488-HiLyte-etiket). Kun actinkanalen vises. (C) TIRF-billeder af dynamiske mikrotubuli (MT) (grøn) og actinfilamenter (lilla), der polymeriserer i fravær (venstre) eller tilstedeværelse af 250 nM Tau (i midten). Blå stiplede linjer og pile markerer, hvor der blev tegnet en linje for linjescanningsdiagrammerne svarende til hver betingelse (under hvert billede). Overlapning mellem mikrotubuli og actinområder (vist som sort) kan scores på et bestemt tidspunkt pr. Område (højre). Vægtstænger, 25 μm. Reaktioner indeholder 0,5 μM actin (10% 647-etiket) og 15 μM fri tubulin (4% 488-HiLyte-etiket) med eller uden 250 nM Tau. Klik her for at se en større version af denne figur.

Discussion

Anvendelsen af total intern refleksionsfluorescens (TIRF) mikroskopi til visualiserede rensede proteiner har været en frugtbar og overbevisende tilgang til at dissekere unikke mekanismer for cytoskeletal regulering 5,23,24,25,26,27,35. Sammenlignet med traditionelle biokemiske assays kræver TIRF-reaktioner meget små volumener (50-100 μL), og kvantitative målinger af cytoskeletal dynamik kan hentes fra et individuelt assay. De fleste undersøgelser af cytoskeletal dynamik fokuserer på et enkelt polymersystem (dvs. actinfilamenter eller mikrotubuli), således at detaljerede målinger af krydstale eller emergent adfærd mellem actinfilamenter og mikrotubuli, der typisk ses i celler, er forblevet undvigende og vanskelige at rekapitulere i reagensglasset. For at løse dette problem beskriver denne protokol et enkeltfilament TIRF-mikroskopisystem, der muliggør direkte visualisering af dynamiske actin- og mikrotubululpolymerer i samme biokemiske reaktion. Således går denne metode ud over traditionelle assays, der rekapitulerer den dynamiske opførsel af actinfilamenter eller mikrotubuli alene. Denne teknik blev også udført med Tau som et eksempel på, hvordan flere dynamiske egenskaber ændres i nærvær af en cytoskeletkoblingsfaktor. Denne protokol kan bruges med yderligere proteiner, der er kendt eller mistænkt for at koordinere actin- eller mikrotubulusdynamik, herunder (men ikke begrænset til) MACF, GAS, formins og mere. Endelig kan forudsatte eksempelanalyser bruges som vejledning til at kvantificere data erhvervet med denne protokol.

“At se er at tro” er en overbevisende grund til at udføre mikroskopibaserede assays. Der kræves dog forsigtighed ved udførelse og fortolkning af TIRF-mikroskopiforsøg. En stor udfordring ved cytoskeletale co-assembly assays er, at mange almindeligt anvendte billeddannelsesbetingelser ikke er kompatible med hver polymer. Mikrotubuli og actin har typisk forskellige buffer-, temperatur-, salt-, nukleotid- og koncentrationskrav til polymerisation. Actin, tubulin, regulatoriske proteiner af interesse og de buffere, der anvendes i denne protokol, er følsomme over for fryse-optøningscyklusser. Derfor er omhyggelig håndtering af proteiner og buffere nødvendig for at kunne udføre denne protokol med succes. For at afhjælpe mange af disse bekymringer anbefales det kraftigt at bruge frisk genanvendt tubulin (frosset i <6 uger) og forrensning af frosne/resuspenderede actiner via ultracentrifugering. Disse overvejelser gælder også for det utal af regulatoriske proteiner, der skal vurderes med denne procedure, og som kan være følsomme over for fryse-optøningscyklusser eller koncentrationen af buffersalte ^5,11,36.

Desværre findes der ingen one-size-fits-all buffer uden eksperimentelle afvejninger. For at opnå større volumen for proteiner med lavere koncentration kan ATP og GTP indgå i 2x TIRF-bufferopløsningen (figur 1C). Men fordi disse nukleotider er ekstremt følsomme over for fryse-optøningscyklusser, anbefales det ikke. De oxygenrensningsforbindelser, der anvendes her (dvs. katalase og glucoseoxidase), er nødvendige for at visualisere proteiner i lange perioder (minutter til timer), men er kendt for at begrænse mikrotubuluspolymerisation ved høje koncentrationer⁵. Relateret til disse bufferovervejelser er en begrænsning af denne protokol, at nogle kanoniske mikrotubulusassocierede regulatoriske proteiner kan kræve mere eller mindre salt for at rekapitulere funktioner, der findes i celler eller assays ved hjælp af mikrotubuli alene (uden actin). Ændring af arten eller koncentrationen af salt for at løse disse bekymringer vil sandsynligvis påvirke hastigheden af actinfilamentpolymerisation og / eller parametre for mikrotubulusdynamik. Målinger af flere beskrivende parametre (minimalt, kimdannelse, forlængelseshastigheder og stabilitet) (figur 3) er nødvendige for at bekræfte protokollens succes eller for eksplicit at dokumentere virkningerne af specifikke buffere eller regulatoriske proteiner. For eksempel kan for meget actinfilamentpolymerisation skjule actin-mikrotubuluskoblingshændelser inden for få sekunder. Derfor vil finjustering af eksperimentelle betingelser ved at sænke den samlede koncentration af actin eller inkludere yderligere proteiner for at undertrykke actinkernedannelse (dvs. profilin) forlænge den samlede periode, hvor koordinerede actin-mikrotubulule aktiviteter kan ses tydeligt. Kontrolelementer, der adresserer disse forudsætninger, og tekniske replikater (ud over flere synsfelter) er afgørende for, at brugerne kan generere pålidelige og reproducerbare resultater.

Cellebaserede undersøgelser giver begrænset mulighed for at observere direkte protein-protein-relationer eller virkningen af regulatoriske komplekser. I modsætning hertil afspejler nogle af de mekanismer, der er hentet fra in vitro-assays, ikke altid den nøjagtige opførsel af proteiner, der ses i celler. Dette klassiske biokemikerdilemma kan løses i fremtidige anvendelser af denne teknik med specifikke modifikationer. For eksempel udvider tilsætning af funktionelle fluorescerende mærkede koblingsproteiner denne metode fra enkeltfilamentundersøgelser til enkeltmolekyleundersøgelser. Assays kan ændres yderligere til at bruge celleekstrakter, der kan tilføje de “manglende” ukendte nøglefaktorer, der kræves for at rekapitulere cellelignende fænomener. For eksempel har TIRF-baserede assays, der anvender gær- eller Xenopus-ekstrakter, rekonstitueret kontraktile actomyosinringe³⁷, mitotiske spindler ^26,38, komponenter i actin- eller mikrotubulussamling^39,40 og jævn dynamik ved centrosom og kinetochores 36,41,42,43 . Desuden kan sådanne systemer bane vejen mod kunstige cellesystemer, der har lipider eller signalfaktorer til stede 44,45,46.

Materials

1% BSA (w/v)	Fisher Scientific	BP1600-100	For this purpose (blocking TIRF chambers), BSA is resuspended in ddH20 and filtered through a 0.22 µm filter.
1× BRB80	Homemade		80 mM PIPES, 1 mM MgCl2, 1 mM EGTA, pH 6.8 with KOH
10 mg/mL (1000 U) glucose oxidase	Sigma Aldrich Inc, St. Louis, MO	G2133-50KU	Combined with catalase, aliquot and store at -80 oC until use
100 µM tubulin	Cytoskeleton Inc, Denver, CO	T240	Homemade tubulins should be recycled before use to remove polymerization-incompetent tubulin (Hyman et al. (1992)29; Li and Moore (2020)30). Commercially available tubulins are often too dilute to recycle, but function well if resuspended according to manufacturer’s instructions and pre-cleared via ultracentrifugation (278,000 × g) for 60 min, before use.
100 mM ATP	Gold Biotechnology Inc, Olivette, MO	A-081	Resuspended in ddH20 (pH 7.5) and filter sterilized.
100 mM GTP	Fisher Scientific	AC226250010	Resuspended in 1× BRB80 (pH 6.8) and filter sterilized.
120-150 mW solid-state lasers	Leica Microsystems	11889151; 11889148
2 mg/mL catalase	Sigma Aldrich Inc, St. Louis, MO	C40-100	Combined with glucose oxidase, aliquot and store at -80 oC until use
2× TIRF buffer	Homemade		2× BRB80, 100 mM KCl, 20 mM DTT, 80 mM glucose, 0.5% (v/v) methylcellulose (4,000 cp); Note: 1 µL of 0.1M GTP and 1 µL of 0.1M ATP added separately to TIRF reactions to avoid repeated freeze-thaw cycles.
24 × 60 mm, #1.5 coverglass	Fisher Scientific, Waltham, MA	22-266882	Coverglass must be extensively washed before use (Smith et al. (2014)22)
37 oC heatblock
37 oC water bath
5 mg/mL Streptavidin (600x stock)	Avantor, Philadelphia, PA	RLS000-01	Resuspended in Tris-HCl (pH 8.8); dilute the aliquot to 1× in HEK buffer on day of use
5 min Epoxy resin and hardener	Loctite, Rocky Hill, CT	1365736	Combined resin and hardener may take up to 30 min to cure.
50% biotinylated-GpCpp microtubule seeds	Cytoskeleton Inc; Homemade	T333P	(optional) GppCpp or Taxol stabilized microtubule seeds can more efficiently mediate microtubule polymerization. Taxol and GppCpp stabilize microtubules in different ways that can affect the microtubule lattice structure and ability of certain regulatory proteins to bind to the stabilized portion of the microtubule. A method to make diverse kinds of microtubule seeds is outlined in Hyman et al. (1992).
70 oC incubator
Actin mix stock	Homemade; this protocol		A 12.5 µM actin mix comprised of labeled (fluorescent and biotinylated) and unlabeled actin for up to six reactions. 2 µL of stock is used in the final TIRF reaction. The final concentration of actin used in each reaction is 0.5 µM (10% Alexa-647; 0.09% biotin-labeled).
Appropriate buffer controls	Homemade		Combination of buffers from all proteins being assessed
Biotin-PEG-silane (MW 3,400)	Laysan Bio Inc	biotin-PEG-SIL-3400	Dispensed into 2-5 mg aliquots, backfilled with nitrogen, parafilmed closed, and stored at -20 oC with desiccant until use
Biotinylated actin	Cytoskeleton Inc; Homemade	AB07	Biotin-actin is made by labeling on lysine residues and thus assumed to be at least 100% labeled, but varies with different lots/preparations.  Optimal biotinylated actin concentrations must be empirically determined for particular uses/experimental designs. Higher concentrations permit more efficient tracking, but may impede polymerization or interactions with regulatory proteins. Here a small percentage (0.09% or 900 pM) biotinylated actin is present in the final TIRF reaction.
Dishsoap	Dawn, Procter and Gamble, Cincinnati, OH		For unknown reasons, the blue version cleans coverslips more efficiently than other available colors.
Dry ice
FIJI Software	www.https://imagej.net/software/fiji/downloads		Schneider et al. (2012)31.
Fluorescently labeled actin	Cytoskeleton Inc; Homemade	AR05	Homemade fluorescently labeled actin is stored in G-buffer supplemented with 50% glycerol at -20 oC (Spudich et al. (1971)47; Liu et al. (2022)48). Fluorescently labeled actin is dialyzed against G-buffer and precleared via ultracentrifugation for 60 min at 278,000 × g before use.
Fluorescently labeled tubulin	Cytoskeleton Inc	TL488M, TLA590M, TL670M	Resuspended in 20 µL 1× BRB80 (10 µM final concentration) and pre-cleared via ultracentrifugation (278,000 × g) for 60 min, before use.
G-buffer	Homemade		3 mM Tris-HCl (pH 8.0), 0.2 mM CaCl2, 0.5 mM DTT, 0.2 mM ATP
HEK Buffer	Homemade		20 mM HEPES (pH 7.5), 1 mM EDTA (pH 8.0), 50 mM KCl
Ice
Ice bucket
Imaging chambers	IBIDI, Fitchburg, WI	80666	Order chambers with no bottom to utilize different coverslip coatings
iXon Life 897 EMCCD camera	Andor, Belfast, Northern Ireland	8114137
LASX Premium microscope software	Leica Microsystems	11640611
Methylcellulose (4,000 cp)	Sigma Aldrich Inc	M0512
Microscope base equipped with TIRF module	Leica Microsystems, Wetzlar, Germany	11889146
mPEG-silane (MW 2,000)	Laysan Bio Inc, Arab, AL	mPEG-SIL-2000	Dispensed into 10-15 mg aliquots, backfilled with nitrogen, parafilmed closed, and stored at -20 oC with desiccant until use
Objective heater and heated stage insert	OKO labs, Pozzioli, Italy	8113569	Set temperature controls to 35-37 oC. Use manufacturer suggestions for accurate calibration.
Perfusion pump	Harvard Apparatus, Holliston, MA	704504	A syringe and tubing can be substituted.
Petri Dish, 100 x 15 mm	Genesee Scientific, San Diego, CA	32-107
Plastic slide mailer container	Fisher Scientific	HS15986
SA-S-1L-SecureSeal 0.12 mm thick	Grace Biolabs, Bend, OR	620001	Double-sided tape of precise manufactured dimensions is strongly recommended.
Small styrofoam container	Abcam, Cambridge, UK		Reused from shipping
Small weigh boat	Fisher Scientific	02-202-100
Spectrophotometer
Tau	Cytoskeleton Inc	TA01	Three isoforms of Tau are present in the commercially available preparation of Tau. The concentration in this protocol was determined from the highest molecular weight band (14.3 µM, when resuspended per manufacturer’s recommendations with 50 µL of ddH20).
Temperature corrected 63× Plan Apo 1.47 N.A. oil immersion TIRF objective	Leica Microsystems	11506319
Tubulin stock	Homemade; this protocol		A tubulin stock consisting of 7.2 µL recycled 100 µM unlabeled tubulin and 3 µL of 10 µM resuspended commercially available fluorescently labeled tubulin. One tubulin stock is used per reaction and thawed/stored on ice. The final concentration of free tubulin in each reaction is 15 µM (4% labeled). More than 15 µM tubulin will result in hyperstabilized (not dynamic) microtubules, whereas concentrations below 7.5 µM free tubulin do not polymerize well. Careful determination of protein concentration and handling is required.
Unlabeled actin (dark)	Cytoskeleton Inc; Homemade	AKL99	Actin nucleates are almost always present in commercially available (lyophilized) or frozen actins and contribute to variability in quantitative measurements (Spudich et al. (1971)47; Liu et al. (2022)48). Rabbit muscle actin is stored in G-buffer at -80 oC and precleared via ultracentrifugation for 60 min at 278,000 × g before use. Several actin stock solutions are made throughout the day (making no more than enough for six reactions at a time is strongly recommended).