Summary
该方案是使用 体外 全内部荧光（TIRF）显微镜测定可视化动态肌动蛋白和微管的指南。
Abstract
传统上，肌动蛋白和微管细胞骨架已被研究为独立的实体，仅限于特定的细胞区域或过程，并由每种聚合物独特的不同结合蛋白套件调节。现在许多研究表明，两种细胞骨架聚合物的动力学是相互交织在一起的，并且这种串扰是大多数细胞行为所必需的。已经鉴定出许多参与肌动蛋白 - 微管相互作用的蛋白质（即Tau，MACF，GAS，formins等），并且仅就肌动蛋白或微管具有良好的表征。然而，相对较少的研究表明，肌动蛋白- 微管与两种聚合物的动态版本的配位测定。这可能会阻塞肌动蛋白和微管之间的紧急连接机制。在这里，基于全内反射荧光（TIRF）显微镜 的体外 重构技术允许从一种生化反应中可视化肌动蛋白和微管动力学。该技术单独或在另一种聚合物存在下保留了肌动蛋白丝或微管的聚合动力学。市售的Tau蛋白用于证明在经典细胞骨架交联蛋白存在下肌动蛋白 - 微管行为如何变化。这种方法可以为单个调节蛋白如何在单丝或高阶复合物的分辨率下协调肌动蛋白 - 微管动力学提供可靠的功能和机制见解。
Introduction
从历史上看，肌动蛋白和微管被视为独立的实体，每个实体都有自己的一组调节蛋白，动力学行为和不同的细胞位置。现在有大量证据表明，肌动蛋白和微管聚合物具有功能性串扰机制，这些机制对于执行许多细胞过程至关重要，包括迁移，有丝分裂纺锤体定位，细胞内运输和细胞形态学1，2，3，4。这些例子背后的各种协调行为依赖于耦合因子、信号和物理属性的复杂平衡。然而，支持这些机制的分子细节在很大程度上仍然是未知的，因为大多数研究都集中在一次1，2，5的单个细胞骨架聚合物上。
肌动蛋白和微管不直接相互作用6，7，8。在细胞中看到的肌动蛋白和微管的协调动力学是由其他因素介导的。已经鉴定出许多被认为调节肌动蛋白 - 微管串扰的蛋白质，并且它们的活性在单独的细胞骨架聚合物方面都有很好的表征1，2。越来越多的证据表明，这种单一聚合物方法掩盖了一些蛋白质/复合物的双重功能，这些蛋白质/复合物使肌动蛋白 - 微管偶联事件7，8，9，10，11，12，13。两种聚合物都存在的实验是罕见的，并且通常使用单个动态聚合物和另一种6，8，9，10，11，14，15，16，17，18的静态稳定版本来定义机理.因此，需要一些方法来研究肌动蛋白 - 微管配位蛋白的涌现特性，这些特性可能只有在同时使用两种动态聚合物的实验系统中才能完全理解。
直接蛋白质标记方法，遗传编码亲和力标签和全内反射荧光（TIRF）显微镜的组合已在仿生重建系统19，20，21，22，23中取得了巨大成功。许多自下而上的方案并不包含调节细胞中蛋白质的所有因素。然而，“盖玻片上的生物化学”技术在高空间和时间尺度上完善了肌动蛋白和微管动力学的许多机制，包括聚合物组装或拆卸所需的组件，以及运动蛋白运动5，12，23，24，25，26，27.这里描述了一种在体外研究肌动蛋白-微管偶联的最小组分单丝方法。该方案可与市售或高纯度纯化蛋白、荧光标记蛋白、灌注室一起使用，并扩展到包含细胞提取物或合成系统的更复杂的方案。在这里，市售的Tau蛋白用于证明在肌动蛋白 - 微管偶联蛋白存在下细胞骨架动力学如何变化，但可以替代其他推定的肌动蛋白 - 微管配位因子。与其他方法相比，该系统的主要优点是能够在一次反应中同时监测多个细胞骨架聚合物的动力学。该协议还为用户提供了示例和简单的工具，以量化细胞骨架聚合物的变化。因此，实验方案用户将产生可靠、定量的单丝分辨率数据，以描述各种调节蛋白如何协调肌动蛋白微管动力学的机制。
Protocol
1. 清洗盖玻片
注：根据Smith等人，清洗（24 mm x 60 mm，#1.5）盖玻片，201328。
- 将盖玻片排列在塑料幻灯片邮件容器中。
- 将盖玻片依次浸没在以下溶液中并超声处理30-60分钟，在每个溶液之间用ddH2O冲洗10次：ddH2O，一滴洗洁精;0.1 M 千兆赫将盖玻片储存在100%乙醇中长达6个月。
注意：请勿用不偏僻的手指触摸玻璃表面。请改用镊子。
2. 使用 mPEG 和生物素-PEG-硅烷清洁（24 mm x 60 mm，#1.5）盖玻片
注意：该协议专门使用生物素 - 链霉亲和素系统在TIRF成像平面内定位肌动蛋白和微管。可以使用其他涂层和体系（例如，抗体、聚-L-赖氨酸、NEM 肌球蛋白等）。
- 解冻PEG-硅烷和生物素-PEG-硅烷粉末的等分试样。
- 在使用前将PEG粉末溶解在80%乙醇（pH 2.0）中，以生成10 mg / mL mPEG-硅烷和2-4 mg / mL生物素 - PEG -硅烷的涂层储备溶液。
注意：PEG粉末经常出现溶解，但可能不在微观水平。适当的重悬需要约1-2分钟，持续移液。鼓励用户在出现粉末溶解后再移液10次。
注意：在制造80%乙醇（pH 2.0）时，戴上手套以保护皮肤免受浓缩盐酸盐的侵害。 - 使用镊子从乙醇储存中取出干净的（24 mm x 60 mm，#1.5）盖玻片。用氮气干燥并储存在干净的培养皿中。
- 用 100 μL 包衣溶液涂覆盖玻片：2 mg/mL mPEG-硅烷 （MW 2，000） 和 0.04 mg/mL 生物素-PEG-硅烷 （MW 3，400） 在 80% 乙醇 （pH 2.0） 中的混合物。
注意：对于稀疏涂层（推荐），请使用 2 mg/mL mPEG-硅烷和 0.04 mg/mL 生物素-PEG-硅烷。对于致密涂层，使用2毫克/毫升mPEG-硅烷，4毫克/毫升生物素-PEG-硅烷。 - 将盖玻片在70°C下孵育至少18小时或直到使用。
注意：如果在70°C下储存超过2周，涂层盖玻片会降解。
3. 组装成像流动室
- 将 12 条双背双面胶带切割成 24 mm 的长度。取下胶带背衬的一侧，并将胶带片固定在干净的成像室上存在的六个凹槽附近。
注意：胶带必须平整才能正确组装，否则成像室会泄漏。小心地取下胶带背衬，以避免颠簸。建议在干净的表面上滑动胶带腔室，以平滑磁带室触点。 - 取下第二块胶带背衬，沿每个腔室凹槽露出胶带的粘性一面。将腔室胶带面朝上放在干净的表面上。
- 在小型称重船中以 1：1（或根据制造商的说明）混合环氧树脂和固化剂溶液。
- 使用P1000尖端在每个成像室凹槽末端的胶带条之间放置一滴混合环氧树脂（红色箭头; 图 1A）。将腔室胶带/环氧树脂面朝上放在干净的表面上。
- 从70°C培养箱中取出涂层盖玻片。用ddH2O冲洗盖玻片的涂层和未涂层表面六次，用过滤的氮气干燥，然后将盖玻片涂层面朝向胶带贴在成像室上。
- 使用P200或P1000移液器吸头对玻璃带状界面施加压力，以确保胶带和盖玻片之间的良好密封。
注：通过适当的密封，双面胶带会变成半透明。缺乏足够胶带室触点的成像室会泄漏。 - 在室温下孵育组装的腔室至少5-10分钟，以使环氧树脂在使用前完全密封腔室孔。灌注室在组装后12-18小时内过期。
注意：根据胶带的位置和所用双面胶带的厚度，组装的腔室的最终体积为20-50μL。
4. 灌注室的调节
- 使用灌注泵（速率设置为500μL/min）在灌注室中按顺序交换预处理溶液，如下所示：
- 流动50μL的1%BSA以启动成像室。从鲁尔锁接头储液器中取出多余的缓冲液。
- 流动50μL的0.005mg / mL链霉亲和素。在室温下孵育1-2分钟。从储液槽中取出多余的缓冲液。
- 流动50μL的1%BSA以阻断非特异性结合。孵育10-30秒。从储液槽中取出多余的缓冲液。
- 流动50μL温（37°C）1x TIRF缓冲液（1x BRB80，50mM KCl，10mM DTT，40mM葡萄糖，0.25%（v / v）甲基纤维素（4，000 cp））。
注意：不要从储液槽中取出多余的缓冲液。这可以防止腔室变干，从而将气泡引入系统。 - 可选：在1x TIRF缓冲液中稀释50μL稳定的29 和50%生物素化微管种子。
注意：适当的稀释必须根据经验确定，并包含批次间的可变性。建议将27，29 个 协议作为起点。稀释后，每个视野产生10-30个种子，与此设置配合得很好。
5. 显微镜制备
注意：使用配备120-150 mW固态激光器，温度校正63倍油浸TIRF物镜和EMCCD相机的倒置全反射荧光（TIRF）显微镜观察/执行含有动态肌动蛋白丝和微管的生化反应。本例中的蛋白质在以下波长下可视化：488nm（微管）和647nm（肌动蛋白）。
- 设置载物台/物镜加热器装置，在对第一次生化反应进行成像之前至少30分钟保持35-37°C。
- 设置图像采集参数如下：
- 将采集间隔设置为每5秒15-20分钟。
- 将 488 和 647 激光曝光设置为 50-100 毫秒，功率为 5%-10%。为显微镜设置适当的TIRF角度。
注意：无论显微镜设置如何，设置激光功率、曝光和TIRF角度的最简单方法是单独对任一聚合物的图像进行调整（见下文5.2.2.1和5.2.2.2）。强烈建议用户使用仍然允许检测的最低激光功率和曝光设置。- 调整聚合反应（图1C）以启动肌动蛋白丝组装并在647nm处获取图像。进行适当的调整。
- 在第二个条件灌注孔中调节聚合反应以启动微管组装（图1C）并在488nm处可视化。进行适当的调整。
6. 蛋白质反应混合物的制备
- 准备荧光标记的微管蛋白的储备溶液。
- 通过Abs280的分光光度法测定自制未标记微管蛋白的浓度，如下所示：
- 空白分光光度计，1xBRB80缺少GTP。
- 使用确定的消光系数 115，000 M-1 cm-1 和以下公式计算微管蛋白的浓度：
- 将商业制造的冻干赖氨酸标记的488微管蛋白重悬于10μM（1mg / mL;100%标记物）中，其中20μL含有1x BRB80缺乏GTP。
- 在冰上解冻7.2μL等分试样100μM未标记的回收微管蛋白29 。
注意：回收的微管蛋白对于 体外 微管组装的成功至关重要，因为它可以去除冷冻蛋白质储备液29，30中形成的聚合不合格的二聚体。 - 将3μL10μM 488微管蛋白与7.2μL等分试样的100μM未标记微管蛋白混合，使用前不超过15分钟。
- 通过Abs280的分光光度法测定自制未标记微管蛋白的浓度，如下所示：
- 制备荧光标记肌动蛋白的储备溶液。
- 对于自制蛋白质， 通过 分光光度法测定 Abs290 和 Abs650 确定肌动蛋白的浓度和百分比标记，如下所示：
- 带G缓冲液的空白分光光度计。
- 使用确定的消光系数25，974 M-1 cm-1和以下公式计算未标记的肌动蛋白的浓度：
- 使用未标记的肌动蛋白的消光系数，氟校正因子0.03和以下公式计算标记的Alexa-647-肌动蛋白的赖氨酸浓度：
[Alexa-647 肌动蛋白]， μM = （Abs290 -
- 使用239，000 M-1 cm-1的Alexa-647的确定ε计算Alexa-647-肌动蛋白的百分比标记，如下所示：
Alexa-647-肌动蛋白的%标记=（Abs290 - （
- 解冻一个2μL等分试样的3μM 100%标记的生物素 - 肌动蛋白（标记在赖氨酸残基上）。通过加入18μLG缓冲液稀释10倍。
- 将3μL稀释的生物素化肌动蛋白，适当体积的未标记和标记的肌动蛋白（上图）结合，使得最终混合物将是12.5μM总肌动蛋白和10%-30%荧光标记。
注意：大于30%的荧光肌动蛋白单体（最终）可能会影响成像分辨率，因为难以从背景中辨别细丝。
- 对于自制蛋白质， 通过 分光光度法测定 Abs290 和 Abs650 确定肌动蛋白的浓度和百分比标记，如下所示：
- 准备反应混合物（图1C）。
- 通过将2μL的12.5μM肌动蛋白混合物储备液（6.2.3）与微管蛋白储备混合物（6.1.4）结合来制备细胞骨架混合物（管A），在成像前不超过15分钟。储存在冰上直至使用。
- 通过组合所有其他实验组分和蛋白质来制备蛋白质反应混合物（试管B），包括：2x TIRF缓冲液，抗漂白剂，核苷酸，缓冲液和辅助蛋白。 图1C显示了一个示例。
注意：最终稀释产生1x TIRF缓冲液，其中含有估计生理范围内的ATP，GTP和离子强度。
- 将试管A和试管B分别在37°C下孵育30-60秒。要启动反应，将管B的内容物混合并加入管A（下图）。
7. 图像肌动蛋白和微管动力学
- 充分调节灌注（图1B;上面的步骤4）。
- 通过将管B（反应混合物）的内容物添加到管A（细胞骨架混合物）中同时启动肌动蛋白和微管组装（图1C）。
- 流动50μL反应，含有1x TIRF缓冲液，补充有15μM游离微管蛋白，1mM GTP和0.5μM肌动蛋白单体和适当体积的缓冲液对照。
- 使用显微镜软件记录延时短片，每5秒采集一次，持续15-20分钟。
注意：肌动蛋白和微管动力学的启动发生在2-5分钟内（图2）。较长的延迟表明温度控制问题或反应混合物中蛋白质的浓度相关问题。 - 调理新的灌注孔（步骤4），并用感兴趣的调节蛋白（即Tau）和缓冲液对照代替缓冲液体积（图1C）。按照步骤7（上文）所述进行获取，以评估针对新兴肌动蛋白微管功能的调节蛋白。
8. 使用斐济软件处理和分析图像31
- 打开保存的TIRF电影并以合成形式观看。
- 分析微管动力学（图3A），如下所示：
- 从图像堆栈菜单生成基于时间的最大 Z 投影。
- 将 Z 投影窗口与 “分析>工具>同步窗口 ”菜单中的原始 TIRF 影片同步。
- 使用直线工具沿时间投影图像上感兴趣的微管绘制一条线。
- 从分析菜单（分析>工具> ROI 管理器）打开感兴趣区域 （ROI） 管理器。
- 按“t”保存单个微管位置。对所有感兴趣的微管重复上述步骤。
- 使用“/”绘制选定线的kymo图，或运行多kymo宏，为ROI管理器31中的每个微管生成视频和kymograph。
- 从分析>工具>比例尺菜单中将长度 （μm） 和时间 （最小） 比例尺添加到kymographs 。
- 从Kymograph斜率测量微管生长速度（图3A，1-2;黑线的斜率）。
- 从生成的kymograph或使用可用的分析宏5，8，18，25计算动态微管事件（灾难或再生）。图3A中的红色虚线1-2表示灾难/快速拆卸事件。
- 分析肌动蛋白动力学（图3B），如下所示：
- 测量肌动蛋白成核，如下所示：
- 计算反应开始后100秒内视场中存在的肌动蛋白丝的数量，并按面积表达（每μm2的细丝数）。
- 在 ROI 管理器中记录和保存数据，如上面的步骤 8.2.3.1 所示。
- 测量肌动蛋白丝伸长率（图3B），如下所示：
- 使用分段线工具沿感兴趣的肌动蛋白丝绘制一条线。
- 将行添加到 ROI 管理器，如上面的步骤 8.2.3.1 所示。
- 沿着该行重复（将每个测量值添加到ROI管理器）至少四个电影帧。
注意：建议测量七到八个连续的框架，但是有些条件会将肌动蛋白聚合速度降低到可检测的限值以下，该限值可以通过物镜/显微镜设置来解决。在这种情况下，可以在非连续帧（例如，每五帧）上以固定间隔进行测量。 - 绘制已用时间内的测量长度值。生成的线的斜率是肌动蛋白伸长率，单位为微米/秒。
- 使用370亚基的校正 因子将最终计算的速率作为s-1μM-1传达给s-1μM-1 ，以解释微米灯丝32中肌动蛋白单体的数量。
- 测量肌动蛋白成核，如下所示：
- 对平行肌动蛋白-微管关联的区域进行相关分析（图3C），如下所示：
- 使用直线工具在特定时间点（即反应引发后300秒）沿感兴趣的微管绘制一条线。
- 将行添加到 ROI 管理器，如上面的步骤 8.2.3.1 所示。
- 沿每个通道中的线绘制荧光强度。
- 使用图像滑块选择每个通道，并使用“命令k”沿线绘制强度。
- 通过单击输出窗口中的“列表”按钮保存或导出值。
- 将肌动蛋白 - 微管偶联事件表示为单个事件的比率（肌动蛋白与微管重叠）或作为给定视野中在一致时间点的事件计数（图3C）。
- 备选方法：使用软件确定两个通道的重叠百分比5，12。
- 使用直线工具在特定时间点（即反应引发后300秒）沿感兴趣的微管绘制一条线。
Representative Results
在上述条件下（图1），肌动蛋白和微管聚合物应在图像采集后2分钟内可见（和动态）（图2）。与任何基于生物化学的方案一样，可能需要针对不同的调节蛋白或蛋白质批次进行优化。由于这些原因，TIRF角度和图像曝光首先设置，反应含有每种单独的聚合物。这证实了储存的蛋白质具有功能性，并且存在足够的标记蛋白质用于检测。虽然并不总是必要的（这里也不执行），但电影的后处理（即背景减法，平均或傅里叶变换）可用于增强图像对比度（特别是微管）5，25，33。该测定提供的单个肌动蛋白丝和微管的直接可视化支持单独或一起定量测定细胞骨架组分的几种动态测量，包括聚合参数（即成核或伸长率），拆卸参数（即收缩率或灾难事件）和聚合物合并/重叠（图3).此外，这些措施可以用作破译Tau等调节配体的结合或影响的起点（图3）。单肌动蛋白丝或微管的许多测量都可以从一个TIRF视频中进行。然而，由于盖玻片涂层、移液和其他因素的差异，可靠的测量还应包括多个技术重复反应/薄膜。
微管动力学的许多方面可以从示例kymographs中确定，包括微管伸长率，以及灾难和救援事件的频率（图3A）。使用kymographs来测量该系统中的肌动蛋白动力学并不那么简单，因为肌动蛋白丝比微管更复杂。因此，肌动蛋白长丝动力学的参数是用手测量的，这是耗时且劳动密集型的。成核计数的测量值为在所有条件下在一致时间点存在的肌动蛋白丝的数量。这些计数在TIRF成像领域差异很大，但可以与许多重复一起使用或用于补充其他聚合测定的观察结果。如果试验条件缺乏稳定的微管种子，成核计数也可用于微管。肌动蛋白细丝伸长率测量为至少四个电影帧随时间变化的长度。每个微摩尔肌动蛋白的速率值以370亚基的校正因子传达，以解释微米长丝中肌动蛋白单体的数量（图3B）32。定义肌动蛋白和微管之间协调行为的测量不太明确。然而，相关分析已被应用于测量两种聚合物的重合性，包括线扫描（图3C）或重叠软件5，11，34。
数据可用性：
与这项工作相关的所有数据集都已存放在Zenodo中，并可通过合理的要求在以下位置获得：10.5281 / zenodo.6368327。
图 1.实验示意图：从流室组装到图像采集。（A）成像室组件。从上到下：IBIDI成像室沿着灌注孔（用箭头表示）贴上胶带;去除第二层（白色）胶带背衬（在所示图像中左侧以更好地定位用户），并在灌注室（箭头）的边缘施加环氧树脂。注意：为了更轻松地确定用户放置环氧树脂的位置，此图像中保留了白色背衬。清洁和涂层的盖玻片连接到成像室，涂层侧朝向灌注孔的内部。（B）流程图，说明调节生物素 - 链霉亲和素连接的成像室的步骤。（C）用于获取动态微管和肌动蛋白丝的TIRF薄膜的反应示例。 请点击此处查看此图的大图。
图 2.在没有 Tau 或存在 Tau 的情况下生长的肌动蛋白丝和微管的图像序列。 来自TIRF测定的延时图像蒙太奇，含有0.5μM肌动蛋白（10%Alexa-647-肌动蛋白和0.09%生物素 - 肌动蛋白标记）和15μM游离微管蛋白（4%HiLyte-488标记）在没有（A）或存在（B）250nM Tau的情况下。图中显示了从反应启动（混合管A和管B）经过的时间。比例尺，25 μm。 请点击此处查看此图的大图。
图 3.微管和肌动蛋白丝动力学的测量示例。 （A）微管蛋白通道的平均时间投影有效地可视化用于生成kymograph图的线扫描的总微管长度。黑色虚线对应于右侧显示的动态微管的两个示例kymographs。每个Kymograph上都显示了微管的生长（纯黑线）和拆卸阶段（粉红色虚线;两个用粉红色箭头表示）。时间刻度栏，3 分钟。长度比例尺，10 μm。反应含有0.5μM肌动蛋白（10%647-标记）和15μM游离微管蛋白（4%488-HiLyte标记）。仅显示微管蛋白通道。（B）两个延时图像蒙太奇示例，描绘了单肌动蛋白丝主动聚合。伸长率计算为每微摩尔肌动蛋白肌动蛋白长度随时间变化的图的斜率。因此，必须对0.5μM肌动蛋白反应施加2的校正因子，以比较通常在1μM肌动蛋白浓度下确定的速率。右侧显示了五根灯丝中的示例。比例尺，10 μm。反应含有0.5μM肌动蛋白（10%647-标记）和15μM游离微管蛋白（4%488-HiLyte标记）。仅显示肌动蛋白通道。（C）动态微管（MT）（绿色）和肌动蛋白丝（紫色）在没有（左）或存在250 nM Tau（中）的情况下聚合的TIRF图像。蓝色虚线和箭头标记了为对应于每个条件的线扫描图绘制线的位置（每个图像下方）。微管和肌动蛋白区域（显示为黑色）之间的重叠可以在每个区域的设定时间点（右）进行评分。比例尺，25 μm。反应含有0.5μM肌动蛋白（10%647-标记）和15μM游离微管蛋白（4%488-HiLyte标记），有或没有250nM Tau。 请点击此处查看此图的大图。
Discussion
使用全内反射荧光（TIRF）显微镜可视化纯化蛋白质一直是剖析细胞骨架调节的独特机制的一种富有成效且令人信服的方法5，23，24，25，26，27，35。与传统的生化测定相比，TIRF反应需要非常小的体积（50-100μL），并且可以从单个测定中收集细胞骨架动力学的定量测量。大多数细胞骨架动力学研究集中在单个聚合物系统（即肌动蛋白丝或微管）上，因此对通常在细胞中看到的肌动蛋白丝和微管之间的串扰或涌现行为的详细测量仍然难以捉摸并且难以在试管中重述。为了解决这个问题，该协议描述了一种单丝TIRF显微镜系统，该系统能够在同一生化反应中直接可视化动态肌动蛋白和微管聚合物。因此，该方法超越了传统的测定，后者仅重述肌动蛋白丝或微管的动态行为。该技术也以Tau为例，说明在存在细胞骨架耦合因子的情况下，几种动态性质如何变化。该协议可以与已知或怀疑的其他蛋白质一起使用，以协调肌动蛋白或微管动力学，包括（但不限于）MACF，GAS，formins等。最后，提供的示例分析可以用作量化使用该协议获取的数据的指南。
“眼见为实”是进行基于显微镜的测定的令人信服的理由。然而，在执行和解释TIRF显微镜实验时需要谨慎。细胞骨架共组装测定的一个主要挑战是许多常用的成像条件与每种聚合物不相容。微管和肌动蛋白通常具有不同的缓冲液、温度、盐、核苷酸和聚合浓度要求。肌动蛋白、微管蛋白、靶向调节蛋白和本方案中使用的缓冲液对冻融循环敏感。因此，仔细处理蛋白质和缓冲液对于成功执行该协议是必要的。为了缓解许多这些问题，强烈建议使用新鲜回收的微管蛋白（冷冻<6周），并通过超速离心预先清除冷冻/重悬的肌动蛋白。这些考虑因素也适用于使用该程序评估的无数调节蛋白，这些调节蛋白可能对冻融循环或缓冲盐浓度5，11，36敏感。
不幸的是，没有一个没有实验权衡的一刀切的缓冲区。为了为较低浓度的蛋白质适当更多的体积，可以在2x TIRF缓冲溶液中包含ATP和GTP（图1C）。然而，由于这些核苷酸对冻融循环极其敏感，因此不推荐使用。这里使用的除氧化合物（即过氧化氢酶和葡萄糖氧化酶）对于长时间（几分钟到几小时）可视化蛋白质是必要的，但已知会限制高浓度下的微管聚合5。与这些缓冲液考虑因素相关，该协议的局限性在于，一些规范的微管相关调节蛋白可能需要或多或少的盐来概括细胞中发现的功能或仅使用微管（不含肌动蛋白）的测定。改变盐的性质或浓度以解决这些问题可能会影响肌动蛋白丝聚合速率和/或微管动力学参数。需要测量多个描述性参数（最小、成核、伸长率和稳定性）（图 3）以确认方案成功或明确记录特定缓冲液或调节蛋白的作用。例如，过多的肌动蛋白细丝聚合会在几秒钟内掩盖肌动蛋白-微管偶联事件。因此，通过降低肌动蛋白的总浓度或包括抑制肌动蛋白成核的额外蛋白质（即profilin）来微调实验条件将延长可以清楚地看到协调的肌动蛋白 - 微管活性的总时间。满足这些先决条件的控制措施和技术重复（超越多个视野）对于用户产生可靠且可重复的结果至关重要。
基于细胞的研究为观察直接蛋白质 - 蛋白质关系或调节复合物的作用提供了有限的机会。相比之下，从 体外测定中 收集的一些机制并不总是反映细胞中观察到的蛋白质的确切行为。这种经典的生物化学困境可以通过特定的修改在该技术的未来应用中得到解决。例如，添加功能性荧光标记的偶联蛋白将这种方法从单丝研究扩展到单分子 研究。可以进一步修改测定以使用细胞提取物，这些细胞提取物可能添加“缺失的”未知关键因子，以概括细胞样现象。例如，基于TIRF的测定采用酵母或非洲爪蟾提取物，具有重组收缩肌动蛋白环37，有丝分裂纺锤体26，38，肌动蛋白或微管组装的组分39，40，甚至在中心体和运动管36，41，42，43处的动力学.此外，这样的系统可能为具有脂质或信号因子的人造细胞系统铺平道路，这些系统存在44，45，46。
Disclosures
没有利益冲突需要披露。
Acknowledgments
我感谢Marc Ridilla（Repair Biotechnologies）和Brian Haarer（SUNY Upstate）对该协议的有用评论。这项工作得到了美国国立卫生研究院（GM133485）的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1% BSA (w/v) | Fisher Scientific | BP1600-100 | For this purpose (blocking TIRF chambers), BSA is resuspended in ddH20 and filtered through a 0.22 µm filter. |
| 1× BRB80 | Homemade | 80 mM PIPES, 1 mM MgCl2, 1 mM EGTA, pH 6.8 with KOH | |
| 10 mg/mL (1000 U) glucose oxidase | Sigma Aldrich Inc, St. Louis, MO | G2133-50KU | Combined with catalase, aliquot and store at -80 oC until use |
| 100 µM tubulin | Cytoskeleton Inc, Denver, CO | T240 | Homemade tubulins should be recycled before use to remove polymerization-incompetent tubulin (Hyman et al. (1992)29; Li and Moore (2020)30). Commercially available tubulins are often too dilute to recycle, but function well if resuspended according to manufacturer’s instructions and pre-cleared via ultracentrifugation (278,000 × g) for 60 min, before use. |
| 100 mM ATP | Gold Biotechnology Inc, Olivette, MO | A-081 | Resuspended in ddH20 (pH 7.5) and filter sterilized. |
| 100 mM GTP | Fisher Scientific | AC226250010 | Resuspended in 1× BRB80 (pH 6.8) and filter sterilized. |
| 120-150 mW solid-state lasers | Leica Microsystems | 11889151; 11889148 | |
| 2 mg/mL catalase | Sigma Aldrich Inc, St. Louis, MO | C40-100 | Combined with glucose oxidase, aliquot and store at -80 oC until use |
| 2× TIRF buffer | Homemade | 2× BRB80, 100 mM KCl, 20 mM DTT, 80 mM glucose, 0.5% (v/v) methylcellulose (4,000 cp); Note: 1 µL of 0.1M GTP and 1 µL of 0.1M ATP added separately to TIRF reactions to avoid repeated freeze-thaw cycles. | |
| 24 × 60 mm, #1.5 coverglass | Fisher Scientific, Waltham, MA | 22-266882 | Coverglass must be extensively washed before use (Smith et al. (2014)22) |
| 37 oC heatblock | |||
| 37 oC water bath | |||
| 5 mg/mL Streptavidin (600x stock) | Avantor, Philadelphia, PA | RLS000-01 | Resuspended in Tris-HCl (pH 8.8); dilute the aliquot to 1× in HEK buffer on day of use |
| 5 min Epoxy resin and hardener | Loctite, Rocky Hill, CT | 1365736 | Combined resin and hardener may take up to 30 min to cure. |
| 50% biotinylated-GpCpp microtubule seeds | Cytoskeleton Inc; Homemade | T333P | (optional) GppCpp or Taxol stabilized microtubule seeds can more efficiently mediate microtubule polymerization. Taxol and GppCpp stabilize microtubules in different ways that can affect the microtubule lattice structure and ability of certain regulatory proteins to bind to the stabilized portion of the microtubule. A method to make diverse kinds of microtubule seeds is outlined in Hyman et al. (1992). |
| 70 oC incubator | |||
| Actin mix stock | Homemade; this protocol | A 12.5 µM actin mix comprised of labeled (fluorescent and biotinylated) and unlabeled actin for up to six reactions. 2 µL of stock is used in the final TIRF reaction. The final concentration of actin used in each reaction is 0.5 µM (10% Alexa-647; 0.09% biotin-labeled). | |
| Appropriate buffer controls | Homemade | Combination of buffers from all proteins being assessed | |
| Biotin-PEG-silane (MW 3,400) | Laysan Bio Inc | biotin-PEG-SIL-3400 | Dispensed into 2-5 mg aliquots, backfilled with nitrogen, parafilmed closed, and stored at -20 oC with desiccant until use |
| Biotinylated actin | Cytoskeleton Inc; Homemade | AB07 | Biotin-actin is made by labeling on lysine residues and thus assumed to be at least 100% labeled, but varies with different lots/preparations. Optimal biotinylated actin concentrations must be empirically determined for particular uses/experimental designs. Higher concentrations permit more efficient tracking, but may impede polymerization or interactions with regulatory proteins. Here a small percentage (0.09% or 900 pM) biotinylated actin is present in the final TIRF reaction. |
| Dishsoap | Dawn, Procter and Gamble, Cincinnati, OH | For unknown reasons, the blue version cleans coverslips more efficiently than other available colors. | |
| Dry ice | |||
| FIJI Software | www.https://imagej.net/software/fiji/downloads | Schneider et al. (2012)31. | |
| Fluorescently labeled actin | Cytoskeleton Inc; Homemade | AR05 | Homemade fluorescently labeled actin is stored in G-buffer supplemented with 50% glycerol at -20 oC (Spudich et al. (1971)47; Liu et al. (2022)48). Fluorescently labeled actin is dialyzed against G-buffer and precleared via ultracentrifugation for 60 min at 278,000 × g before use. |
| Fluorescently labeled tubulin | Cytoskeleton Inc | TL488M, TLA590M, TL670M | Resuspended in 20 µL 1× BRB80 (10 µM final concentration) and pre-cleared via ultracentrifugation (278,000 × g) for 60 min, before use. |
| G-buffer | Homemade | 3 mM Tris-HCl (pH 8.0), 0.2 mM CaCl2, 0.5 mM DTT, 0.2 mM ATP | |
| HEK Buffer | Homemade | 20 mM HEPES (pH 7.5), 1 mM EDTA (pH 8.0), 50 mM KCl | |
| Ice | |||
| Ice bucket | |||
| Imaging chambers | IBIDI, Fitchburg, WI | 80666 | Order chambers with no bottom to utilize different coverslip coatings |
| iXon Life 897 EMCCD camera | Andor, Belfast, Northern Ireland | 8114137 | |
| LASX Premium microscope software | Leica Microsystems | 11640611 | |
| Methylcellulose (4,000 cp) | Sigma Aldrich Inc | M0512 | |
| Microscope base equipped with TIRF module | Leica Microsystems, Wetzlar, Germany | 11889146 | |
| mPEG-silane (MW 2,000) | Laysan Bio Inc, Arab, AL | mPEG-SIL-2000 | Dispensed into 10-15 mg aliquots, backfilled with nitrogen, parafilmed closed, and stored at -20 oC with desiccant until use |
| Objective heater and heated stage insert | OKO labs, Pozzioli, Italy | 8113569 | Set temperature controls to 35-37 oC. Use manufacturer suggestions for accurate calibration. |
| Perfusion pump | Harvard Apparatus, Holliston, MA | 704504 | A syringe and tubing can be substituted. |
| Petri Dish, 100 x 15 mm | Genesee Scientific, San Diego, CA | 32-107 | |
| Plastic slide mailer container | Fisher Scientific | HS15986 | |
| SA-S-1L-SecureSeal 0.12 mm thick | Grace Biolabs, Bend, OR | 620001 | Double-sided tape of precise manufactured dimensions is strongly recommended. |
| Small styrofoam container | Abcam, Cambridge, UK | Reused from shipping | |
| Small weigh boat | Fisher Scientific | 02-202-100 | |
| Spectrophotometer | |||
| Tau | Cytoskeleton Inc | TA01 | Three isoforms of Tau are present in the commercially available preparation of Tau. The concentration in this protocol was determined from the highest molecular weight band (14.3 µM, when resuspended per manufacturer’s recommendations with 50 µL of ddH20). |
| Temperature corrected 63× Plan Apo 1.47 N.A. oil immersion TIRF objective | Leica Microsystems | 11506319 | |
| Tubulin stock | Homemade; this protocol | A tubulin stock consisting of 7.2 µL recycled 100 µM unlabeled tubulin and 3 µL of 10 µM resuspended commercially available fluorescently labeled tubulin. One tubulin stock is used per reaction and thawed/stored on ice. The final concentration of free tubulin in each reaction is 15 µM (4% labeled). More than 15 µM tubulin will result in hyperstabilized (not dynamic) microtubules, whereas concentrations below 7.5 µM free tubulin do not polymerize well. Careful determination of protein concentration and handling is required. | |
| Unlabeled actin (dark) | Cytoskeleton Inc; Homemade | AKL99 | Actin nucleates are almost always present in commercially available (lyophilized) or frozen actins and contribute to variability in quantitative measurements (Spudich et al. (1971)47; Liu et al. (2022)48). Rabbit muscle actin is stored in G-buffer at -80 oC and precleared via ultracentrifugation for 60 min at 278,000 × g before use. Several actin stock solutions are made throughout the day (making no more than enough for six reactions at a time is strongly recommended). |
References
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