यह प्रोटोकॉल इन विट्रो कुल आंतरिक प्रतिदीप्ति (टीआईआरएफ) माइक्रोस्कोपी परख का उपयोग करके गतिशील एक्टिन और सूक्ष्मनलिकाएं की कल्पना करने के लिए एक गाइड है।
परंपरागत रूप से, एक्टिन और सूक्ष्मनलिका साइटोस्केलेटन का अध्ययन अलग-अलग संस्थाओं के रूप में किया गया है, जो विशिष्ट सेलुलर क्षेत्रों या प्रक्रियाओं तक सीमित है, और प्रत्येक बहुलक के लिए अद्वितीय बाध्यकारी प्रोटीन के विभिन्न सूट द्वारा विनियमित किया गया है। कई अध्ययनों से अब पता चलता है कि दोनों साइटोस्केलेटल पॉलिमर की गतिशीलता आपस में जुड़ी हुई है और अधिकांश सेलुलर व्यवहारों के लिए इस क्रॉसस्टॉक की आवश्यकता होती है। एक्टिन-सूक्ष्मनलिकाएं इंटरैक्शन में शामिल कई प्रोटीन पहले से ही पहचाने जा चुके हैं (यानी, ताऊ, एमएसीएफ, जीएएस, फॉर्मिन, और अधिक) और अकेले एक्टिन या सूक्ष्मनलिकाएं के संबंध में अच्छी तरह से विशेषता है। हालांकि, अपेक्षाकृत कम अध्ययनों ने दोनों पॉलिमर के गतिशील संस्करणों के साथ एक्टिन-सूक्ष्मनलिका समन्वय के परख दिखाए। यह एक्टिन और सूक्ष्मनलिकाएं के बीच आकस्मिक लिंकिंग तंत्र को रोक सकता है। यहां, कुल आंतरिक प्रतिबिंब प्रतिदीप्ति (टीआईआरएफ) माइक्रोस्कोपी-आधारित इन विट्रो पुनर्गठन तकनीक एक जैव रासायनिक प्रतिक्रिया से एक्टिन और सूक्ष्मनलिका गतिशीलता दोनों के दृश्य की अनुमति देती है। यह तकनीक व्यक्तिगत रूप से या अन्य बहुलक की उपस्थिति में एक्टिन फिलामेंट या सूक्ष्मनलिकाएं की पोलीमराइजेशन गतिशीलता को संरक्षित करती है। व्यावसायिक रूप से उपलब्ध ताऊ प्रोटीन का उपयोग यह प्रदर्शित करने के लिए किया जाता है कि क्लासिक साइटोस्केलेटल क्रॉसलिंकिंग प्रोटीन की उपस्थिति में एक्टिन-सूक्ष्मनलिका व्यवहार कैसे बदलते हैं। यह विधि विश्वसनीय कार्यात्मक और यंत्रवत अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकती है कि व्यक्तिगत नियामक प्रोटीन एकल फिलामेंट्स या उच्च-क्रम परिसरों के संकल्प पर एक्टिन-सूक्ष्मनलिका गतिशीलता का समन्वय कैसे करते हैं।
ऐतिहासिक रूप से, एक्टिन और सूक्ष्मनलिकाएं अलग-अलग संस्थाओं के रूप में देखी गई हैं, जिनमें से प्रत्येक नियामक प्रोटीन, गतिशीलता व्यवहार और अलग-अलग सेलुलर स्थानों के अपने सेट के साथ है। प्रचुर मात्रा में सबूत अब दर्शाते हैं कि एक्टिन और सूक्ष्मनलिका पॉलिमर कार्यात्मक क्रॉसस्टॉक तंत्र में संलग्न हैं जो माइग्रेशन, माइटोटिक स्पिंडल पोजिशनिंग, इंट्रासेल्युलर ट्रांसपोर्ट और सेल आकृति विज्ञान 1,2,3,4 सहित कई सेल प्रक्रियाओं को निष्पादित करने के लिए आवश्यक हैं। इन उदाहरणों को रेखांकित करने वाले विविध समन्वित व्यवहार युग्मन कारकों, संकेतों और भौतिक गुणों के जटिल संतुलन पर निर्भर हैं। हालांकि, इन तंत्रों को रेखांकित करने वाले आणविक विवरण अभी भी काफी हद तक अज्ञात हैं क्योंकि अधिकांश अध्ययन एक समय 1,2,5 पर एक एकल साइटोस्केलेटल बहुलक पर ध्यान केंद्रित करते हैं।
एक्टिन और सूक्ष्मनलिकाएं सीधे 6,7,8 से बातचीत नहीं करती हैं। कोशिकाओं में देखी गई एक्टिन और सूक्ष्मनलिकाएं की समन्वित गतिशीलता अतिरिक्त कारकों द्वारा मध्यस्थता की जाती है। एक्टिन-माइक्रोट्यूब्यूल क्रॉसस्टॉक को विनियमित करने के लिए सोचे गए कई प्रोटीनों की पहचान की गई है और उनकी गतिविधियों को अकेले साइटोस्केलेटल बहुलक 1,2 के संबंध में अच्छी तरह से विशेषता है। बढ़ते सबूत बताते हैं कि इस एकल बहुलक दृष्टिकोण ने कुछ प्रोटीन / परिसरों के दोहरे कार्यों को छुपाया है जो एक्टिन-सूक्ष्मनलिका युग्मन घटनाओं को सक्षम करते हैं 7,8,9,10,11,12,13। प्रयोग जहां दोनों पॉलिमर मौजूद हैं दुर्लभ हैं और अक्सर अन्य 6,8,9,10,11,14,15,16,17,18 के एकल गतिशील बहुलक और स्थैतिक स्थिर संस्करण के साथ तंत्र को परिभाषित करते हैं . इस प्रकार, एक्टिन-सूक्ष्मनलिका समन्वय प्रोटीन के आकस्मिक गुणों की जांच करने के लिए तरीकों की आवश्यकता होती है जो केवल प्रयोगात्मक प्रणालियों में पूरी तरह से समझा जा सकता है जो दोनों गतिशील पॉलिमर को नियोजित करते हैं।
प्रत्यक्ष प्रोटीन लेबलिंग दृष्टिकोण, आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड आत्मीयता टैग, और कुल आंतरिक प्रतिबिंब प्रतिदीप्ति (टीआईआरएफ) माइक्रोस्कोपी का संयोजन बायोमिमेटिक पुनर्गठन प्रणालियों 19,20,21,22,23 में बड़ी सफलता के साथ लागू किया गया है। कई बॉटम-अप योजनाओं में वे सभी कारक नहीं होते हैं जो कोशिकाओं में प्रोटीन को विनियमित करते हैं। हालांकि, “कवरग्लास पर जैव रसायन” तकनीक ने उच्च स्थानिक और लौकिक तराजू पर एक्टिन और सूक्ष्मनलिका गतिशीलता के कई तंत्रों को परिष्कृत किया है, जिसमें बहुलक असेंबली या विघटन के लिए आवश्यक घटक और मोटर प्रोटीन आंदोलन 5,12,23,24,25,26,27 शामिल हैं . यहां इन विट्रो में एक्टिन-सूक्ष्मनलिका युग्मन की जांच के लिए एक न्यूनतम घटक एकल-फिलामेंट दृष्टिकोण का वर्णन किया गया है। इस प्रोटोकॉल का उपयोग व्यावसायिक रूप से उपलब्ध या अत्यधिक शुद्ध शुद्ध प्रोटीन, फ्लोरोसेंटली लेबल प्रोटीन, छिड़काव कक्षों के साथ किया जा सकता है, और सेल अर्क या सिंथेटिक सिस्टम युक्त अधिक जटिल योजनाओं तक बढ़ाया जा सकता है। यहां, व्यावसायिक रूप से उपलब्ध ताऊ प्रोटीन का उपयोग यह प्रदर्शित करने के लिए किया जाता है कि एक्टिन-सूक्ष्मनलिका युग्मन प्रोटीन की उपस्थिति में साइटोस्केलेटल गतिशीलता कैसे बदलती है, लेकिन इसे अन्य पुटेटिव एक्टिन-सूक्ष्मनलिका समन्वय कारकों के लिए प्रतिस्थापित किया जा सकता है। अन्य दृष्टिकोणों पर इस प्रणाली का प्रमुख लाभ एक प्रतिक्रिया में कई साइटोस्केलेटल पॉलिमर की गतिशीलता की एक साथ निगरानी करने की क्षमता है। यह प्रोटोकॉल उपयोगकर्ताओं को साइटोस्केलेटल पॉलिमर में परिवर्तन की मात्रा निर्धारित करने के लिए उदाहरण और सरल उपकरण भी प्रदान करता है। इस प्रकार, प्रोटोकॉल उपयोगकर्ता तंत्र का वर्णन करने के लिए विश्वसनीय, मात्रात्मक, एकल-फिलामेंट रिज़ॉल्यूशन डेटा का उत्पादन करेंगे जो इस बात को रेखांकित करते हैं कि विविध नियामक प्रोटीन एक्टिन-सूक्ष्मनलिका गतिशीलता का समन्वय कैसे करते हैं।
कुल आंतरिक प्रतिबिंब प्रतिदीप्ति (टीआईआरएफ) माइक्रोस्कोपी का उपयोग शुद्ध प्रोटीन के लिए साइटोस्केलेटल विनियमन 5,23,24,25,26,27,35 के अद्वितीय तंत्र को विच्छेदित करने के लिए एक उपयोगी और सम्मोहक दृष्टिकोण रहा है। पारंपरिक जैव रासायनिक परखों की तुलना में, टीआईआरएफ प्रतिक्रियाओं को बहुत कम मात्रा (50-100 μL) की आवश्यकता होती है, और साइटोस्केलेटल गतिशीलता के मात्रात्मक माप को एक व्यक्तिगत परख से प्राप्त किया जा सकता है। साइटोस्केलेटल गतिशीलता के अधिकांश अध्ययन एक एकल बहुलक प्रणाली (यानी, एक्टिन फिलामेंट्स या सूक्ष्मनलिकाएं) पर ध्यान केंद्रित करते हैं, इस प्रकार आमतौर पर कोशिकाओं में देखे जाने वाले एक्टिन फिलामेंट्स और सूक्ष्मनलिकाएं के बीच क्रॉसस्टॉक या आकस्मिक व्यवहार के विस्तृत माप मायावी और टेस्ट ट्यूब में पुनरावृत्ति करना मुश्किल रहा है। इस समस्या को हल करने के लिए, यह प्रोटोकॉल एक एकल-फिलामेंट टीआईआरएफ माइक्रोस्कोपी प्रणाली का वर्णन करता है जो एक ही जैव रासायनिक प्रतिक्रिया में गतिशील एक्टिन और सूक्ष्मनलिका पॉलिमर के प्रत्यक्ष दृश्य को सक्षम बनाता है। इस प्रकार, यह विधि पारंपरिक परखों से परे है जो अकेले एक्टिन फिलामेंट्स या सूक्ष्मनलिकाएं के गतिशील व्यवहार को दोहराती है। इस तकनीक को ताऊ के साथ एक उदाहरण के रूप में भी किया गया था कि साइटोस्केलेटन युग्मन कारक की उपस्थिति में कितने गतिशील गुण बदलते हैं। इस प्रोटोकॉल का उपयोग अतिरिक्त प्रोटीन के साथ किया जा सकता है जिसे एक्टिन या सूक्ष्मनलिका गतिशीलता का समन्वय करने के लिए जाना जाता है या संदिग्ध किया जा सकता है, जिसमें एमएसीएफ, जीएएस, फॉर्मिन और बहुत कुछ शामिल है (लेकिन सीमित नहीं है)। अंत में, प्रदान किए गए उदाहरण विश्लेषण इस प्रोटोकॉल के साथ अधिग्रहित डेटा को मापने के लिए एक गाइड के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है।
“देखना विश्वास है” माइक्रोस्कोपी-आधारित परख करने का एक सम्मोहक कारण है। हालांकि, टीआईआरएफ माइक्रोस्कोपी प्रयोगों के निष्पादन और व्याख्या में सावधानी की आवश्यकता है। साइटोस्केलेटल सह-असेंबली परख की एक बड़ी चुनौती यह है कि कई आमतौर पर उपयोग की जाने वाली इमेजिंग स्थितियां प्रत्येक बहुलक के अनुरूप नहीं हैं। सूक्ष्मनलिकाएं और एक्टिन में आमतौर पर पोलीमराइजेशन के लिए अलग-अलग बफर, तापमान, नमक, न्यूक्लियोटाइड और एकाग्रता आवश्यकताएं होती हैं। एक्टिन, ट्यूबुलिन, ब्याज के नियामक प्रोटीन, और इस प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले बफर फ्रीज-पिघलना चक्रों के प्रति संवेदनशील हैं। इसलिए, इस प्रोटोकॉल को सफलतापूर्वक निष्पादित करने के लिए प्रोटीन और बफर की सावधानीपूर्वक हैंडलिंग आवश्यक है। इनमें से कई चिंताओं को कम करने के लिए, ताजा पुनर्नवीनीकरण ट्यूबुलिन (<6 सप्ताह के लिए जमे हुए) का उपयोग करना, और अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन के माध्यम से पूर्व-समाशोधन जमे हुए / ये विचार इस प्रक्रिया के साथ मूल्यांकन किए जाने वाले नियामक प्रोटीन के असंख्य पर भी लागू होते हैं, जो फ्रीज-पिघलना चक्र या बफर लवण 5,11,36 की एकाग्रता के प्रति संवेदनशील हो सकते हैं।
दुर्भाग्य से, प्रयोगात्मक ट्रेडऑफ के बिना कोई भी आकार-फिट-सभी बफर मौजूद नहीं है। कम एकाग्रता के प्रोटीन के लिए अधिक मात्रा उपयुक्त करने के लिए, एटीपी और जीटीपी को 2x टीआईआरएफ बफर समाधान (चित्रा 1 सी) में शामिल किया जा सकता है। हालांकि, क्योंकि ये न्यूक्लियोटाइड फ्रीज-पिघलना चक्रों के प्रति बेहद संवेदनशील हैं, इसलिए इसकी सिफारिश नहीं की जाती है। यहां उपयोग किए जाने वाले ऑक्सीजन मैला ढोने वाले यौगिक (यानी, कैटालेज़ और ग्लूकोज-ऑक्सीडेज) लंबे समय तक प्रोटीन की कल्पना करने के लिए आवश्यक हैं (मिनट से घंटों तक), लेकिन उच्च सांद्रता पर सूक्ष्मनलिका पोलीमराइजेशन को प्रतिबंधित करने के लिए जाने जाते हैं5. इन बफर विचारों से संबंधित, इस प्रोटोकॉल की एक सीमा यह है कि कुछ विहित सूक्ष्मनलिकाएं से जुड़े नियामक प्रोटीन को अकेले सूक्ष्मनलिकाएं (एक्टिन के बिना) का उपयोग करके कोशिकाओं या परखों में पाए जाने वाले कार्यों को दोहराने के लिए कम या ज्यादा नमक की आवश्यकता हो सकती है। इन चिंताओं को दूर करने के लिए नमक की प्रकृति या एकाग्रता को बदलने से एक्टिन फिलामेंट पोलीमराइजेशन और / या सूक्ष्मनलिका गतिशीलता के मापदंडों की दर प्रभावित होगी। प्रोटोकॉल की सफलता की पुष्टि करने या विशिष्ट बफर या नियामक प्रोटीन के प्रभावों को स्पष्ट रूप से दस्तावेज करने के लिए कई वर्णनात्मक मापदंडों (न्यूनतम, न्यूक्लिएशन, बढ़ाव दर, और स्थिरता) (चित्रा 3) के माप की आवश्यकता होती है। उदाहरण के लिए, बहुत अधिक एक्टिन फिलामेंट पोलीमराइजेशन सेकंड के भीतर एक्टिन-सूक्ष्मनलिका युग्मन घटनाओं को अस्पष्ट कर सकता है। नतीजतन, एक्टिन की समग्र एकाग्रता को कम करके या एक्टिन न्यूक्लिएशन (यानी, प्रोफिलिन) को दबाने के लिए अतिरिक्त प्रोटीन सहित ठीक-ट्यूनिंग प्रयोगात्मक स्थितियां समग्र अवधि का विस्तार करेंगी जो समन्वित एक्टिन-सूक्ष्मनलिका गतिविधियों को स्पष्ट रूप से देखा जा सकता है। इन पूर्वापेक्षाओं को संबोधित करने वाले नियंत्रण, और तकनीकी प्रतिकृतियां (देखने के कई क्षेत्रों से परे), उपयोगकर्ताओं के लिए विश्वसनीय और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य परिणाम उत्पन्न करने के लिए महत्वपूर्ण हैं।
सेल-आधारित अध्ययन प्रत्यक्ष प्रोटीन-प्रोटीन संबंधों या नियामक परिसरों की कार्रवाई का निरीक्षण करने के लिए सीमित अवसर प्रदान करते हैं। इसके विपरीत, इन विट्रो परखों से प्राप्त कुछ तंत्र हमेशा कोशिकाओं में देखे गए प्रोटीन के सटीक व्यवहार को प्रतिबिंबित नहीं करते हैं। इस क्लासिक बायोकेमिस्ट दुविधा को विशिष्ट संशोधनों के साथ इस तकनीक के भविष्य के अनुप्रयोगों में संबोधित किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, कार्यात्मक फ्लोरोसेंटली लेबल युग्मन प्रोटीन जोड़ना इस विधि को एकल-फिलामेंट अध्ययन से एकल-अणु अध्ययन तक फैलाता है। परख को सेल अर्क का उपयोग करने के लिए और संशोधित किया जा सकता है जो सेल जैसी घटनाओं को दोहराने के लिए आवश्यक “लापता” अज्ञात कुंजी कारकों को जोड़ सकता है। उदाहरण के लिए, खमीर या ज़ेनोपस अर्क को नियोजित करने वाले टीआईआरएफ-आधारित परखों ने सिकुड़ा हुआ एक्टोमायोसिन के छल्ले37, माइटोटिक स्पिंडल 26,38, एक्टिन या सूक्ष्मनलिका असेंबलीके घटकों 39,40, और यहां तक कि सेंट्रोसोम और कीनेटोकोर्स 36,41,42,43 पर गतिशीलता का पुनर्गठन किया है . इसके अलावा, ऐसी प्रणालियां कृत्रिम सेल प्रणालियों की ओर मार्ग प्रशस्त कर सकती हैं जिनमें लिपिड या सिग्नलिंग कारक44,45,46 मौजूद हैं।
The authors have nothing to disclose.
मैं इस प्रोटोकॉल पर उपयोगी टिप्पणियों के लिए मार्क रिडिला (मरम्मत बायोटेक्नोलॉजीज) और ब्रायन हारर (सनी अपस्टेट) का आभारी हूं। इस काम को नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ हेल्थ (जीएम 133485) द्वारा समर्थित किया गया था।
1% BSA (w/v) | Fisher Scientific | BP1600-100 | For this purpose (blocking TIRF chambers), BSA is resuspended in ddH20 and filtered through a 0.22 µm filter. |
1× BRB80 | Homemade | 80 mM PIPES, 1 mM MgCl2, 1 mM EGTA, pH 6.8 with KOH | |
10 mg/mL (1000 U) glucose oxidase | Sigma Aldrich Inc, St. Louis, MO | G2133-50KU | Combined with catalase, aliquot and store at -80 oC until use |
100 µM tubulin | Cytoskeleton Inc, Denver, CO | T240 | Homemade tubulins should be recycled before use to remove polymerization-incompetent tubulin (Hyman et al. (1992)29; Li and Moore (2020)30). Commercially available tubulins are often too dilute to recycle, but function well if resuspended according to manufacturer’s instructions and pre-cleared via ultracentrifugation (278,000 × g) for 60 min, before use. |
100 mM ATP | Gold Biotechnology Inc, Olivette, MO | A-081 | Resuspended in ddH20 (pH 7.5) and filter sterilized. |
100 mM GTP | Fisher Scientific | AC226250010 | Resuspended in 1× BRB80 (pH 6.8) and filter sterilized. |
120-150 mW solid-state lasers | Leica Microsystems | 11889151; 11889148 | |
2 mg/mL catalase | Sigma Aldrich Inc, St. Louis, MO | C40-100 | Combined with glucose oxidase, aliquot and store at -80 oC until use |
2× TIRF buffer | Homemade | 2× BRB80, 100 mM KCl, 20 mM DTT, 80 mM glucose, 0.5% (v/v) methylcellulose (4,000 cp); Note: 1 µL of 0.1M GTP and 1 µL of 0.1M ATP added separately to TIRF reactions to avoid repeated freeze-thaw cycles. | |
24 × 60 mm, #1.5 coverglass | Fisher Scientific, Waltham, MA | 22-266882 | Coverglass must be extensively washed before use (Smith et al. (2014)22) |
37 oC heatblock | |||
37 oC water bath | |||
5 mg/mL Streptavidin (600x stock) | Avantor, Philadelphia, PA | RLS000-01 | Resuspended in Tris-HCl (pH 8.8); dilute the aliquot to 1× in HEK buffer on day of use |
5 min Epoxy resin and hardener | Loctite, Rocky Hill, CT | 1365736 | Combined resin and hardener may take up to 30 min to cure. |
50% biotinylated-GpCpp microtubule seeds | Cytoskeleton Inc; Homemade | T333P | (optional) GppCpp or Taxol stabilized microtubule seeds can more efficiently mediate microtubule polymerization. Taxol and GppCpp stabilize microtubules in different ways that can affect the microtubule lattice structure and ability of certain regulatory proteins to bind to the stabilized portion of the microtubule. A method to make diverse kinds of microtubule seeds is outlined in Hyman et al. (1992). |
70 oC incubator | |||
Actin mix stock | Homemade; this protocol | A 12.5 µM actin mix comprised of labeled (fluorescent and biotinylated) and unlabeled actin for up to six reactions. 2 µL of stock is used in the final TIRF reaction. The final concentration of actin used in each reaction is 0.5 µM (10% Alexa-647; 0.09% biotin-labeled). | |
Appropriate buffer controls | Homemade | Combination of buffers from all proteins being assessed | |
Biotin-PEG-silane (MW 3,400) | Laysan Bio Inc | biotin-PEG-SIL-3400 | Dispensed into 2-5 mg aliquots, backfilled with nitrogen, parafilmed closed, and stored at -20 oC with desiccant until use |
Biotinylated actin | Cytoskeleton Inc; Homemade | AB07 | Biotin-actin is made by labeling on lysine residues and thus assumed to be at least 100% labeled, but varies with different lots/preparations. Optimal biotinylated actin concentrations must be empirically determined for particular uses/experimental designs. Higher concentrations permit more efficient tracking, but may impede polymerization or interactions with regulatory proteins. Here a small percentage (0.09% or 900 pM) biotinylated actin is present in the final TIRF reaction. |
Dishsoap | Dawn, Procter and Gamble, Cincinnati, OH | For unknown reasons, the blue version cleans coverslips more efficiently than other available colors. | |
Dry ice | |||
FIJI Software | www.https://imagej.net/software/fiji/downloads | Schneider et al. (2012)31. | |
Fluorescently labeled actin | Cytoskeleton Inc; Homemade | AR05 | Homemade fluorescently labeled actin is stored in G-buffer supplemented with 50% glycerol at -20 oC (Spudich et al. (1971)47; Liu et al. (2022)48). Fluorescently labeled actin is dialyzed against G-buffer and precleared via ultracentrifugation for 60 min at 278,000 × g before use. |
Fluorescently labeled tubulin | Cytoskeleton Inc | TL488M, TLA590M, TL670M | Resuspended in 20 µL 1× BRB80 (10 µM final concentration) and pre-cleared via ultracentrifugation (278,000 × g) for 60 min, before use. |
G-buffer | Homemade | 3 mM Tris-HCl (pH 8.0), 0.2 mM CaCl2, 0.5 mM DTT, 0.2 mM ATP | |
HEK Buffer | Homemade | 20 mM HEPES (pH 7.5), 1 mM EDTA (pH 8.0), 50 mM KCl | |
Ice | |||
Ice bucket | |||
Imaging chambers | IBIDI, Fitchburg, WI | 80666 | Order chambers with no bottom to utilize different coverslip coatings |
iXon Life 897 EMCCD camera | Andor, Belfast, Northern Ireland | 8114137 | |
LASX Premium microscope software | Leica Microsystems | 11640611 | |
Methylcellulose (4,000 cp) | Sigma Aldrich Inc | M0512 | |
Microscope base equipped with TIRF module | Leica Microsystems, Wetzlar, Germany | 11889146 | |
mPEG-silane (MW 2,000) | Laysan Bio Inc, Arab, AL | mPEG-SIL-2000 | Dispensed into 10-15 mg aliquots, backfilled with nitrogen, parafilmed closed, and stored at -20 oC with desiccant until use |
Objective heater and heated stage insert | OKO labs, Pozzioli, Italy | 8113569 | Set temperature controls to 35-37 oC. Use manufacturer suggestions for accurate calibration. |
Perfusion pump | Harvard Apparatus, Holliston, MA | 704504 | A syringe and tubing can be substituted. |
Petri Dish, 100 x 15 mm | Genesee Scientific, San Diego, CA | 32-107 | |
Plastic slide mailer container | Fisher Scientific | HS15986 | |
SA-S-1L-SecureSeal 0.12 mm thick | Grace Biolabs, Bend, OR | 620001 | Double-sided tape of precise manufactured dimensions is strongly recommended. |
Small styrofoam container | Abcam, Cambridge, UK | Reused from shipping | |
Small weigh boat | Fisher Scientific | 02-202-100 | |
Spectrophotometer | |||
Tau | Cytoskeleton Inc | TA01 | Three isoforms of Tau are present in the commercially available preparation of Tau. The concentration in this protocol was determined from the highest molecular weight band (14.3 µM, when resuspended per manufacturer’s recommendations with 50 µL of ddH20). |
Temperature corrected 63× Plan Apo 1.47 N.A. oil immersion TIRF objective | Leica Microsystems | 11506319 | |
Tubulin stock | Homemade; this protocol | A tubulin stock consisting of 7.2 µL recycled 100 µM unlabeled tubulin and 3 µL of 10 µM resuspended commercially available fluorescently labeled tubulin. One tubulin stock is used per reaction and thawed/stored on ice. The final concentration of free tubulin in each reaction is 15 µM (4% labeled). More than 15 µM tubulin will result in hyperstabilized (not dynamic) microtubules, whereas concentrations below 7.5 µM free tubulin do not polymerize well. Careful determination of protein concentration and handling is required. | |
Unlabeled actin (dark) | Cytoskeleton Inc; Homemade | AKL99 | Actin nucleates are almost always present in commercially available (lyophilized) or frozen actins and contribute to variability in quantitative measurements (Spudich et al. (1971)47; Liu et al. (2022)48). Rabbit muscle actin is stored in G-buffer at -80 oC and precleared via ultracentrifugation for 60 min at 278,000 × g before use. Several actin stock solutions are made throughout the day (making no more than enough for six reactions at a time is strongly recommended). |