Tumor sfæroider bliver i stigende grad brugt til at vurdere tumorcelle-mikromiljøinteraktioner og terapirespons. Den nuværende protokol beskriver en robust, men enkel metode til semi-high-throughput billeddannelse af 3D tumor sfæroider ved hjælp af hurtig optisk clearing.
Tumor sfæroider er hurtigt ved at blive almindelige i grundlæggende kræftforskning og lægemiddeludvikling. At opnå data vedrørende proteinekspression inden for sfæroidet på celleniveau er vigtigt for analyse, men eksisterende teknikker er ofte dyre, besværlige, bruger ikke-standardudstyr, forårsager betydelig størrelsesforvrængning eller er begrænset til relativt små sfæroider. Denne protokol præsenterer en ny metode til montering og rydning af sfæroider, der løser disse problemer, samtidig med at den giver mulighed for konfokal analyse af den indre struktur af sfæroider. I modsætning til eksisterende tilgange giver denne protokol mulighed for hurtig montering og rydning af et stort antal sfæroider ved hjælp af standardudstyr og laboratorieforsyninger. Montering af sfæroider i en pH-neutral agarose-PBS-gelopløsning, før der indføres en brydningsindeksmatchet rydningsløsning, minimerer størrelsesforvrængning, der er fælles for andre lignende teknikker. Dette giver mulighed for detaljeret kvantitativ og statistisk analyse, hvor nøjagtigheden af størrelsesmålinger er altafgørende. Sammenlignet med væskerensningsløsninger holder agarosegelteknikken desuden sfæroider fastgjort på plads, hvilket muliggør indsamling af tredimensionelle (3D) konfokale billeder. Denne artikel uddyber, hvordan metoden giver to- og 3D-billeder af høj kvalitet, der giver information om variabilitet mellem celler og indre sfæroidstruktur.
Tredimensionelle (3D) cellekulturer, såsom sfæroider, giver biologisk realistiske og reproducerbare modeller af aggregeret cellevækst 1,2. Disse modeller er hurtigt ved at blive almindelige i både grundforskning og lægemiddeludvikling, hvor forskelle i sfæroid størrelse og struktur undersøges mellem behandlingerne for at fastslå lægemiddeleffektivitet 3,4. I disse sammenhænge er evnen til at indsamle detaljerede oplysninger fra et stort antal sfæroider meget fordelagtig, både fra et statistisk magtperspektiv og for at muliggøre hurtig vurdering af celleadfærd på tværs af flere behandlinger.
Almindeligt anvendte teknikker til opnåelse af detaljerede mikroskopibilleder af sfæroid struktur er enten tidskrævende, dyre eller producerer billeder af dårlig kvalitet, der ikke bevarer vigtige kvantitative funktioner såsom sfæroidstørrelse 4,5. For eksempel kan histologiske teknikker baseret på kryosektion give billeder af høj kvalitet, men er ofte tidskrævende, kræver faglært arbejdskraft og skaber ofte sektioneringsgenstande 6,7, mens elegante teknologier, såsom enkeltplanbelysningsmikroskopi (SPIM)8 og multifotonmikroskopi9 kræver specialiserede mikroskoper, der ikke er let tilgængelige. Moderne mikroskopiteknologier har for nylig muliggjort den såkaldte optiske sektionering, hvor sfæroider placeres i en brydningsindeksmatchet clearingopløsning, og billeder opnås ved hjælp af konfokal mikroskopi 4,5. Mens disse teknikker har potentialet til at producere et højt udbytte, omfatter almindelige problemer sfæroid bevægelse under billeddannelse, størrelsesforvrængning under rydning og den høje udgift til proprietære clearingløsninger. Desuden gælder mange eksisterende protokoller kun for relativt små sfæroider på mindre end 300 μm i diameter eller dybde op til 100 μm, hvilket begrænser teknologien til de tidlige stadier af tumorvækst 5,10,11.
Den nuværende protokol tillader semi-high-throughput, high-yield indsamling af detaljerede sfæroidbilleder ved hjælp af en billig brydningsindeks-matchet clearingløsning afledt af hele organ clearing procedurer12,13. For at forhindre sfæroid bevægelse under billeddannelse og give strukturel støtte for at reducere størrelsesforvrængning, er sfæroiderne monteret i agarose-PBS gel i en 24-brønd # 1.5 glasbundplade. Da denne teknik gør det muligt at montere flere sfæroider i hver brønd i en 24-brøndplade, kan op til 360 sfæroider (15 sfæroider / brønd) hurtigt monteres og afbildes på tværs af forskellige eksperimentelle forhold. En brydningsindeks-matchet rydningsløsning konstrueret af let tilgængelige forbrugsstoffer bruges til at rydde monterede sfæroider og den omgivende gel optisk. Efter en bundfældningsperiode på 24 timer giver denne protokol højkvalitets 2D- og 3D-billeder af sfæroidstruktur, selv for relativt store sfæroider (ca. 700 μm i diameter) med mindre end 2% størrelsesforvrængning.
En protokol til opnåelse af to- og tredimensionelle billeder af tumorfæroider af høj kvalitet præsenteres her. Eksisterende metoder, såsom CLARITY, See deep brain (SeeDB) og ScaleS, forårsager ofte størrelsesforvrængning med op til 30%, mens teknikker som Benzylalkohol / Benzylbenzoat (BABB) og 3D-billeddannelse af opløsningsmiddel-rensede organer (3DISCO) kan slukke fluorescerende protein18. Mange af disse metoder er designet til at rydde væv med strukturel integritet og forvrænge størrelsen og strukturen, når de påføres sfæroider18. I modsætning til andre protokoller, der bruger kommercielt tilgængelige dyre clearingløsninger, bruger denne protokol let tilgængelige forbrugsstoffer, samtidig med at optisk klarhed og endogen fluorescens opretholdes og minimerer størrelsesforvrængning. Indlejring af sfæroider i agarose-PBS gel giver strukturel støtte til sfæroider og minimerer osmotisk stød, når rydningsopløsningen tilsættes. Dette er afgørende ved billeddannelse af skrøbelige sfæroider efter lægemiddelbehandling. Det antages, at denne optiske clearingmetode er egnet til sfæroider dannet ved enhver metode, da denne protokol er tilpasset fra helvævsrensning. Antagelsen er baseret på ligheden i sfæroiderne opnået ved forskellige sfæroiddannelsesmetoder. Valget af fikseringsmiddel kan påvirke sfæroidstørrelsen såvel som endogen fluorescens. Denne clearingmetode er velegnet til sfæroider fastgjort med neutral 4% PFA-opløsning. Yderligere test er påkrævet for at kontrollere dens kompatibilitet med andre fikseringsmidler.
I betragtning af at denne teknik gør det muligt at montere flere sfæroider samtidigt i en multi-well plade, er den velegnet til kvantitative analyserørledninger, der kræver sfæroidstrukturinformation fra op til 360 sfæroider pr. 24-brøndplade. Mikroskoper med automatiserede trin- og pladekortlægningsfunktioner kan gøre billeddannelse mindre manuel. Selvom denne metode er hurtigere og lettere end sektionering, er den i øjeblikket uegnet til fuldstændig automatisering. Imidlertid er billeder opnået ved denne metode egnede til automatiseret billedbehandling 4,19, og den hastighed, hvormed sfæroider kan monteres ved hjælp af denne protokol, giver mulighed for kvantitativ analyse af sfæroid indre struktur 20,21,22.
Til farvning af hele sfæroider skal antistofkoncentrationen, volumenet og inkubationstiden optimeres for hvert antistof. Som vejledning skal du bruge 2,5x af den anbefalede 2D immunofluorescensantistofkoncentration og 100-200 μL antistof afhængigt af antallet af sfæroider pr. Rør. Sørg for, at alle sfæroider er dækket af farvningsopløsning, når de er på rotoren. Inkubationstiden afhænger af mange faktorer, herunder størrelsen og densiteten af sfæroider og antistoffet, og kan variere fra 16-72 timer. På trods af at metoden muliggør signaldetektion dybere inde i sfæroidet, forårsager fluorophorer, der er ophidset af UV, betydelig lysspredning, hvilket fører til et lavt signal-støj-forhold. Der skal udvises forsigtighed, når du vælger fluorophorer til at visualisere målproteinet. For eksempel vil farvning af mindre rigelige og strukturelle proteiner med fluoroforer med længere bølgelængde og mere rigelige protein- eller nukleare pletter med fluoroforer med kortere bølgelængde opnå det bedste resultat. Endelig viser ryddede sfæroider stadig lystab på grund af spredning i den nekrotiske kerne, hvilket fremgår af y / z-dimensionen af billeder opnået af 600 μm sfæroider (figur 2C).
Højere forstørrelsesbilleddannelse med højere NA-mål er mulig med sfæroider monteret og ryddet ved hjælp af denne protokol, men målets arbejdsafstand begrænser billeddybden. For en olie nedsænkning linse er det vigtigt at bruge olie, der har en RI på 1,51 for det bedste resultat.
For at opsummere giver agarose-PBS gel indlejret clearing metode mulighed for visualisering af celler dybt inde i sfæroider ved hjælp af almindeligt tilgængelige forbrugsstoffer. Sfæroider monteret og ryddet ved hjælp af denne metode gennemgår minimal størrelsesforvrængning og opretholder deres strukturelle integritet, hvilket muliggør indsamling af data af høj kvalitet vedrørende den indre sfæroidstruktur og efterfølgende automatiseret kvantificering.
The authors have nothing to disclose.
Denne forskning blev udført på Translational Research Institute (TRI), Woolloongabba, QLD. TRI er støttet af et tilskud fra den australske regering. Vi takker prof. Atsushi Miyawaki, RIKEN, Wako-city, Japan, for at levere FUCCI-konstruktionerne, prof. Meenhard Herlyn og fru Patricia Brafford, The Wistar Institute, Philadelphia, PA, for at levere cellelinjerne. Vi takker Dr. Loredana Spoerri for at levere C8161 kryosektionsbilleder.
Dette arbejde blev støttet af projektbevillinger til N.K.H.: Australian Research Council (DP200100177) og Meehan Project Grant (021174 2017002565).
#1.5 glass bottom 24-well plate | Celvis | P24-1.5H-N | |
500 µL clear PCR tubes | Sigma | HS4422 | |
Alexa Fluor 647 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson Immuno research | 715-605-151 | Dilution used 1:500 |
Bovine serum albumin | Sigma | A7906 | Final concentration 2% w/v |
DAPI | Sigma | D9542-10MG | Final concentration 5 µg/mL |
Deionized water | MILLI Q | ||
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 | Thermofisher | A-31573 | Dilution used 1:500 |
DRAQ7 | Thermofisher | D15106 | Dilution used 1:250 |
Heating block | Ratek | DBH10 | or similar equipment |
Hypoxyprobe Kits | Hypoxyprobe | HP1-1000Kit | Antibody dilution used 1:500 |
Low-melting agarose powder | Sigma | A9414 | Final concentration 2% w/v |
Microwave | Sharp | ||
N,N,N′,N′-Tetrakis(2-Hydroxypropyl)ethylenediamine | Sigma | 122262 | Final concentration 9% w/w |
NaCl | Sigma | S9888 | Final concentration 150 mM |
NaN3 | Sigma | S2002 | Final concentration 0.10% w/v |
p27 Kip1 (D69C12) XP | Cell Signalling technology | 3686S | Dilution used 1:500 |
Paraformaldehyde solution | Proscitech | C004 | Final concentration 4% w/v |
Phosphate Buffered Saline (PBS) | Thermofisher | 18912014 | Final concentration 1x |
Pipette | Eppendorf | ||
Quickspin minifuge | or similar equipment | ||
Roller | Ratek | BTR10-12V | or similar equipment |
Rotor | Ratek | RSM7DC | or similar equipment |
Shaker | Ratek | EOM5 | or similar equipment |
Sucrose | Sigma | S9378 | Final concentration 44% w/w |
Tris-HCl pH 7.4 | Sigma | T5941 | Final concentration 20 mM |
Triton X-100 | Sigma | X100 | Final concentration 0.10% v/v |
Triton X-100 | Sigma | X100 | Final concentration 0.1% v/v |
Tween 20 | Sigma | P1379 | Final concentration 0.1% v/v |
Urea | Sigma | U5379 | Final concentration 22% w/w |