Os esferoides tumorais estão se tornando cada vez mais utilizados para avaliar as interações de microambientes de células tumorais e a resposta terapêutica. O presente protocolo descreve um método robusto, mas simples, para imagens semi-de alta produtividade de esferoides tumorais 3D usando limpeza óptica rápida.
Os esferoides tumorais estão rapidamente se tornando comuns na pesquisa básica do câncer e no desenvolvimento de medicamentos. A obtenção de dados sobre a expressão proteica dentro do esferoide no nível celular é importante para análise, mas as técnicas existentes são muitas vezes caras, trabalhosas, usam equipamentos fora do padrão, causam distorção significativa do tamanho ou são limitadas a esferoides relativamente pequenos. Este protocolo apresenta um novo método de montagem e limpeza de esferoides que abordam essas questões, permitindo a análise confocal da estrutura interna dos esferoides. Em contraste com as abordagens existentes, este protocolo prevê a rápida montagem e limpeza de um grande número de esferoides usando equipamentos padrão e suprimentos de laboratório. A montagem de spheroids em uma solução de gel agarose-PBS neutra em pH antes de introduzir uma solução de compensação compatível com índices refrativos minimiza a distorção de tamanho comum a outras técnicas semelhantes. Isso permite uma análise quantitativa e estatística detalhada onde a precisão das medidas de tamanho é primordial. Além disso, em comparação com as soluções de compensação líquida, a técnica de gel de agarose mantém os esferoides fixos no lugar, permitindo a coleta de imagens tridimensionais (3D) confocal. O presente artigo elabora como o método produz imagens de alta qualidade de duas e 3D que fornecem informações sobre variabilidade intercelular e estrutura esferoide interna.
Culturas celulares tridimensionais (3D), como esferoides, fornecem modelos biologicamente realistas e reprodutíveis de crescimento celular agregado 1,2. Esses modelos estão se tornando rapidamente comuns tanto na pesquisa básica quanto no desenvolvimento de medicamentos, onde diferenças no tamanho e estrutura esferoides são examinadas entre os tratamentos para verificar a eficácia da droga 3,4. Nesses contextos, a capacidade de coletar informações detalhadas de um grande número de esferoides é altamente vantajosa, tanto do ponto de vista estatístico de poder quanto de permitir uma rápida avaliação do comportamento celular em vários tratamentos.
Técnicas comumente utilizadas para a obtenção de imagens detalhadas de microscopia da estrutura esferoide são demoradas, caras ou produzem imagens de má qualidade que não retêm características quantitativas importantes, como o tamanho esferoide 4,5. Por exemplo, técnicas histológicas baseadas em criosectioning podem fornecer imagens de alta qualidade, mas muitas vezes são demoradas, exigem mão-de-obra qualificada e muitas vezes criam artefatos de secção 6,7, enquanto tecnologias elegantes, como microscopia de iluminação de plano único (SPIM)8 e microscopia multifotol9 requerem microscópios especializados que não estão prontamente disponíveis. As modernas tecnologias de microscopia permitiram recentemente a chamada seção óptica, onde os esferoides são colocados dentro de uma solução de compensação compatível com índice refrativo e as imagens são obtidas usando microscopia confocal 4,5. Embora essas técnicas tenham o potencial de produzir um alto rendimento, problemas comuns incluem o movimento esferoide enquanto a imagem, a distorção de tamanho durante a compensação e o alto gasto de soluções proprietárias de compensação. Além disso, muitos protocolos existentes aplicam-se apenas a esferoides relativamente pequenos de menos de 300 μm de diâmetro ou profundidade até 100 μm, limitando a tecnologia aos estágios iniciais do crescimento do tumor 5,10,11.
O presente protocolo permite uma coleta semi-alta e de alto rendimento de imagens esferoides detalhadas usando uma solução de compensação compatível com o índice de refração de baixo custo derivada de procedimentos completos de compensação de órgãos12,13. Para evitar o movimento esferoide durante a imagem e fornecer suporte estrutural para reduzir a distorção de tamanho, os esferoides são montados em gel agarose-PBS em uma placa inferior de vidro de 24 poços #1.5. Uma vez que esta técnica permite que vários esferoides sejam montados em cada poço em uma placa de 24 poços, até 360 esferoides (15 esferoides/bem) podem ser rapidamente montados e imagens em várias condições experimentais. Uma solução de compensação refrativa combinada com o índice construído a partir de consumíveis prontamente disponíveis é usada para limpar esferoides montados e o gel circundante de forma óptica. Após um período de assentamento de 24 horas, este protocolo fornece imagens 2D e 3D de alta qualidade da estrutura esferoide, mesmo para esferoides relativamente grandes (aproximadamente 700 μm de diâmetro), com menos de 2% de distorção de tamanho.
Um protocolo para a obtenção de imagens bi e tridimensionais de alta qualidade de esferoides tumorais é apresentado aqui. Métodos existentes, como CLARITY, See deep brain (SeeDB) e ScaleS, muitas vezes causam distorção de tamanho em até 30%, enquanto técnicas como Benzyl Alcohol/ Benzyl Benzoate (BABB) e imagem 3D de órgãos desmatados por solventes (3DISCO) podem saciar a proteína fluorescente18. Muitos desses métodos são projetados para limpar tecidos com integridade estrutural e distorcer o tamanho e a estrutura quando aplicados aos esferoides18. Em contraste com outros protocolos que utilizam soluções de compensação caras disponíveis comercialmente, este protocolo utiliza consumíveis prontamente disponíveis, mantendo a clareza óptica e fluorescência endógena e minimizando a distorção do tamanho. A incorporação de esferoides em gel agarose-PBS fornece suporte estrutural para esferoides e minimiza o choque osmótico quando a solução de compensação é adicionada. Isso é crucial quando a imagem de esferoides frágeis pós-tratamento medicamentoso. Supõe-se que este método de compensação óptica é adequado para esferoides formados por qualquer método, uma vez que este protocolo é adaptado de toda a limpeza tecidual. A suposição baseia-se na similaridade nos esferoides obtidos por diferentes métodos de formação esferoide. A escolha da fixação pode afetar o tamanho esferoide, bem como fluorescência endógena. Este método de compensação é adequado para esferoides fixos com solução PFA neutra de 4%. Outros testes são necessários para verificar sua compatibilidade com outros fixativos.
Dado que esta técnica permite que vários esferoides sejam montados simultaneamente em uma placa multi-poço, é bem adequado para dutos de análise quantitativa que requerem informações de estrutura esferoide de até 360 esferoides por placa de 24 poços. Microscópios com funções automatizadas de mapeamento de etapas e placas podem tornar a imagem menos manual. Embora este método seja mais rápido e fácil do que a secção, ele é atualmente inadequado para automação completa. No entanto, as imagens obtidas por este método são adequadas para o processamento automatizado de imagens 4,19, e a taxa na qual os esferoides podem ser montados usando este protocolo empresta à análise quantitativa da estrutura interna esferoide 20,21,22.
Para colorar esferoides inteiros, a concentração de anticorpos, volume e tempo de incubação precisam ser otimizados para cada anticorpo. Como guia, use 2,5x da concentração recomendada de anticorpos de imunofluorescência 2D e 100-200 μL de anticorpos, dependendo do número de esferoides por tubo. Certifique-se de que todos os esferoides estão cobertos pela solução de coloração quando estiverem no rotor. O tempo de incubação depende de muitos fatores, incluindo o tamanho e a densidade dos esferoides e do anticorpo, podendo variar de 16 a 72 h. Apesar do método que permite a detecção de sinal mais profunda dentro do esferoide, fluoroforos animados por UV causam dispersão significativa de luz, levando a uma baixa relação sinal-ruído. Deve-se tomar cuidado ao escolher fluoroforos para visualizar a proteína alvo. Por exemplo, manchas de proteínas menos abundantes e estruturais com lanças de comprimento de onda mais longas e proteínas ou manchas nucleares mais abundantes com lançadores de comprimento de onda mais curtos alcançarão o melhor resultado. Finalmente, os esferoides limpos ainda apresentam perda de luz devido à dispersão no núcleo necrosado, evidente na dimensão y/z das imagens obtidas de 600 μm spheroids (Figura 2C).
Imagens de ampliação mais altas com objetivos de NA mais elevados são possíveis com esferoides montados e limpos usando este protocolo, mas a distância de trabalho do objetivo limita a profundidade de imagem. Para uma lente de imersão em óleo, é importante usar óleo que tenha uma RI de 1,51 para obter o melhor resultado.
Resumindo, o método de compensação incorporado em gel agarose-PBS permite a visualização de células no interior dos esferoides usando consumíveis comumente disponíveis. Os esferoides montados e limpos usando este método sofrem distorção de tamanho mínimo e mantêm sua integridade estrutural, permitindo a coleta de dados de alta qualidade relacionados à estrutura esferoide interna e posterior quantificação automatizada.
The authors have nothing to disclose.
Esta pesquisa foi realizada no Instituto de Pesquisa Translacional (TRI), Woolloongabba, QLD. A TRI é apoiada por uma subvenção do Governo australiano. Agradecemos aos funcionários da instalação do núcleo de microscopia da TRI por seu excelente apoio técnico. Agradecemos ao Prof. Atsushi Miyawaki, RIKEN, Wako-city, Japão, por fornecer as construções da FUCCI, Prof. Meenhard Herlyn e Patricia Brafford, The Wistar Institute, Filadélfia, PA, por fornecer as linhas celulares. Agradecemos à Dra Loredana Spoerri por fornecer imagens de crioseção C8161.
Este trabalho foi apoiado por subsídios de projeto para n.K.H.: Australian Research Council (DP200100177) e Meehan Project Grant (021174 2017002565).
#1.5 glass bottom 24-well plate | Celvis | P24-1.5H-N | |
500 µL clear PCR tubes | Sigma | HS4422 | |
Alexa Fluor 647 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson Immuno research | 715-605-151 | Dilution used 1:500 |
Bovine serum albumin | Sigma | A7906 | Final concentration 2% w/v |
DAPI | Sigma | D9542-10MG | Final concentration 5 µg/mL |
Deionized water | MILLI Q | ||
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 | Thermofisher | A-31573 | Dilution used 1:500 |
DRAQ7 | Thermofisher | D15106 | Dilution used 1:250 |
Heating block | Ratek | DBH10 | or similar equipment |
Hypoxyprobe Kits | Hypoxyprobe | HP1-1000Kit | Antibody dilution used 1:500 |
Low-melting agarose powder | Sigma | A9414 | Final concentration 2% w/v |
Microwave | Sharp | ||
N,N,N′,N′-Tetrakis(2-Hydroxypropyl)ethylenediamine | Sigma | 122262 | Final concentration 9% w/w |
NaCl | Sigma | S9888 | Final concentration 150 mM |
NaN3 | Sigma | S2002 | Final concentration 0.10% w/v |
p27 Kip1 (D69C12) XP | Cell Signalling technology | 3686S | Dilution used 1:500 |
Paraformaldehyde solution | Proscitech | C004 | Final concentration 4% w/v |
Phosphate Buffered Saline (PBS) | Thermofisher | 18912014 | Final concentration 1x |
Pipette | Eppendorf | ||
Quickspin minifuge | or similar equipment | ||
Roller | Ratek | BTR10-12V | or similar equipment |
Rotor | Ratek | RSM7DC | or similar equipment |
Shaker | Ratek | EOM5 | or similar equipment |
Sucrose | Sigma | S9378 | Final concentration 44% w/w |
Tris-HCl pH 7.4 | Sigma | T5941 | Final concentration 20 mM |
Triton X-100 | Sigma | X100 | Final concentration 0.10% v/v |
Triton X-100 | Sigma | X100 | Final concentration 0.1% v/v |
Tween 20 | Sigma | P1379 | Final concentration 0.1% v/v |
Urea | Sigma | U5379 | Final concentration 22% w/w |