Tumörsfäroider används alltmer för att bedöma tumörcell-mikromiljöinteraktioner och terapisvar. Det nuvarande protokollet beskriver en robust men enkel metod för semi-high-throughput avbildning av 3D-tumörsfäroider med hjälp av snabb optisk clearing.
Tumörsfäroider blir snabbt vanliga inom grundläggande cancerforskning och läkemedelsutveckling. Att få data om proteinuttryck i sfäroiden på cellulär nivå är viktigt för analys, men befintliga tekniker är ofta dyra, mödosamma, använder icke-standardutrustning, orsakar betydande storleksförvrängning eller är begränsade till relativt små sfäroider. Detta protokoll presenterar en ny metod för montering och rensning av sfäroider som tar itu med dessa problem samtidigt som det möjliggör konfokal analys av sfäroidernas inre struktur. I motsats till befintliga tillvägagångssätt möjliggör detta protokoll snabb montering och rensning av ett stort antal sfäroider med hjälp av standardutrustning och laboratorieutrustning. Montering av sfäroider i en pH-neutral agaros-PBS-gellösning innan en brytningsindexmatchad clearinglösning införs minimerar storleksförvrängning som är gemensam för andra liknande tekniker. Detta möjliggör detaljerad kvantitativ och statistisk analys där noggrannheten i storleksmätningar är av största vikt. Dessutom, jämfört med flytande clearinglösningar, håller agarosgeltekniken sfäroider fixerade på plats, vilket möjliggör insamling av tredimensionella (3D) konfokala bilder. Den här artikeln utvecklar hur metoden ger högkvalitativa två- och 3D-bilder som ger information om intercellvariabilitet och inre sfäroidstruktur.
Tredimensionella (3D) cellkulturer, såsom sfäroider, ger biologiskt realistiska och reproducerbara modeller av aggregerad celltillväxt 1,2. Dessa modeller blir snabbt vanliga inom både grundforskning och läkemedelsutveckling, där skillnader i sfäroidstorlek och struktur undersöks mellan behandlingar för att fastställa läkemedelseffekt 3,4. I dessa sammanhang är förmågan att samla in detaljerad information från ett stort antal sfäroider mycket fördelaktig, både ur ett statistiskt maktperspektiv och för att möjliggöra snabb bedömning av cellbeteende över flera behandlingar.
Vanliga tekniker för att få detaljerade mikroskopibilder av sfäroidstruktur är antingen tidskrävande, dyra eller producerar bilder av dålig kvalitet som inte behåller viktiga kvantitativa funktioner som sfäroidstorlek 4,5. Till exempel kan histologiska tekniker baserade på kryosektion ge högkvalitativa bilder men är ofta tidskrävande, kräver skickligt arbete och skapar ofta sektioneringsartiklar 6,7, medan eleganta tekniker, såsom enkelplansbelysningsmikroskopi (SPIM)8 och multifotonmikroskopi9 kräver specialiserade mikroskop som inte är lättillgängliga. Modern mikroskopiteknik har nyligen möjliggjort den så kallade optiska sektionering, där sfäroider placeras i en brytningsindexmatchad clearinglösning och bilder erhålls med hjälp av konfokalmikroskopi 4,5. Även om dessa tekniker har potential att ge ett högt utbyte, inkluderar vanliga problem sfäroidrörelse under avbildning, storleksförvrängning under röjning och den höga kostnaden för proprietära clearinglösningar. Dessutom gäller många befintliga protokoll endast för relativt små sfäroider med mindre än 300 μm i diameter eller djup upp till 100 μm, vilket begränsar tekniken till de tidiga stadierna av tumörtillväxt 5,10,11.
Det nuvarande protokollet möjliggör semi-high-throughput, high-yield insamling av detaljerade sfäroidbilder med hjälp av en billig brytningsindexmatchad clearinglösning härledd från hela organrensningsförfaranden12,13. För att förhindra sfäroidrörelse under avbildning och ge strukturellt stöd för att minska storleksförvrängning, är sfäroiderna monterade i agaros-PBS-gel i en 24-brunns # 1.5 glasbottenplatta. Eftersom denna teknik gör det möjligt att montera flera sfäroider i varje brunn i en 24-brunnsplatta, kan upp till 360 sfäroider (15 sfäroider / brunn) snabbt monteras och avbildas under olika experimentella förhållanden. En brytningsindexmatchad röjningslösning konstruerad av lättillgängliga förbrukningsvaror används för att rensa monterade sfäroider och den omgivande gelén optiskt. Efter en sedimenteringsperiod på 24 timmar ger detta protokoll högkvalitativa 2D- och 3D-bilder av sfäroidstruktur, även för relativt stora sfäroider (cirka 700 μm i diameter), med mindre än 2% storleksförvrängning.
Ett protokoll för att erhålla högkvalitativa två- och tredimensionella bilder av tumörsfäroider presenteras här. Befintliga metoder, såsom CLARITY, See deep brain (SeeDB) och ScaleS, orsakar ofta storleksförvrängning med upp till 30%, medan tekniker som bensylalkohol / bensylbensoat (BABB) och 3D-avbildning av lösningsmedelsklarerade organ (3DISCO) kan släcka fluorescerande protein18. Många av dessa metoder är utformade för att rensa vävnad med strukturell integritet och förvränga storleken och strukturen när de appliceras på sfäroider18. Till skillnad från andra protokoll som använder kommersiellt tillgängliga dyra clearinglösningar, använder detta protokoll lättillgängliga förbrukningsvaror samtidigt som optisk klarhet och endogen fluorescens bibehålls och storleksförvrängning minimeras. Inbäddning av sfäroider i agaros-PBS-gel ger strukturellt stöd för sfäroider och minimerar osmotisk chock när röjningslösningen tillsätts. Detta är avgörande vid avbildning av ömtåliga sfäroider efter läkemedelsbehandling. Det antas att denna optiska clearingmetod är lämplig för sfäroider som bildas av vilken metod som helst eftersom detta protokoll är anpassat från helvävnadsrensning. Antagandet är baserat på likheten i sfäroiderna erhållna genom olika sfäroidbildningsmetoder. Valet av fixeringsmedel kan påverka sfäroidstorleken såväl som endogen fluorescens. Denna clearingmetod är lämplig för sfäroider fixerade med neutral 4% PFA-lösning. Ytterligare testning krävs för att kontrollera dess kompatibilitet med andra fixeringsmedel.
Med tanke på att denna teknik gör att flera sfäroider kan monteras samtidigt i en flerbrunnsplatta, är den väl lämpad för kvantitativa analysrörledningar som kräver sfäroidstrukturinformation från upp till 360 sfäroider per 24-brunnsplatta. Mikroskop med automatiserade scen- och plattkartläggningsfunktioner kan göra avbildning mindre manuell. Även om den här metoden är snabbare och enklare än sektionering, är den för närvarande olämplig för fullständig automatisering. Bilder som erhålls med denna metod är emellertid lämpliga för automatiserad bildbehandling 4,19, och den hastighet med vilken sfäroider kan monteras med detta protokoll ger kvantitativ analys av sfäroid inre struktur 20,21,22.
För färgning av hela sfäroider måste antikroppskoncentrationen, volymen och inkubationstiden optimeras för varje antikropp. Som vägledning, använd 2,5x av den rekommenderade 2D-immunofluorescensantikroppskoncentrationen och 100-200 μl antikropp, beroende på antalet sfäroider per rör. Se till att alla sfäroider är täckta med färgningslösning när de är på rotorn. Inkubationstiden beror på många faktorer, inklusive storleken och densiteten hos sfäroider och antikroppen, och kan sträcka sig från 16-72 h. Trots att metoden möjliggör signaldetektering djupare inuti sfäroiden orsakar fluoroforer upphetsade av UV betydande ljusspridning, vilket leder till ett lågt signal-brusförhållande. Försiktighet måste vidtas när du väljer fluoroforer för att visualisera målproteinet. Till exempel kommer färgning av mindre rikliga och strukturella proteiner med fluoroforer med längre våglängd och rikligare protein- eller kärnfläckar med fluoroforer med kortare våglängd att uppnå det bästa resultatet. Slutligen visar rensade sfäroider fortfarande ljusförlust på grund av spridning i den nekrotiska kärnan, vilket framgår av y / z-dimensionen av bilder som erhållits av 600 μm sfäroider (figur 2C).
Högre förstoringsavbildning med högre NA-mål är möjlig med sfäroider monterade och rensade med detta protokoll, men målets arbetsavstånd begränsar bilddjupet. För en oljedämpande lins är det viktigt att använda olja som har en RI på 1,51 för bästa resultat.
Sammanfattningsvis möjliggör den agarose-PBS gel inbäddade rensningsmetoden visualisering av celler djupt inuti sfäroider med hjälp av allmänt tillgängliga förbrukningsvaror. Sfäroider monterade och rensade med denna metod genomgår minimal storleksförvrängning och bibehåller sin strukturella integritet, vilket möjliggör insamling av högkvalitativa data relaterade till den inre sfäroidstrukturen och efterföljande automatiserad kvantifiering.
The authors have nothing to disclose.
Denna forskning utfördes vid Translational Research Institute (TRI), Woolloongabba, QLD. TRI stöds av ett bidrag från den australiska regeringen. Vi tackar prof. Atsushi Miyawaki, RIKEN, Wako-city, Japan, för att ha tillhandahållit FUCCI-konstruktionerna, prof. Meenhard Herlyn och Ms. Patricia Brafford, The Wistar Institute, Philadelphia, PA, för att ha tillhandahållit cellinjerna. Vi tackar Dr Loredana Spoerri för att ha tillhandahållit C8161 kryosektionsbilder.
Detta arbete stöddes av projektbidrag till N.K.H.: Australian Research Council (DP200100177) och Meehan Project Grant (021174 2017002565).
#1.5 glass bottom 24-well plate | Celvis | P24-1.5H-N | |
500 µL clear PCR tubes | Sigma | HS4422 | |
Alexa Fluor 647 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson Immuno research | 715-605-151 | Dilution used 1:500 |
Bovine serum albumin | Sigma | A7906 | Final concentration 2% w/v |
DAPI | Sigma | D9542-10MG | Final concentration 5 µg/mL |
Deionized water | MILLI Q | ||
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 | Thermofisher | A-31573 | Dilution used 1:500 |
DRAQ7 | Thermofisher | D15106 | Dilution used 1:250 |
Heating block | Ratek | DBH10 | or similar equipment |
Hypoxyprobe Kits | Hypoxyprobe | HP1-1000Kit | Antibody dilution used 1:500 |
Low-melting agarose powder | Sigma | A9414 | Final concentration 2% w/v |
Microwave | Sharp | ||
N,N,N′,N′-Tetrakis(2-Hydroxypropyl)ethylenediamine | Sigma | 122262 | Final concentration 9% w/w |
NaCl | Sigma | S9888 | Final concentration 150 mM |
NaN3 | Sigma | S2002 | Final concentration 0.10% w/v |
p27 Kip1 (D69C12) XP | Cell Signalling technology | 3686S | Dilution used 1:500 |
Paraformaldehyde solution | Proscitech | C004 | Final concentration 4% w/v |
Phosphate Buffered Saline (PBS) | Thermofisher | 18912014 | Final concentration 1x |
Pipette | Eppendorf | ||
Quickspin minifuge | or similar equipment | ||
Roller | Ratek | BTR10-12V | or similar equipment |
Rotor | Ratek | RSM7DC | or similar equipment |
Shaker | Ratek | EOM5 | or similar equipment |
Sucrose | Sigma | S9378 | Final concentration 44% w/w |
Tris-HCl pH 7.4 | Sigma | T5941 | Final concentration 20 mM |
Triton X-100 | Sigma | X100 | Final concentration 0.10% v/v |
Triton X-100 | Sigma | X100 | Final concentration 0.1% v/v |
Tween 20 | Sigma | P1379 | Final concentration 0.1% v/v |
Urea | Sigma | U5379 | Final concentration 22% w/w |