Her beskriver vi en protokoll som kombinerer adenoassosiert virusinjeksjon med kranialvinduimplantasjon for samtidig avbildning av mikrogliadynamikk og nevronaktivitet hos våkne mus.
Siden hjernefunksjoner er under kontinuerlig påvirkning av signalene fra perifert vev, er det viktig å belyse hvordan gliaceller i hjernen sanser ulike biologiske forhold i periferien og overfører signalene til nevroner. Mikroglia, immunceller i hjernen, er involvert i synaptisk utvikling og plastisitet. Derfor bør mikroglias bidrag til nevralkretskonstruksjon som respons på kroppens indre tilstand testes kritisk ved intravital avbildning av forholdet mellom mikroglialdynamikk og nevronaktivitet.
Her beskriver vi en teknikk for samtidig avbildning av mikroglialdynamikk og nevronaktivitet hos våkne mus. Adenoassosiert virus som koder for R-CaMP, en genkodet kalsiumindikator for rødt fluorescensprotein, ble injisert i lag 2/3 av den primære visuelle cortex i CX3CR1-EGFP transgene mus som uttrykker EGFP i mikroglia. Etter virusinjeksjon ble et kranialvindu installert på hjerneoverflaten av det injiserte området. In vivo to-foton avbildning i våkne mus 4 uker etter operasjonen viste at nevral aktivitet og mikrogliadynamikk kunne registreres samtidig ved sub-sekund temporal oppløsning. Denne teknikken kan avdekke koordinasjonen mellom mikroglialdynamikk og nevronaktivitet, med førstnevnte som reagerer på perifere immunologiske tilstander og sistnevnte koder for de indre hjernetilstandene.
Det er økende bevis på at kroppens indre tilstand hele tiden påvirker hjernefunksjonene hos dyr 1,2,3,4,5. For å få en dypere forståelse av hjernens funksjoner er det derfor avgjørende å belyse hvordan gliaceller i hjernen overvåker biologiske forhold i periferien og videresender informasjonen til nevroner.
Mikroglia, immunceller i hjernen, er involvert i synaptisk utvikling og plastisitet, som skulpturerer egenskaper av nevrale kretser i hjernen 6,7,8,9. For eksempel viste pionerarbeidet til Wake et al. at mikrogliaprosesser kommer i kontakt med synapser på en nevronaktivitetsavhengig måte i museneocortex, og at kunstig iskemi induserer synapsetap etter langvarig kontakt med mikroglia10. Tremblay et al. fant at endring av visuell opplevelse endrer modaliteten til mikroglial interaksjon med synapser. I den kritiske perioden når dendritisk ryggradsomsetning i den primære visuelle cortex (V1) økes ved kikkertmangel, reduserer mørk tilpasning motiliteten til mikroglialprosesser og øker både kontaktfrekvensen med synaptiske spalter og antall cellulære inneslutninger i mikroglia11. Disse resultatene tyder på at mikrogliaprosesser sanser nevral aktivitet og deres omgivelser for å ombygge nevrale kretser. Videre rapporterte en nylig studie at mikroglialovervåking er forskjellig mellom våkne og bedøvede forhold, noe som tyder på viktigheten av eksperimenter med våkne mus for å undersøke nevron-mikroglia-kommunikasjon under fysiologiske forhold12.
In vivo to-foton kalsiumavbildning er et kraftig verktøy for opptak av kalsiumdynamikk, som reflekterer pågående nevronavfyring, i hundrevis av nevroner samtidig i et levende dyr13,14,15. Kalsiumavbildning i nevroner krever generelt en tidsmessig oppløsning på mer enn noen få Hz for å spore raske nevronresponser16,17. I motsetning til dette har tidligere studier som sporer mikroglialdynamikk samplet mikrogliastrukturer ved en relativt lav temporal oppløsning på mindre enn 0.1 Hz18,19,20. En nylig studie brukte samtidig to-foton avbildning for å forstå nevron-mikroglia kommunikasjon21. Imidlertid er det fortsatt uklart hvordan dynamiske mikrogliaprosesser reagerer på den omkringliggende nevrale aktiviteten ved en tidsmessig oppløsning på mer enn noen få Hz i våkne mus. For å løse dette problemet beskriver vi en samtidig in vivo to-foton avbildningsmetode for nevral aktivitet og mikroglialdynamikk med en tidsoppløsning høyere enn 1 Hz hos våkne mus. Denne metoden lar oss oppnå stabil avbildning i våkne mus med høyere bildefrekvens (maksimum, 30 Hz med pikselrammestørrelsen på 512 x 512 piksler) og gir en gunstigere måte å undersøke overvåkingsoppførselen til mikroglia eller deres interaksjon med nevronaktivitet i våkne mus.
Vi beskriver protokollen for AAV-injeksjon og kraniotomi for simultan avbildning av mikrogliadynamikk og nevronaktivitet hos våkne mus samt databehandling. Denne teknikken kan avdekke koordinasjonen mellom mikroglialdynamikk og nevronaktivitet på tidsskalaer fra sub-sekund til titalls sekunder.
Operasjonsprotokollen innebærer flere teknisk krevende trinn. AAV-injeksjon er et av de kritiske trinnene. Mislykket AAV-injeksjon kan føre til en signifikant reduksjon i uttrykket av R-CaMP. Det er to hovedårsaker: tette glasspipetter og vevskader. Tilstopping av glasspipetter reduserer eller blokkerer helt utstøtingen av AAV-oppløsningen. Denne situasjonen kan unngås ved å fargelegge AAV-løsningen med et fargestoff som raskt grønt og visuelt bekrefte injeksjonens suksess. Vevsskade forårsaket av AAV-injeksjon forhindrer eksogent genuttrykk nær midten av injeksjonsstedet. Skaden forårsaket av AAV-injeksjon skyldes sannsynligvis en plutselig økning i utstrømningen fra spissen av glasspipetten etter akkumulering av trykket inne i pipetten. Derfor bør utstrømningen av AAV-oppløsning fra glasspipetten være konstant under injeksjonen. Å velge glasspipetter med litt bredere diameter på spissene ville løse dette problemet. Ved kranialvinduimplantasjon er operasjonshastigheten kritisk. Hvis operasjonen tar for lang tid, kan hjernevevet bli alvorlig skadet. Følgelig er gjentatt praksis nødvendig for å sikre hastigheten og jevnheten i operasjonen. I tillegg kan kvaliteten på bildediagnostikken i løpet av de 4 ukene fra operasjon til avbildning reduseres ved vevsregenerering mellom kranialvinduet og hjernevevet ved konvensjonell metode17. Metoden her overvinner dette problemet ved å bruke tykke briller for den indre glassplaten i kranialvinduene for å hemme vevregenerering og holde vinduet klart. I systemet beskrevet her var denne effekten tydelig ved å bruke en indre glassskive med en tykkelse på 0,525 ± 0,075 μm.
Metoden kan brukes med hell på mus eldre enn 4 uker, men søknaden til yngre mus kan være problematisk. Hos unge mus viser skallen rask og fremtredende vekst, noe som induserer et misforhold mellom kranialbenet og glassvinduet.
I noen banebrytende studier ble in vivo to-foton avbildning brukt til å studere mikroglia-nevron-interaksjoner 12,21,23. Spesielt i pionerarbeidet til Merlini et al. utførte de samtidig in vivo-avbildning av mikroglialdynamikk og nevral aktivitet i cellelegemene21. I denne metoden, ved å bruke tykkere indre briller for kraniale vinduer, kunne vi undertrykke bevegelsesartefakter i dybdeorienteringen og oppnå stabil måling av nevronaktivitet i mikrostrukturer, for eksempel dendritiske pigger. Denne metoden vil bidra til å undersøke synapse-mikroglial prosessinteraksjoner i våkne mus.
Nylig viste in vitro-studier at tynne filopodia-lignende mikrogliaprosesser har raskere motilitet enn tykke prosesser, noe som tyder på viktigheten av deres raskere motilitet i overvåking19. Systemet her kan spore motiliteten til tynne mikroglialprosesser med en tidsmessig oppløsning fra et undersekund til noen få titalls sekunder. Denne egenskapen bidrar til å belyse den funksjonelle betydningen av deres motilitet for overvåking in vivo.
I fremtiden vil kombinasjonen av denne bildebehandlingsteknikken med intervensjoner, som optogenetikk24 eller kjemogenetikk25, anvendt på lokale nevrale kretser eller interregionale nevrale forbindelser, kaste lys over nye mikroglialfunksjoner i synaptisk utvikling og plastisitet som skulpturerer egenskaper av nevrale kretser. Videre integrering av bildebehandling, intervensjon og atferdsoppgaver vil også bidra til å avsløre koordineringen av mikroglia og nevroner som ligger til grunn for spesifikk atferd.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Dr. Masashi Kondo og Dr. Masanori Matsuzaki for å gi virusvektorer. Dette arbeidet ble støttet av Grants-in-Aid for Scientific Research (20H00481, 20A301, 20H05894, 20H05895 til SO), Japan Agency for Medical Research and Development (JP19gm1310003 og JP17gm5010003 til SO og JP19dm0207082 til HM), UTokyo Center for Integrative Science of Human Behavior (CiSHuB), Japan Science and Technology Agency Moonshot R & D (JPMJMS2024 til HM), Brain Science Foundation (til H. M.).
10-inch LCD monitor | EIZO | DuraVision FDX1003 | For presenting grating visual stimuli |
26G Hamilton syringe | Hamilton | 701N | |
27G needle | Terumo | NN-2719S | |
AAV-hSyn-R-CAMP1.07 | N/A | N/A | Kindly gifted from Prof. Matsuzaki's laboratory |
Activated charcoal powder | Nacalai tesque | 07909-65 | |
Black aluminum foil | THORLABS | BKF12 | |
CX3CR1-EGFP mouse | Jackson laboratory | IMSR_JAX: 005582 | CX3CR-1EGFP/+ knock-in/knock-out mice expressing EGFP in microglia in the brain under the control of the endogenous Cx3cr1 locus. |
DENT SILICONE-V | Shofu Inc | N/A | For the attachment of a shading device to a head-plate |
Dental cement (quick resin, liquid) | Shofu Inc | N/A | AB |
Dental cement(quick resin, powder) | Shofu Inc | N/A | B Color 3 |
Drill | Toyo Associates | HP-200 | |
Glass capillary pipette | Drummond Scientific Company | 2-000-075 | |
Glass disc (large) | Matsunami | N/A | 4mm in diameter, 0.15±0.02mm in thickness |
Glass disc (small) | Matsunami | N/A | 2mm in diameter, 0.525±0.075mm in thickness |
Head-plate | Customized | N/A | Material: SUS304, thickness: 0.5mm, see Figure2B for the shape |
Hemostatic fiber | Davol Inc | 1010090 | |
ImageJ Fiji software | Free software | For data registration | |
Instant glue (Aron alpha) | Daiichi Sankyo | N/A | |
Isoflurane | Pfizer | N/A | |
Lidocaine | Astrazeneca | N/A | |
MATLAB 2017b | MathWorks | N/A | For data registration and processing |
Meloxicam | Tokyo Chemical Industry | M1959 | |
Microinjector | KD scienfitic | KDS-100 | |
Micropipette puller | Sutter Instrument Company | P-97 | |
Multi-photon excitation microscope | NIKON | N/A | The commercial name is "A1MP+". |
Objective lens | NIKON | N/A | The commercial name is "CFI75 apochromat 25xC W". |
Paraffin Liquid | Nacalai tesque | 26132-35 | |
Psychtoolbox | Free software | For presenting grating visual stimuli | |
Shading device | Customized | N/A | |
Stereomicroscope | Leica | M165 FC | |
Stereotaxic instrument | Narishige Scientific Instrument | SR-611 | For the surgery |
Stereotaxic instrument | Customized | N/A | For fixing mice under the two-photon microscope |
Stopcock | ISIS | VXB1079 | |
Surgical silk | Ethicon | K881H | |
Treadmill | Customized | N/A | |
UV light curing agent | Norland Products Inc | NOA 65 | |
Vaporizer | Penlon | Sigma Delta | Anesthetic machine |