Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Hånddissektion af Caenorhabditis elegans Tarme

Published: September 13, 2022 doi: 10.3791/64120
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Biochemistry & Molecular Biology, Colorado State University

Summary

Den nuværende protokol beskriver en procedure til isolering af tarmene fra voksne Caenorhabditis elegans nematodeorme i hånden til input i genomik, proteomik, mikrobiom eller andre assays.

Abstract

Caenorhabditis elegans tarm består af kun 20 celler og er forbindelsen mellem mange livsstøttende funktioner, herunder fordøjelse, stofskifte, aldring, immunitet og miljørespons. Kritiske interaktioner mellem C. elegans vært og dets miljø konvergerer i tarmen, hvor tarmmikrobiota koncentrerer sig. Derfor er evnen til at isolere tarmvæv væk fra resten af ormen nødvendig for at vurdere tarmspecifikke processer. Denne protokol beskriver en metode til hånddissekering af voksne C. elegans tarme. Proceduren kan udføres i fluorescerende mærkede stammer for lethed eller træningsformål. Når teknikken er perfektioneret, kan tarmene opsamles fra umærkede orme af enhver genotype. Denne mikrodissektionsmetode giver mulighed for samtidig indfangning af værts tarmvæv og tarmmikrobiota, en fordel for mange mikrobiomundersøgelser. Som sådan kan downstream-applikationer til tarmpræparaterne, der genereres af denne protokol, omfatte, men er ikke begrænset til, RNA-isolering fra tarmceller og DNA-isolering fra fanget mikrobiota. Samlet set giver hånddissektion af C. elegans tarme en enkel og robust metode til at undersøge kritiske aspekter af tarmbiologi.

Introduction

Caenorhabditis elegans nematodeorm med kun 959 celler og en 4-dages æg-til-æg-livscyklus er et ideelt modelsystem til mange genetik-, genomforsknings- og udviklingsstudier 1,2. Den lette fremadrettede og omvendte genetiske screening, forekomsten af konstruerede fluorescerende markører, kapaciteten til at udføre nukleotidspecifik genomredigering og de mange ressourcer i hele samfundet har alle bidraget til store opdagelser og indsigter i C. elegans-systemet. En betydelig ulempe er imidlertid vanskeligheden ved at opnå rene populationer af celler, væv eller organer, som er små, skrøbelige og kan sammenkobles. Da rene populationer af celler er vigtige for genomiske assays som RNA-seq, ChIP-seq og ATAC-seq, er der opstået flere tilgange til at opnå rene præparater af C. elegans celler, væv og organer. Her beskrives en metode til hånddissekering af tarme i store sektioner ud af voksne C. elegans orme. De resulterende præparater er egnede til downstream genomiske assays (figur 1).

Den finskala vævsdissektionsmetode, der er beskrevet her (figur 2), er kun en tilgang. Andre alternative teknikker - såsom molekylær mærkning, opdeling af orme og rensning af celletyper af interesse med fluorescensaktiveret cellesortering (FACS) og post hoc-analyse - er også med succes blevet brugt til at undersøge de vævsspecifikke træk ved C. elegans molekylærbiologi. En fordel ved hånddissektion i forhold til disse andre tilgange er imidlertid, at den kan bruges til samtidig at udforske funktionerne i C. elegans tarm og dens bakterieindhold 3,4,5. Dette muliggør 16S rRNA-gensekventering og letter mikrobiomundersøgelser inden for C. elegans-systemet. En vigtig begrænsning er imidlertid, at tarmceller ikke isoleres individuelt.

Molekylær mærkning giver kun molekyler et celletypespecifikt mærke inden for det specificerede væv eller celler af interesse. Disse tags kan derefter isoleres fra samlede ormpræparater. På denne måde har vævsspecifikke promotorer, der driver et mærket polyA-bindende protein eller splejset leder, muliggjort vævsspecifik transkriptomprofilering 6,7,8,9,10 og 3'UTR-kortlægning 11,12. Tilsvarende er vævsspecifikke transkriptionsfaktorprofiler blevet udført ved hjælp af ChIP-seq og DamID, hvor promotorspecifikke transkriptionsfaktorvarianter blev tilføjet med tags eller enzymfusioner13,14.

FACS giver mulighed for at isolere celletyper af interesse fra dissocierede orme baseret på deres iboende cellulære egenskaber og fluorescerende egenskaber. Denne tilgang har genereret vævsspecifikke transkriptomer fra forskellige organer 8,15,16 og individuelle neuronale celletyper 8,9,15,16,17,18 og er blevet brugt til at skabe et udtrykskort over hele C. elegans nervesystem 19,20 . FACS og dets fætter fluorescensaktiverede kernesortering (FANS) er også blevet brugt til at generere cellespecifikke kromatinprofiler21,22.

Endelig kan post-hoc-analyse udføres i enkeltcelleopløsningsassays. I denne metode undersøges alle individuelle celler, celletypen for hver tilskrives i analysefasen, og celletyperne af interesse filtreres selektivt til yderligere undersøgelse. Post-hoc analyse er med succes blevet brugt til at opnå transkriptomer af udviklende celler med både høj rumlig og tidsmæssig opløsning i C. elegans embryoner 23,24,25,26,27 og L1 28 trin orme. Kromatin tilgængelighed er også blevet karakteriseret ved hjælp af ATAC-seq i stedet for RNA-seq ved hjælp af en lignende strategi29.

Hver tilgang har sine fordele og begrænsninger. For C. elegans tarm er ormopdeling og FACS-isolering af tarmceller opnåelig i embryo- og larvestadierne30, men er udfordrende hos voksne. Dette menes at skyldes tarmens store, endo-reduplicated og stærkt klæbende celler, der gør dem vanskelige at adskille ubeskadiget. Den her beskrevne hånddissektionsmetode omgår disse udfordringer og giver mulighed for isolering af store dele af den voksne orms tarm. Praksis med hånddissekering af gonader fra samme stadium er udbredt og ligetil. Tarmens dissektion ligner gonaddissektion, men udføres mindre almindeligt32. Protokollen, der præsenteres her, er tilpasset fra en længere, upubliceret protokol udviklet af Dr. James McGhee og Barb Goszczynski. Denne strømlinede protokol låner teknikker til isolering af blastomerer fra tidlige embryoner 23,33,34,35. Selvom hånddissektion ikke er mulig til isolering af de fleste celle- eller vævstyper i C. elegans, er den ideel til isolering af tarme fra voksne orme. Derfor supplerer hånddissektion andre midler til opnåelse af tarmspecifikke cellepræparater.

Protocol

CL2122 orme blev anvendt til denne undersøgelse. Ormene blev opnået gennem Caenorhabditis Genetics Center (CGC, se Tabel over materialer), finansieret af NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440).

1. Dyrkning af orme til dissektion

  1. Dyrk en stor plade af CL2122-orme i blandet trin til synkronisering efter standarddyrkningsprocedurer (dvs. NGM-plader podet med E. coli OP50)36,37.
    BEMÆRK: Det tager generelt ~ 96 timer at nå maksimal æglægningskapacitet.
    1. Embryo prep ormene inden for 72-96 h perioden. Efter embryoforberedelse tillades embryonerne at klække i M9 (se tabel 1) i 48 timer. Dette vil give en synkron population af L1-sceneorme.
      BEMÆRK: CL2122 orme har en integreret transgen-GFP (grønt fluorescerende protein) drevet af den tarmspecifikke mtl-2 (MeTaLlothionein 2) promotor38. Denne promotor er specifik for tarmcellecytoplasmaet og gør det muligt at visualisere tarmen på et fluorescerende dissektionsmikroskop. Når de er uddannet, finder brugerne muligvis ikke fluorescensvejledning nødvendig.
  2. Plade synkroniserede L1 orme på mindst to små plader. Dyrk orme på NGM-plader med tilstrækkelig mad, indtil de når voksenstadiet (identificeret ved tilstedeværelsen af embryoner, der er i stand til æglægning). Dette tager mellem 38-46 timer ved 20 °C.
    1. Sørg for at sikre, at det samme udviklingsstadium høstes på tværs af replikater og på tværs af komparative stammer.
      BEMÆRK: Hvor lang tid det tager at dyrke ormene afhænger af stammen, temperaturen, fødekilden og udviklingsstadiet målrettet39. Andre stadier nær voksenstadiet kan også bruges, såsom L4 og ældre voksne stadier. Til planlægning af mikrobiomeksperimenter kan forskellige bakterielle fødekilder ud over den traditionelle fødekilde (E. coli OP50) bruges til at dyrke orme, såsom CeMbio-stammerne4 eller et patogen af interesse40.

2. Fremstilling af stamopløsninger og mikrokapillærpipetter

BEMÆRK: Tabel 1 indeholder oplysninger om alle de buffere og opløsninger, der er anvendt til denne undersøgelse.

  1. Forbered 50 ml ægsalte (alias ægbuffer) i et nukleasefrit konisk rør (se materialetabel). Når den er lavet, opbevares ved stuetemperatur.
  2. Forbered 10 ml 100 mM levamisolstamopløsning i et nukleasefrit konisk rør. Når de er tilberedt, fremstilles 500 μL aliquots og opbevares ved -20 °C. Aliquots kan optøes og opbevares ved 4 °C i 1 uge ad gangen.
  3. Der fremstilles 1 ml 20 mg/ml acetyleret bovint serumalbumin (BSA) i et nukleasefrit mikrocentrifugerør. Når de er tilberedt, fremstilles 50 μL engangsalikvoter og opbevares ved -20 °C.
    BEMÆRK: Det er vigtigt at bruge den acetylerede version af BSA, fordi dette er den eneste form for BSA, der er nukleasefri. Ikke-acetyleret BSA kan være en væsentlig kilde til nukleaser og dermed føre til nedbrydning af prøver.
  4. Forbered mindst fem 50 μm og 100 μm mikrokapillærpipetter hver efter nedenstående trin.
    1. Først skal du trække standardglaskapillærer (4 i lang og 1,2 mm ydre diameter) ind i en injektionsnålform ved hjælp af en nåletrækker (se Materialetabel) og betingelser for "Adherent Cell, C. elegans, & Drosophila" fra Sutter Instruments Pipette Cookbook41 (Betingelser: Varme = Rampe + 5; Træk = 100; Vel. = 75; forsinkelse = 90; Tryk = 500; 2,5 mm x 2,5 mm kasse).
    2. Derefter smedes mikrokapillærpipetterne til enten 50 μm (tre aksemærker som angivet med mikroforge-okulær lineal under M5/0.1-målet) eller 100 μm (fem aksemærker under de samme betingelser) størrelse ved hjælp af en mikroforge (se Materialetabel). Disse størrelser repræsenterer mikrokapillærpipettens anslåede åbningsdiameter (figur 3).
    3. Fastgør derefter et mundaspiratorrør til mikrokapillærpipetterne.
      BEMÆRK: Aspiratorpipetter styres traditionelt ved mundpipettering, men mange moderne sikkerhedsprotokoller tillader ikke denne metode. Som sådan kan brugerne kontrollere aspiration med mundaspiratorslangen ved at klemme slangen mellem fingeren og tommelfingeren. Derudover kan et sprøjtefilter installeres i mundaspiratorrørsystemet for ekstra sikkerhed.

3. Eksperimentel forberedelse

  1. Forbered 5 ml dissektionsbuffer i et nukleasefrit konisk rør. Opbevares ved stuetemperatur.
  2. Der fremstilles 1 ml acetyleret BSA-opløsning i et nukleasefrit mikrocentrifugerør. Bliv på is.
  3. Der fremstilles 350 μL arbejdslevamisolopløsning i et nukleasefrit mikrocentrifugerør. Forbered dig i tre eksemplarer (et rør til ca. 20 orme). Bliv på is.
  4. Der fremstilles kelationsbuffer i et nukleasefrit mikrocentrifugerør (tabel 1). Lav i replikat (et rør til ca. 10 dissekerede orme). Bliv på is. Brug af kelationsbuffer under hånddissektioner forbedrer RNA-kvalitet og kvantitet (figur 4).
  5. Der fremstilles et mikrocentrifugerør pr. forsøgsgruppe, der indeholder 500 μL nukleinsyreisoleringsreagens eller kitspecificeret isolationsreagens (se Materialetabel) i et nukleasefrit rør. Bliv på is. Dette rør vil blive brugt til at indsamle de endelige, isolerede tarme til opbevaring eller senere brug.
  6. Forbered et M9-bad og et dissektionsbufferbad. For at gøre det skal du få to sterile petriskåle med en diameter på 35 mm. Tilsæt derefter 2 ml M9 til den ene skål og 2 ml dissektionsbuffer til den anden. Til sidst tilsættes 100 μL fungerende BSA-opløsning til hvert bad. Hvirvle for at blande. Tilføjelse af BSA til badene forhindrer ormene i at klæbe til plasten.
  7. Forbered dissektionsarrayet. Opnå et 2-brønds konkavitet dias (se Materialetabel) og tilsæt 150 μL arbejdslevamisolopløsning til den første brønd. Tilsæt derefter 150 μL dissektionsbuffer til den anden brønd. Til sidst tilsættes 20 μL fungerende BSA-opløsning til hver brønd. Tilføjelse af BSA til hver brønd forhindrer ormene i at klæbe til diaset.

4. Hånddissektion af C. elegans tarm

  1. Brug en ormepluk til at flytte 20 voksne orme fra NGM-pladen ind i M9-badet (trin 3.6). Dette vil vaske eksterne bakterier fra ormene.
  2. Flyt derefter alle 20 orme fra M9-badet til dissektionsbufferbadet (trin 3.6). Dette vil yderligere vaske eksterne bakterier væk og ligevægte ormene i dissektionsbufferen.
  3. Flyt derefter partier af orme (dvs. i sæt på 10) fra dissektionsbufferbadet ind i brønden indeholdende levamisolopløsning (trin 3.7).
    BEMÆRK: Levamisol vil midlertidigt lamme ormene.
    1. Når ormens bevægelser sænkes, skal du hurtigt flytte dem fra levamisolbrønden til brønden, der indeholder dissektionsbufferen (trin 3.7). Pas på ikke at overlamme ormene.
      BEMÆRK: Antallet af orme, der flyttes i partier til levamisolopløsningen, kan variere afhængigt af brugerens komfort. Dette gælder også for antallet af orme, der først blev plukket ind i M9-badet og derefter flyttet ind i dissektionsbufferbadet. Det er god praksis at have yderligere orme til rådighed til dissektion, især under træning, da brugeren lærer og bliver fortrolig med protokollen.
  4. Lad derefter ormene begynde at bevæge sig lidt i dissektionsbufferen, inden dissektionerne startes.
    BEMÆRK: Tarmene ekstruderer ikke godt fra alt for lammede orme (dvs. orme, der slet ikke bevæger sig).
  5. Når du er klar, dissekeres ormene under et fluorescerende dissekeringsomfang ved hjælp af en hypodermisk nål (dvs. 27 G x 1/2 in) (se Materialetabel) ved at lave et snit enten lige bag svælget (figur 5Aa) eller lige foran endetarmen (figur 5Ab). Dette vil producere to store dele af tarmen, en forreste halvdel og en midterste halvdel. Fortsæt dette mønster for resten af ormene, og hold antallet af tarmsektioner opnået fra de forreste og midterste sektioner ækvivalente, indtil det ønskede samlede antal tarme er erhvervet.
    BEMÆRK: Anbringelse af den hypodermiske nål på en tom 1 ml sprøjtetønde kan hjælpe med dens manipulation under hånddissektioner. Afhængigt af brugerens komfort og erfaring er det ikke ualmindeligt at lave et dissektionssnit, der ikke giver noget tarmfragment. Men med praksis bliver dette langt mindre almindeligt.
  6. Vent ca. 1 minut på, at tarmene maksimalt ekstruderes fra kroppen. De antager typisk en løkkeform og kan sidde fast på en del af gonaderne (figur 5A). Mens du venter, tilsættes 50 μL kelationsbuffer til brønden for at hjælpe med at reducere RNA-nedbrydning (figur 4).
  7. Mens du venter og for yderligere at lette tarmekstrudering, skal du bruge den 100 μm mikrokapillærpipette, der er fastgjort til en mundaspirator, og trække tarmen/ormen ind og ud af pipetten (figur 5B). Dette vil også bidrage til at frigøre tarmen fra gonaden. Pas på ikke at miste tarmen ved ved et uheld at suge den helt op i mikrokapillærpipetten.
    BEMÆRK: Brugeren kan skifte mellem 100 μm og 50 μm mikrokapillærpipetter for at frigøre tarmen fra resten af kroppen og gonaden. Åbningen med en mindre diameter af mikrokapillærpipetten med en mindre diameter kan give en fordel til at fjerne klæbrige stykker fra tarmen. Aspiratorpipetter styres traditionelt ved mundpipettering, men mange moderne sikkerhedsprotokoller tillader ikke denne metode. Som sådan kan brugerne kontrollere aspiration med mundaspiratorslangen ved at klemme slangen mellem fingeren og tommelfingeren. Derudover kan et sprøjtefilter installeres i mundaspiratorrørsystemet for ekstra sikkerhed.
  8. Når en tarm er tilstrækkeligt ekstruderet, skal du bruge 27 G hypodermisk nål til at skære den væk fra resten af kroppen og eventuel resterende gonad. Størrelsen af tarmsektionen isoleret kan variere meget afhængigt af høstmaskinens oplevelse, kvaliteten af snittet og niveauet af lammelse i ormen.
    BEMÆRK: Tarmens og tarmfragmenternes integritet kan let overvåges i hele protokollen via deres GFP-fluorescens.
  9. Brug nu mikrokapillærpipetten til at aspirere tarmsektionen og flytte den ud af brønden og ind i mikrocentrifugerøret, der indeholder nukleinsyreisoleringsreagens eller kitspecificeret isolationsreagens. Hold de isolerede tarme i reagens på is og gentag for de resterende tarme.
    BEMÆRK: Flere tarme kan tilsættes til mikrocentrifugerøret, der indeholder nukleinsyreisoleringsreagens eller et andet kitspecificeret isolationsreagens hele dagen. Bliv på is. Hvis alle tarmene ikke kan isoleres på 1 dag, kan de, der allerede er isoleret og opbevaret i et nukleinsyreisoleringsreagens (som bevarer nukleinsyrerne), opbevares ved -80 ° C, indtil isoleringerne genoptages og / eller kan afsluttes. Her er prøverne stabile på lang sigt (dvs. flere måneder til 1 år) og kan forblive indtil de er klar til at isolere nukleinsyrer. Tarmene kan høstes i vand eller en hvilken som helst kitspecifik lysisbuffer. Der skal dog tages hensyn til, når det bestemmes, hvor længe tarmene kan forblive i en given buffer på is (eller anden ønsket temperatur), inden de går videre til nedstrøms applikationer.

5. RNA-isolering fra dissekerede tarme

  1. Homogeniser det erhvervede væv, der er lagret i nukleinsyreisoleringsreagenset ved at udføre tre fryse-/optønings-/hvirvelcyklusser. For at gøre dette skal du bruge et 37 ° C perlebad og flydende nitrogen (eller andre sammenlignelige midler).
  2. Derefter tilsættes 0,2 volumener phenol:chloroform:IAA-reagens (se Materialetabel) til prøven og hvirvel kort. For eksempel for et startprøvevolumen på 500 μL ville 0,2 volumener chloroform være 100 μL.
  3. Ryst røret i hånden i 20 s, og inkuber derefter ved stuetemperatur i 3 minutter.
  4. Prøvefaserne adskilles ved centrifugering (10.000 x g, 18 min., 4 °C).
  5. Fjern den vandige fase og overfør til et nyt nukleasefrit mikrocentrifugerør.
    BEMÆRK: Pas på ikke at aspirere eller forstyrre grænsefladen.
  6. Derefter tilsættes et tilsvarende volumen 100% ethanol til den vandige fase og rystes prøven manuelt i 20 s.
  7. 700 μL af prøven overføres til spinkolonnen (se Materialetabel). Derefter klæbes RNA til søjlen med centrifugering (≥8.000 x g, 30 s, RT [stuetemperatur]). Kassér gennemstrømningen. Gentag for eventuelle yderligere resterende prøver.
  8. Der tilsættes 350 μL RW1-buffer (se Materialetabel) til kolonnen for at vaske prøven. Derefter centrifugeres (≥8.000 x g, 30 s, RT) og gennemstrømningen kasseres.
  9. Udfør DNA-fordøjelse på søjlen. Der tilsættes 80 μL DNase I i RDD-buffer (se Materialetabel) til eksempelkolonnen. Derefter inkuberes i 15 minutter ved RT.
  10. Derefter tilsættes 350 μL RW1-buffer til kolonnen for at vaske prøven. Centrifuge (≥8.000 x g, 30 s, RT) og overføre søjlen til et nyt opsamlingsrør. Kassér gennemstrømningsrøret og det gamle opsamlingsrør. Denne vask fjerner DNase.
  11. Føj 500 μL RPE (se Materialetabel) til eksempelkolonnen. Derefter centrifugeres (≥8.000 x g, 30 s, RT) og gennemstrømningen kasseres. Gentag for en anden vask.
  12. Centrifuge derefter i yderligere 1 minut for yderligere at tørre søjlemembranen (≥8.000 x g, 1 min, RT). Derefter overføres prøvekolonnen til et frisk nukleasefrit mikrocentrifugeopsamlingsrør med låg. Kassér gennemstrømningsrøret og det gamle opsamlingsrør.
  13. Der tilsættes 14 μL nukleasefrit vand direkte til membranen i prøvekolonnen. Derefter inkuberes prøven i 2 minutter ved RT. Dernæst centrifuge (≥8.000 x g, 1 min, RT) for at eluere RNA'et.
  14. Opbevar prøven på is. Vurder derefter prøvens RNA-kvalitet og kvantitet ved hjælp af kommercielt tilgængelige analysesæt (se materialetabellen). Når prøven er færdig, opbevares den i en -80 °C fryser.
    BEMÆRK: RNA er generelt stabilt ved -80 °C i op til 1 år uden nedbrydning.

Representative Results

Den nuværende protokol blev brugt til at isolere store dele af tarmen fra voksne C. elegans i hånden (figur 2). Den endelige tarmprøve for hver vist forsøgsgruppe består af en lige samling af forreste og midterste tarmafsnit. Afhængigt af det eksperimentelle spørgsmål kan det imidlertid også omfatte en samling af kun anterior, midterste eller bageste tarmafsnit. Samlet præsenteres tre repræsentative resultater for denne protokol. Den første skildrer den vellykkede dissektion og isolering af tarmene (figur 6). Den anden rapporterer resultaterne af RNA-isolering fra isolerede tarme (figur 7). Den tredje viser resultaterne af mikrobiel overvågning fra isolerede tarme (figur 8).

For det første resultat viser figur 6A, hvordan en ekstruderet tarm ser ud efter at have foretaget et primært snit på stedet "a" i figur 5A i voksne CL2122 orme. Da CL2122-orme huser den tarmspecifikke mtl-2-promotor smeltet sammen med GFP (mtl-2 p::GFP), vil isolerede tarme lyse grønt under det fluorescerende dissekeringsomfang. Den vellykkede dissektion af et tarmsegment vises derefter i figur 6B. Denne tarmsektion er fri for synlige forurenende stoffer såsom snavs fra gonaden eller slagtekroppen. I modsætning hertil viser figur 6C tarme, der ikke er dissekeret med succes, da gonad og krop stadig er synligt fastgjort til tarmsegmentet.

For det andet resultat blev tarmene høstet i et nukleinsyreisoleringsreagens og behandlet den næste dag ved hjælp af en total RNA-ekstraktionsprotokol med lavt input (se Materialetabel). En endelig tarmprøve på 60 samlede tarmafsnit fra de forreste og midterste sektioner giver ca. 15 ng total RNA af høj kvalitet (figur 7A). Denne mængde total tarm kan let opnås på en enkelt dag, men kan også brydes op over flere dage, hvis det er nødvendigt. RNA-udbytter fra hånddissektion er mere effektive end ormopdeling og FACS-isolering af tarmceller, idet hundredtusinder af tarmceller er nødvendige for at opnå tilsvarende mængder total RNA (figur 7B). Det er vigtigt, at RNA-udbyttet, der genereres ved hånddissektion, er mere end tilstrækkeligt som input til kommercielle RNA-seq-bibliotekssæt (dvs. NEBNext Ultra II og NEBNext Single Cell / Low Input), som kan tage så lidt som 2 pg RNA.

Til det tredje resultat blev tarmene høstet i steril ddH20 og behandlet samme dag ved hjælp af et kommercielt mikrobielt DNA-isolationssæt (se Materialetabel). En endelig tarmprøve på 40 totale tarmsektioner fra de forreste og midterste sektioner giver omkring 0,009 pg total mikrobielt DNA ved hjælp af et panbakterielt detektionsassay (se materialetabel) (figur 8). Disse mængder er for lave til traditionelle kvantificeringsmetoder og skal ekstrapoleres fra qPCR-standardkurver. Ideelt set bør brugerne målrette mod en endelig samlet mængde tarme >40, da dette øger detektionsgrænsen og grænsen for signal-til-støj vedrørende reagensforureningsniveauer.

Når man overvejer forsøgsdesign, er det altid nødvendigt at indsamle passende kontrolprøver. Til transkriptomiske eksperimenter kan en passende eksperimentel kontrol omfatte præparater af hele ormen indsamlet på samme måde som tarmene. Under dissektion og isolering af tarme fra C. elegans er det imidlertid almindeligt at se stumper af slagtekroppe og gonad klamre sig til tarmsektionerne. Mens disse forurenende væv ideelt set vil blive fjernet fra tarmene inden opbevaring til downstream-brug, kan yderligere eksperimentelle kontroller omfatte indsamling af de resterende ormkroppe efter tarmdissektion og / eller indsamling af dissekerede gonader. Til mikrobiomforsøg kan kontroller også omfatte præparater af hele ormen indsamlet på samme måde som tarmene, ud over konventionelle positive (bakteriekultur) og negative (vand) kontroller.

Figure 1
Figur 1: Hånddissektion af tarme fra voksne C. elegans , der anvendes til at generere vævsspecifikke præparater til brug i en lang række downstream omics-assays. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Skema for hånddissektionsprotokollen. Denne protokol blev brugt til at isolere store dele af tarmen fra voksne C. elegans i hånden. Tarmene kan isoleres til forskellige nedstrøms assays. Vist her er brugen af tarme til RNA-isolering og mikrobiel DNA-isolering. Billede oprettet med BioRender.com. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Fremstilling af mikrokapillærpipette. (A) En nytrukket, men uforfalsket mikrokapillærpipette vises gennem det okulære stykke af en mikroforge. En okulær lineal bruges til at måle mikrokapillærpipetter på 50 μm til en estimeret indre diameter på tre aksemærker (vist, angivet med pil). (B) Uforfalskede, 50 μm og 100 μm mikrokapillærpipetter vises under dissekeringsområdet sammen med en kalibreringslineal med 1 div = 0,1 mm. (C) 50 μm og 100 μm mikrokapillærpipetter fra (B) vises igen, men fra et andet udsigtspunkt. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4: Brugen af chelationsbuffer (CB) under hånddissektion for at forbedre RNA-udbyttet. En total RNA-ekstraktionsprotokol med lavt input genererede RNA-præparater fra navngivne væv. Repræsentative gelelektroforesekørsler, der karakteriserer isoleret total RNA-kvalitet (RIN, RNA-integritetsnummer) og kvantitet vises. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 5
Figur 5: Skridt til dissektion af hænder . (A) De dissektionstrin, der er beskrevet i protokollen, er skitseret her. I (1) visualiseres ormens tarm ved GFP-fluorescens. Det primære snitsted kan fordeles jævnt mellem ormene for at sikre jævn dækning over hele tarmens længde. Alternativt kan enten "a" eller "b" primære snitsteder vælges for at opnå et anterior-mid eller mid-posterior intestinal fragment-specifikt præparat. I (2) er tarmen ekstruderet og har fået en løkkeform. I (3) skæres tarmen først væk fra ormlegemet, mens den forsøges at frigøre den fra slagtekroppen og gonaden. Tarmen fjernes derefter fra eventuelle resterende slagtekroppe eller gonader, der ikke kan fjernes. I (4) er en renset del af tarmen isoleret og klar til opbevaring. (B) Et kritisk skridt er at fjerne ethvert klæbende affald (dvs. gonad, krop) fra tarmen ved at føre det ind og ud af mikrokapillærpipetten, der er formet i slutningen af mundaspiranten. Skalabjælker = 100 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 6
Figur 6: Repræsentative resultater af hånddissektionstrin. Et repræsentativt billede, der viser (A) ekstrudering af tarmen fra ormen. Disse er orme af CL2122-genotypen, der udtrykker GFP under den tarmcellespecifikke mtl-2-promotor . To repræsentative billeder viser (B) en renset og fuldt isoleret del af tarmen og (C) en isoleret tarm med forurenende gonad- og slagtekroppe. Skalabjælker = 100 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 7
Figur 7: Repræsentative resultater af total RNA-ekstraktion fra isolerede tarme . (A) Et repræsentativt billede af RNA-præparater opløst ved agarosegelelektroforese er vist, der karakteriserer kvaliteten (RIN'er, RNA-integritetsnummer) og mængden af isolerede totale RNA'er. (B) En repræsentativ gel af total RNA isoleret fra tarmceller høstet fra L1-trinsorm via fluorescensaktiveret cellesortering (FACS) er vist til sammenligning. Ved 20 celler pr. tarm kan det udledes, at hånddissektionsmetoden giver mere total RNA pr. tarm end FACS-oprensede tarmceller. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 8
Figur 8: Repræsentative resultater for total mikrobiel DNA-ekstraktion fra isolerede tarme. Et kommercielt mikrobielt DNA-isolationssæt genererede DNA-præparater fra tarme, hele orme og kontroller. Et panbakterielt genassay blev brugt til at kvantificere antallet af bakterier i prøverne. Et repræsentativt billede af (A) de genererede qPCR-forstærkningskurver, (B) E. coli OP50-standardkurven, der bruges til at kvantificere prøverne, og (C) prøverne vises. I (B) er logstartkoncentrationerne af E. coli-standarder tegnet mod deres CT-værdier . I (C) blev to replikater (reps) af 40 hele orme skåret medialt, og 40 isolerede tarmafsnit blev behandlet til mikrobiel gDNA-isolering. No-Template-Control (NTC) fra qPCR-kørslen vises også. Y-aksen repræsenterer prøvens CT-værdier . Mængden af DNA kvantificeret fra PCR'er vises som samlede picogramværdier (pg) over prøvestængerne. Klik her for at se en større version af denne figur.

Tabel 1: Sammensætninger af buffere og opløsninger, der er anvendt i denne undersøgelse. Klik her for at downloade denne tabel.

Discussion

Denne artikel beskriver den trinvise protokol for hånddissekering af tarme fra voksne C. elegans, der genererer rene præparater til nedstrøms assays. Kritiske trin i denne protokol omfatter (1) sikring af ikke at overlamme ormene, (2) at foretage nøjagtige dissektionsskæringer, (3) smedning af mikropipetter af passende størrelse til dissektion og (4) sikring af hurtig genopretning af sunde tarme under den endelige høst. Af disse grunde skal man være forsigtig, når man udsætter orme for levamisolopløsningen, og de hypodermiske nåle skal opdateres ofte for at sikre maksimal skarphed. Håndtering af tarmen ved hjælp af mikrokapillærpipetten og mundaspiratoren er et andet trin, der vil tage øvelse. Korrekt smedede mikropipetter af passende størrelse gør også en væsentlig forskel ved at isolere store dele af tarmen under dissektioner ud over at reducere risikoen for at miste tarmene i mikropipetten. Nye protokolbrugere mister ofte tarmene på indersiden af mikrokapillærpipetten, før de kan skubbes ud i isolationsreagenset. Dette problem kan ændres med praksis og korrekt smedede mikrokapillærpipetter.

Protokollen beskrevet heri blev designet til brug i voksne orme. Foreløbige forsøg understøtter, at denne protokol også er effektiv til brug i L4 orme og ældre voksne orme. Effekten af denne protokol er imidlertid endnu ikke blevet evalueret i orme i det tidlige larvestadium. En begrænsning af denne tilgang er den lille mængde materiale, den giver. Selvom mængderne er tilstrækkelige til RNA-seq og PCR, er de muligvis ikke tilstrækkelige til andre assays. Som sådan skal brugerne afgøre, om det mindste krævede input til et assay kan indsamles med denne protokol.

Vores laboratorium bruger rutinemæssigt FACS til at rense tarmceller efter isolering 30, post-hoc analysemetoder til identifikation af tarmceller og denne hånddissektionsmetode30,42. Hånddissektion har den fordel, at den kan bruges i voksne orme, når ormopdeling og celleisolering er mindre vellykkede. Desuden er effektiviteten og kvaliteten af total RNA ekstraheret fra hånddissektionspræparater høj, sandsynligvis fordi vævene hurtigt plukkes fra ormene og derefter hurtigt deponeres i et nukleinsyreisoleringsreagens, hvilket reducerer RNA-nedbrydning. En anden fordel ved hånddissektionsmetoden er, at den er billig, let at lære og ikke kræver specialudstyr. Endelig giver denne tilgang mulighed for høst og isolering af tarmbakterier fra ormtarme, hvilket muliggør downstream mikrobiomundersøgelser.

Hånddissektionsprotokollen beskrevet her til isolering af tarme fra voksne C. elegans repræsenterer et kraftfuldt værktøj til at studere forskellige aspekter af C. elegans biologi . For eksempel kan forskere med en ren forberedelse af tarmene undersøge skæringspunktet mellem immunitet, aldring, stofskifte og mikrobiomet.

Disclosures

Forfatterne erklærer ingen interessekonflikter.

Acknowledgments

Vi står i gæld til James McGhee og Barb Goszczynskis pionerarbejde, som oprindeligt udviklede tarmdissektionsmetoden, hvorfra denne protokol er tilpasset. Vores arbejde understøttes af en MIRA (R35) Award overvåget af National Institute of General Medical Sciences (National Institutes of Health, R35GM124877 til EON) og en NSF-CAREER Award overvåget af NSF MCB Div Of Molecular and Cellular Bioscience (Award #2143849 til EON).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetylated Bovine Serum Albumin (BSA) VWR 97061-420 Nuclease free BSA
CL2122 worm strain CGC (Caenorhabditis Genetics Center) CL2122 dvIs15 [(pPD30.38) unc-54(vector) + (pCL26) mtl-2::GFP]. Control strain for CL2120. Phenotype apparently WT.
Calcium Chloride Dihydrate Fisher C79 needed for making Egg Salts
50 mL Centrifuge Tubes, Bulk Olympus Plastics 28-108 Nuclease free conical tube needed for solution making.
15 mL Centrifuge Tubes, Bulk Olympus Plastics 28-103 Nuclease free conical tube needed for solution making.
Concavity slide (2-well) Electron Microscopy Sciences 71878-08 12-pk of 2-well concavity slides
Ethylene glycol-bis(2-amino-ethylether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid (EGTA) Millipore Sigma E3889 needed for making chelation buffer
Fluorescent Dissection Microscope Leica M205 FCA This is an optional piece of equipment that can be used with fluorescent C. elegans strains to help guid users during hand dissections
N-(2-Hydroxyethyl)piperazine-N′-(2-ethanesulfonic acid), 4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid (HEPES) Millipore Sigma H4034 needed for making dissection buffer
High Sensitivity RNA ScreenTape Agilent 5067-5579 for assesment of total RNA quality and quantity
High Sensitivity RNA ScreenTape Ladder Agilent 5067-5581 for assesment of total RNA quality and quantity
High Sensitivity RNA ScreenTape Sample Buffer Agilent 5067-5580 for assesment of total RNA quality and quantity
HostZERO Microbial DNA Kit Zymo Research D4310 Isolation of microbial DNA from worm intestines/worms
Hypodermic Needle (27G x 1/2") BD Scientific 305109 needed for hand dissection of intestines
Levamisole (a.k.a. (-)-Tetramisole hydrochloride) Millipore Sigma L9756 used to temporarily paralyze worms prior to hand dissection of intestines.
Luer-Lok General Use Disposable Syringe (1 mL) BD Scientific 309628 Optional. Can be used to affix the hypodermic needle to, allowing easier manipulation of the needle during dissection. Remove the plunger.
Magnesium Chloride Hexahydrate Fisher M33 needed for making Egg Salts
Magnesium Sulfate Hpetahydrate Sigma-Aldrich 230391-500G needed for making M9 buffer
MF-900 Microforge Narishige MF-900 Used to forge the microcapillary pipettes. Available through Tritech Research.
1.7 mL Microtubes, Clear Olympus Plastics 22-282 Nuclease free microfuge tube needed for solution making and sample storage.
Mouth Aspirator Tube Millipore Sigma A5177 Mouth aspirator tube is needed in combination with the microcapillary pipette to allow aspiration of dissected intestines.
16S Pan-Bacterial Control TaqMan Assay Thermo Fisher A50137 Assay ID: Ba04930791_s1. Assay used for gut microbial detection via qPCR.
P-1000 Micropipette Puller Sutter Instruments Model P-1000 Used to pull the microcapillary pippettes prior to forging.
Petri Dish (35 x 10 mm) Genesee Scientific - Olympus Plastics 32-103 Used to make M9 bath and Disseciton Buffer bath for washing worms prior to dissection.
Phenol:Chloroform:IAA Ambion AM9730 Used in the isolation of total RNA
Potassium Chloride Millipore Sigma 529552 needed for making Egg Salts
Potassium Phosphate Monobasic Sigma-Aldrich P0662-500G needed for making M9 buffer
Qubit 3 Fluorometer Invitrogen Q33216 Accompanies the Qubit RNA HS Assay Kit. Can be used to quantify RNA prior to running sample on the Agilent ScreenTape.
Qubit RNA HS Assay Kit Invitrogen Q32852 Can be used to quantify RNA prior to running sample on the Agilent ScreenTape.
RNasin Ribonuclease Inhibitor Promega N2111 Broad spectrum inhibition of common eukaryotic Rnases
RNase-Free DNase Set Qiagen 79254 used for on-column DNA digestion during RNA isolation protocol.
RNeasy Micro Kit Qiagen 74004 Used for isolation of total RNA from worm intestines/worms
Standard Glass Capillaries World Precision Instruments 1B100F-4 4 in OD 1.2 mm standard borosilicate glass capillaries used to make microcapillary pipettes for dissection
Sodium Chloride Fisher S271 needed for making Egg Salts
Sodium phosphate dibasic heptahydrate Fisher Scientific S373-500 needed for making M9 buffer
Syringe filter (0.2 micrometer SCFA) Thermo Fisher 72302520 Optional for use with the mouth aspirator tube when mouth pipetting.
4150 TapeStation System Agilent G2992AA Accompanies the RNA ScreenTape reagents for assessing RNA quality and quantity
TaqPath BactoPure Microbial Detection Master Mix Applied Biosystems A52699 master mix used for qPCR
TRIzol Reagent Thermo Fisher Scientific 15596026 Nucleic acid isolation and preservation. QIAzol (Qiagen; 79306) can be substituted if preferred.
Worm Pick NA NA Made in house from a pasteur pipette and a platinum wire. See wormbook for details.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Riddel, D. L., Blumenthal, T., Meyer, B. J., Priess, J. C. elegans II. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (1997).
  2. Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. A transparent window into biology: A primer on Caenorhabditis elegans. Genetics. 200 (2), 387-407 (2015).
  3. Zhang, F., et al. Natural genetic variation drives microbiome selection in the Caenorhabditis elegans gut. Current Biology. 31 (12), 2603-2618 (2021).
  4. Dirksen, P., et al. CeMbio - The Caenorhabditis elegans microbiome resource. G3: Genes, Genomes, Genetics. 10 (9), 3025-3039 (2020).
  5. Zhang, F., et al. Caenorhabditis elegans as a model for microbiome research. Frontiers in Microbiology. 8, 485 (2017).
  6. Roy, P. J., Stuart, J. M., Lund, J., Kim, S. K. Chromosomal clustering of muscle-expressed genes in Caenorhabditis elegans. Nature. 418 (6901), 975-979 (2002).
  7. Pauli, F., Liu, Y., Kim, Y. A., Chen, P. -J., Kim, S. K. Chromosomal clustering and GATA transcriptional regulation of intestine-expressed genes in C. elegans. Development. 133 (2), 287-295 (2005).
  8. Spencer, W. C., et al. A spatial and temporal map of C. elegans gene expression. Genome Research. 21 (2), 325-341 (2011).
  9. Spencer, W. C., et al. Isolation of specific neurons from C. elegans larvae for gene expression profiling. PLoS One. 9 (11), 112102 (2014).
  10. Ma, X., et al. Analysis of C. elegans muscle transcriptome using trans-splicing-based RNA tagging (SRT). Nucleic Acids Research. 44 (21), 156 (2016).
  11. Blazie, S. M., et al. Comparative RNA-Seq analysis reveals pervasive tissue-specific alternative polyadenylation in Caenorhabditis elegans intestine and muscles. BMC Biology. 13 (1), 4 (2015).
  12. Blazie, S. M., et al. Alternative polyadenylation directs tissue-specific miRNA targeting in Caenorhabditis elegans somatic tissues. Genetics. 206 (2), 757-774 (2017).
  13. Gómez-Saldivar, G., et al. et al.Tissue-specific transcription footprinting using RNA PoI DamID (RAPID) in Caenorhabditis elegans. Genetics. 216 (4), 931-945 (2020).
  14. Katsanos, D., Barkoulas, M. Targeted DamID in C. elegans reveals a direct role for LIN-22 and NHR-25 in antagonizing the epidermal stem cell fate. Science Advances. 8 (5), 3141 (2022).
  15. Kaletsky, R., et al. The C. elegans adult neuronal IIS/FOXO transcriptome reveals adult phenotype regulators. Nature. 529 (7584), 92-96 (2015).
  16. Kaletsky, R., et al. Transcriptome analysis of adult Caenorhabditis elegans cells reveals tissue-specific gene and isoform expression. PLoS Genetics. 14 (8), 1007559 (2018).
  17. Mathies, L. D., et al. mRNA profiling reveals significant transcriptional differences between a multipotent progenitor and its differentiated sister. BMC Genomics. 20 (1), 427 (2019).
  18. Liang, X., Calovich-Benne, C., Norris, A. Sensory neuron transcriptomes reveal complex neuron-specific function and regulation of mec-2/ Stomatin splicing. Nucleic Acids Research. 50 (5), 2401-2416 (2021).
  19. Glenwinkel, L., et al. In silico analysis of the transcriptional regulatory logic of neuronal identity specification throughout the C. elegans nervous system. eLife. 10, 64906 (2021).
  20. Taylor, S. R., et al. Molecular topography of an entire nervous system. Cell. 184 (16), 4329-4347 (2021).
  21. Charest, J., et al. Combinatorial action of temporally segregated transcription factors. Developmental Cell. 55 (4), 483-499 (2020).
  22. Steiner, F. A., Talbert, P. B., Kasinathan, S., Deal, R. B., Henikoff, S. Cell-type-specific nuclei purification from whole animals for genome-wide expression and chromatin profiling. Genome Research. 22 (4), 766-777 (2012).
  23. Tintori, S. C., Nishimura, E. O., Golden, P., Lieb, J. D., Goldstein, B. A transcriptional lineage of the early C. embryo. Developmental Cell. 38 (4), 430-444 (2016).
  24. Hashimshony, T., Wagner, F., Sher, N., Yanai, I. CEL-Seq: Single-cell RNA-Seq by multiplexed linear amplification. Cell Reports. 2 (3), 666-673 (2012).
  25. Hashimshony, T., Feder, M., Levin, M., Hall, B. K., Yanai, I. Spatiotemporal transcriptomics reveals the evolutionary history of the endoderm germ layer. Nature. 519 (7542), 219-222 (2015).
  26. Packer, J. S., et al. A lineage-resolved molecular atlas of C. elegans embryogenesis at single-cell resolution. Science. 365 (6459), 1971 (2019).
  27. Warner, A. D., Gevirtzman, L., Hillier, L. W., Ewing, B., Waterston, R. H. The C. elegans embryonic transcriptome with tissue, time, and alternative splicing resolution. Genome Research. 29 (6), 1036-1045 (2019).
  28. Cao, J., et al. Comprehensive single-cell transcriptional profiling of a multicellular organism. Science. 357 (6352), 661-667 (2017).
  29. Durham, T. J., et al. Comprehensive characterization of tissue-specific chromatin accessibility in L2 Caenorhabditis elegans nematodes. Genome Research. 31 (10), 1952-1969 (2021).
  30. King, D. C., et al. The transcription factor ELT-2 positively and negatively impacts direct target genes to modulate the Caenorhabditis elegans intestinal transcriptome. bioRxiv. , (2021).
  31. Kocsisova, Z., Mohammad, A., Kornfeld, K., Schedl, T. Cell cycle analysis in the C. elegans germline with the thymidine analog EdU. Journal of Visualized Experiments. (140), e58339 (2018).
  32. Han, S., et al. Mono-unsaturated fatty acids link H3K4me3 modifiers to C. elegans lifespan. Nature. 544 (7649), 185-190 (2017).
  33. Edgar, L. G., Wolf, N., Wood, W. B. Early transcription in Caenorhabditis elegans embryos. Development. 120 (2), 443-451 (1994).
  34. Edgar, L. G., Goldstein, B. Culture and manipulation of embryonic cells. Methods in Cell Biology. 107, 151-175 (2012).
  35. Nishimura, E. O., Zhang, J. C., Werts, A. D., Goldstein, B., Lieb, J. D. Asymmetric transcript discovery by RNA-seq in C. elegans blastomeres identifies neg-1, a gene important for anterior morphogenesis. PLoS Genetics. 11 (4), 1005117 (2015).
  36. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , 1-11 (2006).
  37. Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cerón, J. Basic Caenorhabditis elegans methods: Synchronization and observation. Journal of Visualized Experiments. (64), e4019 (2012).
  38. Fay, D. S., Fluet, A., Johnson, C. J., Link, C. D. In vivo aggregation of β-amyloid peptide variants. Journal of Neurochemistry. 71 (4), 1616-1625 (1998).
  39. Altun, Z. F., Hall, D. H. WormAtas Hermaphrodite Handbook – Introduction to C. elegans Anatomy. WormAtlas. , (2006).
  40. Tan, M. -W., Mahajan-Miklos, S., Ausubel, F. M. Killing of Caenorhabditis elegans by Pseudomonas aeruginosa used to model mammalian bacterial pathogenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (2), 715-720 (1999).
  41. Oesterle, A. Pipette Cookbook 2018: P-97 & P-1000 Micropipette Pullers. Sutter Instrument Company. , Novato, CA. https://www.sutter.com/PDFs/pipette_cookbook.pdf (2018).
  42. Dineen, A., Nishimura, E. O., Goszczynski, B., Rothman, J. H., McGhee, J. D. Quantitating transcription factor redundancy: The relative roles of the ELT-2 and ELT-7 GATA factors in the C. elegans endoderm. Developmental Biology. 435 (2), 150-161 (2018).

Tags

Biologi udgave 187 C. elegans tarm hånddissektion mtl-2 mikrobiom transkriptomik
Hånddissektion af <em>Caenorhabditis elegans</em> Tarme
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hill, J. L., Moore, A., Williams, R. … More

Hill, J. L., Moore, A., Williams, R. T. P., Osborne Nishimura, E. Hand Dissection of Caenorhabditis elegans Intestines. J. Vis. Exp. (187), e64120, doi:10.3791/64120 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter