Summary
Dit protocol beschrijft de Capture Hi-C-methode die wordt gebruikt om de 3D-organisatie van megagebaseerde gerichte genomische regio's met hoge resolutie te karakteriseren, inclusief grenzen van topologisch associërende domeinen (TAD's) en chromatine-interacties op lange afstand tussen regulerende en andere DNA-sequentie-elementen.
Abstract
De ruimtelijke organisatie van het genoom draagt bij aan de functie en regulatie ervan in vele contexten, waaronder transcriptie, replicatie, recombinatie en reparatie. Het begrijpen van de exacte causaliteit tussen genoomtopologie en -functie is daarom cruciaal en in toenemende mate het onderwerp van intensief onderzoek. Chromosoomconformatie-opnametechnologieën (3C) maken het mogelijk om de 3D-structuur van chromatine af te leiden door de frequentie van interacties tussen elk gebied van het genoom te meten. Hier beschrijven we een snel en eenvoudig protocol om Capture Hi-C uit te voeren, een op 3C gebaseerde doelverrijkingsmethode die de allelspecifieke 3D-organisatie van megagebaseerde genomische doelen met hoge resolutie karakteriseert. In Capture Hi-C worden doelgebieden opgevangen door een reeks gebiotinyleerde sondes voordat downstream high-throughput sequencing plaatsvindt. Zo worden een hogere resolutie en allel-specificiteit bereikt terwijl de tijdseffectiviteit en betaalbaarheid van de technologie worden verbeterd. Om zijn sterke punten aan te tonen, werd het Capture Hi-C-protocol toegepast op het X-inactivatiecentrum van de muis (Xic), de hoofdregulerende locus van X-chromosoominactivatie (XCI).
Introduction
Het lineaire genoom bevat alle informatie die nodig is voor een organisme om een embryonale ontwikkeling te ondergaan en te overleven gedurende de volwassenheid. Het instrueren van genetisch identieke cellen om verschillende functies uit te voeren is echter van fundamenteel belang om nauwkeurig te controleren welke informatie wordt gebruikt in specifieke contexten, inclusief verschillende weefsels en / of ontwikkelingsstadia. De driedimensionale organisatie van het genoom wordt verondersteld deel te nemen aan deze nauwkeurige spatio-temporele regulatie van genactiviteit door de fysieke interactie tussen regulerende elementen die kunnen worden gescheiden door enkele honderden kilobases in het lineaire genoom te vergemakkelijken of te voorkomen (voor beoordelingen 1,2,3). In de afgelopen 20 jaar is ons begrip van de wisselwerking tussen genoomvouwing en activiteit snel toegenomen, grotendeels als gevolg van de ontwikkeling van chromosoomconformatievangsttechnologieën (3C) (voor overzicht 4,5,6,7). Deze methoden meten de frequentie van interacties tussen alle regio's van het genoom en vertrouwen op de ligatie van DNA-sequenties die zich in nauwe 3D-nabijheid binnen de kern bevinden. De meest voorkomende 3C-protocollen beginnen met de fixatie van celpopulaties met een cross-linking middel zoals formaldehyde. Het verknoopte chromatine wordt vervolgens verteerd met een restrictie-enzym, hoewel MNase-vertering ook is gebruikt 8,9. Na de spijsvertering worden vrije DNA-uiteinden in nauwe ruimtelijke nabijheid opnieuw geligeerd en wordt cross-linking omgekeerd. Deze stap geeft aanleiding tot de 3C 'bibliotheek' of 'template', een gemengde pool van hybride fragmenten waarin sequenties die zich in 3D in de nabijheid van de kern bevonden een grotere kans hebben om geligeerd te worden in hetzelfde DNA-fragment. De stroomafwaartse kwantificering van deze hybride fragmenten maakt het mogelijk om de 3D-conformatie af te leiden van genomische gebieden die zich duizenden basenparen uit elkaar bevinden in het lineaire genoom, maar mogelijk interageren in de 3D-ruimte.
Er zijn veel verschillende benaderingen ontwikkeld om de 3C-bibliotheek te karakteriseren, die zowel verschillen in termen van welke subsets van ligatiefragmenten worden geanalyseerd als welke technologie wordt gebruikt voor hun downstream-kwantificering. Het oorspronkelijke 3C-protocol was gebaseerd op de selectie van twee interessante regio's en de kwantificering van hun 'één versus één' interactiefrequentie met PCR10,11. De 4C-benadering (circular chromosome conformation capture) meet de interacties tussen een enkele locus of interest (d.w.z. het 'view-point') en de rest van het genoom ('one versus all')12,13,14. In 4C ondergaat de 3C-bibliotheek een tweede ronde van vertering en herligatie om kleine circulaire DNA-moleculen te genereren die PCR worden versterkt door view-point specifieke primers15. 5C (chromosome conformation capture carbon copy) maakt de karakterisering van 3D-interacties over grotere interessegebieden mogelijk, wat inzicht geeft in chromatinevouwing van hogere orde binnen dat gebied ('veel versus veel')16. In 5C wordt de 3C-bibliotheek gehybridiseerd tot een pool van oligonucleotiden die overlappende restrictieplaatsen die vervolgens kunnen worden versterkt door multiplex PCR met universele primers15. In zowel 4C als 5C werden de informatieve DNA-fragmenten aanvankelijk gekwantificeerd door microarrays en later door next-generation sequencing (NGS)17,18,19. Deze strategieën karakteriseren gerichte regio's van belang, maar kunnen niet worden toegepast om genoombrede interacties in kaart te brengen. Dit laatste doel wordt bereikt met Hi-C, een op 3C gebaseerde high-throughput strategie waarbij massaal parallelle sequencing van de 3C-template de onbevooroordeelde karakterisering van chromatinevouwing op genoombreed niveau ('alles versus alle')20 mogelijk maakt. Het Hi-C-protocol omvat de opname van een gebiotinyleerd residu aan de uiteinden van de verteerde fragmenten, gevolgd door het naar beneden trekken van ligatiefragmenten met streptavidineparels om het herstel van geligeerde fragmenten te vergroten20.
Hi-C onthulde dat het genoom van zoogdieren structureel georganiseerd is op meerdere schalen in de 3D-kern. Op de megabaseschaal is het genoom verdeeld in gebieden van actief en inactief chromatine, de A- en B-compartimenten, respectievelijk20,21. Het bestaan van verdere subcompartimenten vertegenwoordigd door verschillende chromatine- en activiteitstoestanden werd vervolgens ook aangetoond22. Bij een hogere resolutie wordt het genoom verder verdeeld in sub-megabase zelf-interagerende domeinen genaamd topologisch associërende domeinen (TAD's), voor het eerst onthuld door Hi-C en 5C analyse van de menselijke en muis genomen23,24. In tegenstelling tot compartimenten die op een weefselspecifieke manier variëren, zijn TAD's meestal constant (hoewel er veel uitzonderingen zijn). Belangrijk is dat TAD-grenzen behouden blijven voor soort25. In zoogdiercellen omvatten TAD's vaak genen die hetzelfde regulerende landschap delen en is aangetoond dat ze een structureel kader vertegenwoordigen dat genco-regulatie vergemakkelijkt en tegelijkertijd de interacties met naburige regulerende domeinen beperkt (voor beoordeling 3,26,27,28). Bovendien kunnen interacties als gevolg van CTCF-locaties aan de basis van cohesine-geëxtrudeerde lussen binnen TAD's de kans op interacties tussen promotor-enhancer of enhancer-enhancer vergroten (voor review29).
In Hi-C kunnen compartimenten en TAD's worden gedetecteerd met een resolutie van 1 Mb tot 40 kb, maar een hogere resolutie kan worden bereikt om contacten op kleinere schaal te karakteriseren, zoals looping-interacties tussen distale elementen op een schaal van 5-10 kb. Het verhogen van de resolutie om dergelijke lussen efficiënt door HiC te kunnen detecteren, vereist echter een aanzienlijke toename van de sequencingdiepte en dus sequencingkosten. Dit wordt verergerd als de analyse allelspecifiek moet zijn. Inderdaad, een X-voudige toename in resolutie vereist een X2-toename in sequencingdiepte, wat betekent dat benaderingen met hoge resolutie en allelspecifieke genoombrede benaderingen onbetaalbaar kunnen zijn30.
Om de kosteneffectiviteit en betaalbaarheid te verbeteren met behoud van een hoge resolutie, kunnen doelgebieden van belang fysiek worden verwijderd uit genoombrede 3C- of Hi-C-bibliotheken na hun hybridisatie met complementaire biotine-gelabelde oligonucleotide-sondes voordat downstream sequencing. Deze doelverrijkingsstrategieën worden Capture-C-methoden genoemd en maken het mogelijk om interacties van honderden doelloci verspreid over het genoom te ondervragen (d.w.z. Promoter Capture (PC) Hi-C; Volgende generatie (NG) Capture-C; Low Input (LI) Capture-C; Nucleair getitreerde (NuTi) Capture-C; Tri-C)31,32,33,34,35,36,37,38,39,40, of over regio's die zich uitstrekken tot verschillende megabases (d.w.z. Capture HiC; HYbrid Capture Hi-C (Hi-C2); Betegeld-C)41,42,43. Twee aspecten kunnen variëren in op vangst gebaseerde methoden: (1) de aard en het ontwerp van gebiotinyleerde oligonucleotiden (d.w.z. RNA of DNA, enkele oligo's die verspreide genomische doelen vastleggen of meerdere oligo's die een interessant gebied betegelen); en (2) de sjabloon die wordt gebruikt voor het neerhalen van doelen die de 3C- of Hi-C-bibliotheek kunnen zijn, de laatste bestaande uit gebiotinyleerde restrictiefragmenten die uit de 3C-bibliotheek zijn getrokken.
Hier wordt een Capture Hi-C-protocol beschreven op basis van de verrijking van doelcontacten uit de 3C-bibliotheek. Het protocol is gebaseerd op het ontwerp van een op maat gemaakte tegelreeks van gebiotinyleerde RNA-sondes en kan in 1 week worden uitgevoerd van de voorbereiding van de 3C-bibliotheek tot de NGS-sequencing. Het protocol is snel, eenvoudig en maakt het mogelijk om de hogere orde 3D-organisatie van megabase-sized regio's van belang te karakteriseren met een resolutie van 5 kb, terwijl de effectiviteit van de tijd en de betaalbaarheid worden verbeterd in vergelijking met andere 3C-methoden. Het Capture Hi-C-protocol werd toegepast op de master regulatory locus van X-chromosoominactivatie (XCI), het X-inactivatiecentrum (Xic), dat het Xist niet-coderende RNA host. De Xic is eerder het onderwerp geweest van uitgebreide structurele en functionele analyses (voor review44,45). Bij zoogdieren compenseert XCI de dosering van X-gebonden genen tussen vrouwtjes (XX) en mannetjes (XY) en omvat het transcriptionele uitschakeling van bijna het geheel van een van de twee X-chromosomen in vrouwelijke cellen. De Xic vertegenwoordigt een krachtige, gouden standaardlocus voor studies in 3D-genoomtopologie en de wisselwerking met genregulatie44. 5C-analyse van de Xic in embryonale stamcellen van muizen (mESCs) leidde tot de ontdekking en naamgeving van TAD's, wat de eerste inzichten verschafte in de functionele relevantie van topologische partitionering en genco-regulatie24. De topologische organisatie van de Xic bleek vervolgens kritisch betrokken te zijn bij de juiste ontwikkelingstiming van Xist-upregulatie en XCI46, en onvermoede cis-regulerende elementen die de genactiviteit binnen en tussen TAD's kunnen beïnvloeden, werden onlangs ook ontdekt binnen de Xic47,48,49. Het toepassen van Capture Hi-C op 3 Mb van het X-chromosoom van de muis dat de Xic overspant, toont de kracht van deze aanpak bij het ontleden van grootschalige chromatinevouwing met hoge resolutie. Een gedetailleerd en gemakkelijk te volgen protocol wordt geleverd, beginnend bij het ontwerp van de reeks gebiotinyleerde sondes op elke DpnII-beperkingslocatie binnen het gebied van belang tot het genereren van de genoombrede 3C-bibliotheek, de hybridisatie en vastlegging van doelcontacten en downstream data-analyse. Een overzicht van de juiste kwaliteitscontroles en verwachte resultaten is ook opgenomen, en zowel de sterke als de beperkingen van de aanpak worden besproken in het licht van vergelijkbare bestaande methoden.
Protocol
De embryonale stamcellen van muizen (mESCs) die in deze studie werden gebruikt, waren afgeleid van een kruising van een TX/TX R26 rtTA/rtTA-vrouwtje 50 met een Mus musculus castaneus-mannetje volgens de richtlijnen voor dierverzorging van Institut Curie (Paris)51.
1. Sonde ontwerp
- Ontwerp een reeks gebiotinyleerde sondes (120-mer RNA oligonucleotiden) die het doelgebied van belang bedekken.
- Betegel het gebied van belang met overlappende oligonucleotiden, zodat gemiddeld elke sequentie binnen het doelwit wordt bedekt door twee unieke sondes (2x dekking) (figuur 1).
- Sluit repetitieve sequenties uit van de sondedekking om verrijking van niet-specifieke interacties te voorkomen.
OPMERKING: Om de verrijking van informatieve ligatiefragmenten te maximaliseren, werden regio's gedefinieerd die 300 bp stroomopwaarts en stroomafwaarts van elke DpnII-beperkingslocatie over het doel beslaan (ChrX: 102.475.000-105.475.000) en 28.913 gebiotinyleerde sondes werden ontworpen volgens de SureSelect DNA-doelverrijkingstechnologie via het Sure Design-platform52. Volgens deze strategie zijn maximaal 40 basen van repetitieve sequenties toegestaan in elk oligonucleotide om de verrijking van niet-specifieke interacties te minimaliseren. De sonde-array werd gesynthetiseerd door Agilent. Hier wordt DpnII om twee redenen gebruikt als een restrictie-enzym: (1) het is een viersnijder die routinematig wordt gebruikt in verschillende 3C-gebaseerde methoden53; en (2) het maximaliseert de kans op het vastleggen van informatieve single nucleotide polymorfismen (SNP's) in de nabijheid van de snijplaatsen in vergelijking met andere restrictie-enzymen die werden getest in silico in F1 hybride lijnen die in deze studie werden gebruikt (C57BL / 6J x CASTEi / J).
2. Experimentele procedure
- Celvoorbereiding
- Zaai het juiste aantal cellen op een of meerdere celkweekplaten om een totaal celaantal van ≥ 5 x 107 cellen op de dag van fixatie te bereiken.
OPMERKING: In deze studie werden embryonale stamcellen van muizen (mESCs) gebruikt. mESCs worden geplateerd op gelatiniseerde (0,1% gelatine in 1x PBS - o/n bij 37 °C, 5% CO2-incubator) celkweekplaten in mESCs-medium met 2i + LIF en batchgetest foetaal kalfsserum (DMEM, 15% FBS, 0,1 mM β-mercaptoethanol, 1.000 U/ml−1 leukemieremmende factor (LIF), CHIR99021 (3 μM) en PD0325901 (1 μM)). Voor dit celtype bevat één 80% confluente plaat van 10 cm ongeveer 2 x 107 cellen. - Bereid één extra celkweekplaat voor voor celtelling.
OPMERKING: Een kleinere celkweekplaat kan worden gebruikt om het mediagebruik te verminderen. In dit geval moet het aantal cellen dat op de kleinere plaat moet worden gezaaid dienovereenkomstig worden aangepast (bijvoorbeeld 3x minder cellen op een plaat van 10 cm in vergelijking met een plaat van 15 cm).
- Zaai het juiste aantal cellen op een of meerdere celkweekplaten om een totaal celaantal van ≥ 5 x 107 cellen op de dag van fixatie te bereiken.
- Formaldehyde fixatie
- Schat het totale aantal cellen dat moet worden gekoppeld.
- Voordat de cross-linking reactie wordt gestart, trypsiniseren en cellen tellen van de controleplaat die speciaal is voorbereid voor celtelling met behulp van een geautomatiseerde celteller volgens de instructies van de fabrikant.
- Neem een levensvatbaarheidskleuring op (bijv. Trypan Blue) om het percentage levensvatbare cellente bepalen 54. Schat op basis van dit celgetal het totale aantal cellen in de plaat(en) dat (die) is (zijn) voorbereid voor cross-linking.
- Verwijder het kweekmedium van de platen die zijn voorbereid voor crosslinking en vervang het door de juiste hoeveelheid fixatieoplossing (2% formaldehyde in celkweekmedium). Gebruik 10 ml op een plaat van 10 cm (bijv. ~ 20 ml voor een plaat van 15 cm).
OPMERKING: Voeg een exact volume fixatieoplossing toe. Als het fixeren van hechtende cellen niet mogelijk is, kan deze stap worden aangepast aan trypsinized cellen en worden uitgevoerd in 30 ml fixatieoplossing in 50 ml conische centrifugebuizen. Formaldehyde mag niet ouder zijn dan 1 jaar. Het heeft de voorkeur om injectieflacons voor eenmalig gebruik te gebruiken. De fixatieoplossing moet vóór gebruik op kamertemperatuur (RT) worden gebracht.
LET OP: Formaldehyde is gevaarlijk en moet worden behandeld volgens de juiste gezondheids- en veiligheidsvoorschriften. - Fix gedurende 10 min bij RT onder voorzichtig mengen op een shaker.
- Blus de fixatiereactie door toevoeging van 2,5 M glycine-1x PBS tot een eindconcentratie van 0,125 M. Voeg 530 μL van 2,5 M glycine-1x PBS toe aan 10 ml op een plaat van 10 cm (bijv. 1060 μL tot 20 ml op een plaat van 15 cm).
OPMERKING: Als de cellen in oplossing waren gefixeerd, blus dan de fixatiereactie met 1590 μL van 2,5 M glycine-1x PBS. - Incubeer gedurende 5 minuten bij RT, meng voorzichtig op een shaker.
- Breng de platen over op ijs en incubeer nog eens 15 minuten op ijs terwijl je voorzichtig mengt op een shaker.
OPMERKING: Vanaf nu moeten de cellen op ijs worden gehouden en moeten buffers worden voorgekoeld om verdere verknoping te voorkomen. Ga naar een koude ruimte als er veel platen moeten worden verwerkt. - Verwijder de fixatieoplossing uit de cellen door deze in een bekerglas te gieten om een snelle hantering te garanderen.
OPMERKING: Zorg ervoor dat u het formaldehydehoudende vloeibare afval verwijdert volgens de toepasselijke gezondheids- en veiligheidsvoorschriften. - Spoel de plaat van 10 cm snel twee keer af met 5 ml koude 0,125 M glycine-1x PBS (8 ml voor een plaat van 15 cm) om het vuil en de dode cellen af te spoelen. Verwijder de vloeistof van de plaat door deze in een bekerglas te gieten om een snelle hantering te garanderen.
- Voeg 5 ml koude 0,125 M glycine-1x PBS toe aan de plaat van 10 cm (10 ml voor een plaat van 15 cm) en schraap de cellen snel van de plaat met behulp van een plastic celschraper.
- Breng de celsuspensie over in een voorgekoelde conische centrifugebuis van 50 ml met behulp van een serologische pipet.
- Spoel de plaat tweemaal af met 5 ml koude 0,125 M glycine-1x PBS en voeg de celsuspensie toe aan de conische centrifugebuis.
- Draai 10 minuten bij 480 x g bij 4 °C.
OPMERKING: Als de cellen in oplossing zijn gefixeerd, breng de cel dan over in een voorgekoelde conische centrifugebuis en draai gedurende 10 minuten bij 4 °C bij 480 x g naar beneden. Verwijder de fixatieoplossing door deze in een bekerglas te gieten en was driemaal in 10 ml koude 0,125 M glycine-1x PBS. Zorg ervoor dat u de cellen bij elke wasstap resuspensiedt. - Verwijder het supernatant door te aspireren met een benchtop aspiratiesysteem. Resuspendeer de cellen in 500 μL of 1x PBS per 1 x 107 cellen door voorzichtig op en neer te pipetten met een P1000 pipet. Om cellen in het juiste volume te resuspenderen, raadpleegt u de schatting van het totale aantal cellen verkregen in 2.2.1.
- Aliquot 500 μL van de celsuspensie in het berekende aantal microcentrifugebuizen van 1,5 ml (1 x 107 cellen/buis).
- Draai 10 minuten bij 480 x g bij 4 °C.
- Verwijder het supernatant met een benchtop-aspiratiesysteem en vries de celpellets in vloeibare stikstof in. Bewaar de droge celkorrels bij -80 °C.
OPMERKING: Monsters kunnen minstens 1 jaar worden bewaard.
- Schat het totale aantal cellen dat moet worden gekoppeld.
- Cellyse
- Ontdooi de bevroren pellet(s) op ijs.
- Bereid 1,5 ml lysisbuffer in H 2 0 per monster: voeg 10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 10 mM NaCl en0,2% NP40 toe.
- Voeg 600 μL van de koude lysisbuffer toe en resuspensie goed op ijs.
- Incubeer gedurende 15 minuten op ijs om de cellen te laten zwellen.
- Draai 5 minuten bij 4 °C naar beneden bij 2655 x g en verwijder het supernatant met behulp van een tafelaspiratiesysteem.
- Om vuil te verwijderen, resuspendeert u de pellet in 1 ml van de koude lysisbuffer, spint u gedurende 5 minuten bij 4 °C bij 2655 x g en verwijdert u het supernatant.
- Draai nogmaals kort bij 2655 x g en 4 °C en verwijder zoveel mogelijk van het resterende supernatant met behulp van een tafelaspiratiesysteem met een P200-punt.
- Resuspendie in 100 μL van 0,5% (vol/vol) SDS.
- Incubeer in een thermomixer bij 62 °C, wervelend bij 1400 tpm gedurende 10 min.
- Voeg 290 μL H2O + 50 μL 10% TritonX-100 toe en meng goed, vermijd luchtbellen.
- Incubeer in een thermomixer bij 37 °C, wervelend bij 1400 tpm gedurende 15 minuten.
- Voeg 50 μL 10x Dpnll buffer toe en keer de buis om om te mengen.
- Neem 50 μL onverteerd DNA voor kwaliteitscontrole in een aparte buis. Vergeet niet om het onverteerde controlemonster te nemen.
- DpnII vertering
- Voeg 10 μL Dpnll hoge concentratie (500 U totaal) toe en meng door omkeren.
- Incubeer de monsters en de onverteerde regeling in een thermomixer bij 37 °C, draaiend bij 1400 tpm gedurende >4 uur.
- Voeg aan het einde van de dag 10 μL Dpnll hoge concentratie (500 U totaal) toe.
- Incubeer de monsters en de onverteerde controle bij 37 °C, draaiend bij 1400 tpm gedurende een nacht.
- Voeg aan het begin van de volgende dag 10 μL Dpnll hoge concentratie (500 U totaal) toe aan de monsters.
- Incubeer de monsters en de onverteerde regeling in een thermomixer bij 37 °C, draaiend bij 1400 tpm gedurende 4 uur.
- Ligatie en omkering van cross-linking
- Incubeer de buizen bij 65 °C gedurende 20 minuten bij 1400 tpm.
OPMERKING: Voeg op dit moment geen SDS toe. Het idee is om de nucleaire integriteit te behouden, zodat de ligatie in de kernen wordt uitgevoerd, waardoor de noodzaak van extreme verdunning wordt omzeild. - Laat de monsters maximaal 5-10 minuten afkoelen op ijs. Om SDS-neerslag te voorkomen, moet u de monsters niet langer dan dit op ijs laten liggen.
- Neem 50 μL van het niet-geligeerde verteerde DNA voor kwaliteitscontrole in een aparte buis. Bewaar de onverteerde en niet-gestreepte controles bij -20 °C.
OPMERKING: Vergeet niet het niet-geligeerde controlemonster te nemen. - Voeg 800 μL ligatiecocktail toe: 122 μL 10x ligasebuffer, 8 μL T4-ligase (30 E/μL) en 670 μL H20.
- Incubeer bij 16 °C, draai 's nachts bij 1000 tpm.
- Voeg 7,5 μl proteïnase K (20 mg/ml) toe aan de monsters en 2 μl aan de controles.
- Incubeer bij 65 °C gedurende 4 uur bij 1000 tpm.
- Incubeer de buizen bij 65 °C gedurende 20 minuten bij 1400 tpm.
- DNA-zuivering
- Breng de monsters over op ijs in voorgekoelde conische centrifugebuizen van 15 ml en voeg 2 ml water, 10,5 ml ijskoud EtOH en 583 μl 3 M NaAC toe.
OPMERKING: Extra water is bedoeld om overdracht van DTT naar de pellet te voorkomen. - Voeg 200 μL ijskoud EtOH, 10,8 μL NaAC en 1 μL coprecipitant toe aan de onverteerde en niet-geligeerde kwaliteitscontroles.
- Incubeer bij -80 °C gedurende ten minste 4 uur tot een nacht.
- Draai de buizen van 15 ml gedurende 45 minuten op 2200 x g bij 4 °C.
- Draai de regelbuizen van 1,5 ml gedurende 30 minuten op 20.500 x g bij 4 °C.
- Eenmaal wassen met 3 ml (monsters) en 1 ml (controles) ijskoud 70% EtOH.
- Draai bij 2200 x g ( monsters) of 20.500 x g (controles) bij 4 °C gedurende 10 min.
- Verwijder EtOH voorzichtig en droog aan de lucht bij RT gedurende 10-15 minuten; Niet overdrogen.
- Resuspendie van de monsters en controles in respectievelijk 100 μL en 20 μL H20.
- Voeg 1 μL RNAseA toe en incubeer bij 37 °C, draaiend bij 1400 tpm gedurende 30 min.
- Breng de monsters over op ijs in voorgekoelde conische centrifugebuizen van 15 ml en voeg 2 ml water, 10,5 ml ijskoud EtOH en 583 μl 3 M NaAC toe.
- Kwaliteitscontrole van 3C-sjabloonvoorbereiding
- Kwantificeer elk monster en controleer met behulp van een fluorometerkit voor hooggevoelige DNA-concentratiemetingen.
- Laad 100-200 ng van elk monster en elke controle op een 1% agarose / 1x TBE-gel.
- Controleer of de gelafbeelding het verwachte resultaat weergeeft door de verschillen in DNA-fragmentgroottes van de besturingselementen en de 3C-sjabloon te vergelijken, zoals weergegeven in figuur 2A.
- Bewaar de monsters en controles bij -20 °C.
- Hybridisatie, vastlegging en monsterverwerking voor multiplexed sequencing
- Om de array van gebiotinyleerde RNA-sondes te hybridiseren naar de 3C-sjabloon, de beoogde ligatiefragmenten vast te leggen en de monsters voor te bereiden op multiplexed sequencing volgens het doelverrijkingssysteem dat in deze studie wordt gebruikt voor paired-end multiplexed sequencing (zie Materiaalopgave). Volg het protocol volgens de instructies van de fabrikant en breng de volgende kleine wijzigingen aan:
- Punt 2 van het protocol van de fabrikant: Monstervoorbereiding
- Volg de instructies voor doelverrijking vanaf 3 μg gDNA-invoer.
- Schuif het DNA in een sonicator met behulp van de volgende specificaties: 10% duty cycle, 4 intensiteit, 200 cyc / burst en 130 s. Begin met 4 μg 3C-sjabloon geresuspendeerd in 130 μL water voor elke vangreactie om ervoor te zorgen dat er voldoende materiaal is om de monstervoorbereiding voort te zetten met 3 μg van het geschoren DNA.
- Beoordeel de kwaliteit van geschoren DNA. Voer 1 μL van het geschoren DNA uit op een DNA-bioanalysator volgens het hoogsensitiviteitsprotocol. Verwacht een verdeling van de fragmentgrootte tussen 150-700 bp (figuur 2).
- Zuiver het monster met behulp van solid phase reversible immobilization (SPRI) kralen. Voeg 124 μL SPRI-kralen toe aan 124 μL van het DNA-monster om een 1:1 linkerzijmaatselectie uit te voeren volgens de instructies van de fabrikant en elueer in 25 μL nucleasevrij water. Deze zuiveringsstap verwijdert kortere fragmenten om fragmenten van ongeveer 300 bp te verrijken (figuur 2).
OPMERKING: De hoeveelheid monsters en SPRI-kralen die bij deze stap worden gebruikt, houdt rekening met het volumeverlies dat is opgetreden tijdens het overbrengen van de monsters naar nieuwe buizen en het uitvoeren van de kwaliteitscontroles bij de Bioanalyzer. Alle volgende maatselectiestappen worden uitgevoerd volgens de verhoudingen die worden aanbevolen door het protocol van de fabrikant. DNA-elutie uit SPRI-kralen wordt uitgevoerd bij RT gedurende het hele protocol. - Beoordeel de kwaliteit van door grootte geselecteerd geschoren DNA. Voer 1 μL van het geschoren DNA uit op de DNA-bioanalysator volgens het HS-protocol (high-sensitivity). Verwacht een verdeling van fragmentgroottes met de hoogste verrijking bij 300 bp (figuur 2). Ga door met de kwantificering van het geschoren DNA als het scheren succesvol was.
- Kwantificeer het geschoren DNA met een fluorometerkit voor HS-DNA-concentratiemetingen.
OPMERKING: Als DNA-afschuiving resulteert in een DNA-opbrengst van <3 μg, voert u een tweede ronde DNA-afschuiving uit met nog eens 4 μg DNA en combineert u de geschoren DNA-monsters na de eerste SPRI-kraalzuiveringsstap om een totaal van 3 μg geschoren DNA te bereiken. - Voeg nucleasevrij water toe aan het door de grootte geselecteerde gereinigde DNA-monster (3 μg totaal) tot een eindvolume van 48 μL en ga verder met de eindreparatiereactie volgens het protocol van de fabrikant.
- Na ligatie van gekoppelde adapters, versterkt u de bibliotheek door vijf cycli van pre-capture PCR uit te voeren volgens de instructies van de fabrikant (de voorwaarden voor PCR en de primers worden in de kit verstrekt).
- Sectie 4 van het protocol van de fabrikant: Hybridisatie en afvang
- Om de geprepareerde DNA-monsters te hybridiseren naar de doelspecifieke RNA-sondes, verdunt u 750 ng DNA-monsters in een eindvolume van 3,4 μL, wat resulteert in een beginconcentratie van 221 ng / μL. Voor DNA-monsters verdund in grotere volumes, gebruik een snelheidsvacuüm concentrator om te reduceren tot het uiteindelijke volume. Een snelheidsvacuümconcentratie (250 x g; ≤45 °C) gedurende 15-20 minuten is normaal gesproken voldoende voor de monsters die in 10 μl worden geresuspendeerd. Zorg ervoor dat u voor elk monster hetzelfde invoervolume hebt voordat u de snelheidsvacuümconcentrator start.
- Incubeer het hybridisatiemengsel gedurende 16-18 uur bij 65 °C met een verwarmd deksel bij 105 °C volgens de instructies van de fabrikant.
- Punt 5 van het protocol van de fabrikant: Indexering en monsterverwerking voor multiplexed sequencing
- Om de vastgelegde bibliotheken te versterken met indexeringsprimers, voert u 12 cycli van PCR na opname uit volgens de instructies van de fabrikant (de voorwaarden voor PCR en de primers worden in de kit geleverd).
- Punt 2 van het protocol van de fabrikant: Monstervoorbereiding
- Om de array van gebiotinyleerde RNA-sondes te hybridiseren naar de 3C-sjabloon, de beoogde ligatiefragmenten vast te leggen en de monsters voor te bereiden op multiplexed sequencing volgens het doelverrijkingssysteem dat in deze studie wordt gebruikt voor paired-end multiplexed sequencing (zie Materiaalopgave). Volg het protocol volgens de instructies van de fabrikant en breng de volgende kleine wijzigingen aan:
- Sequencing van de volgende generatie
- Als u meerdere Hi-C-weergavebibliotheken op dezelfde stroomcel wilt uitvoeren, bereidt u een equimolair mengsel van de opnamebibliotheken voor en sequentieert u 100-120 M-leesbewerkingen per bibliotheek.
- Als de allel-specifieke analyse nodig is, sequentie 150 bp paired-end om voldoende SNP-dekking te garanderen.
3. Data-analyse
- Pas de HiC-Pro-pijplijn toe om Capture Hi-C-gegevensanalyse55 uit te voeren. HiC-Pro biedt kwaliteitscontroles bij elke stap van de verwerking, waaronder (figuur 3):
i) De uitlijningssnelheid op het referentiegenoom specificeert de fractie van reads die een ligatieplaats overspant, evenals het aantal paren en singletons.
ii) De fractie van geldige ligatieproducten en niet-informatieve leesparen (bungelende uiteinden, zelfligatie, enz.).
iii) De fractie van korte/lange-afstands- en intra-/interchromosomale contacten.
iv) De fractie van on-target contacten voor Capture Hi-C.
v) De fractie van allelspecifieke waarden indien opgegeven.
OPMERKING: HiC-Pro ondersteunt een breed scala aan protocollen, waaronder in situ Hi-C en Capture Hi-C. In het laatste geval hoeft de gebruiker alleen maar het doelgebied (BED-indeling) op te geven in het configuratiebestand. Zodra de gegevens zijn verwerkt, kunnen de HiC-Pro-uitgangen eenvoudig worden omgezet in een koeler object voor downstream-analyse56. Bij deze stap worden de contactkaarten met verschillende resoluties genormaliseerd met behulp van de ICE-methode die eerder is beschreven door Imakaev en collega's57. Verschillende analyses kunnen vervolgens worden uitgevoerd om chromosoomcompartimenten, TAD's of chromatinelussen aan te roepen (voor beoordeling58). De workflow van het protocol is weergegeven in figuur 4. Hier wordt de 'cooltools'-suite toegepast om de isolatiescore en TADs-grenzen te berekenen, zoals geïllustreerd in figuur 5 en figuur 659.
Representative Results
Het beschreven Capture Hi-C-protocol is gebaseerd op de voorbereiding van het genoombrede 3C-sjabloon met behulp van een vier-base cutter (DpnII). De daaropvolgende verrijking van ligatiefragmenten over het genomische gebied van belang wordt verkregen door hybridisatie van een reeks betegelde RNA-sondes en hun op streptavidin gebaseerde vangst volgens het doelverrijkingssysteem dat in deze studie wordt gebruikt (figuur 1). Gebiotinyleerde RNA-sondes werden geselecteerd omdat ze een nauwere bindingsaffiniteit vertonen met hun doelen in vergelijking met DNA-sondes52,60. Vastgelegde bibliotheken worden vervolgens geïndexeerd en gepoold voor multiplexed high-throughput sequencing. Capture Hi-C-gegevens kunnen worden gevisualiseerd als Hi-C-interactiekaarten met hoge resolutie, maar ook als 4C-achtige single view-point contactkaarten om specifiek de interacties van kleinere sequenties zoals promotors of versterkers binnen het hele vastgelegde gebied te visualiseren. De workflow van het protocol is weergegeven in figuur 4. Pre-sequencing kwaliteitscontroles zijn weergegeven in figuur 2 en omvatten de beoordeling van de juiste vertering en herligatie van de 3C-sjabloon en de efficiënte afschuiving en zuivering ervan in de verschillende stappen van het protocol. Het geschoren 3C-sjabloon-DNA zal naar verwachting tussen 150 en 700 bp lopen en er mag geen verrijking van fragmenten >2 kb worden gedetecteerd. Tijdens de volgende stappen worden verschillende op kralen gebaseerde DNA-opschonings- en grootteselectiestappen uitgevoerd, eerst na het scheren, vervolgens na de PCR's vóór en na de vangst. Gereinigde bibliotheken tonen een duidelijk fragmentverrijkingsprofiel zoals gevisualiseerd op een hooggevoelige DNA-bioanalysator (figuur 2). De gemiddelde fragmentgrootte neemt toe in de loop van de bibliotheekvoorbereiding als gevolg van de ligatie van adapters, sequencing en indexeringsprimers. Post-sequencing kwaliteitscontroles worden verkregen via Hi-C Pro en weergegeven in figuur 3. Veel verschillende bioinformatica software toepassingen zijn voorgesteld voor 3C-achtige gegevensverwerking en -analyse. Onder hen is de HiC-Pro-pijplijn een van de meest populaire oplossingen, waardoor onbewerkte sequencinggegevens kunnen worden verwerkt tot de uiteindelijke contactkaarten met verschillende resoluties55. HiC-Pro maakt gebruik van een tweestaps mappingstrategie om de sequencing reads af te stemmen op het referentiegenoom. De 3C-producten worden vervolgens gereconstrueerd en uitgefilterd om niet-informatieve contactparen te verwijderen en de contactkaarten te genereren. Bovendien is het in staat om een lijst met bekende polymorfismen te gebruiken om allelspecifieke analyse uit te voeren en om de contacten afkomstig van de twee ouderlijke allelen in verschillende contactkaarten te scheiden. Meer recent is HiC-Pro opgenomen en uitgebreid in het nf-core framework (nf-core-hic), waardoor een zeer schaalbare en reproduceerbare community-driven pipeline61,62 wordt geboden.
Om de xic van de muis vast te leggen, werd een array van 28.913 RNA-sondes ontworpen die 3 Mb van het X-chromosoom betegelen. Deze regio omvat de belangrijkste speler in XCI, het lange niet-coderende gen Xist, en het bekende ~ 800 kb regulerende landschap (figuur 5). Dit ~ 800 kb-gebied is verdeeld in twee TAD's: één inclusief de Xist-promotor en zijn bekende positieve regulatoren (d.w.z. de niet-coderende transcripten Ftx, Jpx en Xert en het eiwitcoderende gen Rnf12), en de naburige TAD die de negatieve cis-regulatoren van Xist omvat (d.w.z. zijn antisense-transcript Tsix, het versterkerelement Xite en het niet-coderende transcript Linx) (voor beoordeling44,45).
Door het beschreven Capture Hi-C protocol toe te passen op de Xic werd de topologische organisatie van deze locus verkregen met een ongekende resolutie (Figuur 6 en Figuur 7). Dit is vooral duidelijk wanneer het Capture Hi-C-profiel wordt vergeleken met eerder gepubliceerde 5C47 (figuur 6 en figuur 7; Aanvullende tabel 1) en Hi-C61 (figuur 6 en figuur 7; Aanvullende tabel 1) Profielen. Sub-TAD-structuren zijn bijvoorbeeld duidelijker - de TAD met de Xist-promotor ( Xist-TAD ) is duidelijk onderverdeeld in twee kleinere domeinen (figuur 6A, blauwe pijlpunt). Voorheen kon dit alleen visueel worden "geraden" uit het 5C-profiel (figuur 6B), zij het de detectie van een grens in dit gebied met behulp van het isolatiescore-algoritme. Evenzo maakt de resolutie van het Capture Hi-C-profiel de identificatie mogelijk van twee kleinere domeinen in de naburige TAD (figuur 6A, B), die de promotor van de Tsix-locus ( Tsix-TAD ) bevat; dit werd eerder niet bereikt met 5C (figuur 6B). Van belang is dat topologische grenzen die worden bepaald door de isolatiescore van de Capture Hi-C- en 5C-gegevens over het algemeen worden gedetecteerd op enigszins verschillende locaties en met verschillende relatieve sterktes.
Bovendien zijn andere sub-TAD-structuren zoals contactlussen duidelijk zichtbaar in de Capture Hi-C-gegevens, zoals de lus tussen Xist en Ftx (figuur 7A), eerder geïdentificeerd met Capture-C63, en de lus tussen Xist en Xert (figuur 7B), onlangs geïdentificeerd met behulp van een vergelijkbaar protocol voor Capture Hi-C48. Andere contacten kunnen ook nauwkeuriger in kaart worden gebracht door de verhoogde resolutie van de Capture Hi-C-profielen, zoals die welke de bekende contacthotspots vormen binnen de Tsix-TAD tussen de Linx-, Chic1- en Xite-loci (figuur 7A).
In vergelijking met de Hi-C-gegevens in figuur 7 zorgde Capture Hi-C voor een viervoudige toename van de resolutie, maar het vereiste slechts een vierde van de sequencingdiepte (d.w.z. 126 M leest versus 571 M) (aanvullende tabel 1). Deze toename in resolutie maakt de detectie mogelijk van subTADs en looping-interacties die niet door Hi-C konden worden gedetecteerd op de sequencingdiepte die wordt weergegeven in figuur 6 en figuur 7. Het beschreven protocol voor Capture Hi-C maakt dus een veel gedetailleerdere karakterisering met hoge resolutie van een groot genomisch gebied van belang mogelijk, in vergelijking met eerdere benaderingen.
Figuur 1: Sondeontwerp. Schematische weergave van de strategie die wordt gebruikt voor het ontwerp van de sonde. Regio's van 300 bp stroomopwaarts en stroomafwaarts van elke DpnII-beperkingslocatie in het doelgebied van 3 Mb werden geselecteerd en betegeld met overlappende gebiotinyleerde RNA-sondes. Een van deze geselecteerde regio's wordt getoond, chrX: 102.474.805-102.475.500. Niet meer dan 40 basen van repetitieve sequenties zijn toegestaan in elke sonde. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Hi-C pre-sequencing kwaliteitscontroles vastleggen . (A) Representatief voorbeeld van kwaliteitscontroles van 3C-sjablonen. 200 ng DNA werd geladen op een 1% agarose gel. Baan 1: 1 kb ladder. Baan 2: Onverteerd, verknoopt en intact chromatine loopt als een scherpe band op >10 kb. Baan 3: DpnII-verteerd cross-linked chromatine loopt als een uitstrijkje tussen 1 kb en 3 kb groot. Baan 4: Laatste 3C-bibliotheek of -sjabloon; vrije uiteinden van verteerde verknoopte DNA-fragmenten worden opnieuw geligeerd. Het DNA-uitstrijkje van lagere moleculaire grootte is bijna niet detecteerbaar en het ligatieproduct wordt gedetecteerd als een band van > 10 kb. (B) Representatieve voorbeelden van hooggevoelige bioanalysator-DNA-profielen. Linksboven: succesvol geschoren 3C-bibliotheek met een verdeling van fragmentgrootte tussen 150 bp en 700 bp. Rechtsboven: onbevredigende geschoren 3C-bibliotheek. Ongehoord DNA wordt gedetecteerd als brede verrijking van fragmenten >2 kb. (C) Linksonder: geschoren DNA-monster na een selectie van 1:1 linkerzijde met behulp van SPRI-kralen. Fragmenten van ~300 bp worden verrijkt. Middenonder: Pcr-profiel vooraf vastleggen na ligatie van gekoppelde adapters volgens het protocol van de fabrikant. Rechtsonder: definitieve Capture Hi-C-bibliotheek inclusief adapters, sequencing en indexeringsprimers voor multiplexed sequencing. Afkortingen: bp = baseparen, FU = willekeurige fluorescentie-eenheid. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Leg Hi-C post-sequencing kwaliteitscontroles vast met HiC-Pro . (A) Voorbeeld van mapping rate op het referentiegenoom voor de eerste mate van de sequencingparen. De lichtblauwe fractie vertegenwoordigt de waarden die door HiC-Pro zijn uitgelijnd en een ligatiekruising overspannen. Deze metriek kan dus worden gebruikt om de experimentele ligatiestap te valideren. (B) Zodra sequencing mates zijn uitgelijnd op het genoom, worden alleen uniek uitgelijnde leesparen bewaard voor analyse. (C) Niet-geldige paren (in rood) zoals bungelende uiteinden, zelfcirkels of herligatie worden uit de analyse verwijderd. De fractie van geldige paren is een goede indicator van de ligatie en pull-down efficiëntie. (D) De geldige paren kunnen verder worden onderverdeeld in intra-/interchromosomale en korte/lange-afstandscontacten. Gedupliceerde leesparen die waarschijnlijk PCR-artefacten vertegenwoordigen, worden uit de analyse verwijderd. (E) Voor allel-specifieke analyse rapporteert HiC-Pro het aantal allelische reads ondersteund door een of twee partners voor elk ouderlijk genoom (d.w.z. C57BL / 6J x CASTEi / J). Dezelfde fractie van de lezingen toegewezen aan het moederlijke en vaderlijke allel wordt verwacht. (F) Ten slotte worden alleen geldige paren geselecteerd die het opnamegebied overlappen om de contactkaarten te maken. Capture-capture-paren vertegenwoordigen contacten binnen het beoogde gebied, terwijl capture-reporter-paren interactie tussen de beoogde regio en een off-target regio omvatten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Workflow van het Capture Hi-C-protocol. Schematische weergave van verschillende protocolstappen. Om de genoombrede 3C-sjabloon te genereren, wordt chromatine eerst verknoopt met formaldehyde en vervolgens verteerd met het DpnII-restrictie-enzym. Vrije DNA-uiteinden worden dan opnieuw geligeerd, cross-linking wordt omgekeerd en DNA wordt gezuiverd. Om fragmenten die het doelgebied omvatten te verrijken, wordt een reeks gebiotinyleerde RNA-sondes gehybridiseerd naar de 3C-sjabloon en gevangen door streptavidin-gemedieerde pull-down. Capture-bibliotheken worden verwerkt voor multiplexed sequencing en geldige ligatiefragmenten worden gekwantificeerd om de frequentie van chromatinecontacten over het doel af te leiden, die worden gevisualiseerd als interactiekaarten met hoge resolutie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Overzicht van het gebied dat de Xic op het X-chromosoom van de muis omvat. Schematische weergave van het X-chromosoom van de muis en inzoomen van het 3 Mb vastgelegde gebied (ChrX: 102.475.000-105.475.000). Het beoogde gebied bevat ~800 kb DNA dat overeenkomt met de Xic, de master regulatory locus van XCI. De Xic bevat de lange niet-coderende genen, Xist, een belangrijke speler van XCI, en zijn regelgevende landschap. Positieve regulatoren van Xist worden weergegeven in het groen en negatieve regulatoren in paars. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Afbeelding 6: Leg Hi-C-, 5C- en Hi-C-interactiekaarten vast in het vastgelegde gebied van 3 Mb. (A) Leg Hi-C-interactiekaart vast van het 3 Mb-doel dat de muis Xic omvat met een resolutie van 10 kb (deze studie). (B) 5C-interactiekaart van hetzelfde doelgebied als in A met een resolutie van 6 kb (gegevens opnieuw verwerkt vanaf47). Repetitieve gebieden die niet in de analyses zijn opgenomen, worden in het wit gemaskeerd. De 5C-gegevens vereisen hun eigen bioinformatica-verwerking (zie47). Na het reinigen en uitlijnen worden de 5C-kaarten met de primerresolutie in de prullenbak gegooid met behulp van een lopende mediaan (venster = 30 kb, stap = 5) om een uiteindelijke resolutie van 6 kb te bereiken. (C) Hi-C-interactiekaart van hetzelfde genomische gebied als in A en B met een resolutie van 40 kb (gegevens opnieuw verwerkt vanaf64). Alle interactiekaarten zijn gegenereerd op basis van muis-SER's. De isolatiescore is berekend met behulp van cooltools en wordt weergegeven als histogrammen met isolatieminima's aan TAD-grenzen. TAD-grenzen worden weergegeven als verticale lijnen onder de kaart. De hoogte van elke lijn geeft de grenssterkte aan. Genen worden weergegeven als pijlen die in de richting van transcriptie wijzen. Sub-TAD-grenzen die uitsluitend of nauwkeuriger worden gedetecteerd in Capture Hi-C-kaarten worden aangegeven met magenta en blauwe pijlpunten voor sub-TAD's in respectievelijk de Tsix- en Xist-TAD's. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Afbeelding 7: Leg Hi-C-, 5C- en Hi-C-interactiekaarten vast over 1 Mb binnen het vastgelegde gebied. (A) Leg Hi-C-interactiekaart vast van het 1 Mb genomische gebied dat de muis Xic omvat met een resolutie van 5 kb (deze studie). (B) 5C-interactiekaart van hetzelfde genomische gebied als in A. bij een resolutie van 6 kB (gegevens opnieuw verwerkt vanaf47). Repetitieve gebieden die niet in de analyses zijn opgenomen, worden in het wit gemaskeerd. Van belang is dat de 5C-gegevens hun eigen bioinformatica-verwerking vereisen (zie47). Na het reinigen en uitlijnen worden de 5C-kaarten met de primerresolutie in de prullenbak gegooid met behulp van een lopende mediaan (venster = 30 kb, stap = 5) om een uiteindelijke resolutie van 6 kb te bereiken. (C) Hi-C-interactiekaart van hetzelfde genomische gebied als in A en B van Hi-C met een resolutie van 20 kb (gegevens opnieuw verwerkt vanaf64). Alle interactiekaarten zijn gegenereerd vanuit mESC's. De isolatiescore is berekend met behulp van cooltools en wordt weergegeven als histogrammen met isolatieminima's aan TAD-grenzen. TAD-grenzen worden weergegeven als verticale lijnen onder de kaart. De hoogte van elke lijn geeft de grenssterkte aan. Genen worden weergegeven als pijlen die wijzen naar de richting van transcriptie. Contactlussen die uitsluitend of nauwkeuriger worden gedetecteerd in Capture Hi-C worden aangegeven met magenta en blauwe sterretjes voor lussen in respectievelijk de Tsix en Xist TAD's. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Aanvullende tabel 1: Post-sequencing statistieken voor de datasets gebruikt in dit manuscript: Capture Hi-C (deze studie), Hi-C64, en 5C47. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Discussion
Hier beschrijven we een relatief snel en eenvoudig Capture Hi-C-protocol om de hogere orde organisatie van genomische regio's ter grootte van megabases te karakteriseren met een resolutie van 5-10 kb. Capture Hi-C behoort tot de familie van Capture-C-technologieën die zijn ontworpen om gerichte chromatine-interacties van genoombrede 3C- of Hi-C-sjablonen te verrijken. Tot op heden is de grote meerderheid van Capture-C-toepassingen gebruikt om chromatinecontacten van relatief kleine regulerende elementen verspreid over het hele genoom in kaart te brengen. In het eerste Capture-C-protocol werden meerdere overlappende RNA-biotinyleerde sondes gebruikt om >400 vooraf geselecteerde promotors vast te leggen in 3C-bibliotheken bereid uit erytroïde cellen31. Dezelfde strategie werd vervolgens verbeterd in Next Generation (NG) en Nuclear Titrated (NuTi) Capture-C om interactieprofielen met hoge resolutie van >8.000 promotors te bereiken door gebruik te maken van enkel 120 bp DNA-aas verspreid over enkele restrictielocaties en twee opeenvolgende rondes van Capture om de verrijking van informatieve ligatiefragmenten te maximaliseren32,40. Deze strategieën leidden tot de functionele dissectie van cis-werkende elementen in veel verschillende contexten, waaronder embryonale ontwikkeling van muizen, celdifferentiatie, X-chromosoominactivatie en genmisregulatie in pathologische omstandigheden 46,63,65,66,67,68,69,70,71.
In Promoter Capture Hi-C (PCHi-C) werden >22.000 geannoteerde promotors met restrictiefragmenten uit Hi-C-bibliotheken gehaald door hybridisatie van enkele RNA 120-mer gebiotinyleerde sondes aan een of beide uiteinden van het restrictiefragment34,72. Deze methode maakte dissectie mogelijk van het interactoom van duizenden promotors in een snel toenemend aantal celtypen, waaronder embryonale stamcellen van muizen, foetale levercellen en adipocyten 34,35,72,73, maar ook menselijke lymfoblastoïde lijnen, hematopoietische voorlopercellen, epidermale keratinocyten en pluripotente cellen 37,74,75,76,77.
In vergelijking met deze doelverrijkingstechnologieën richt Capture Hi-C zich op aaneengesloten genomische regio's tot op de megabaseschaal, waardoor een of meer TAD's worden overspannen en regulerende landschappen van genen worden omvat. Het hele gebied van belang moet worden betegeld met een reeks gebiotinyleerde sondes die elke DpnII-beperkingslocatie binnen het doelwit omvatten. De hybridisatie van de gebiotinyleerde array naar de 3C-sjabloon, de daaropvolgende op streptavidin gebaseerde opname en verwerking voor multiplexed sequencing wordt uitgevoerd met behulp van een doelverrijkingssysteem voor Illumina Paired-End multiplexed sequencing. Het hele protocol is snel, omdat het in 1 week kan worden uitgevoerd, van 3C-bibliotheekvoorbereiding tot NGS-sequencing, en het vereist slechts kleine aanpassingen en / of aangepaste specifieke probleemoplossing.
Het protocol biedt ook voordelen in vergelijking met andere 3C-gebaseerde methoden. Om interactiekaarten met een resolutie van 5-10 kb te verkrijgen, hebben we 100-120 M paired-end reads gesequenced. Ter vergelijking gebruikten we hier een Hi-C-dataset van 571 M-reads om een resolutie van 20 kb64 (GSM2053973) te bereiken, en ten minste 1 miljard reads zouden nodig zijn om een resolutie van 5 kb te bereiken met chromosoombrede Hi-C22.
Capture Hi-C zoals gebruikt in deze studie bereikt een veel hogere resolutie dan de eerder gepubliceerde 5C op basis van een 6-bp cutterrestrictie-enzym47 (aanvullende tabel 1). Belangrijk is dat de strategie die is ontworpen om gerichte interacties in 5C te verrijken en te versterken, geen allelspecifieke analyse van chromatine-interacties mogelijk maakt. Integendeel, Capture Hi-C-gegevens kunnen allelspecifiek in kaart worden gebracht, waardoor de 3D-structurele landschappen van paren homologe chromosomen kunnen worden ontleed, bijvoorbeeld in menselijke cellen of in F1 hybride cellijnen afgeleid door genetisch verschillende muizenstammen te kruisen78. Om allel-specifieke Capture Hi-C-interactiekaarten met een resolutie van 5 kb te genereren, hebben we 150 bp paired-end reads gesequenced om de SNP-dekking te vergroten. Soortgelijke allelspecifieke benaderingen kunnen worden toegepast op menselijke cellijnen, waarvoor de annotatie van SNP's beschikbaar is22.
Belangrijk is dat, hoewel Capture Hi-C over het algemeen een hoge resolutie garandeert en tegelijkertijd de betaalbaarheid van sequencingkosten verbetert, de productie van op maat gemaakte gebiotinyleerde oligonucleotiden een impact heeft op de totale kosten van deze methode. Daarom zal de keuze van de meest geschikte 3C-methode verschillen voor verschillende toepassingen en afhangen van de biologische vraag die wordt aangepakt en de vereiste resolutie, evenals de grootte van het interessegebied. Andere Capture Hi-C-protocollen die zijn ontwikkeld, delen belangrijke functies met het protocol dat hier wordt beschreven. Er werd bijvoorbeeld een Capture Hi-C-strategie toegepast om ~ 50 kb tot 1 Mb genomische regio's te karakteriseren die niet-coderende varianten omvatten die verband houden met het risico op borst- en colorectale kanker; in dit protocol werden doelgebieden uit Hi-C-bibliotheken gehaald door 120-mer RNA-aas te hybridiseren en de doelgebieden te betegelen met een 3x dekkingvan 33,38,79. Op dezelfde manier werd HYbrid Capture Hi-C (Hi-C 2) gebruikt om interacties binnen interessante regio's tot2 Mb80 te targeten. In beide protocollen verhoogde het gebruik van een Hi-C-sjabloon verrijkt voor biotine pull-down ligatiefragmenten het percentage totale informatieve lezingen in vergelijking met ons protocol. In de Hi-C-dataset die we hier hebben gebruikt voor vergelijking64 (GSM2053973), is het percentage geldige paren na het verwijderen van duplicaten bijvoorbeeld 4,8 keer hoger dan de geldige paren verkregen in Capture Hi-C zoals beschreven in figuur 3 en aanvullende tabel 1. De opeenvolgende pull-down van gebiotinyleerde geligeerde fragmenten en gehybridiseerde sondes maakt het protocol echter aanzienlijk complexer en tijdrovender, terwijl de complexiteit van het gevangen gebied mogelijk wordt verminderd.
Een andere beschikbare methode om 3C-sjablonen te verrijken met tegelsondes is Tiled-C, dat werd toegepast om chromatine-architectuur te bestuderen met een hoge ruimtelijke en temporele resolutie tijdens de erytroïde differentiatie van de muis43. In Tiled-C wordt een panel van 70 bp gebiotinyleerde sondes gebruikt om contacten binnen grootschalige regio's te verrijken in twee opeenvolgende opnamerondes om kaarten met zeer hoge resolutie van gerichte interacties te genereren43,81. De dubbele opnameverrijking maakt het protocol ook langer en complexer in vergelijking met Capture Hi-C. In tegenstelling tot de Capture-C-strategieën die zich richten op afzonderlijke beperkingslocaties, lijkt de tweede opnameronde in Tiled-C de opname-efficiëntie echter niet significant te verhogen en kan daarom waarschijnlijk worden weggelaten43. Ten slotte werd een vergelijkbare tegelbenadering op basis van dezelfde doelverrijkingsstrategie die in deze studie werd gebruikt, toegepast op de dissectie van regulerende landschappen die structurele varianten omvatten die worden beschreven bij patiënten met aangeboren misvormingen en opnieuw worden ontworpen in transgene muizen41,42. In dit geval is de betegelingsarray van sondes ontworpen over het hele doel in plaats van in de nabijheid van DpnII-beperkingslocaties41. Niettemin was dit werk baanbrekend in het benadrukken van de gevoeligheid en kracht van deze strategie om een hoge resolutie karakterisering van grote genomische regio's in verschillende contexten te bereiken41,42,48.
Kortom, het hier beschreven protocol vertegenwoordigt een eenvoudige, robuuste en krachtige strategie voor de 3D-karakterisering met hoge resolutie van alle genomische regio's van belang. De toepassing van deze benadering op verschillende modelsystemen, celtypen, ontwikkelingsgereguleerde chromatinelandschappen en genregulatie in gezonde en pathologische omstandigheden zal waarschijnlijk ons begrip van de wisselwerking en causaliteit tussen genoomtopologie en genregulatie vergemakkelijken, een van de fundamentele open vragen op het gebied van epigenetica. Bovendien heeft het toepassen van Capture Hi-C om langeafstandsinteracties en hogere-orde chromatinevouwing van risicovarianten geïdentificeerd door GWAS-studies in kaart te brengen, het potentieel om de functionele relevantie van niet-coderende genomische loci geassocieerd met menselijke ziekten in verschillende contexten te onthullen, waardoor nieuwe inzichten worden verkregen in de processen die mogelijk ten grondslag liggen aan pathogenese.
Disclosures
Kai Hauschulz is Field Application Scientist bij Agilent Technologies - Diagnostic and Genomics Group. Alle andere auteurs verklaren geen tegenstrijdige belangen te hebben.
Acknowledgments
Het werk in het Heard-laboratorium werd ondersteund door een European Research Council Advanced Investigator award (XPRESS - AdG671027). A.L. wordt ondersteund door een Marie Skłodowska-Curie Actions Individual Fellowship van de Europese Unie (IF-838408). A.H. wordt ondersteund door het ITN Innovative and Interdisciplinary Network ChromDesign, onder de Marie Skłodowska-Curie Grant overeenkomst 813327. De auteurs zijn Daniel Ibrahim (MPI for Molecular Genetics, Berlijn) dankbaar voor nuttig technisch advies, het NGS-platform van het Institut Curie (Parijs) en Vladimir Benes en de Genomics Core Facility van EMBL (Heidelberg) voor ondersteuning en assistentie.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x PBS pH 7.4 | Gibco | 10010-023 | |
| 37% (vol/vol) paraformaldehyde solution | Electron Microscopy Sciences | 15686 | single use glass-vials; do not reuse |
| 50 mL PP conical tube | Falcon | 352070 | |
| Agarose | Sigma | A9539-500g | |
| Bioanalyzer | Agilent | G2939BA | |
| Cell Scrapers - 25 cm Handle and 3.0 cm Blade | Falcon | 353089 | |
| CHIR99021 | Axon Medchem BV | Axon 1386 | |
| cOmplete Mini, Protease inhibitor cocktail (EDTA-free) | Merck | 11836170001 | |
| Countess Cell Counting Chamber Slides | Invitrogen | C10228 | |
| Countess II FL | Invitrogen | ZGEXSCCOUNTESS2FL | Automated cell counter |
| Covaris S2 | Covaris | 500217 | Sonicator |
| DNA LoBind tube, 1.5 mL | Eppendorf | 30108051 | |
| DpnII (50000 units/mL) | New England Biolabs | R0543M | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Merck | D6429 | |
| Ethanol (100%) | Merck | 1.00983.2500 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Thermo Scientific | 10270106 | |
| gelatine from porcine skin | Sigma | G1890 | |
| GeneRuler 1 kb Plus DNA Ladder | Thermo Scientific | SM0313 | |
| GlycoBlue | Thermo Scientific | AM9516 | Coprecipitant |
| High-Sensitivity Bioanlayzer chips | Agilent | 5067-4626 | |
| Large Cooling Centrifuge 5920 R | Eppendorf | 5948000018 | |
| leukaemia inhibitory factor (LIF) | Merck | ESG1107 | |
| Liquiport | KNF | NF300 | Benchtop aspiration system |
| Low-binding filter tips | Biozym | VT0260U, VT0240, VT0220, VT0200U | |
| Molecular biology grade water | Merck | W3500-6x500ML | |
| Next Seq 500 | Illumina | SY-415-1001 | |
| Next Seq 500 High Output v2 Kit (300 cycles) | Illumina | FC-404-2004 | |
| Nonidet P40 Substitute (NP40) | Merck | 11332473001 | |
| PD0325901 | Axon Medchem BV | Axon 1408 | |
| Protease inhibitor cocktail (EDTA-free) | Merck | 11873580001 | |
| Proteinase K - recombinant, PCR-grade (20 mg/mL) | Thermo Scientific | EO0491 | |
| Qubit 2.0 | Thermo Scientific | Q32871 | |
| Qubit assay tubes | Thermo Scientific | Q32856 | |
| Qubit dsDNA High Sensitivity kit | Thermo Scientific | Q32851 | |
| RNase A (10 mg/mL) | Thermo Scientific | EN0531 | |
| Sodium acetate pH 5.2 (3M) | Merck | S7899 | |
| speed vacuum concentrator | Eppendorf | EP5305000100-1EA | |
| Agencourt AMPureXP | Beckman Coulter | A63881 | SPRI beads |
| SureSelect Target Enrichment Box 1 | Agilent | 5190-8645 | |
| SureSelect Target Enrichment Kit ILM Indexing Hyb Module Box 2 | Agilent | 5190-4455 | |
| SureSelect XT Library Prep Kit ILM | Agilent | 5500-0132 | |
| T4 ligase (30 units/µL) | Thermo Scientific | EL0013 | |
| table-top Centrifuge 5427 R | Eppendorf | 5409000012 | |
| Triton-X-100 (500 mL) | Merck | X100-500ML | |
| Trypan Blue | Invitrogen | T10282 | |
| Trypsine | Thermo Scientific | 25300054 | |
| UltraPure Glycine | Thermo Scientific | 15527013 | |
| β-mercaptoethanol | Thermo Scientific | 31350010 |
References
- Ibrahim, D. M., Mundlos, S. The role of 3D chromatin domains in gene regulation: a multi-facetted view on genome organization. Current Opinion in Genetics & Development. 61, 1-8 (2020).
- Bolt, C. C., Duboule, D. The regulatory landscapes of developmental genes. Development. 147 (3), (2020).
- Glaser, J., Mundlos, S. 3D or not 3D: Shaping the genome during development. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 14 (5), 040188 (2021).
- Denker, A., De Laat, W. The second decade of 3C technologies: detailed insights into nuclear organization. Genes & Development. 30 (12), 1357-1382 (2016).
- Kempfer, R., Pombo, A. Methods for mapping 3D chromosome architecture. Nature Reviews Genetics. 21 (4), 207-226 (2020).
- McCord, R. P., Kaplan, N., Giorgetti, L. Chromosome conformation capture and beyond: Toward an integrative view of chromosome structure and function. Molecular Cell. 77 (4), 688-708 (2020).
- Jerkovic, I., Cavalli, G. Understanding 3D genome organization by multidisciplinary methods. Nature ReviewsMolecular Cell Biology. 22 (8), 511-528 (2021).
- Hsieh, T. -H. S., et al. Mapping nucleosome resolution chromosome folding in yeast by Micro-C. Cell. 162 (1), 108-119 (2015).
- Krietenstein, N., et al. Ultrastructural details of mammalian chromosome architecture. Molecular Cell. 78 (3), 554-565 (2020).
- Dekker, J., Rippe, K., Dekker, M., Kleckner, N.
- Naumova, N., Smith, E. M., Zhan, Y., Dekker, J. Analysis of long-range chromatin interactions using Chromosome Conformation Capture. Methods. 58 (3), 192-203 (2012).
- Simonis, M., et al. Nuclear organization of active and inactive chromatin domains uncovered by chromosome conformation capture-on-chip (4C). Nature Genetics. 38 (11), 1348-1354 (2006).
- Zhao, Z., et al. Circular chromosome conformation capture (4C) uncovers extensive networks of epigenetically regulated intra-and interchromosomal interactions. Nature Genetics. 38 (11), 1341-1347 (2006).
- Würtele, H., Chartrand, P. Genome-wide scanning of HoxB1-associated loci in mouse ES cells using an open-ended Chromosome Conformation Capture methodology. Chromosome Research. 14 (5), 477-495 (2006).
- De Wit, E., De Laat, W. A decade of 3C technologies: insights into nuclear organization. Genes & Development. 26 (1), 11-24 (2012).
- Dostie, J., et al. Chromosome Conformation Capture Carbon Copy (5C): a massively parallel solution for mapping interactions between genomic elements. Genome Research. 16 (10), 1299-1309 (2006).
- Splinter, E., et al. The inactive X chromosome adopts a unique three-dimensional conformation that is dependent on Xist RNA. Genes & Development. 25 (13), 1371-1383 (2011).
- Ferraiuolo, M. A., Sanyal, A., Naumova, N., Dekker, J., Dostie, J. From cells to chromatin: capturing snapshots of genome organization with 5C technology. Methods. 58 (3), 255-267 (2012).
- Kim, J. H., et al. 5C-ID: Increased resolution Chromosome-Conformation-Capture-Carbon-Copy with in situ 3C and double alternating primer design. Methods. 142, 39-46 (2018).
- Lieberman-Aiden, E., et al. Comprehensive mapping of long-range interactions reveals folding principles of the human genome. Science. 326 (5950), 289-293 (2009).
- Zhang, Y., et al. Spatial organization of the mouse genome and its role in recurrent chromosomal translocations. Cell. 148 (5), 908-921 (2012).
- Rao, S. S. P., et al. A 3D map of the human genome at kilobase resolution reveals principles of chromatin looping. Cell. 159 (7), 1665-1680 (2014).
- Dixon, J. R., et al. Topological domains in mammalian genomes identified by analysis of chromatin interactions. Nature. 485 (7398), 376-380 (2012).
- Nora, E. P., et al. Spatial partitioning of the regulatory landscape of the X-inactivation centre. Nature. 485 (7398), 381-385 (2012).
- Krefting, J., Andrade-Navarro, M. A., Ibn-Salem, J. Evolutionary stability of topologically associating domains is associated with conserved gene regulation. BMC Biology. 16 (1), 87 (2018).
- Galupa, R., Heard, E. Topologically associating domains in chromosome architecture and gene regulatory landscapes during development, disease, and evolution. Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 82, 267-278 (2017).
- Tena, J. J., Santos-Pereira, J. M. Topologically associating domains and regulatory landscapes in development, evolution and disease. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 702787 (2021).
- Lupiáñez, D. G., Spielmann, M., Mundlos, S. Breaking TADs: How alterations of chromatin domains result in disease. Trends in Genetics. 32 (4), 225-237 (2016).
- Davidson, I. F., Peters, J. -M. Genome folding through loop extrusion by SMC complexes. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 22 (7), 445-464 (2021).
- Schmitt, A. D., Hu, M., Ren, B. Genome-wide mapping and analysis of chromosome architecture. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (12), 743-755 (2016).
- Hughes, J. R., et al. Analysis of hundreds of cis-regulatory landscapes at high resolution in a single, high-throughput experiment. Nature Genetics. 46 (2), 205-212 (2014).
- Davies, J. O. J., et al. Multiplexed analysis of chromosome conformation at vastly improved sensitivity. Nature Methods. 13 (1), 74-80 (2016).
- Jäger, R., et al. Capture Hi-C identifies the chromatin interactome of colorectal cancer risk loci. Nature Communications. 6, 6178 (2015).
- Schoenfelder, S., et al. The pluripotent regulatory circuitry connecting promoters to their long-range interacting elements. Genome Research. 25 (4), 582-597 (2015).
- Sahlén, P., et al. Genome-wide mapping of promoter-anchored interactions with close to single-enhancer resolution. Genome Biology. 16, 156 (2015).
- Joshi, O., et al. Dynamic reorganization of extremely long-range promoter-promoter interactions between two states of pluripotency. Cell Stem Cell. 17 (6), 748-757 (2015).
- Mifsud, B., et al. Mapping long-range promoter contacts in human cells with high-resolution capture Hi-C. Nature Genetics. 47 (6), 598-606 (2015).
- Dryden, N. H., et al. Unbiased analysis of potential targets of breast cancer susceptibility loci by Capture Hi-C. Genome Research. 24 (11), 1854-1868 (2014).
- Oudelaar, A. M., Davies, J. O. J., Downes, D. J., Higgs, D. R., Hughes, J. R. Robust detection of chromosomal interactions from small numbers of cells using low-input Capture-C. Nucleic Acids Research. 45 (22), 184 (2017).
- Oudelaar, A. M., et al. Single-allele chromatin interactions identify regulatory hubs in dynamic compartmentalized domains. Nature Genetics. 50 (12), 1744-1751 (2018).
- Franke, M., et al. Formation of new chromatin domains determines pathogenicity of genomic duplications. Nature. 538 (7624), 265-269 (2016).
- Despang, A., et al. Functional dissection of the Sox9-Kcnj2 locus identifies nonessential and instructive roles of TAD architecture. Nature Genetics. 51 (8), 1263-1271 (2019).
- Oudelaar, A. M., et al. Dynamics of the 4D genome during in vivo lineage specification and differentiation. Nature Communications. 11 (1), 1-12 (2020).
- Galupa, R., Heard, E. X-chromosome inactivation: A crossroads between chromosome architecture and gene regulation. Annual Review of Genetics. 52, 535-566 (2018).
- Loda, A., Collombet, S., Heard, E. Gene regulation in time and space during X-chromosome inactivation. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 23 (4), 231-249 (2022).
- van Bemmel, J. G., et al. The bipartite TAD organization of the X-inactivation center ensures opposing developmental regulation of Tsix and Xist. Nature Genetics. 51 (6), 1024-1034 (2019).
- Galupa, R., et al. A conserved noncoding locus regulates random monoallelic Xist expression across a topological boundary. Molecular Cell. 77 (2), 352-367 (2020).
- Gjaltema, R. A. F., et al. Distal and proximal cis-regulatory elements sense X chromosome dosage and developmental state at the Xist locus. Molecular Cell. 82 (1), 190-208 (2022).
- Galupa, R., et al. Inversion of a topological domain leads to restricted changes in its gene expression and affects inter-domain communication. Development. 149 (9), (2022).
- Savarese, F., Flahndorfer, K., Jaenisch, R., Busslinger, M., Wutz, A. Hematopoietic precursor cells transiently reestablish permissiveness for X inactivation. Molecular and Cellular Biology. 26 (19), 7167-7177 (2006).
- Schulz, E. G., et al. The two active X chromosomes in female ESCs block exit from the pluripotent state by modulating the ESC signaling network. Cell Stem Cell. 14 (2), 203-216 (2014).
- Gnirke, A., et al. Solution hybrid selection with ultra-long oligonucleotides for massively parallel targeted sequencing. Nature Biotechnology. 27 (2), 182-189 (2009).
- Akgol Oksuz, B., et al. Systematic evaluation of chromosome conformation capture assays. Nature Methods. 18 (9), 1046-1055 (2021).
- Piccinini, F., Tesei, A., Arienti, C., Bevilacqua, A. Cell counting and viability assessment of 2D and 3D Cell cultures: Expected reliability of the trypan blue assay. Biological Procedures Online. 19 (1), 8 (2017).
- Servant, N., et al. HiC-Pro: an optimized and flexible pipeline for Hi-C data processing. Genome Biology. 16, 259 (2015).
- Abdennur, N., Mirny, L. A. Cooler: scalable storage for Hi-C data and other genomically labeled arrays. Bioinformatics. 36 (1), 311-316 (2020).
- Imakaev, M., et al. Iterative correction of Hi-C data reveals hallmarks of chromosome organization. Nature Methods. 9 (10), 999-1003 (2012).
- Forcato, M., et al. Comparison of computational methods for Hi-C data analysis. Nature Methods. 14 (7), 679-685 (2017).
- Venev, S., et al. open2c/cooltools: v0.4.1. , (2021).
- Wages, J. M. NUCLEIC ACIDS | Immunoassays. Encyclopedia of Analytical Science. , Elsevier. 408-417 (2005).
- Ewels, P. A., et al. The nf-core framework for community-curated bioinformatics pipelines. Nature Biotechnology. 38 (3), 276-278 (2020).
- Servant, N., Peltzer, A.
- Furlan, G., et al. The Ftx noncoding locus controls X chromosome inactivation independently of its RNA products. Molecular Cell. 70 (3), 462-472 (2018).
- Giorgetti, L., et al. Structural organization of the inactive X chromosome in the mouse. Nature. 535 (7613), 575-579 (2016).
- Simon, C. S., et al. Functional characterisation of cis-regulatory elements governing dynamic Eomes expression in the early mouse embryo. Development. 144 (7), 1249-1260 (2017).
- Williams, R. M., et al. Reconstruction of the global neural crest gene regulatory network in vivo. Developmental Cell. 51 (2), 255-276 (2019).
- Godfrey, L., et al. DOT1L inhibition reveals a distinct subset of enhancers dependent on H3K79 methylation. Nature Communications. 10 (1), 2803 (2019).
- Hanssen, L. L. P., et al. Tissue-specific CTCF-cohesin-mediated chromatin architecture delimits enhancer interactions and function in vivo. Nature Cell Biology. 19 (8), 952-961 (2017).
- Larke, M. S. C., et al. Enhancers predominantly regulate gene expression during differentiation via transcription initiation. Molecular Cell. 81 (5), 983-997 (2021).
- Oudelaar, A. M., et al. A revised model for promoter competition based on multi-way chromatin interactions at the α-globin locus. Nature Communications. 10 (1), 5412 (2019).
- Long, H. K., et al. Loss of extreme long-range enhancers in human neural crest drives a craniofacial disorder. Cell Stem Cell. 27 (5), 765-783 (2020).
- Schoenfelder, S., Javierre, B. -M., Furlan-Magaril, M., Wingett, S. W., Fraser, P. Promoter Capture Hi-C: High-resolution, genome-wide profiling of promoter interactions. Journal of Visualized Experiments. (136), e57320 (2018).
- Siersbæk, R., et al. Dynamic rewiring of promoter-anchored chromatin loops during adipocyte differentiation. Molecular Cell. 66 (3), 420-435 (2017).
- Rubin, A. J., et al. Lineage-specific dynamic and pre-established enhancer-promoter contacts cooperate in terminal differentiation. Nature Genetics. 49 (10), 1522-1528 (2017).
- Freire-Pritchett, P., et al. Global reorganisation of cis-regulatory units upon lineage commitment of human embryonic stem cells. eLife. 6, 21926 (2017).
- Javierre, B. M., et al. Lineage-specific genome architecture links enhancers and non-coding disease variants to target gene promoters. Cell. 167 (5), 1369-1384 (2016).
- Miguel-Escalada, I., et al. Human pancreatic islet three-dimensional chromatin architecture provides insights into the genetics of type 2 diabetes. Nature Genetics. 51 (7), 1137-1148 (2019).
- Keane, T. M., et al. Mouse genomic variation and its effect on phenotypes and gene regulation. Nature. 477 (7364), 289-294 (2011).
- Baxter, J. S., et al. Capture Hi-C identifies putative target genes at 33 breast cancer risk loci. Nature Communications. 9 (1), 1028 (2018).
- Sanborn, A. L., et al. Chromatin extrusion explains key features of loop and domain formation in wild-type and engineered genomes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (47), 6456-6465 (2015).
- Owens, D. D. G., et al. Dynamic Runx1 chromatin boundaries affect gene expression in hematopoietic development. Nature Communications. 13 (1), 773 (2022).
