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Medicine

मुराइन आंतों मेसेनचाइम का अलगाव जिसके परिणामस्वरूप टेलोसाइट्स की उच्च उपज होती है

Published: March 24, 2023 doi: 10.3791/64169
Automatic Translation
*1, *1,2, 2, 1
1Department of Developmental Biology and Cancer Research, The Institute for Medical Research Israel-Canada, The Hebrew University - Hadassah Medical School, 2Shanghai Institute of Immunology, Department of Immunology and Microbiology, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine
* These authors contributed equally

Summary

यहां, हम टेलोसाइट्स सहित मुराइन आंतों मेसेनकाइमल को अलग करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। इनका उपयोग कई अनुप्रयोगों के लिए किया जा सकता है, जैसे कि माउस या मानव-व्युत्पन्न ऑर्गेनोइड्स के साथ सह-संस्कृति, विकास का समर्थन करने और मूल ऊतक में स्थिति को बेहतर ढंग से प्रतिबिंबित करने के लिए।

Abstract

मुराइन छोटी आंत, या बृहदान्त्र मेसेनकाइमल, अत्यधिक हेटरोजेनस है, जिसमें रक्त और लसीका एंडोथेलियम, नसों, फाइब्रोब्लास्ट्स, मायोफाइब्रोब्लास्ट्स, चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं, प्रतिरक्षा कोशिकाओं और हाल ही में पहचाने गए सेल प्रकार, टेलोसाइट्स सहित अलग-अलग सेल प्रकार होते हैं। टेलोसाइट्स लंबी साइटोप्लाज्मिक प्रक्रियाओं के साथ अद्वितीय मेसेनकाइमल कोशिकाएं हैं, जो कोशिका शरीर से दसियों से सैकड़ों माइक्रोन की दूरी तक पहुंचती हैं। टेलोसाइट्स हाल ही में एक महत्वपूर्ण आंतों के स्टेम सेल आला घटक के रूप में उभरे हैं, जो डब्ल्यूएनटी प्रोटीन प्रदान करते हैं जो स्टेम और पूर्वज सेल प्रसार के लिए आवश्यक हैं।

यद्यपि माउस आंत से मेसेनचाइम को अलग करने के तरीके पर प्रोटोकॉल उपलब्ध हैं, यह स्पष्ट नहीं है कि क्या ये प्रक्रियाएं टेलोसाइट्स के कुशल अलगाव की अनुमति देती हैं। टेलोसाइट्स को कुशलतापूर्वक अलग करने के लिए विशेष प्रोटोकॉल समायोजन की आवश्यकता होती है जो उनकी व्यवहार्यता को प्रभावित किए बिना टेलोसाइट्स और पड़ोसी कोशिकाओं के बीच मजबूत सेल-सेल संपर्क के पृथक्करण की अनुमति देगा। यहां, उपलब्ध आंतों के मेसेनचाइम अलगाव प्रोटोकॉल को मेसेनचाइम के सफल अलगाव और संस्कृति का समर्थन करने के लिए समायोजित किया गया था जिसमें व्यवहार्य एकल-कोशिका टेलोसाइट्स की अपेक्षाकृत उच्च उपज होती है।

प्राप्त एकल-सेल निलंबन का विश्लेषण कई तकनीकों द्वारा किया जा सकता है, जैसे इम्यूनोस्टेनिंग, सेल सॉर्टिंग, इमेजिंग और एमआरएनए प्रयोग। यह प्रोटोकॉल टेलोसाइट्स के पर्याप्त रूप से संरक्षित एंटीजेनिक और कार्यात्मक गुणों के साथ मेसेनचाइमल पैदा करता है, और इसका उपयोग कई अनुप्रयोगों के लिए किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, उनका उपयोग माउस- या मानव-व्युत्पन्न ऑर्गेनोइड्स के साथ सह-संस्कृति के लिए किया जा सकता है ताकि बिना किसी विकास कारक पूरक के ऑर्गेनोइड विकास का समर्थन किया जा सके, ताकि मूल ऊतक में स्थिति को बेहतर ढंग से प्रतिबिंबित किया जा सके।

Introduction

स्टेम कोशिकाओं की उपस्थिति के कारण छोटी आंत और बृहदान्त्र दोनों अत्यधिक पुनर्योजी ऊतक हैं, जो प्रसार और ईंधन पुनर्जनन1. एपिथेलियम के आसपास का मेसेनकाइमल बाह्य मैट्रिक्स प्रोटीन और सिग्नलिंग अणुओं 2 को स्रावित करके संरचनात्मक और कार्यात्मक समर्थन प्रदान करता है, जो उपकला कोशिकाओं की प्रतिक्रिया कोसंशोधित करता है। टेलोसाइट्स बड़े मेसेनकाइमल कोशिकाएं हैं, जिन्हें मुख्य रूप से इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी द्वारा टेलोपोड्स नामक लंबी साइटोप्लाज्मिक प्रक्रियाओं वाली कोशिकाओं के रूप में वर्णित किया गया है, जो एक भूलभुलैया नेटवर्क 3,4,5,6,7 बनाने के लिए ओवरलैप करते हैं। हाल ही में, प्रतिलेखन कारक FOXL1 को व्यक्त करने वाले आंतों के टेलोसाइट्स डब्ल्यूएनटी प्रोटीन प्रदान करने वाले एक महत्वपूर्ण स्टेम सेल आला घटक के रूप में उभरे हैं, जो स्टेम और पूर्वज सेल फ़ंक्शन के लिए महत्वपूर्ण हैं। आंतों के टेलोसाइट्स प्रमुख सिग्नलिंग मार्ग प्रोटीन जैसे डब्ल्यूएनटी, बीएमपी, टीजीएफबी और एसएचएच के उच्च स्तर को व्यक्त करते हैं, साथ ही साथ कई विकास कारक8.

यह देखते हुए कि टेलोसाइट्स विवो में एक महत्वपूर्ण स्टेम सेल आला घटक हैं, उन्हें अलग करने और कल्चर करने के लिए प्रोटोकॉल विकसित करने से विकास और भेदभाव का समर्थन करने के लिए अणुओं और विकास कारकों को संकेत देने के लिए एक स्रोत के रूप में उनका उपयोग करने की अनुमति मिलेगी। अच्छी तरह से स्थापित प्रोटोकॉल का उपयोग करके, बृहदान्त्र या आंतों के उपकला क्रिप्ट को अलग किया जा सकता है और 3 डी संरचनाओं का निर्माण किया जा सकता है जिन्हें ऑर्गेनोइड्स 9,10,11 के रूप में जाना जाता है। तीन आयामी ऑर्गेनोइड आंतों के उपकला एक्स विवो के शरीर विज्ञान और विकृति दोनों की जांच करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण का प्रतिनिधित्व करते हैं। एक पूर्व विवो प्रणाली में, ऑर्गेनोइड्स जीवित रहने और विकास के लिए कारकों के बहिर्जात पूरक पर भरोसा करतेहैं। पृथक मेसेनकाइमल को माउस और मानव-व्युत्पन्न ऑर्गेनोइड्स दोनों के साथ सुसंस्कृत किया जा सकता है और मूल ऊतक में स्थिति को बेहतर ढंग से प्रतिबिंबित करने के लिए बहिर्जात पूरकता के बजाय विकास कारकों के स्रोत के रूप में उपयोग किया जा सकता है। टेलोसाइट्स एक्स विवो का अध्ययन करने से सामान्य या पैथोलॉजिकल सेलुलर व्यवहार, ऊतक होमियोस्टेसिस के तंत्र और सेल-सेल इंटरैक्शन की जांच में कई लाभ होते हैं।

यद्यपि माउस आंत से मेसेनचाइम को अलग करने के तरीके का वर्णन करने वाले प्रोटोकॉल उपलब्ध हैं, यह स्पष्ट नहीं है कि इन प्रक्रियाओं के परिणामस्वरूप टेलोसाइट्स का कुशल अलगाव होता है या नहीं। टेलोसाइट्स के सफल अलगाव के लिए विशेष प्रोटोकॉल समायोजन की आवश्यकता होती है जो उनकी व्यवहार्यता को प्रभावित किए बिना टेलोसाइट्स और पड़ोसी कोशिकाओं के बीच मजबूत सेल-सेल संपर्क के पृथक्करण की अनुमति देगा। इन सीमाओं को दूर करने के लिए, यह पेपर एक संशोधित प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है जो लगातार एक अत्यधिक व्यवहार्य, एकल-सेल निलंबन उत्पन्न करता है जिसमें पर्याप्त रूप से संरक्षित एंटीजेनिक और कार्यात्मक गुणों के साथ अपेक्षाकृत उच्च मात्रा में टेलोसाइट्स होते हैं। इन टेलोसाइट्स का उपयोग कई अनुप्रयोगों के लिए किया जा सकता है, जिसमें माउस- या मानव-व्युत्पन्न ऑर्गेनोइड्स के साथ सह-संस्कृति शामिल है, बिना किसी विकास कारक पूरक के विकास का समर्थन करने के लिए। यह बदले में मूल ऊतक में स्थिति को बेहतर ढंग से दर्शाता है।

हमने FOXL1-Cre: Rosa-mTmG माउस मॉडल8 का उपयोग किया, जिसमें टेलोसाइट्स को हरे रंग में हरे फ्लोरोसेंट प्रोटीन (जीएफपी) के झिल्ली-बाध्य संस्करण के साथ लेबल किया जाता है, जो अन्वेषक को उनकी संपूर्णता में टेलोसाइट्स का पालन करने की अनुमति देता है; अन्य सभी मेसेनकाइमल कोशिकाओं को लाल रंग में झिल्ली-बाध्य टीडीटोमेटो के साथ लेबल किया जाता है। वर्तमान प्रोटोकॉल को टेलोसाइट उपज और व्यवहार्यता में सुधार के लिए आंतों के मेसेनकाइमल12 को अलग करने वाले प्रोटोकॉल से संशोधित किया गया था।

Protocol

नीचे वर्णित सभी प्रक्रियाओं को यरूशलेम के हिब्रू विश्वविद्यालय में संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (आईएसीयूसी) द्वारा अनुमोदित किया गया था।

1. अभिकर्मकों और बफर की तैयारी

  1. पानी के स्नान को 37 डिग्री सेल्सियस तक गर्म करें।
  2. तालिका 1 में सभी समाधान तैयार करें।

2. आंतों के मेसेनचाइमल अलगाव

  1. सीओ2 इनहेलेशन द्वारा माउस को इच्छामृत्यु करें, इसके तुरंत बाद गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था।
  2. माउस को लापरवाह स्थिति में रखें और पेट को 70% ईटीओएच के साथ स्प्रे करें। पेट की त्वचा को उठाएं और पेरिटोनियल गुहा को उजागर करने के लिए मध्य रेखा के साथ अनुदैर्ध्य रूप से काटें ( चित्र 1 I, II देखें)।
  3. पेट का पता लगाएं, अन्नप्रणाली से काट लें, और धीरे-धीरे आंत को पेरिटोनियल गुहा से बाहर निकालें। बल का उपयोग करके अतिरिक्त वसा और संयोजी ऊतक को साफ करें। ग्रहणी से छोटी आंत को सेकुम से लगभग 0.5 सेमी तक उत्पादित करना (चित्र 1 III, IV)।
  4. ठंडी बाँझ पीबीएस युक्त पेट्री डिश में आंत को धोएं। बॉल-टिप कैंची का उपयोग करके, आंतों की ट्यूब को अनुदैर्ध्य रूप से खोलें और मल को धो लें (चित्रा 1 वी)। आंत को ताजा ठंडा पीबीएस युक्त एक नए पकवान में स्थानांतरित करें और फिर से धो लें।
  5. छोटी आंत को 1 सेमी लंबे खंडों में काटें और 8 एमएल पीबीएस से भरे 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में स्थानांतरित करें। ट्यूब को 1 मिनट के लिए एक या दो चक्रों / सेकंड पर मैन्युअल रूप से हिलाएं।
  6. बल का उपयोग करके खंडों को 20 एमएल ताजा बने समाधान ए से भरे 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में स्थानांतरित करें ( तालिका 1 देखें)। ट्यूबों को 20 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर कक्षीय शेकर इनक्यूबेटर में रखें। इनक्यूबेशन के बाद, एपिथेलियम को अलग करने के लिए 1 मिनट के लिए चार या पांच चक्रों / सेकंड पर हाथ से ट्यूब को जोर से हिलाएं।
  7. चरण 2.6 को एक बार दोहराएं।
  8. खंडों को 10 एमएल बाँझ पीबीएस से भरे एक नए 50 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें, और ट्यूब को 1 मिनट के लिए एक या दो चक्रों / सेकंड पर उलट दें।
  9. खंडों को बाँझ पीबीएस के 10 एमएल से भरे एक नए 15 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें, और 2 मिनट के लिए एक या दो चक्रों / सेकंड पर धीरे से ऊपर और नीचे झुकाएं।
  10. एक जैव सुरक्षा कैबिनेट के तहत, खंडों को सुखाने के लिए बाँझ प्रयोगशाला पोंछे पर रखने के लिए फोर्सप्स का उपयोग करें। सूखने के बाद, खंडों को 0.5 सेमी टुकड़ों में काट लें।
  11. बल का उपयोग करके छोटे खंडों को प्रति कुएं 4 एमएल पूर्वनिर्मित पाचन समाधान से भरे 6-वेल प्लेट में स्थानांतरित करें। 50 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। धीरे से हर 20 मिनट में हाथ से प्लेट हिलाएं।
  12. पाश्चर पिपेट का उपयोग करके खंडों को 4 एमएल डीएमईएम से भरे 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में स्थानांतरित करें। एकल-सेल निलंबन प्राप्त करने के लिए ट्यूब को 1 मिनट के लिए चार या पांच चक्रों / सेकंड पर मैन्युअल रूप से हिलाएं।
  13. निलंबन को 100 μm छन्नी के माध्यम से 50 mL शंक्वाकार ट्यूब में फ़िल्टर करें। 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 700 × ग्राम पर छानने वाले छान को सेंट्रीफ्यूज करें।
  14. आकांक्षा द्वारा सतह पर तैरने वाले को त्याग दें और सेल पेलेट को 2% एफबीएस / पीबीएस के 5 एमएल में पुन: निलंबित करें। 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 700 × ग्राम पर निलंबन को सेंट्रीफ्यूज करें।
  15. आकांक्षा द्वारा सतह पर तैरने वाले को त्याग दें, सेल पेलेट को 12 एमएल कल्चर माध्यम के साथ फिर से निलंबित करें, और दो 6-वेल प्लेटों पर 1 एमएल प्रति अच्छी तरह से बीज दें। अगले दिन, किसी भी मरने वाली कोशिकाओं को धोएं और एस्पिरेट करें और खर्च किए गए माध्यम को ताजा माध्यम से बदलें।
    नोट: संस्कृति के इष्टतम रखरखाव के लिए, हर 2 दिनों में माध्यम को बदलने की सिफारिश की जाती है। माउस तनाव, आनुवंशिक पृष्ठभूमि और उम्र के आधार पर, मेसेनचाइम को सह-संस्कृति प्रयोगों के लिए तैयार होने के लिए 4 दिन से 2 सप्ताह की आवश्यकता होती है। आगे के सह-संस्कृति प्रयोगों के लिए, मेसेनकाइमल को सामंजस्य तक पहुंचना चाहिए, जैसा कि चित्रा 2 में दिखाया गया है, सपाट और पूरी तरह से फैला हुआ सेलुलर आकृति विज्ञान प्रदर्शित करना चाहिए। सामान्य तौर पर, गोल आकृति विज्ञान वाली कोशिकाएं व्यवहार्य या कार्यात्मक नहीं होती हैं।

Figure 1
चित्र 1: माउस विच्छेदन। (I) माउस को लापरवाह स्थिति में रखें और पेट को 70% ETOH के साथ स्प्रे करें। पेट की त्वचा को ऊपर उठाएं। (II) पेरिटोनियल गुहा को मध्य रेखा के साथ अनुदैर्ध्य रूप से खोलें। (III) पेट को धीरे से खींचते समय, अन्नप्रणाली को अलग करें। (IV) पेट को पिंच करें और धीरे-धीरे आंत को बाहर निकालें। (V) बॉल-टिप कैंची की नोक को लुमेन में डालें और आंतों की ट्यूब को अनुदैर्ध्य रूप से खोलें। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

3. पासिंग या सह-संस्कृति के लिए मेसेनचाइम रीसस्पेंशन

  1. मेसेनचाइम को 6-वेल प्लेट में 0.25% ट्रिप्सिन-0.5 एमएम ईडीटीए / वेल के 2 एमएल के साथ पुन: निलंबित करें। 37 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। इनक्यूबेशन बाद, यदि कई कोशिकाओं ने पहले से ही डिश से अलग होना शुरू नहीं किया है, तो अतिरिक्त 2 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
  2. सेल स्क्रैपर का उपयोग करके, धीरे से कुएं की सतह को खुरचें। सेल निलंबन को 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में स्थानांतरित करें। डीएमईएम-एफ 12 / अच्छी तरह से 2 एमएल जोड़ें और धीरे से निलंबन को ऊपर और नीचे करें।
    नोट: ट्यूब की मात्रा के 50% से अधिक के साथ ट्यूब को ओवरफिल नहीं करना महत्वपूर्ण है। इसलिए प्रत्येक दो कुओं के लिए 8 एमएल निलंबन से भरे 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब का उपयोग करने की सिफारिश की जाती है।
  3. कोशिकाओं की गणना करें।
    नोट: एक पूरी तरह से कंफ्लुएंट वेल 2 × 106 कोशिकाओं और 2.5 × 10 6 कोशिकाओं के बीच पैदावारदेता है।
  4. 3-5 × 105 कोशिकाओं / एमएल के सीडिंग घनत्व को प्राप्त करने के लिए सेल निलंबन को पतला करें। सेंट्रीफ्यूज 5 मिनट के लिए 500 × ग्राम 4 डिग्री सेल्सियस पर और सावधानीपूर्वक आकांक्षा से सतह पर तैरने वाले को त्याग दें।
    नोट: जितना संभव हो उतना तरल निकालना महत्वपूर्ण है।
  5. सेल पेलेट को पूर्वनिर्मित संस्कृति माध्यम और प्लेट में पुन: निलंबित करें।

4. टेलोसाइट शुद्धिकरण के लिए फ्लो साइटोमेट्री विश्लेषण

  1. मेसेनकाइमल सेल गोली प्राप्त करें (चरण 2.14)। सेल पेलेट को एफएसीएस बफर के 1 एमएल में पुन: निलंबित करें और 40 μm छन्नी के माध्यम से फ़िल्टर करें।
  2. एपिथेलियल, प्रतिरक्षा और एंडोथेलियल कोशिकाओं को बाहर करने के लिए कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए एफएसीएस बफर के 400 μL में एलोफिकोसायनिन (एपीसी) संयुग्मित सीडी 326 (1: 100), सीडी 45 (1: 400), और सीडी 31 (1: 250) एंटीबॉडी के साथ सेल निलंबन को इनक्यूबेट करें।
  3. 1 एमएल एफएसीएस बफर जोड़कर कोशिकाओं को धोएं और 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 700 × ग्राम पर स्पिन करें। एफएसीएस बफर के 400 μL में पुन: निलंबन करें और प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण के लिए 4', 6-डायमिडिनो-2-फेनिलइंडोल (DAPI, 5 mg / mL, 1: 1,000) जोड़ें। एसएससी-क्षेत्र द्वारा एसएससी-ऊंचाई के अनुसार एकल कोशिकाओं को गेट करें। डीएपीआई- जीवित कोशिकाओं को गेट करें और जीएफपी + टेलोसाइट्स को क्रमबद्ध करने के लिए सीडी 45 + / सीडी 31 + / सीडी 326 + को गेट करें, जैसा कि चित्र 3 में दिखाया गया है।

Representative Results

उपरोक्त आंतों के मेसेनचाइम अलगाव प्रोटोकॉल को वू एट अल.12 और शोशकेस-कार्मेल एट अल.8 दोनों में वर्णित प्रोटोकॉल से संशोधित किया गया था। वू एट अल में वर्णित प्रोटोकॉल बृहदान्त्र के लिए है, और शोशकेस-कार्मेल एट अल द्वारा एक छोटी आंत के लिए है, इस प्रकार पाचन की स्थिति एंजाइम संयोजन, कार्य एकाग्रता और इन दो प्रोटोकॉल के बीच इनक्यूबेशन समय में भिन्न होती है। यहां, वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग आंतों के मेसेनकाइमल कोशिकाओं को अलग करने और संस्कृति करने के लिए सफलतापूर्वक किया गया है, जिसमें टेलोसाइट्स भी शामिल हैं। संक्षेप में, हमने फॉक्सएल 1-क्रे: रोजा-एमटीएमजी माउस मॉडल8 का उपयोग करके ग्रहणी से इलियम तक छोटी आंत को विच्छेदित किया, जिसमें टेलोसाइट्स को झिल्ली-जीएफपी (हरे) के साथ लेबल किया गया था, जबकि अन्य मेसेनकाइमल कोशिकाओं को झिल्ली-टीडीटोमेटो (लाल) के साथ लेबल किया गया था। हमने पचाने वाले एंजाइमों का उपयोग करके ऊतक को अलग किया और मेसेनचाइम को 6-वेल प्लेट में बीज दिया। पृथक्करण के बाद, टेलोसाइट्स अपनी सेलुलर विशेषताओं को खो देते हैं, जो गोल सेलुलर आकृति विज्ञान (चित्रा 2 ए) दिखाते हैं, जो निम्नलिखित दिनों की तुलना में दिन 1 पर जीएफपी + कोशिकाओं के कम परिमाणीकरण में परिलक्षित होता है (चित्रा 2 एफ)। कुछ दिनों के बाद, टेलोसाइट्स छोटी सेलुलर प्रक्रियाओं (चित्रा 2 बी, सी) के साथ एक छोटे से विस्तारित कोशिका आकृति विज्ञान का प्रदर्शन करते हैं। हालांकि, सीडिंग के 7-10 दिनों के बाद, टेलोसाइट्स अपनी सेलुलर विशेषताओं को पुनः प्राप्त करते हैं, लंबी साइटोप्लाज्मिक प्रक्रियाओं (चित्रा 2 डी, ई) के साथ बड़े विस्तारित सेल आकृति विज्ञान दिखाते हैं, और ऑर्गेनोइड्स के साथ सह-संस्कृति में उपयोग किए जाने के लिए तैयार हैं और उनके विकास का समर्थन करते हैं।

Figure 2
चित्रा 2: एफओएक्सएल 1 सीआरई से अलग सुसंस्कृत मेसेनकाइमल: रोजा-एमटीएमजी माउस आंत। FOXL1+ टेलोसाइट्स को GFP के साथ लेबल किया जाता है, जबकि अन्य मेसेनकाइमल कोशिकाएं tdTomato + होती हैं। (A-E) सुसंस्कृत मेसेनचाइम की प्रतिनिधि छवियों को वर्तमान प्रोटोकॉल का उपयोग करके अलग किया गया, 6-वेल प्लेट में चढ़ाया गया, और संस्कृति के 1 (ए), 4 (बी, सी), और 7 (डी, ई) दिनों के बाद चित्रित किया गया। स्केल बार = 100 μm. (F) संस्कृति के दिन 1, 4, और 7 पर प्रति क्षेत्र (प्रतिशत) GFP/tdTomato सेल अनुपात का परिमाणीकरण। संक्षेप: FOXL1 = फोर्कहेड बॉक्स L1 प्रोटीन; जीएफपी = हरा फ्लोरोसेंट प्रोटीन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

इस अलगाव प्रोटोकॉल का मूल्यांकन करने और सेल संरचना को प्रकट करने के लिए, हमने फ्लो साइटोमेट्री (चित्रा 3) द्वारा प्राप्त सेल निलंबन का विश्लेषण किया। कुल मिलाकर, 69% पृथक कोशिकाएं DAPI धुंधलापन के आधार पर व्यवहार्य थीं (चित्रा 3 III); जीवित कोशिकाओं में से, 60.9% ने उपकला संदूषण और प्रतिरक्षा और एंडोथेलियल कोशिकाओं (सीडी 326 +, सीडी 45 +, और सीडी 31 +) का प्रतिनिधित्व किया; चित्र 3 टेलोसाइट अंश (जीएफपी +) क्रमशः 100k और 70k FSC और SSC से ऊपर बिखरा हुआ है (चित्रा 3 VI), और गेटेड मेसेनकाइमल (लाइव CD45-, CD326-, CD31-) से लगभग 10% का प्रतिनिधित्व करता है (चित्रा 3 V)।

Figure 3
चित्रा 3: पृथक वयस्क माउस आंतों के मेसेनचाइम से टेलोसाइट्स को छांटने के लिए फ्लो साइटोमेट्री गेटिंग रणनीति। (II) एकल कक्षों को एसएससी-क्षेत्र द्वारा एसएससी-ऊंचाई के अनुसार गेट किया गया था। (III) DAPI+ घटनाओं को मृत कोशिकाओं को इस प्रकार से बाहर करने के लिए गेट आउट किया गया था। (iv) डीएपीआई-सीडी45+/सीडी326+/सीडी31+ घटनाओं को क्रमश प्रतिरक्षा, उपकला और एंडोथेलियल कोशिकाओं को बाहर करने के लिए बाहर रखा गया था। (v) जीएफपी+ टेलोसाइट्स डीएपीआई-सीडी45-/सीडी326-/सीडी31-कोशिकाओं के 103% के लिए जिम्मेदार हैं। (VI) बैक-गेटिंग विश्लेषण से एफएससी-ए/एसएससी-ए प्लॉट में जीएफपी+ टेलोसाइट्स के निर्देशांक का पता चला। संक्षेप: एसएससी-ए = साइड स्कैटर-पीक क्षेत्र; एफएससी-ए = आगे स्कैटर-पीक क्षेत्र; एसएससी-एच = साइड स्कैटर-पीक ऊंचाई; DAPI = 4', 6-डायमिडिनो-2-फेनिलइंडोल; जीएफपी = हरा फ्लोरोसेंट प्रोटीन; एपीसी = एलोफिकोसायनिन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

समानांतर में, हमने मेसेनचाइम को एक जंगली-प्रकार (डब्ल्यूटी) सी 57बीएल 6 माउस आंत से भी अलग किया, जिसमें टेलोसाइट अंश का मूल्यांकन फॉक्सएल 1 सीआरई से अलग मेसेनचाइम पर पहले विश्लेषण किए गए सतह मार्करों के संयोजन का उपयोग करके किया गया था: रोजा-एमटीएमजी माउस मॉडल, जिसमें टेलोसाइट अंश जीएफपी-लेबल था। हमने पाया कि टेलोसाइट्स के एक उप-समूह को सीडी 201 और पोडोप्लानिन (जीपी 38) (चित्रा 4) के लिए सकारात्मक धुंधलापन द्वारा परिभाषित किया जा सकता है। इसके अलावा, अलगाव और संस्कृति के 1 दिन बाद इम्यूनोस्टेनिंग में इन मार्करों का उपयोग करने से पुष्टि हुई कि, हालांकि कोशिकाओं ने अभी तक अपनी सेलुलर विशेषताओं का प्रदर्शन नहीं किया था, उन्होंने इन आणविक मार्करों की अभिव्यक्ति प्राप्त की, जो जीएफपी + टेलोसाइट्स के 70% -80% में धुंधलापन दिखाते हैं (चित्रा 5)।

सतह मार्करों द्वारा परिभाषित टेलोसाइट अंश फॉक्सएल 1-संचालित रिपोर्टर माउस का उपयोग करके प्राप्त किए गए के समान नहीं है; टेलोसाइट अत्यधिक विषम है और इसमें कई उपसमुच्चय होते हैं। टेलोसाइट परिभाषा के लिए सतह मार्कर को FOXL1 लेबलिंग के साथ जोड़ना आवश्यक है। FOXL1Cre की छोटी आंत में: Rosa-mTmG माउस, GFP + कोशिकाओं का 60% -70% CD201 सकारात्मक है, और 65% -80% GP38 के लिए सकारात्मक हैं। सतह मार्करों का उपयोग करते समय, यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि एंटीबॉडी के अनुचित भंडारण और दोहराए जाने वाले फ्रीज-पिघलने चक्र बाध्यकारी दक्षता को कम करते हैं। इसके अलावा, एंजाइमेटिक पाचन सतह मार्कर अभिव्यक्ति को बाधित कर सकता है। हमने देखा कि सीडी 138 की अभिव्यक्ति, मेसेनकाइमल कोशिकाओं पर व्यक्त एक ट्रांसमेम्ब्रेन प्रोटिओग्लाइकन, विघटन के साथ बाधित और बहुत कम हो गया था।

Figure 4
चित्रा 4: FOXL1Cre से पृथक एकल-सेल मेसेनकाइमल निलंबन का एफएसीएस विश्लेषण: वर्तमान प्रोटोकॉल का उपयोग करके रोजा-एमटीएमजी माउस छोटी आंत। (I-II) एकल कोशिकाओं, (III) DAPI-, (IV-VI) Lin-(CD45-, CD326-, CD31-) GFP+ कोशिकाओं पर FACS विश्लेषण से पता चलता है कि (VII) GFP+ का 65.3% और टमाटर + का 31.2% GP38 के लिए सकारात्मक है, जबकि (VIII) GFP+ का 60.5% और टमाटर + का 22.6% CD201 के लिए सकारात्मक है। संक्षेप: एसएससी-ए = साइड स्कैटर-पीक क्षेत्र; एफएससी-ए = आगे स्कैटर-पीक क्षेत्र; एसएससी-एच = साइड स्कैटर-पीक ऊंचाई; DAPI = 4', 6-डायमिडिनो-2-फेनिलइंडोल; जीएफपी = हरा फ्लोरोसेंट प्रोटीन; एपीसी = एलोफीकोसायनिन; पीई = फाइकोएरिथ्रिन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 5
चित्र 5: पहले दिन मेसेनकाइमल मार्करों के लिए सुसंस्कृत मेसेनकाइमल, तय और सना हुआ। (ए-डी) जीपी 38 के लिए सना हुआ सुसंस्कृत मेसेनकाइमल की प्रतिनिधि छवियां। (F-I) सीडी 201 के लिए सना हुआ सुसंस्कृत मेसेनकाइमल की प्रतिनिधि छवियां। स्केल बार = 100 μm. (E) कुल टमाटर + से टमाटर + GP38 + और टमाटर + CD201 + डबल-पॉजिटिव का परिमाणीकरण। (जे) कुल जीएफपी + से जीएफपी + जीपी 38 + और जीएफपी + सीडी 201 + डबल-पॉजिटिव का परिमाणीकरण। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

समाधान ए: एचबीएसएस 2% एफबीएस, 1 एमएम डीएल-डिथियोथ्रेइटोल (डीटीटी), 2 एमएम ईडीटीए (पीएच 8.0) के साथ पूरक है।
पूरक माध्यम 1640 (सीएम 1640): आरपीएमआई 1640 मध्यम 10% एफबीएस, पेन / स्ट्रेप (100 यूनिट पेनिसिलिन / एमएल, 100 μg स्ट्रेप्टोमाइसिन / एमएल) के साथ पूरक है।
पाचन समाधान: 100 यू /एमएल कोलेजनेज टाइप VIII, 75 मिलीग्राम / एमएल डीएनएस I 4 एमएल प्रीवार्ड सीएम 1640 में। नोट: पाचन प्रक्रिया शुरू होने से ठीक पहले कोलेजनेज और डीनेस आई जोड़ें।
संस्कृति मीडिया: डीएमईएम-एफ 12 मीडिया को 10 μg / mL gentamicin, 10 mM HEPES, ग्लूटामाइन, पेन / स्ट्रेप (100 यूनिट पेनिसिलिन / एमएल, 100 μg स्ट्रेप्टोमाइसिन / एमएल) के साथ पूरक किया गया।
FACS बफर: पीबीएस 5% एफबीएस और 1 एमएम ईडीटीए के साथ पूरक है।

तालिका 1: प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले सभी समाधानों की संरचना।

पूरक तालिका एस 1: वर्तमान प्रोटोकॉल और दो संदर्भ प्रोटोकॉल के बीच प्रमुख अंतर यहां सूचीबद्ध हैं। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Discussion

यहां, हमने FOXL1-Cre: Rosa26-mTmG माउस मॉडल का उपयोग करके माउस छोटी आंत से मेसेनकाइमल को अलग करने के लिए एक प्रोटोकॉल विकसित किया, जो शोधकर्ताओं को अन्य मेसेनकाइमल कोशिकाओं से टेलोसाइट्स को अलग करने में सक्षम बनाता है। इस प्रोटोकॉल में पालन करने के लिए कुछ महत्वपूर्ण कदम हैं। सबसे पहले, मेसेनकाइमल अलगाव के दौरान उपकला कोशिकाओं के बहुमत को त्यागने के लिए, ट्यूब को चार या पांच चक्रों / सेकंड में जोर से हिलाना महत्वपूर्ण है। एंजाइमेटिक पाचन के लिए इनक्यूबेशन समय पाचन दक्षता के आधार पर अनुकूलित किया जाना चाहिए। इनक्यूबेशन दौरान, प्लेटों को हर 20 मिनट में कुछ सेकंड के लिए क्षैतिज रूप से धीरे से हिलाया जाना है। एक बार जब ऊतक फिलामेंट जैसा हो जाता है, तो प्रोटोकॉल चरण 2.12 पर आगे बढ़कर इनक्यूबेशन को रोकना होगा। लंबे पाचन समय के लिए ऊतक को उजागर करने से कम सेल व्यवहार्यता दर और उपज हो सकती है। एंजाइमेटिक पाचन के बाद, ट्यूब को निलंबन में अधिक एकल कोशिकाओं को छोड़ने के लिए यांत्रिक रूप से हिलाया जाना चाहिए; आदर्श रूप से, समाधान बादल दिखना चाहिए, और कोई ऊतक टुकड़े दिखाई नहीं देना चाहिए। यदि ऐसा नहीं है, तो एंजाइमेटिक पाचन को 60 मिनट तक बढ़ाएं।

बाँझ स्थितियों को बनाए रखना और संभावित जीवाणु संदूषण से बचना प्राथमिक ऊतक संस्कृति के साथ काम करते समय महत्वपूर्ण चरणों में से एक है। बाँझ विच्छेदन उपकरण, अभिकर्मकों और बफर का उपयोग किया जाना चाहिए; दस्ताने को बदला जाना चाहिए, और जानवरों के साथ काम करते समय कार्य क्षेत्र को साफ किया जाना चाहिए। एक बार सेल निलंबन प्राप्त हो जाने के बाद, काम एक लामिनार जैविक हुड के तहत आयोजित किया जाना चाहिए। चढ़ाना के बाद, कोशिकाओं को बिना किसी गड़बड़ी के रात भर इनक्यूबेट किया जाना चाहिए, क्योंकि यह पालन को प्रभावित कर सकता है। इसके अलावा, सीडिंग के एक दिन बाद संस्कृति माध्यम को बदलना महत्वपूर्ण है, क्योंकि गैर-अनुयायी कोशिकाएं संस्कृति व्यवहार्यता को प्रभावित कर सकती हैं।

इस प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले सतह मार्करों ने अपने एपिटोप्स के साथ दृढ़ता से प्रतिक्रिया व्यक्त की; हालांकि, यह संभव है कि एंजाइमेटिक पाचन बाध्यकारी प्रतिक्रिया को प्रभावित कर सकता है, और इसलिए, एफएसीएस विश्लेषण परिणाम। इस प्रोटोकॉल की एक और सीमा मांसपेशियों की परत का कम प्रतिनिधित्व है। मांसपेशी परत सेल अलगाव की दक्षता में सुधार करने के लिए, हम म्यूकोसा परतों से मांसपेशियों के यांत्रिक पृथक्करण की सलाह देते हैं, और प्रत्येक परतों के लिए एंजाइमेटिक पाचन को अलग करते हैं। स्ट्रोमा से उपकला को अलग करने के लिए, या तो यांत्रिक पृथक्करण या चेलेटिंग एजेंट (ईडीटीए या डीटीटी) का उपयोग किया जा सकता है; हालांकि, एकल कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए एंजाइमेटिक पाचन को इस प्रोटोकॉल में अनुकूलित किया गया है।

आंतों के मेसेनचाइमल के अलगाव को पहले वर्णित किया गया है8; एक कवरस्लिप के साथ विली को स्क्रैप करने से विलस के साथ कुछ मेसेनचाइमल का नुकसान होगा, विशेष रूप से विलस टिप मेसेनकाइमल कोशिकाएं जैसे कि एलजीआर 5 + विलस टिप टेलोसाइट्स13। इस प्रोटोकॉल में, हम डीनेस I के साथ संयोजन में डिस्पेज़ II और ट्रिप्सिन के बजाय कोलेजनेज टाइप VIII का उपयोग करते हैं, क्योंकि कोलेजनेज मैट्रिक्स से मेसेनकाइमल कोशिकाओं को अधिक कुशलता से जारी करता है। यद्यपि यह प्रसंस्करण समय (>90 मिनट बनाम 35 मिनट) को बढ़ाता है, दो प्रोटोकॉल ने समान सेल व्यवहार्यता दर प्राप्त की; वर्तमान प्रोटोकॉल ने सामान्य रूप से मेसेनकाइमल कोशिकाओं की उपज में सुधार किया, और विशेष रूप से टेलोसाइट अंश। वर्तमान प्रोटोकॉल ने लगभग 10% जीएफपी + टेलोसाइट्स प्राप्त किए, जो विज़ुअलाइज़ेशन और एफएसीएस विश्लेषण दोनों द्वारा पुष्टि की गई, जबकि पहले के प्रोटोकॉल ने 2% जीएफपी + टेलोसाइट्स का उत्पादन किया। वर्तमान प्रोटोकॉल और दो संदर्भ प्रोटोकॉल के बीच प्रमुख अंतर पूरक तालिका एस 1 में सूचीबद्ध हैं।

एफओएक्सएल 1 + जीएफपी + कोशिकाओं की पहचान उपउपकला टेलोसाइट्स के रूप में विवो अध्ययनों पर आधारित है। टेलोसाइट्स की उच्च पैदावार का उत्पादन करने के लिए उपलब्ध मेसेनकाइमल अलगाव प्रोटोकॉल को विकसित करने और संशोधित करने की आवश्यकता, और इसे प्राप्त करने के तरीके का ज्ञान विवो में फॉक्सएल 1 + टेलोसाइट्स की संरचना और कार्य की हमारी समझ पर आधारित था, क्योंकि लंबे सेलुलर अनुमानों वाली बड़ी कोशिकाएं उपकला कोशिकाओं से निकटता से जुड़ी हुई थीं।

दिलचस्प बात यह है कि एक्स विवो जीएफपी + टेलोसाइट्स आंत में विवो में उनकी विशेषताओं के समान सेलुलर विशेषताओं का प्रदर्शन करते हैं और इसलिए, ऑर्गेनोइड विकास के लिए एक आदर्श समर्थन के रूप में सेवा करने का सुझाव दिया जाता है। यद्यपि यह प्रोटोकॉल मुख्य रूप से छोटी आंत से टेलोसाइट अलगाव पर चर्चा करता है, मामूली संशोधन के साथ एक समान प्रोटोकॉल का उपयोग किया जा सकता है और आसानी से बृहदान्त्र मेसेनकाइमल कोशिकाओं के लिए लागू किया जा सकता है, जैसे कि हाल ही में वर्णित एमएपी 3 के 2-विनियमित आंतों के स्ट्रोमल सेल (एमआरआईएससी)12।

एक बार जब मेसेनकाइमल कोशिकाएं फैल जाती हैं और सामंजस्य तक पहुंच जाती हैं, तो उनका उपयोग कई अतिरिक्त अनुप्रयोगों के लिए किया जा सकता है, जैसे कि माउस- या मानव-व्युत्पन्न ऑर्गेनोइड्स के साथ 3 डी सह-संस्कृति, विकास कारक-मुक्त मैट्रिगेल का उपयोग करके। मेसेनकाइमल आमतौर पर एक नेटवर्क बनाता है जो पूरी तरह से ऑर्गेनोइड गठन और विकास का समर्थन करता है जिसमें कोई बहिर्जात विकास कारक पूरक नहीं होता है। आंतों के स्ट्रोमा में आंतरिक 3 डी विशेषताएं हैं जो उपकला को यांत्रिक सहायता14 प्रदान कर सकती हैं। इसलिए, इस प्रोटोकॉल का उपयोग मेसेनचाइम को 3 डी बायो-प्रिंटेड पाड़ में एकीकृत करने के लिए अलग करने के लिए भी किया जा सकता है और आगे के जेनोग्राफ्ट प्रयोगों के लिए उपयोग किया जा सकता है।

Disclosures

लेखकों के पास घोषित करने के लिए हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

इस काम को इज़राइल साइंस फाउंडेशन (एमएससी व्यक्तिगत अनुदान) और इज़राइल साइंस फाउंडेशन और चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन के बीच संयुक्त कार्यक्रम से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
15 mL Centrifuge Tubes Corning 430052
50 mL Centrifuge Tubes Corning 430828
5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube with Cell-strainer cap Corning 352235
6 Well Cell Culture Plate Costar 3516
APC Anti-Mouse CD31 Biolegend 102509
APC Anti-Mouse CD326 Biolegend 118213
APC Anti-Mouse CD45 Biolegend 103111
Cell Lifter Corning 3008
Cell Strainer 100μm Nylon Yellow Corning CLS431752
Collagenase type VIII Sigma C2139-500MG
DL-Dithiothreitol (DTT) Sigma 43815-1G
DMEM/F-12 (HAM) 1:1 Biological Industries 01-170-1A
DNase I Sigma DN25-1G
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Biological Industries 01-055-1A
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline Sigma D1283-500ML 10x
EDTA 0.5 M, pH 8.0 Biological Industries 01-862-1B
FBS Biological Industries 04-007-1A
Gentamicin Sigma G1914-250MG 100x
Gluta Max-I Gibco 35050-038 100x
Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) Biological Industries 02-017-5A 10x
HEPES Gibco 15630-080 100x
Penicillin-Streptomycin (Pen/Strep) Biological Industries 03-033-1B 100x
RPMI 1640 medium Gibco 21875-034
Trypsin EDTA Solution B Sartorius 03-052-1A

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Carroll, T. D., Newton, I. P., Chen, Y., Blow, J. J., Näthke, I. Lgr5+ intestinal stem cells reside in an unlicensed G1 phase. The Journal of Cell Biology. 217 (5), 1667-1685 (2018).
  2. Kinchen, J., et al. Structural remodeling of the human colonic mesenchyme in inflammatory bowel disease. Cell. 175 (2), 372-386 (2018).
  3. Popescu, L. M., Faussone-Pellegrini, M. -S. TELOCYTES - a case of serendipity: The winding way from Interstitial Cells of Cajal (ICC), via Interstitial Cajal-Like Cells (ICLC) to TELOCYTES. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 14 (4), 729-740 (2010).
  4. Gherghiceanu, M., Manole, C. G., Popescu, L. M. Telocytes in endocardium: electron microscope evidence. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 14 (9), 2330-2334 (2010).
  5. Ceafalan, L., Gherghiceanu, M., Popescu, L. M., Simionescu, O. Telocytes in human skin—are they involved in skin regeneration. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 16 (7), 1405-1420 (2012).
  6. Hinescu, M. E., Gherghiceanu, M., Suciu, L., Popescu, L. M. Telocytes in pleura: two- and three-dimensional imaging by transmission electron microscopy. Cell and Tissue Research. 343 (2), 389-397 (2011).
  7. Popescu, L. M., et al. Telocytes in human epicardium. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 14 (8), 2085-2093 (2010).
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  13. Bahar Halpern, K., et al. Lgr5+ are a signaling source at the intestinal villus tip. Nature Communication. 11 (1), 1936 (2020).
  14. Koliaraki, V., Pallangyo, C. K., Greten, F. R., Kollias, G. Mesenchymal cells in colon cancer. Gastroenterology. 152 (5), 964-979 (2017).

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चिकित्सा अंक 193
मुराइन आंतों मेसेनचाइम का अलगाव जिसके परिणामस्वरूप टेलोसाइट्स की उच्च उपज होती है
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Canella, M., Tan, J., Su, B.,… More

Canella, M., Tan, J., Su, B., Shoshkes-Carmel, M. Isolation of Murine Intestinal Mesenchyme Resulting in a High Yield of Telocytes. J. Vis. Exp. (193), e64169, doi:10.3791/64169 (2023).

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