Summary
Burada, telositler de dahil olmak üzere murin bağırsak mezenkimini izole etmek için bir protokol sunuyoruz. Bunlar, büyümeyi desteklemek ve orijinal dokudaki durumu daha iyi yansıtmak için fare veya insan kaynaklı organoidlerle birlikte kültür gibi çeşitli uygulamalar için kullanılabilir.
Abstract
Murin ince bağırsak veya kolon mezenkimi, kan ve lenfatik endotel, sinirler, fibroblastlar, miyofibroblastlar, düz kas hücreleri, bağışıklık hücreleri ve yakın zamanda tanımlanan hücre tipi telositler dahil olmak üzere farklı hücre tipleri içeren oldukça heterojendir. Telositler, hücre gövdesinden onlarca ila yüzlerce mikron mesafeye ulaşan, uzun sitoplazmik süreçlere sahip benzersiz mezenkimal hücrelerdir. Telositler son zamanlarda kök ve progenitör hücre proliferasyonu için gerekli olan Wnt proteinlerini sağlayan önemli bir bağırsak kök hücre niş bileşeni olarak ortaya çıkmıştır.
Mezenkimin fare bağırsağından nasıl izole edileceğine dair protokoller mevcut olmasına rağmen, bu prosedürlerin telositlerin etkili bir şekilde izole edilmesine izin verip vermediği açık değildir. Telositleri verimli bir şekilde izole etmek, telositler ve komşu hücreler arasındaki güçlü hücre-hücre temasının canlılıklarını etkilemeden ayrışmasına izin verecek özel protokol ayarlamaları gerektirir. Burada, mevcut bağırsak mezenkim izolasyon protokolleri, nispeten yüksek miktarda canlı tek hücreli telosit içeren mezenkimin başarılı izolasyonunu ve kültürünü desteklemek için ayarlanmıştır.
Elde edilen tek hücreli süspansiyon, immün boyama, hücre sıralama, görüntüleme ve mRNA deneyleri gibi çeşitli tekniklerle analiz edilebilir. Bu protokol, telositlerin yeterince korunmuş antijenik ve fonksiyonel özelliklerine sahip mezenkim verir ve çeşitli uygulamalar için kullanılabilir. Örneğin, orijinal dokudaki durumu daha iyi yansıtmak için, büyüme faktörü takviyesi olmadan organoid büyümesini desteklemek için fare veya insan kaynaklı organoidlerle birlikte kültür için kullanılabilirler.
Introduction
Hem ince bağırsak hem de kolon, çoğalan ve rejenerasyonu besleyen kök hücrelerin varlığı nedeniyle oldukça rejeneratif dokulardır1. Epiteli çevreleyen mezenkim, epitel hücrelerinin tepkisini modüle eden hücre dışı matriks proteinlerini ve sinyal moleküllerini2 salgılayarak yapısal ve fonksiyonel destek sağlar. Telositler, esas olarak elektron mikroskobu ile şimdiye kadar, labirent bir ağoluşturmak için üst üste binen telopodlar adı verilen uzun sitoplazmik süreçlere sahip hücreler olarak tanımlanan büyük mezenkimal hücrelerdir 3,4,5,6,7. Son zamanlarda, transkripsiyon faktörü FOXL1'i eksprese eden bağırsak telositleri, kök ve progenitör hücre fonksiyonu için çok önemli olan Wnt proteinlerini sağlayan önemli bir kök hücre niş bileşeni olarak ortaya çıkmıştır. Bağırsak telositleri, Wnt, Bmp, Tgfb ve Shh gibi anahtar sinyal yolu proteinlerinin yüksek seviyelerini ve ayrıca birçok büyüme faktörünüifade eder 8.
Telositlerin in vivo olarak kritik bir kök hücre niş bileşeni olduğu göz önüne alındığında, onları ex vivo olarak izole etmek ve kültürlemek için protokoller geliştirmek, molekülleri ve büyüme faktörlerini işaret etmek için bir kaynak olarak kullanılmalarına, ex vivo büyümeyi ve farklılaşmayı desteklemelerine izin verecektir. İyi kurulmuş protokoller kullanılarak, kolon veya bağırsak epitel kriptleri izole edilebilir ve organoidler 9,10,11 olarak bilinen 3D yapılar oluşturabilir. Üç boyutlu organoidler, bağırsak epitelinin ex vivo fizyolojisini ve patolojisini araştırmak için güçlü bir araçtır. Bir ex vivo sistemde, organoidler hayatta kalma ve büyüme için faktörlerin eksojen takviyesine dayanır10. İzole mezenkim, hem fare hem de insan kaynaklı organoidlerle kültürlenebilir ve orijinal dokudaki durumu daha iyi yansıtmak için eksojen takviye yerine bir büyüme faktörleri kaynağı olarak kullanılabilir. Telositlerin ex vivo olarak incelenmesi, normal veya patolojik hücresel davranışları, doku homeostazı mekanizmalarını ve hücre-hücre etkileşimlerini daha ayrıntılı olarak araştırmada sayısız faydaya sahiptir.
Mezenkimin fare bağırsağından nasıl izole edileceğini açıklayan protokoller mevcut olmasına rağmen, bu prosedürlerin telositlerin etkili izolasyonu ile sonuçlanıp sonuçlanmadığı açık değildir. Telositlerin başarılı bir şekilde izole edilmesi, telositler ve komşu hücreler arasındaki güçlü hücre-hücre temasının canlılıklarını etkilemeden ayrışmasına izin verecek özel protokol ayarlamaları gerektirir. Bu sınırlamaların üstesinden gelmek için, bu makale, yeterince korunmuş antijenik ve fonksiyonel özelliklere sahip nispeten yüksek miktarda telosit içeren oldukça uygulanabilir, tek hücreli bir süspansiyonu tutarlı bir şekilde veren değiştirilmiş bir protokol sunmaktadır. Bu telositler, büyüme faktörü takviyesi olmadan büyümeyi desteklemek için fare veya insan kaynaklı organoidlerle birlikte kültür de dahil olmak üzere çeşitli uygulamalar için kullanılabilir. Bu da orijinal dokudaki durumu daha iyi yansıtır.
FOXL1-Cre'yi kullandık: Rosa-mTmG fare modeli8, telositlerin yeşil renkte yeşil floresan proteinin (GFP) membrana bağlı bir versiyonu ile etiketlendiği, araştırmacının telositleri bütünüyle takip etmesini sağlayan; diğer tüm mezenkimal hücreler kırmızı renkte membrana bağlı bir tdDomates ile etiketlenmiştir. Mevcut protokol, telosit verimini ve canlılığını artırmak için bağırsak mezenkimini izole eden bir protokolden değiştirildi12 .
Protocol
Aşağıda açıklanan tüm prosedürler, Kudüs İbrani Üniversitesi'ndeki Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır.
1. Reaktiflerin ve tamponların hazırlanması
- Bir su banyosunu önceden 37 ° C'ye ısıtın.
- Tablo 1'deki tüm çözümleri hazırlayın.
2. Bağırsak mezenkim izolasyonu
- Fareyi CO2 inhalasyonu ile ötenazi yapın, hemen ardından servikal çıkık izleyin.
- Fareyi sırtüstü pozisyona getirin ve karnına% 70 EtOH püskürtün. Karın derisini kaldırın ve periton boşluğunu ortaya çıkarmak için orta hat boyunca uzunlamasına kesin (bkz. Şekil 1 I, II).
- Mideyi bulun, yemek borusundan kesin ve bağırsağı yavaşça periton boşluğundan çekin. Forseps kullanarak fazla yağ ve bağ dokusunu temizleyin. İnce bağırsağı duodenumdan çekumdan yaklaşık 0,5 cm'ye kadar çıkarın (Şekil 1 III,IV).
- Bağırsağı soğuk steril PBS içeren bir Petri kabında yıkayın. Bilyalı uçlu makas kullanarak, bağırsak tüpünü uzunlamasına açın ve dışkıyı yıkayın (Şekil 1 V). Bağırsağı taze soğuk PBS içeren yeni bir kaba aktarın ve tekrar yıkayın.
- İnce bağırsağı 1 cm uzunluğunda segmentlere ayırın ve 8 mL PBS ile doldurulmuş 15 mL'lik bir konik tüpe aktarın. Tüpü 1 dakika boyunca bir veya iki döngü / s'de manuel olarak çalkalayın.
- Forseps kullanarak segmentleri, 20 mL'lik taze yapılmış A çözeltisi ile doldurulmuş 50 mL'lik bir konik tüpe aktarın (bakınız Tablo 1). Tüpleri 20 dakika boyunca 37 ° C'de bir orbital çalkalayıcı inkübatörüne yerleştirin. İnkübasyondan sonra, epiteli ayrıştırmak için tüpü 1 dakika boyunca dört veya beş döngü / s'de elle kuvvetlice çalkalayın.
- Adım 2.6'yı bir kez yineleyin.
- Segmentleri 10 mL steril PBS ile doldurulmuş yeni bir 50 mL tüpe aktarın ve tüpü 1 dakika boyunca bir veya iki döngü / s'de ters çevirin.
- Segmentleri 10 mL steril PBS ile doldurulmuş yeni bir 15 mL tüpe aktarın ve 2 dakika boyunca bir veya iki döngü / s'de yavaşça yukarı ve aşağı doğru eğin.
- Bir biyogüvenlik kabininin altında, segmentleri steril bir laboratuvar mendiline yerleştirmek için forseps kullanın, kurutmak için. Kuruduktan sonra, segmentleri 0,5 cm'lik parçalara ayırın.
- Forseps kullanarak küçük segmentleri, kuyucuk başına 4 mL önceden ısıtılmış sindirim çözeltisi ile doldurulmuş 6 delikli bir plakaya aktarın. 37 ° C'de 50 dakika boyunca inkübe edin. Tabağı her 20 dakikada bir elle hafifçe sallayın.
- Pasteur pipeti kullanarak segmentleri 4 mL DMEM ile doldurulmuş 15 mL'lik konik bir tüpe aktarın. Tek hücreli bir süspansiyon elde etmek için tüpü 1 dakika boyunca dört veya beş döngü / s'de manuel olarak sallayın.
- Süspansiyonu 100 μm'lik bir süzgeçten 50 mL'lik bir konik tüpe filtreleyin. Filtreyi 700 × g'da 4 °C'de 5 dakika boyunca santrifüj edin.
- Süpernatantı aspirasyonla atın ve hücre peletini 5 mL'de% 2 FBS / PBS'de yeniden askıya alın. Süspansiyonu 700 × g'da 4 °C'de 5 dakika boyunca santrifüj edin.
- Süpernatantı aspirasyonla atın, hücre peletini 12 mL kültür ortamı ile yeniden askıya alın ve iki adet 6 delikli plaka üzerine kuyucuk başına 1 mL tohumlayın. Ertesi gün, ölmekte olan hücreleri yıkayın ve aspire edin ve harcanan ortamı taze ortamla değiştirin.
NOT: Kültürün optimum bakımı için, ortamın her 2 günde bir değiştirilmesi önerilir. Fare suşuna, genetik arka plana ve yaşa bağlı olarak, mezenkimin ortak kültür deneylerine hazır olması için 4 gün ila 2 hafta arasında bir süre gerekir. Daha ileri ko-kültür deneyleri için, mezenkim, Şekil 2'de gösterildiği gibi düz ve tamamen gerilmiş hücresel morfolojiyi göstererek akıcılığa ulaşmalıdır. Genel olarak, yuvarlak morfolojiye sahip hücreler canlı veya işlevsel değildir.
Resim 1: Fare diseksiyonu . (I) Fareyi sırtüstü pozisyona getirin ve karnına %70 EtOH püskürtün. Karın derisini kaldırın. (II) Periton boşluğunu orta hat boyunca uzunlamasına açın. (III) Mideyi nazikçe çekerken, yemek borusunu kesin. (IV) Mideyi sıkıştırın ve bağırsağı yavaşça dışarı çekin. (V) Bilyalı uçlu makasın ucunu lümene yerleştirin ve bağırsak tüpünü uzunlamasına açın. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
3. Geçim veya ortak kültür için mezenkim süspansiyonu
- Mezenkimi 2 mL% 0.25 tripsin-0.5 mM EDTA / kuyu ile 6 delikli bir plakada tekrar askıya alın. 37 ° C'de 5 dakika inkübe edin. Kuluçkadan sonra, birkaç hücre çanaktan ayrılmaya başlamamışsa, fazladan 2 dakika boyunca inkübe edin.
- Bir hücre kazıyıcı kullanarak, kuyunun yüzeyini yavaşça kazıyın. Hücre süspansiyonunu 15 mL'lik bir konik tüpe aktarın. 2 mL DMEM-F12/kuyucuk ekleyin ve süspansiyonu yavaşça yukarı ve aşağı pipetinleyin.
NOT: Tüpü, tüp hacminin% 50'sinden fazlası ile aşırı doldurmamak önemlidir. Bu nedenle, her iki kuyucuk için 8 mL süspansiyonla doldurulmuş 15 mL'lik bir konik tüp kullanılması önerilir. - Hücreleri sayın.
NOT: Tam akışlı bir kuyu 2 × 10 6 hücre ile 2,5 × 106 hücre arasında verim sağlar. - 3-5 × 105 hücre / mL'lik bir tohumlama yoğunluğu elde etmek için hücre süspansiyonunu seyreltin. 4 ° C'de 500 × g'da 5 dakika boyunca santrifüj yapın ve süpernatantı dikkatli bir aspirasyonla atın.
NOT: Mümkün olduğunca fazla sıvının uzaklaştırılması önemlidir. - Hücre peletini önceden ısıtılmış kültür ortamında ve plakada yeniden askıya alın.
4. Telosit saflaştırma için akış sitometri analizi
- Mezenkimal hücre peletini elde edin (adım 2.14). Hücre peletini 1 mL FACS tamponunda yeniden askıya alın ve 40 μm'lik bir süzgeçten süzün.
- Hücre süspansiyonunu, allophycocyanin (APC)-konjuge CD326 (1:100), CD45 (1:400) ve CD31 (1:250) antikorları ile oda sıcaklığında 400 μL FACS tamponunda 15 dakika boyunca inkübe ederek sırasıyla epitelyal, immün ve endotel hücrelerini sıralamadan hariç tutun.
- 1 mL FACS tamponu ekleyerek hücreleri yıkayın ve 4 ° C'de 5 dakika boyunca 700 × g'da döndürün. 400 μL FACS tamponunda tekrar askıya alın ve akış sitometri analizleri için 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI, 5 mg / mL, 1:1,000) ekleyin. Tek hücreleri SSC yüksekliğine göre SSC alanına göre açın. Şekil 3'te gösterildiği gibi GFP+ telositlerini sıralamak için DAPI- canlı hücrelerini ve CD45+/CD31+/CD326+ kapısını açın.
Representative Results
Yukarıdaki bağırsak mezenkim izolasyon protokolü, hem Wu hem de ark.12 ve Shoshkes-Carmel ve ark.8'de açıklanan protokollerden modifiye edilmiştir. Wu ve ark.'da açıklanan protokol kolon içindir ve Shoshkes-Carmel ve ark. tarafından yapılan protokol ince bağırsak içindir, bu nedenle sindirim durumu enzim kombinasyonu, iş konsantrasyonu ve bu iki protokol arasındaki inkübasyon süresinde farklıdır. Burada, tarif edilen protokol, telositler de dahil olmak üzere bağırsak mezenkimal hücrelerini izole etmek ve kültürlemek için başarıyla kullanılmıştır. Kısaca, ince bağırsağı duodenumdan ileuma bir FOXL1-Cre kullanarak diseke ettik: Rosa-mTmG fare modeli8, telositlerin membran-GFP (yeşil) ile etiketlendiği, diğer mezenkimal hücrelerin ise membran-tdDomates (kırmızı) ile etiketlendiği. Sindirici enzimleri kullanarak dokuyu ayrıştırdık ve mezenkimi 6 delikli bir plakaya tohumladık. Dissosiyasyonu takiben, telositler hücresel özelliklerini kaybeder ve sonraki günlere kıyasla 1. günde GFP + hücrelerinin yetersiz nicelleştirilmesine yansıyan yuvarlak hücresel morfolojiyi gösterir (Şekil 2A) (Şekil 2F). Birkaç gün sonra, telositler kısa hücresel süreçlere sahip küçük bir gerilmiş hücre morfolojisi sergiler (Şekil 2B, C). Bununla birlikte, tohumlamadan 7-10 gün sonra, telositler hücresel özelliklerini yeniden kazanırlar, uzun sitoplazmik süreçlerle büyük gerilmiş hücre morfolojisi gösterirler (Şekil 2D, E) ve organoidlerle birlikte kültürde kullanılmaya ve büyümelerini desteklemeye hazırdırlar.
Şekil 2: FOXL1Cre'den izole edilen kültürlü mezenkim: Rosa-mTmG fare bağırsağı. FOXL1+ telositleri GFP ile etiketlenirken, diğer mezenkimal hücreler tdTomato+'dur. (A-E) Mevcut protokol kullanılarak izole edilmiş, 6 delikli bir plakaya kaplanmış ve 1 (A), 4 (B, C) ve 7 (D, E) günlük kültürü takiben görüntülenen kültürlenmiş mezenkimin temsili görüntüleri. Ölçek çubukları = 100 μm. (F) Kültürün 1, 4 ve 7. günlerinde görüş alanı başına GFP / tdDomates hücre oranının (yüzdeler) ölçülmesi. Kısaltmalar: FOXL1 = Forkhead box L1 proteini; GFP = yeşil floresan proteini. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Bu izolasyon protokolünü değerlendirmek ve hücre kompozisyonunu ortaya çıkarmak için elde edilen hücre süspansiyonunu flow sitometri ile analiz ettik (Şekil 3). Genel olarak, izole edilen hücrelerin% 69'u DAPI boyamasına dayanarak yaşayabilirdi (Şekil 3 III); Canlı hücrelerin %60.9'u epitel kontaminasyonu ve immün ve endotel hücrelerini (CD326+, CD45+ ve CD31+; Şekil 3 IV). Telosit fraksiyonu (GFP +) sırasıyla 100k ve 70k FSC ve SSC'nin üzerine dağılmıştır (Şekil 3 VI) ve kapılı mezenkimden (canlı CD45-, CD326-, CD31-) neredeyse% 10'unu temsil etmektedir (Şekil 3 V).
Şekil 3: İzole yetişkin fare bağırsak mezenkiminden telositleri ayırmak için akış sitometrisi geçit stratejisi. (I) Düşük seviyeli yan saçılma olayları hariç tutulmuştur. (II) Tek hücreler SSC yüksekliğine göre SSC-alanı ile kapılıydı. (III) DAPI+ olayları, ölü hücreleri sıralamadan dışlamak için kapatıldı. (IV) DAPI- CD45+/CD326+/CD31+ olayları sırasıyla immün, epitel ve endotel hücrelerini dışlamak için dışarı çıkarıldı. (V) GFP + telositleri, DAPI- CD45-/CD326-/CD31- hücrelerinin %10.3'ünü oluşturuyordu. (VI) Geri geçit analizi, bir FSC-A / SSC-A grafiğindeki GFP + telositlerinin koordinatlarını ortaya çıkardı. Kısaltmalar: SSC-A = yan saçılma-tepe alanı; FSC-A = ileri saçılma-tepe alanı; SSC-H = yan saçılma-tepe yüksekliği; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindol; GFP = yeşil floresan proteini; APC = allofikosiyanin. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Buna paralel olarak, mezenkimi vahşi tip (WT) C57Bl6 fare bağırsağından da izole ettik, burada telosit fraksiyonu, daha önce bir FOXL1Cre'den izole edilen mezenkim üzerinde analiz edilen yüzey belirteçlerinin bir kombinasyonu kullanılarak değerlendirildi: Rosa-mTmG fare modeli, telosit fraksiyonunun GFP etiketli olduğu. Telositlerin bir alt kümesinin CD201 ve podoplanine (GP38) pozitif boyanma ile tanımlanabileceğini bulduk (Şekil 4). Ayrıca, bu belirteçlerin izolasyon ve kültürden 1 gün sonra immün boyamada kullanılması, hücrelerin henüz hücresel özelliklerini sergilememelerine rağmen, GFP+ telositlerinin% 70-80'inde boyanma gösteren bu moleküler belirteçlerin ekspresyonunu elde ettiklerini doğruladı (Şekil 5).
Yüzey belirteçleri tarafından tanımlanan telosit fraksiyonu, FOXL1 güdümlü muhabir fare kullanılarak elde edilenle aynı değildir; Telosit oldukça heterojendir ve birkaç alt küme içerir. Telosit tanımı için yüzey işaretleyicisini FOXL1 etiketlemesi ile birleştirmek gerekir. FOXL1Cre: Rosa-mTmG farenin ince bağırsağında, GFP + hücrelerinin% 60-70'i CD201 pozitiftir ve% 65-80'i GP38 için pozitiftir. Yüzey belirteçleri kullanırken, antikorların uygun olmayan depolama ve tekrarlayan donma-çözme döngülerinin bağlanma verimliliğini azalttığına dikkat etmek önemlidir. Ek olarak, enzimatik sindirim yüzey belirteci ekspresyonunu bozabilir. Mezenkimal hücreler üzerinde eksprese edilen bir transmembran proteoglikan olan CD138'in ekspresyonunun bozulduğunu ve ayrışma ile büyük ölçüde azaldığını gözlemledik.
Şekil 4: FOXL1Cre'den izole edilen tek hücreli mezenkim süspansiyonunun FACS analizi: Mevcut protokolü kullanarak Rosa-mTmG fare ince bağırsağı. (I-II) tek hücreli, (III) DAPI-, (IV-VI) Lin-(CD45-, CD326-, CD31-) GFP+ hücreleri üzerinde yapılan FACS analizi, (VII) GFP+'nın %65,3'ünün ve Domates+'ın %31,2'sinin GP38 için pozitif olduğunu, (VIII) GFP+'nın %60,5'inin ve Domates+'ın %22,6'sının CD201 için pozitif olduğunu göstermektedir. Kısaltmalar: SSC-A = yan saçılma-tepe alanı; FSC-A = ileri saçılma-tepe alanı; SSC-H = yan saçılma-tepe yüksekliği; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindol; GFP = yeşil floresan proteini; APC = allofikosiyanin; PE = fikoeritrin. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Birinci gün: Mezenkimal belirteçler için sabitlenmiş ve boyanmış kültürlü mezenkim. (A-D) GP38 için boyanmış kültürlü mezenkimin temsili görüntüleri. (F-I) CD201 için boyanmış kültürlü mezenkimin temsili görüntüleri. Ölçek çubukları = 100 μm. (E) Toplam Domates+'tan Domates+, GP38+ ve Domates+, CD201+, çift pozitif miktarının belirlenmesi. (J) GFP+ GP38+ ve GFP+ CD201+'ın toplam GFP+'dan çift pozitif olarak ölçülmesi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
| Çözüm A: | HBSS% 2 FBS, 1 mM DL-ditiyotreitol (DTT), 2 mM EDTA (pH 8.0) ile desteklenmiştir. | |||
| Tamamlayıcı ortam 1640 (CM1640): | RPMI 1640 besiyeri% 10 FBS, Kalem / Strep (100 birim penisilin / mL, 100 μg streptomisin / mL) ile desteklenmiştir. | |||
| Sindirim çözümü: | 100 U/mL kollajenaz tip VIII, 4 mL önceden ısıtılmış CM1640'ta 75 mg/mL DNaz I. Not: Sindirim prosedürü başlamadan hemen önce kollajenaz ve DNaz I ekleyin. | |||
| Kültür medyası: | 10 μg / mL gentamisin, 10 mM HEPES, glutamin, Kalem / Strep (100 ünite penisilin / mL, 100 μg streptomisin / mL) ile desteklenmiş DMEM-F12 ortamı. | |||
| FACS tamponu: | PBS% 5 FBS ve 1 mM EDTA ile desteklenmiştir. | |||
Tablo 1: Protokolde kullanılan tüm çözeltilerin bileşimi.
Ek Tablo S1: Mevcut protokol ile iki referans protokol arasındaki temel farklar burada listelenmiştir. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Discussion
Burada, araştırmacıların telositleri diğer mezenkimal hücrelerden ayırt etmelerini sağlayan FOXL1-Cre: Rosa26-mTmG fare modelini kullanarak mezenkimi fare ince bağırsağından izole etmek için bir protokol geliştirdik. Bu protokolde izlenmesi gereken bazı kritik adımlar vardır. İlk olarak, mezenkim izolasyonu sırasında epitel hücrelerinin çoğunu atmak için tüpü dört veya beş döngü / s'de kuvvetlice sallamak önemlidir. Enzimatik sindirim için kuluçka süresi, sindirim verimliliğine göre optimize edilmelidir. Kuluçka sırasında, plakalar her 20 dakikada bir birkaç saniye boyunca yatay olarak hafifçe çalkalanmalıdır. Doku filament benzeri hale geldiğinde, inkübasyon protokol adımı 2.12'ye ilerleyerek durdurulmalıdır. Dokunun uzun sindirim sürelerine maruz kalması, düşük hücre canlılığı oranı ve verimi ile sonuçlanabilir. Enzimatik sindirimi takiben, daha fazla tek hücreyi süspansiyona salmak için tüp mekanik olarak çalkalanmalıdır; İdeal olarak, çözelti bulutlu görünmeli ve hiçbir doku parçası görünmemelidir. Durum böyle değilse, enzimatik sindirimi 60 dakikaya kadar uzatın.
Steril koşulları korumak ve potansiyel bakteriyel kontaminasyondan kaçınmak, birincil doku kültürü ile çalışırken kritik adımlardan biridir. Steril diseksiyon aletleri, reaktifler ve tamponlar kullanılmalıdır; Eldivenler değiştirilmeli ve hayvanlarla çalışma yapılırken çalışma alanı temizlenmelidir. Hücre süspansiyonu elde edildikten sonra, laminer biyolojik bir başlık altında çalışma yapılmalıdır. Kaplamayı takiben, hücreler gece boyunca herhangi bir rahatsızlık olmadan inkübe edilmelidir, çünkü bu yapışmayı etkileyebilir. Ek olarak, tohumlamadan bir gün sonra kültür ortamının değiştirilmesi önemlidir, çünkü yapışkan olmayan hücreler kültür canlılığını etkileyebilir.
Bu protokolde kullanılan yüzey belirteçleri epitoplarıyla güçlü bir şekilde reaksiyona girdi; Bununla birlikte, enzimatik sindirimin bağlanma reaktivitesini ve dolayısıyla FACS analiz sonuçlarını etkilemesi mümkündür. Bu protokolün bir başka sınırlaması da muscularis tabakasının yeterince temsil edilmemesidir. Kas tabakası hücre izolasyonunun verimliliğini artırmak için, kasın mukoza katmanlarından mekanik olarak ayrılmasını ve katmanların her biri için ayrı enzimatik sindirimi öneririz. Epiteli stromadan ayırmak için, mekanik ayırma veya şelatlama ajanları (EDTA veya DTT) kullanılabilir; Bununla birlikte, tek hücrelerin elde edilmesi için enzimatik sindirim bu protokolde optimize edilmiştir.
Bağırsak mezenkiminin izolasyonu daha önce tarif edilmiştir8; Villusun bir örtü kayması ile kazınması, villusun yanında bazı mezenkimlerin, özellikle de Lgr5+ villus ucu telositleri13 gibi villus ucu mezenkimal hücrelerinin kaybına neden olur. Bu protokolde, dispaz II yerine kollajenaz tip VIII'i ve DNaz I ile kombinasyon halinde tripsin kullanıyoruz, çünkü kollajenaz mezenkimal hücreleri matristen daha verimli bir şekilde serbest bırakıyor. İşlem süresini uzatmasına rağmen (>90 dakikaya karşı 35 dakika), iki protokol benzer hücre canlılığı oranları verdi; Mevcut protokol, genel olarak mezenkimal hücrelerin ve daha spesifik olarak telosit fraksiyonunun verimini arttırdı. Mevcut protokol, hem görselleştirme hem de FACS analizi ile doğrulanan yaklaşık% 10 GFP + telosit verirken, önceki protokol% 2 GFP + telosit verdi. Geçerli protokol ile iki başvuru protokolü arasındaki başlıca farklar Ek Tablo S1'de listelenmiştir.
FOXL1 + GFP + hücrelerinin subepitelyal telositler olarak tanımlanması in vivo çalışmalara dayanmaktadır. Daha yüksek telosit verimi üretmek için mevcut mezenkim izolasyon protokollerini geliştirme ve değiştirme ihtiyacı ve bunun nasıl başarılacağı bilgisi, epitel hücrelerine yakından bağlı uzun hücresel projeksiyonlara sahip büyük hücreler olarak FOXL1 + telositlerinin in vivo yapısı ve işlevi hakkındaki anlayışımıza dayanıyordu.
İlginçtir ki, ex vivo GFP + telositler, bağırsakta in vivo özelliklerine benzer hücresel özellikler sergiler ve bu nedenle organoid büyüme için ideal bir destek görevi görmesi önerilir. Bu protokol esas olarak ince bağırsaktan telosit izolasyonunu tartışsa da, küçük modifikasyonlu benzer bir protokol, yakın zamanda tarif edilen MAP3K2 tarafından düzenlenmiş bağırsak stromal hücresi (MRISC) 12 gibi kolon mezenkimal hücreleri için kullanılabilir ve kolayca uygulanabilir.
Mezenkimal hücreler gerildikten ve akıcılığa ulaştıktan sonra, büyüme faktörü içermeyen Matrigel kullanarak, fare veya insan kaynaklı organoidlerle 3D ortak kültür gibi çeşitli ek uygulamalar için kullanılabilirler. Mezenkim tipik olarak, eksojen büyüme faktörü takviyesi olmadan organoid oluşumunu ve büyümesini tamamen destekleyen bir ağ oluşturur. Bağırsak stroması, epiteli mekanik destek sağlayabilen içsel 3D özelliklere sahiptir14. Bu nedenle, bu protokol aynı zamanda 3D biyo-baskılı bir iskeleye entegre edilecek ve daha ileri ksenogreft deneyleri için kullanılacak mezenkimi izole etmek için de kullanılabilir.
Disclosures
Yazarların beyan edecekleri çıkar çatışmaları yoktur.
Acknowledgments
Bu çalışma, İsrail Bilim Vakfı'ndan (MSC kişisel hibesi) gelen hibeler ve İsrail Bilim Vakfı ile Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı arasındaki ortak program ile desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL Centrifuge Tubes | Corning | 430052 | |
| 50 mL Centrifuge Tubes | Corning | 430828 | |
| 5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube with Cell-strainer cap | Corning | 352235 | |
| 6 Well Cell Culture Plate | Costar | 3516 | |
| APC Anti-Mouse CD31 | Biolegend | 102509 | |
| APC Anti-Mouse CD326 | Biolegend | 118213 | |
| APC Anti-Mouse CD45 | Biolegend | 103111 | |
| Cell Lifter | Corning | 3008 | |
| Cell Strainer 100μm Nylon Yellow | Corning | CLS431752 | |
| Collagenase type VIII | Sigma | C2139-500MG | |
| DL-Dithiothreitol (DTT) | Sigma | 43815-1G | |
| DMEM/F-12 (HAM) 1:1 | Biological Industries | 01-170-1A | |
| DNase I | Sigma | DN25-1G | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Biological Industries | 01-055-1A | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Sigma | D1283-500ML | 10x |
| EDTA 0.5 M, pH 8.0 | Biological Industries | 01-862-1B | |
| FBS | Biological Industries | 04-007-1A | |
| Gentamicin | Sigma | G1914-250MG | 100x |
| Gluta Max-I | Gibco | 35050-038 | 100x |
| Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) | Biological Industries | 02-017-5A | 10x |
| HEPES | Gibco | 15630-080 | 100x |
| Penicillin-Streptomycin (Pen/Strep) | Biological Industries | 03-033-1B | 100x |
| RPMI 1640 medium | Gibco | 21875-034 | |
| Trypsin EDTA Solution B | Sartorius | 03-052-1A |
References
- Carroll, T. D., Newton, I. P., Chen, Y., Blow, J. J., Näthke, I. Lgr5+ intestinal stem cells reside in an unlicensed G1 phase. The Journal of Cell Biology. 217 (5), 1667-1685 (2018).
- Kinchen, J., et al. Structural remodeling of the human colonic mesenchyme in inflammatory bowel disease. Cell. 175 (2), 372-386 (2018).
- Popescu, L. M., Faussone-Pellegrini, M. -S. TELOCYTES - a case of serendipity: The winding way from Interstitial Cells of Cajal (ICC), via Interstitial Cajal-Like Cells (ICLC) to TELOCYTES. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 14 (4), 729-740 (2010).
- Gherghiceanu, M., Manole, C. G., Popescu, L. M. Telocytes in endocardium: electron microscope evidence. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 14 (9), 2330-2334 (2010).
- Ceafalan, L., Gherghiceanu, M., Popescu, L. M., Simionescu, O. Telocytes in human skin—are they involved in skin regeneration. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 16 (7), 1405-1420 (2012).
- Hinescu, M. E., Gherghiceanu, M., Suciu, L., Popescu, L. M. Telocytes in pleura: two- and three-dimensional imaging by transmission electron microscopy. Cell and Tissue Research. 343 (2), 389-397 (2011).
- Popescu, L. M., et al.
- Shoshkes-Carmel, M., et al. Subepithelial telocytes are an important source of Wnts that supports intestinal crypts. Nature. 557 (7704), 242-246 (2018).
- Dekkers, J. F., et al. A functional CFTR assay using primary cystic fibrosis intestinal organoids. Nature Medicine. 19 (7), 939-945 (2013).
- Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett’s epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
- Vonk, A. M., et al. Protocol for application, standardization and validation of the forskolin-induced swelling assay in cystic fibrosis human colon organoids. STAR Protocols. 1 (1), 100019 (2020).
- Wu, N., et al. MAP3K2-regulated intestinal stromal cells define a distinct stem cell niche. Nature. 592 (7855), 606-610 (2021).
- Bahar Halpern, K., et al. Lgr5+ are a signaling source at the intestinal villus tip. Nature Communication. 11 (1), 1936 (2020).
- Koliaraki, V., Pallangyo, C. K., Greten, F. R., Kollias, G.
