Summary
ミニブタ(ミニブタ)は、人工内耳の研究に最適な大型動物モデルです。ミニブタへの人工内耳手術は、ヒトと同様の生体系における新規電極アレイおよび外科的アプローチの安全性および潜在的性能の初期証拠を提供するために利用することができる。
Abstract
人工内耳(CI)は、重度から重度の感音難聴の人を治療するための最も効果的な方法です。CIは世界中で使用されていますが、CIを持つ患者または動物モデルの電気生理学および組織病理学を調査したり、電極アレイの新しいモデルを評価したりするための標準モデルは存在しません。ヒトと同様の蝸牛特性を有する大型動物モデルは、ヒトで使用する前に、高度および改変アレイの研究および評価プラットフォームを提供する可能性がある。
この目的のために、我々は、内耳の解剖学的構造がヒトと非常に類似しているBamaミニブタを用いて標準的なCI法を確立した。ヒト用に設計されたアレイを丸い窓膜を通してミニブタ蝸牛に移植し、ヒトCIレシピエントに使用されるものと同様の外科的アプローチが続いた。アレイ挿入に続いて、誘発複合活動電位(ECAP)測定を行い、聴神経の機能を評価しました。この研究では、動物の準備、外科的ステップ、アレイ挿入、および術中の電気生理学的測定について説明します。
結果は、ヒトに使用されたのと同じCIが、標準化された外科的アプローチを介してミニブタに容易に移植でき、ヒトCIレシピエントで測定されたのと同様の電気生理学的結果をもたらすことを示しました。ミニブタは、新しい電極アレイと外科的アプローチの安全性と潜在的な性能の初期証拠を人間に適用する前に提供するための貴重な動物モデルになる可能性があります。
Introduction
世界保健機関(WHO)によると、世界で10億人以上が難聴のリスクにさらされており、2050年までに4人に1人が難聴に苦しむと推定されています1。過去20年間、CIは、永続的な重度で重度の感音難聴(SNHL)を持つ人々にとって最も効果的な介入でした。CIは、音の物理的信号を生体電気信号に変換し、有毛細胞をバイパスしてらせん状神経節ニューロン(SGN)を刺激します。時間の経過とともに、CIの適応症は拡大され、現在では残存聴、片側性難聴、および非常に高齢者または若年者が含まれるようになりました2,3,4。一方、完全に埋め込み可能なCIと高度なアレイが開発されました5。しかし、CIを用いて内耳の電気生理学および組織病理学を調査するための経済的に実現可能な大型動物モデルはありません。この大型動物モデルの欠如は、CIを改善し、内耳に対するCIの電気生理学的影響についての洞察を得ようとする研究を制限します。
CI研究では、マウス6、スナネズミ7、ラット8、モルモット9など、いくつかのげっ歯類動物モデルが適用されています。しかし、形態や電気生理学的応答の特徴はヒトとは異なります。ネコ、モルモット、その他の動物など、CI研究に伝統的に使用されている動物モデルの蝸牛構造は、ヒトの蝸牛構造のそれとは大きく異なります10。アレイ挿入はネコ11とウサギ12で行われてきましたが、蝸牛が小さいため、これは人間で使用するように設計されていないアレイで行われました。CIのためにいくつかの大型動物モデルも調査されています。子羊は非外傷性人工内耳のトレーニングモデルとして適していますが、蝸牛のサイズが小さいため、完全なアレイ挿入が不可能になります13。霊長類は、人間と解剖学的に類似しているため、CI研究に最も適した動物である可能性があります14,15;しかし、サルの性的成熟は遅れ(4〜5年)、妊娠期間は最大約165日であり、各女性は通常、年間16人の子孫しか産みません。これらの理由と高価なコストは、CI研究における霊長類の広範な適用を妨げています。
対照的に、ブタは5-8ヶ月で性成熟に達し、妊娠期間は~114日であり、ブタは大型動物モデルとしてCI研究に利用しやすくなっています16。バマミニブタ(ミニブタ)は、1985年に中国の小型ブタ種に由来し、その遺伝的背景はよく理解されています。それらは、固有の小さいサイズ、早期の性的成熟、急速な繁殖、および管理の容易さによって特徴付けられます17。ミニブタは、形態学および電気生理学において人間と類似しているため、耳鼻咽喉科および聴覚学の理想的なモデルです18。バマミニブタのスカラティンパニの長さは38.58 mmで、人間の36 mmの長さに近い10。ミニブタ蝸牛は3.5ターンで、これは人間10に見られる2.5〜3ターンに似ています。形態学に加えて、バマミニブタの電気生理学も人間のそれと非常に似ています18。そこで本研究では,ヒト用アレイを丸窓膜を介してミニブタ蝸牛に挿入し,ヒトCIレシピエントと同様の外科的アプローチをとった。術中ECAP測定を適用して手順を評価しました。ここで説明するプロセスは、CIに関連する前臨床トランスレーショナルリサーチと、レジデントトレーニングのプラットフォームの両方として使用できます。
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Protocol
すべての手順と動物の手術は、人民解放軍総合病院の倫理委員会のガイドラインに従って実施され、承認されました。
1.麻酔と外科的準備
- ブタ(オス、生後2か月、5 kg)にチレタミンとゾラゼパムを10〜15 mg / kgの用量で筋肉状に注射し、5.5フレンチ気管内チューブで挿管します。.イソフルオラン吸入による人工呼吸器補助呼吸による麻酔を維持します。.豚の舌に接続されているECGモニターのパルスオキシメトリクランプを使用して、酸素飽和度(>90%)、呼吸(15-20 /分)、および心拍数(60-120ビート/分)を監視します。
- 低体温症を防ぐために、ミニブタをサーモスタットで調整された加熱パッドの左横位置(右側を移植する場合)に置きます。さまざまな刺激を使用して豚が適切に麻酔されていることを確認します。すべての反応がないことを確認します(例:つま先のピンチ反射)。角膜が乾かないように、ミニブタの目に人工涙液軟膏を塗ります。医療用パッチを使用して目を閉じたままにしてください。
- 耳たぶの周りの手術部位を直径10cmに保ち(図1)、ヨウ素とアルコールの交互の綿棒で中心から外側に向かって円を描くように消毒します。手術領域を滅菌外科用ドレープで覆います。
- 顕微鏡を滅菌プラスチックスリーブで覆い、接眼レンズと対物レンズを覆っている部品を取り外します。
2.外科的処置
- 耳たぶの高さで後耳介溝の1 cm後ろの蝸牛の表面投影部位を見つけます。#15メスを使用して、突起部位を中心に長さ約5cmの耳介後切開を行います。皮下組織、耳下腺、胸鎖乳突筋をマイクロハサミで分割し、乳様突起骨の表面を露出させます(図2A)。出血を最小限に抑えるために、必要に応じて双極焼灼を使用してください。
- 皮質乳様突起切除術
- 乳様突起骨上の蝸牛の表面突起(図2B)から、密で淡い青色の外耳道(EAC)に乳様突起をドリルで開けます(図2C)。出血を避けるために、EACの顔面神経背側の淡いまたは赤みがかった垂直セグメントを損傷しないように注意してください(図2C)。
注:顔面神経が損傷している場合は、双極焼灼が出血を止めるのに適しています。
- 乳様突起骨上の蝸牛の表面突起(図2B)から、密で淡い青色の外耳道(EAC)に乳様突起をドリルで開けます(図2C)。出血を避けるために、EACの顔面神経背側の淡いまたは赤みがかった垂直セグメントを損傷しないように注意してください(図2C)。
- 後部骨EACを囲む骨に穴を開けて鼓膜を露出させます(図2D)。顔面神経を傷つけないように、EACの皮膚と顔面神経を皮下注射針で分離します。EACの皮膚を慎重に押しのけて、鼓膜(耳小骨鎖を含む)と丸い窓のニッチを露出させます(図3A)。
- 丸い窓の膜を露出させます。小さなダイヤモンドバリで丸い窓のニッチを取り除き、連続的な吸引灌漑を維持して、蝸牛と丸い窓の膜の基底回転を露出させます(図3B)。
- レシーバーパッケージを修正します。頭頂筋を分離して、レシーバーにちょうど十分な大きさのポケットを形成します。内部レシーバーパッケージを筋肉ポケットに入れ、固定縫合糸で固定します。
- 筋肉ポケットに固定されたレシーバーに接続された電極アレイを鋭利なマイクロサージカルナイフで開き、マイクロ鉗子を使用して蝸牛のモディオラスとの関係でゆっくりと、着実に、そして連続的にアレイを挿入します(図3C)。吸収性縫合糸2-0で外科的切開部を縫合する。
- ECAP 測定
注:セットアップは、刺激装置(MAXプログラミングインターフェース)とCIコイルを介して患者の人工内耳(CI)に接続されたMAESTROソフトウェアを備えたPCで構成されています。- CIコイルを皮膚を通してCIレシーバーに磁気的に接続します。CIの完全性を確認し、MAESTROソフトウェアによって自動的に実行されるCIのテレメトリ機能を使用して、ECAP測定の前にすべてのチャネルの電極インピーダンスを確認します(図4A、B)。
- 前述のようにECAP測定を実施します19。ECAPモジュールを選択し、刺激する12個の電極すべてを選択し、電極のECAPテストが完了するのを待ちます。ECAP応答の測定に使用されるソフトウェアと刺激装置については、 材料表 を参照してください。30 μsの位相持続時間の二相性刺激を使用して、交互極性パラダイム、平均25回の反復、および45.1パルス/秒の刺激速度を使用して、ECAP測定のために12個の電極すべてを刺激します。
3.術後ケア
- ミニブタが胸骨横臥を維持するのに十分な意識を取り戻すまで、無意識の動きによる害を避けるためにミニブタを監視し続けます。低体温を防ぐために、サーモスタットで調整された加熱パッドにミニピグを置きます。
- ミニブタを一人でホームケージに戻します。
- 術後感染を防ぐために抗生物質を7日間注射します。
- 眼振、旋回、横転などの前庭損傷の症状がないかミニブタを確認します。
4.術後CTスキャン
- 麻酔を誘発するために、3%ペントバルビタールナトリウム1 ml / kg、および0.1 ml / kgのスルフォラファンをミニブタに筋肉内注射します。.37°Cの保温プレートを使用して保温してください。3〜5分後、CTスキャンを行うことができます。
- 電極アレイの正しい位置を確認するには、手術の1週間後にミニブタをチレタミンとゾラゼパムで麻薬化します。CTスキャンおよび3D再構成20 を3Dスライサ画像コンピューティングプラットフォーム( 材料表を参照)を用いて行う。CTのDICOMデータをインポートし、 ボリュームレンダリング モジュールを実行してCIの3D画像を実現します。
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Representative Results
CIの完全性(図4A)とインピーダンス(図4B)は、MAESTROソフトウェアによって確認されました。ECAPの結果、12個の電極すべてが良好な神経反応を示し(図4C)、電極アレイが蝸牛軸にうまく取り付けられ、聴神経を刺激したことが示されました。 図5 は、右蝸牛の術後の3D再構成電極コイルを示しています。アレイは折りたたまれたり脱臼したりしませんでした。電極アレイは蝸牛の基底ターンでコイル状に巻かれ(図5A)、電極は緑色でレンダリングされます(図5B)。3D再構成は、電極アレイが蝸牛にらせん状に巻かれていることを示しています(図5C)。
図1:蝸牛の手術位置と表面投影。 麻酔をかけたブタは左横位にあった。白い破線の円は蝸牛の表面投影を示しています:耳たぶの高さで後耳介溝の1 cm後方。スケールバー= 2 cm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:皮質乳様突起切除術 。 (A)耳介後切開を行い、皮下組織、耳下腺、胸鎖乳突筋を分割して乳様突起骨の表面を露出させます。(B)乳様突起骨上の蝸牛の表面突起に乳様突起をドリルで開けます。(C)EACと顔面神経の垂直セグメントを露出させます。(D)後部EACを囲む骨をドリルで開けて、EACの皮膚を明らかにします。スケールバー = (A) 1 cm, (B,C) 0.5 cm, (D) 0.1 cm.略称:EAC =外耳道。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:鼓 膜の露出。 (A)EACの皮膚を前方に押し、鼓膜を露出させます。中耳のランドマーク、インカス、ステープル、および窓のニッチの周りは、はっきりと見える必要があります。(B)丸い窓のニッチを取り除き、丸い窓の膜を露出させます。(C)丸窓膜を通して術中電極を挿入します。スケールバー = (A) 0.5 cm, (B) 0.2 cm, (C) 0.1 cm.略称:EAC =外耳道。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:12個の電極のCIおよびECAP結果のテレメトリ 。 (A)CIの完全性テスト。(B)電極のインピーダンス試験。(C)12個の電極すべてのECAP結果。略語:CI =人工内耳;ECAP = 誘発された複合活動電位。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図5:電極の術後CT 3D再構成(協奏曲F28の電極)。 (a)電極アレイは、蝸牛の基底ターンにコイル状に巻かれている。(B)電極は緑色でレンダリングされます。(C)3D再構成は、電極アレイが蝸牛にらせん状に巻かれていることを実証する。スケールバー= 10 mm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
世界人口の約15%がある程度の難聴を患っており、5%以上が難聴を患っています21。CIの提供は、重度で重度の感音難聴の成人患者と小児患者の両方にとって最も効率的な治療法です。CIは、移植型脳神経刺激装置として初めて成功した過去20年間、何千人もの難聴者に音の世界に戻り、主流社会に(再)統合する機会を提供してきました。CIは現在、元の外観や機能とは大きく異なりますが、CI研究にはまだ人間に似た大きな動物モデルがありません。経済的でアクセス可能な大型動物モデルは、人間から直接取得することは容易または倫理的ではない重要な電気生理学的および組織病理学的情報を提供します。
CIに依存するいくつかの生体電気処理が現在研究されています。Guoら22は、CIを介した電気音響刺激が神経幹細胞の増殖を促進し、ニューロンに分化させることができることを見出した。さらに、成長ホルモン23、グリア細胞株由来神経栄養因子(GDNF)24、脳由来神経栄養因子(BDNF)25などのいくつかの因子が、神経突起の伸長を促進したり、SGNの生存率を高めたりすることが証明されています。これらの結果は、CI使用の恩恵を受けない可能性のあるSGN変性症の患者に希望を与える可能性があります。
それにもかかわらず、上記のCI性能を改善する可能性のある有望な研究は、 in vitro または小動物モデルで行われています。実験は、生きている人間で実験を行う前に、大型動物モデルで実施する必要があります。したがって、本明細書に記載されるプロトコルは、バマミニブタにおいて人工内耳移植を行う方法を実証する。この動物モデルを使用する大きな利点は、ヒトで使用されるのと同じ装置を動物で研究できること、すなわち、装置または投与量をスケールアップまたはスケールダウンする必要がないことである。
自発呼吸動物への全身麻酔で十分なモルモットやマウスへの人工内耳移植とは異なり、バマミニブタへの人工内耳移植は、手術時間とプロトコルの点でヒトと同様です。チレタミンとゾラゼパムを10〜15 mg / kgの投与量で筋肉内注射しました。.術中麻酔深度確保には,気管内挿管とイソフルオランによる人工呼吸器補助呼吸が不可欠であった.
丸いウィンドウを正常に公開するには、2 つの重要な手順があります。1つ目は手術中の動物の位置です。動物の首の下にクッションを横方向に置くと、乳様突起をはっきりと露出させるのに役立ちます。2つ目は、耳たぶの高さで後耳介溝の1 cm後方に位置する乳様突起の表面上の蝸牛の投影領域を決定することです(図1)。この部位で乳様突起を穿孔すると、EACと顔面神経に簡単にアクセスできます。
2つの重要な解剖学的ランドマーク、EACと顔面神経の垂直セグメントは、中耳を識別するのに役立ちます。顔面神経は赤みがかった色または青白く見えますが、EACの皮膚は青みがかっています(図2D)。後部骨EACを取り除き、EACの皮膚を注意深く前方に押して鼓膜を明らかにする必要があります。丸い窓のニッチは丸い窓の膜を保護します(図3A)。ドリルでニッチを取り除くと、膜が露出します(図3B)。顔面神経が丸い窓の膜を塞ぐことがあり、その場合、顔面神経を切断して膜を露出させる必要があります。顔面神経を切断すると大量の出血が発生し、手術の視界が不明瞭になります。出血を止めるために双極性凝固を使用する必要があります。頭蓋骨の骨溝にインプラントを固定する人工内耳手術とは異なり、ミニブタの頭蓋骨は人間よりも薄いため、インプラントを筋肉ポケットに固定しました。頭蓋骨の上部にレシーバーを固定すると、豚がケージを頭の側面でこすることが多いため、両側の衝突による損傷を回避できます。
本明細書に記載の手順は、新しいタイプのアレイの研究、ならびにCIと組み合わせたバイオセラピーおよび遺伝子治療への適用が可能である。この研究で使用したブタの聴覚は正常であるため、音(例えば、食物の笛)に対する術後の反応を観察することは困難です。今後の研究テーマとして、CIが伝達する音に対するブタの応答を一連の観察法の確立を目指します。
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Disclosures
著者は、利益相反がないことを宣言します。
Acknowledgments
この研究は、中国国家自然科学基金会(第81970890号)および重慶科学研究機関パフォーマンスインセンティブプロジェクト(第19540号)からの助成金によって資金提供されました。MED-EL社のAnandhan Dhanasingh氏とZhi Shu氏のご支援に感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5 mm diamond burr | |||
| 1 mm diamond burr | |||
| 5 mm diamond burr | |||
| 2-0 suture silk | |||
| 3D Slicer image computing platform | 3D reconstruction of CT image | ||
| Alcohol | |||
| Bipolar cautery | |||
| Bipolar electrocoagulation | Stop bleeding | ||
| CI designed for human use (CONCERTO FLEX28) | MED-EL | Concerto F28 | |
| Dressing forceps | |||
| ECG monitor | |||
| Iodine tincture | |||
| Isoflurane | 3.6 mL/h | ||
| Laryngoscope | |||
| MAESTRO Software | MED-EL | Measure ECAP responses | |
| Micro forceps | |||
| Micro spatula | |||
| Mosquito forceps | |||
| Needle holder | |||
| Needle probe | |||
| Negative pressure suction device | |||
| Otological surgical instruments | |||
| Respiratory Anesthesia Machine | |||
| Scalpel with blade No. 15 | |||
| Scissors | |||
| Shaver | |||
| Stimulation device (MAX Programming Interface) | MED-EL | Measure ECAP responses | |
| Surgery microscope | Leica | ||
| Surgical drill | |||
| Surgical Power Device | |||
| Tiletamine and zolazepan | 10-15 mg/kg | ||
| Tissue forceps | |||
| Trachea cannula |
References
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