Summary
Porcos em miniatura (mini-porcos) são um modelo animal de grande porte ideal para a pesquisa de implantes cocleares. A cirurgia de implante coclear em mini-porcos pode ser utilizada para fornecer evidências iniciais da segurança e do desempenho potencial de novas matrizes de eletrodos e abordagens cirúrgicas em um sistema vivo semelhante aos seres humanos.
Abstract
Os implantes cocleares (IC) são o método mais eficaz para tratar pessoas com perda auditiva neurossensorial severa a profunda. Embora os ICs sejam usados em todo o mundo, não existe um modelo padrão para investigar a eletrofisiologia e histopatologia em pacientes ou modelos animais com IC ou para avaliar novos modelos de matrizes de eletrodos. Um modelo animal de grande porte com características de cóclea semelhantes às dos seres humanos pode fornecer uma plataforma de pesquisa e avaliação para matrizes avançadas e modificadas antes de seu uso em humanos.
Para este fim, estabelecemos métodos padrão de IC com mini-porcos Bama, cuja anatomia do ouvido interno é altamente semelhante à dos seres humanos. Matrizes projetadas para uso humano foram implantadas na mini cóclea de porco através de uma membrana de janela redonda, e uma abordagem cirúrgica seguida foi semelhante à usada para receptores humanos de IC. A inserção do array foi seguida por medidas de potencial de ação composto evocado (ECAP) para avaliar a função do nervo auditivo. Este estudo descreve a preparação do animal, as etapas cirúrgicas, a inserção da matriz e as medidas eletrofisiológicas intraoperatórias.
Os resultados indicaram que o mesmo IC usado para humanos poderia ser facilmente implantado em mini-porcos através de uma abordagem cirúrgica padronizada e produziu resultados eletrofisiológicos semelhantes aos medidos em receptores de IC humanos. Os mini-porcos podem ser um modelo animal valioso para fornecer evidências iniciais da segurança e do desempenho potencial de novas matrizes de eletrodos e abordagens cirúrgicas antes de aplicá-las aos seres humanos.
Introduction
De acordo com a Organização Mundial da Saúde (OMS), mais de 1 bilhão de pessoas estão em risco de perda auditiva em todo o mundo, e estima-se que, até 2050, uma em cada quatro pessoas sofrerá perda auditiva1. Nas últimas 2 décadas, os ICs têm sido a intervenção mais eficaz para pessoas com perda auditiva neurossensorial (PASN) severa e profunda permanente. Um IC converte sinais físicos de som em sinais bioelétricos que estimulam os neurônios ganglionares espirais (SGNs), ignorando as células ciliadas. Com o passar do tempo, as indicações de IC foram ampliadas para que passem a incluir pessoas com audição residual, perda auditiva unilateral e pessoas muito velhas ou jovens 2,3,4. Enquanto isso, ICs totalmente implantáveis e matrizes avançadas foram desenvolvidos5. Não há, no entanto, um modelo animal de grande porte economicamente viável para investigar a eletrofisiologia e histopatologia da orelha interna com IC. Essa falta de um modelo animal de grande porte limita a pesquisa que busca melhorar os ICs e obter insights sobre o impacto eletrofisiológico dos ICs no ouvido interno.
Vários modelos animais de roedores têm sido aplicados em pesquisas de IC, como camundongo6, gerbil7, rato8 e cobaia9; no entanto, as características da morfologia e das respostas eletrofisiológicas são diferentes das dos seres humanos. As estruturas cocleares de modelos animais tradicionalmente utilizados para estudos de IC, como gatos, cobaias e outros animais, diferem muito daquelas das estruturas cocleares humanas10. Embora a inserção de matrizes tenha sido conduzida em gatos11 e coelhos12, por causa de suas cócleas menores, isso foi feito com matrizes que não foram projetadas para uso em humanos. Vários modelos animais de grande porte também foram explorados para IC. Os cordeiros são adequados como modelo de treinamento para o implante coclear atraumático, mas o menor tamanho da cóclea impossibilita a inserção completa13. Os primatas podem ser os animais mais adequados para a pesquisa de IC devido à sua semelhança anatômica com os seres humanos14,15; no entanto, a maturidade sexual dos macacos é atrasada (4-5 anos), o período de gestação é de até cerca de 165 dias, e cada fêmea geralmente produz apenas uma prole por ano16. Essas razões, e o custo caro, dificultam a extensa aplicação de primatas na pesquisa de IC.
Em contraste, os porcos atingem a maturidade sexual aos 5-8 meses e têm um período de gestação de ~114 dias, tornando os porcos mais acessíveis para a pesquisa de IC como um modelo animal de grande porte16. Os mini porcos Bama (mini-porcos) originaram-se de uma espécie de porco de pequeno porte na China em 1985, cujo fundo genético é bem compreendido. Caracterizam-se por um pequeno tamanho inerente, maturidade sexual precoce, reprodução rápida e facilidade de manejo17. O mini-porco é um modelo ideal para otologia e audiologia devido à sua semelhança com os seres humanos em morfologia e eletrofisiologia18. O comprimento da scala tympani de um mini-porco Bama é de 38,58 mm, o que é próximo do comprimento de 36 mm em humanos10. A mini-cóclea de porco tem 3,5 voltas, o que é semelhante às 2,5-3 voltas vistas em humanos10. Além da morfologia, a eletrofisiologia dos mini-porcos Bama também é altamente semelhante à dos humanos18. Portanto, no presente estudo, inserimos matrizes projetadas para uso humano na cóclea de mini-porco através da membrana de janela redonda e seguimos uma abordagem cirúrgica semelhante à utilizada em receptores de IC humanos. Medidas de ECAP intraoperatórias foram aplicadas para avaliar o procedimento. O processo que descrevemos aqui poderia ser usado tanto para pesquisa translacional pré-clínica associada a ICs quanto como uma plataforma para treinamento de residentes.
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Protocol
Todos os procedimentos e cirurgias de animais foram realizados de acordo com as diretrizes do Comitê de Ética do Hospital Geral do PLA e foram aprovados.
1. Anestesia e preparação cirúrgica
- Injete o porco (macho, 2 meses de idade, 5 kg) muscularmente com tiletamina e zolazepam com uma dosagem de 10-15 mg/kg e intube-o com um tubo endotraqueal 5.5-French. Manter a anestesia por respiração assistida por ventilador com inalação de isofluorano. Monitore a saturação de oxigênio (>90%), respiração (15-20/min) e frequência cardíaca (60-120 batimentos/min) usando o grampo de oximetria de pulso de um monitor de ECG, que é conectado à língua do porco.
- Coloque o mini-porco em uma posição lateral esquerda (quando o lado direito deve ser implantado) em uma almofada de aquecimento regulada por termostato para evitar a hipotermia. Confirme se o porco está adequadamente anestesiado usando vários estímulos. Garantir a ausência de todas as respostas (por exemplo, reflexo de pinça do dedo do pé). Aplique pomada lacrimal artificial nos olhos do miniporco para evitar que a córnea seque. Mantenha os olhos fechados usando um adesivo médico.
- Raspar a área cirúrgica ao redor do lóbulo da orelha, mantendo-o com 10 cm de diâmetro (Figura 1) e desinfetá-lo com três swabs alternados de iodo e álcool em movimento circular do centro para o exterior. Cubra a área cirúrgica com cortinas cirúrgicas estéreis.
- Cubra o microscópio com uma manga de plástico estéril e remova as partes que cobrem as oculares e a objetiva.
2. Procedimento cirúrgico
- Localizar o local de projeção superficial da cóclea 1 cm atrás do sulco auricular posterior ao nível do lóbulo da orelha. Faça uma incisão pós-auricular de cerca de 5 cm de comprimento com o local de projeção como centro usando um bisturi #15. Divida o tecido subcutâneo, a glândula parótida e o músculo esternocleidomastoideo com microtesouras para expor a superfície do osso mastoideo (Figura 2A). Use cauterização bipolar quando necessário para minimizar o sangramento.
- Mastoidectomia cortical
- Perfurar a mastoide na projeção superficial da cóclea no osso mastoideo (Figura 2B) até o meato acústico externo (MAE), que é denso e azul pálido (Figura 2C). Tenha cuidado para não danificar o segmento vertical pálido ou avermelhado do nervo facial dorsal ao MAE para evitar sangramento (Figura 2C).
NOTA: Se o nervo facial estiver danificado, a cauterização bipolar é uma boa escolha para parar o sangramento.
- Perfurar a mastoide na projeção superficial da cóclea no osso mastoideo (Figura 2B) até o meato acústico externo (MAE), que é denso e azul pálido (Figura 2C). Tenha cuidado para não danificar o segmento vertical pálido ou avermelhado do nervo facial dorsal ao MAE para evitar sangramento (Figura 2C).
- Expor o tímpano perfurando o osso ao redor do MAE ósseo posterior (Figura 2D). Separe a pele do MAE e do nervo facial com uma agulha hipodérmica para evitar danificar o nervo facial. Empurre cuidadosamente a pele do MAE para longe para expor o tímpano (incluindo a cadeia ossicular) e o nicho da janela redonda (Figura 3A).
- Exponha a membrana redonda da janela. Remova o nicho da janela redonda com uma pequena rebarba de diamante e mantenha a sucção-irrigação contínua para expor o giro basal da cóclea e a membrana da janela redonda (Figura 3B).
- Corrija o pacote do receptor. Separe o músculo parietal craniano para formar uma bolsa grande o suficiente para o receptor. Coloque o pacote receptor interno na bolsa muscular e fixe-o com uma sutura de fixação.
- Insira a matriz de eletrodos, que é conectada a um receptor fixado em uma bolsa muscular, abrindo a membrana da janela redonda com uma faca microcirúrgica afiada e inserindo a matriz usando micropinças lenta, constante e continuamente em relação ao modíolo da cóclea (Figura 3C). Suture a incisão cirúrgica com uma sutura absorvível 2-0.
- Medições do ECAP
NOTA: A configuração é composta por um PC com Software MAESTRO conectado ao implante coclear (IC) do paciente através do dispositivo de estimulação (MAX Programming Interface) e da bobina do CI.- Conecte magneticamente a bobina de CI ao receptor de CI através da pele. Confirme a integridade do IC e verifique a impedância do eletrodo para todos os canais antes das medições de ECAP usando a função de telemetria do CI, que é conduzida pelo software MAESTRO automaticamente (Figura 4A,B).
- Realizar as medições do ECAP conforme descrito anteriormente19. Selecione o módulo ECAP, escolha todos os 12 eletrodos para estimulação e aguarde que os testes ECAP dos eletrodos sejam concluídos. Consulte a Tabela de Materiais para o software e o dispositivo de estimulação utilizados para medir as respostas do ECAP. Estimular todos os 12 eletrodos para medições de ECAP usando estímulos bifásicos de duração de fase de 30 μs, com um paradigma de polaridade alternada, com média de mais de 25 iterações e uma taxa de estimulação de 45,1 pulsos/s.
3. Cuidados pós-operatórios
- Continue monitorando o mini-porco para evitar danos devido ao movimento inconsciente até que ele tenha recuperado a consciência suficiente para manter a decúbito esternal. Coloque o minipig na almofada de aquecimento regulada termostaticamente para evitar a hipotermia.
- Coloque o mini-porco de volta em sua gaiola doméstica sozinho.
- Injete antibióticos para prevenir a infecção pós-operatória por 7 dias.
- Verifique o mini-porco para sintomas de lesão vestibular, como nistagmo, circulando ou capotando.
4. Tomografia computadorizada pós-operatória
- Administrar injeção intramuscular de pentobarbital sódico a 3% 1 ml/kg e 0,1 ml/kg de sulforafano para minipig para induzir a anestesia. Use uma placa de aquecimento de 37 ° C para mantê-la aquecida. Após 3 ou 5 minutos, uma tomografia computadorizada pode ser realizada.
- Para confirmar a posição correta da matriz de eletrodos, narcotize o mini-porco com tiletamina e zolazepam 1 semana após a operação. Realize a tomografia computadorizada e a reconstrução 3D20 usando a plataforma de computação de imagem de segmentação de dados 3D (consulte a Tabela de Materiais). Importe dados DICOM do CT e conduza o módulo de renderização de volume para obter imagens 3D do CI.
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Representative Results
A integridade (Figura 4A) e as impedâncias (Figura 4B) do IC foram confirmadas pelo software MAESTRO. Os resultados do ECAP mostraram que todos os 12 eletrodos demonstraram boas respostas neurais (Figura 4C), o que significa que a matriz de eletrodos estava bem aderida ao eixo coclear e estimulava o nervo auditivo. A Figura 5 demonstra bobinas de eletrodos reconstruídas em 3D no pós-operatório na cóclea direita. A matriz não dobrou ou se deslocou. A matriz de eletrodos foi enrolada no giro basal da cóclea (Figura 5A), e os eletrodos são renderizados em verde (Figura 5B). A reconstrução 3D demonstra que a matriz de eletrodos foi enrolada em espiral na cóclea (Figura 5C).
Figura 1: Posição cirúrgica e projeção superficial da cóclea. O porco anestesiado encontrava-se em posição lateral esquerda. O círculo tracejado branco mostra a projeção superficial da cóclea: 1 cm atrás do sulco auricular posterior ao nível do lóbulo da orelha. Barra de escala = 2 cm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Mastoidectomia cortical. (A) Faça uma incisão pós-auricular e divida o tecido subcutâneo, a glândula parótida e o músculo esternocleidomastóideo para expor a superfície do osso mastoideo. (B) Perfure a mastoide na projeção superficial da cóclea no osso mastoideo. (C) Expor o MAE e o segmento vertical do nervo facial. (D) Perfure o osso ao redor do MAE posterior para revelar a pele do MAE. Barras de escala = (A) 1 cm, (B,C) 0,5 cm, (D) 0,1 cm. Abreviação: MAE = meato acústico externo. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Expondo o tímpano . (A) Empurre a pele do MAE para frente e exponha o tímpano. Os marcos do ouvido médio, da bigorna, dos estribos, bem como ao redor do nicho da janela, devem ser claramente visíveis. (B) Remova o nicho da janela redonda e exponha a membrana da janela redonda. (C) Inserir eletrodos intraoperatórios através da membrana da janela redonda. Barras de escala = (A) 0,5 cm, (B) 0,2 cm, (C) 0,1 cm. Abreviação: MAE = meato acústico externo. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Telemetria dos resultados do IC e ECAP de 12 eletrodos . (A) Teste de integridade do IC. (B) Testes de impedância em eletrodos. (C) Resultados ECAP de todos os 12 eletrodos. Abreviaturas: IC = implante coclear; ECAP = potencial de ação composto evocado. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Reconstrução pós-operatória por TC 3D de eletrodos (Eletrodos do Concerto F28). (A) A matriz de eletrodos é enrolada na volta basal da cóclea. (B) Os eléctrodos são renderizados a verde. (C) A reconstrução 3D demonstra que a matriz de eletrodos está enrolada em espiral na cóclea. Barra de escala = 10 mm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Cerca de 15% da população mundial tem algum grau de perda auditiva e mais de 5% têm perda auditiva incapacitante21. O fornecimento de IC é o tratamento mais eficiente para pacientes adultos e pediátricos com perda auditiva neurossensorial severa e profunda. Como o primeiro estimulador de nervos cranianos implantável bem-sucedido, nas últimas 2 décadas, os ICs ofereceram a milhares de pessoas com perda auditiva a oportunidade de retornar ao mundo do som e (re)integrar-se à sociedade convencional. Mesmo que os ICs sejam agora muito diferentes de sua aparência e função originais, a pesquisa de IC ainda carece de um grande modelo animal semelhante aos seres humanos. Um modelo animal de grande porte econômico e acessível forneceria informações eletrofisiológicas e histopatológicas importantes que não são fáceis ou éticas de obter diretamente dos seres humanos.
Vários tratamentos bioelétricos, dependendo do IC, estão atualmente sendo investigados. Guo et al.22 encontraram que a estimulação eletroacústica via IC poderia promover a proliferação e diferenciação de células-tronco neurais em neurônios. Além disso, vários fatores, como o hormônio do crescimento23, o fator neurotrófico derivado da linhagem celular glial (GDNF)24 e o fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF)25 demonstraram promover a extensão da neurite ou aumentar a taxa de sobrevivência dos SGNs. Esses resultados podem dar esperança aos pacientes com degeneração da SGN, que podem não se beneficiar do uso de IC.
No entanto, a pesquisa promissora que pode melhorar o desempenho do IC mencionada acima é realizada in vitro ou em pequenos modelos animais. Experimentos devem ser conduzidos em grandes modelos animais antes de conduzi-los em seres humanos vivos. Assim, o protocolo aqui descrito demonstra como realizar o implante coclear em um mini-porco Bama. A grande vantagem de usar esse modelo animal é que os mesmos dispositivos podem ser estudados em animais como são usados em humanos, ou seja, os dispositivos ou dosagens não precisam ser ampliados ou reduzidos.
Ao contrário do implante coclear em cobaias ou camundongos, onde a anestesia geral em um animal que respira espontaneamente é suficiente, o implante coclear em mini-porcos Bama é semelhante ao dos seres humanos em termos de tempo de operação e protocolos. Tiletamina e zolazepam foram injetados por via intramuscular com uma dosagem de 10-15 mg/kg. Após a indução anestésica bem-sucedida, a intubação endotraqueal e a respiração assistida por ventilação mecânica com isofluorano foram essenciais para garantir a profundidade da anestesia no intraoperatório.
Há duas etapas principais para expor com sucesso a janela redonda. A primeira é a posição do animal durante a cirurgia. Colocar uma almofada sob o pescoço do animal em uma posição lateral ajuda a expor claramente o osso mastoideo. A segunda é determinar a área de projeção da cóclea na superfície da mastoide, que está localizada 1 cm atrás do sulco auricular posterior ao nível do lóbulo da orelha (Figura 1). A perfuração da mastoide neste local permite fácil acesso ao EAC e ao nervo facial.
Dois marcos anatômicos importantes, o MAE e o segmento vertical do nervo facial, são úteis para identificar a orelha média. O nervo facial aparece avermelhado ou pálido, enquanto a pele do MAE parece azulada (Figura 2D). Deve-se remover o MAE ósseo posterior e empurrar cuidadosamente a pele do MAE para a frente para revelar o tímpano. O nicho da janela redonda abriga a membrana da janela redonda (Figura 3A). A remoção do nicho com uma broca expõe a membrana (Figura 3B). O nervo facial pode bloquear a membrana da janela redonda, caso em que o nervo facial deve ser cortado para expor a membrana. Cortar o nervo facial resulta em sangramento maciço e obscurece a visão cirúrgica. A coagulação bipolar deve ser usada para parar o sangramento. Ao contrário da cirurgia de implante coclear em humanos, na qual o implante é fixado em um sulco ósseo no crânio, fixamos o implante em uma bolsa muscular porque o crânio de um mini-porco é mais fino do que o de um ser humano. Fixar o receptor no topo do crânio deve evitar danos devido à colisão em ambos os lados, porque os porcos muitas vezes esfregam sua gaiola com os lados de suas cabeças.
O procedimento aqui descrito poderia ser aplicado à pesquisa de novos tipos de matrizes e à bioterapia e terapia gênica combinadas com IC. Devido à audição normal dos suínos utilizados nesta pesquisa, é difícil observar as respostas pós-operatórias em relação ao som (por exemplo, um apito para alimentação). Como tema de pesquisas futuras, objetivamos estabelecer uma série de métodos para observar as respostas dos suínos ao som transmitido pelo IC.
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Disclosures
Os autores declaram que não têm conflitos de interesse.
Acknowledgments
Este estudo foi financiado por doações da Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (Nos. 81970890) e do projeto de incentivo ao desempenho da Chongqing Scientific Research Institution (Nos. 19540). Agradecemos a Anandhan Dhanasingh e Zhi Shu da empresa MED-EL por seu apoio.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5 mm diamond burr | |||
| 1 mm diamond burr | |||
| 5 mm diamond burr | |||
| 2-0 suture silk | |||
| 3D Slicer image computing platform | 3D reconstruction of CT image | ||
| Alcohol | |||
| Bipolar cautery | |||
| Bipolar electrocoagulation | Stop bleeding | ||
| CI designed for human use (CONCERTO FLEX28) | MED-EL | Concerto F28 | |
| Dressing forceps | |||
| ECG monitor | |||
| Iodine tincture | |||
| Isoflurane | 3.6 mL/h | ||
| Laryngoscope | |||
| MAESTRO Software | MED-EL | Measure ECAP responses | |
| Micro forceps | |||
| Micro spatula | |||
| Mosquito forceps | |||
| Needle holder | |||
| Needle probe | |||
| Negative pressure suction device | |||
| Otological surgical instruments | |||
| Respiratory Anesthesia Machine | |||
| Scalpel with blade No. 15 | |||
| Scissors | |||
| Shaver | |||
| Stimulation device (MAX Programming Interface) | MED-EL | Measure ECAP responses | |
| Surgery microscope | Leica | ||
| Surgical drill | |||
| Surgical Power Device | |||
| Tiletamine and zolazepan | 10-15 mg/kg | ||
| Tissue forceps | |||
| Trachea cannula |
References
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