Summary
Aquí describimos un protocolo detallado para generar cultivos altamente enriquecidos de astrocitos derivados de diferentes regiones del sistema nervioso central de ratones postnatales y su conversión directa en neuronas funcionales por la expresión forzada de factores de transcripción.
Abstract
La reprogramación neuronal directa es un enfoque poderoso para generar neuronas funcionales a partir de diferentes poblaciones de células iniciadoras sin pasar por intermedios multipotentes. Esta técnica no solo tiene grandes promesas en el campo del modelado de enfermedades, ya que permite convertir, por ejemplo, fibroblastos para pacientes que sufren enfermedades neurodegenerativas en neuronas, sino que también representa una alternativa prometedora para las terapias de reemplazo basadas en células. En este contexto, un gran avance científico fue la demostración de que las células no neurales diferenciadas dentro del sistema nervioso central, como los astrocitos, podrían convertirse en neuronas funcionales in vitro. Desde entonces, la reprogramación directa in vitro de astrocitos en neuronas ha proporcionado información sustancial sobre los mecanismos moleculares subyacentes a la conversión forzada de identidad y los obstáculos que impiden una reprogramación eficiente. Sin embargo, los resultados de los experimentos in vitro realizados en diferentes laboratorios son difíciles de comparar debido a las diferencias en los métodos utilizados para aislar, cultivar y reprogramar astrocitos. Aquí, describimos un protocolo detallado para aislar y cultivar de manera confiable astrocitos con alta pureza de diferentes regiones del sistema nervioso central de ratones en edades postnatales a través de la clasificación de células magnéticas. Además, proporcionamos protocolos para reprogramar astrocitos cultivados en neuronas a través de la transducción viral o la transfección de ADN. Este protocolo simplificado y estandarizado se puede utilizar para investigar los mecanismos moleculares subyacentes al mantenimiento de la identidad celular, el establecimiento de una nueva identidad neuronal, así como la generación de subtipos neuronales específicos y sus propiedades funcionales.
Introduction
El sistema nervioso central (SNC) de los mamíferos es altamente complejo, que consta de cientos de tipos de células diferentes, incluyendo un gran número de diferentes subtipos neuronales 1,2,3,4,5,6. A diferencia de otros órganos o tejidos 7,8,9, el SNC de mamíferos tiene una capacidad regenerativa muy limitada; La pérdida neuronal después de una lesión cerebral traumática o neurodegeneración es irreversible y a menudo resulta en déficits motores y cognitivos10. Con el objetivo de rescatar las funciones cerebrales, diferentes estrategias para reemplazar las neuronas perdidas están bajo intensa investigación11. Entre ellos, la reprogramación directa de células somáticas en neuronas funcionales está emergiendo como un enfoque terapéutico prometedor12. La reprogramación directa, o transdiferenciación, es el proceso de convertir un tipo de célula diferenciada en una nueva identidad sin pasar por un estado proliferativo o pluripotente intermedio 13,14,15,16. Iniciado por la identificación de MyoD1 como un factor suficiente para convertir fibroblastos en células musculares17,18, este método se ha aplicado con éxito para reprogramar varios tipos de células en neuronas funcionales 19,20,21.
Los astrocitos, la macroglía más abundante en el SNC22,23, son un tipo de célula particularmente prometedor para la reprogramación neuronal directa por varias razones. En primer lugar, se distribuyen amplia y uniformemente en todo el SNC, proporcionando una fuente abundante en loco para nuevas neuronas. En segundo lugar, los astrocitos y las neuronas están estrechamente relacionados con el desarrollo, ya que comparten un ancestro común durante el desarrollo embrionario, las células gliales radiales24. El origen embrionario común de los dos tipos de células parece facilitar la conversión neuronal en comparación con la reprogramación de células de diferentes capas germinales19,21. Además, la información de patrones heredada por los astrocitos a través de su origen en la glía radial también se mantiene en los astrocitos adultos 25,26,27, y parece contribuir a la generación de subtipos neuronales regionalmente apropiados 28,29,30. Por lo tanto, investigar y comprender la conversión de astrocitos en neuronas es una parte importante para lograr todo el potencial de esta técnica para las estrategias de reemplazo basadas en células.
La conversión de astrocitos cultivados in vitro en neuronas ha dado lugar a varios avances en el campo de la reprogramación neuronal directa, entre ellos: i) la identificación de factores de transcripción suficientes para generar neuronas a partir de astrocitos 15,19,31, ii) el desentrañamiento de los mecanismos moleculares desencadenados por diferentes factores de reprogramación en el mismo contexto celular 32 , y iii) destacando el impacto del origen en el desarrollo de los astrocitos en la inducción de diferentes subtipos neuronales 28,29,33. Además, la conversión directa in vitro de astrocitos desentraña varios obstáculos importantes que limitan la reprogramación neuronal directa34,35, como el aumento de la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS)34 y las diferencias entre el proteoma mitocondrial de los astrocitos y las neuronas35. Por lo tanto, estas observaciones apoyan firmemente el uso de cultivos primarios de astrocitos como modelo para la reprogramación neuronal directa para investigar varias preguntas fundamentales en biología12, relacionadas con el mantenimiento de la identidad celular, los obstáculos que previenen los cambios en el destino celular, así como el papel del metabolismo en la reprogramación.
Aquí presentamos un protocolo detallado para aislar astrocitos de ratones en edad postnatal (P) con muy alta pureza, como lo demuestra el aislamiento de astrocitos de la médula espinal murina29. También proporcionamos protocolos para reprogramar astrocitos en neuronas a través de la transducción viral o la transfección de plásmidos de ADN. Las células reprogramadas se pueden analizar a los 7 días después de la transducción (7 DPT) para evaluar diversos aspectos, como la eficiencia de reprogramación y la morfología neuronal, o se pueden mantener en cultivo durante varias semanas, para evaluar su maduración a lo largo del tiempo. Es importante destacar que este protocolo no es específico de los astrocitos de la médula espinal y se puede aplicar fácilmente para aislar astrocitos de varias otras regiones del cerebro, incluida la materia gris cortical, el mesencéfalo y el cerebelo.
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Protocol
El siguiente procedimiento sigue las directrices de cuidado de animales del Helmholtz Zentrum Munich de acuerdo con la Directiva 2010/63/UE sobre la protección de los animales utilizados con fines científicos. Asegúrese de cumplir con las pautas de cuidado de animales de la institución donde se realiza la disección.
1. Preparación de materiales de disección, disociación y cultivo
NOTA: Prepare todos los reactivos de cultivo dentro de un gabinete de seguridad biológica y trabaje utilizando solo equipos esterilizados o esterilizados en autoclave. Los reactivos de disección y disociación se pueden preparar fuera de un gabinete de seguridad biológica.
- Preparar los matraces de cultivo recubriendo un matraz de cultivo T25 con poli-D-lisina (stock 1 mg/ml; solución de trabajo 20 μg/mL) en H2O durante un mínimo de 2 h. Después, enjuague 3x con H2O y seque al aire.
- Prepare el tampón de disección agregando 5 ml de solución tampón HEPES de 1 M a 500 ml de solución salina equilibrada (HBSS) de Hank.
- Prepare un tubo C (ver Tabla de Materiales) por cada seis médulas espinales agregando 1950 μL de tampón X del kit de disociación del tejido neural (ver Tabla de Materiales). Almacenar en hielo durante la disección. Prepare la mezcla maestra de digestión enzimática agregando 20 μL de tampón Y y 10 μL de tampón A por tubo C (parte del kit de disociación del tejido neural; consulte la Tabla de materiales). Mezclar bien y conservar a 4 °C hasta que sea necesario.
- Prepare 1x solución salina tamponada con fosfato (1x PBS) con calcio y magnesio y colóquela en hielo. Preparar el medio de cultivo básico añadiendo 5 mL de penicilina-estreptomicina (concentración final, 100 U/mL), 5 mL de D-glucosa al 45% y 5 mL de suplemento de glutamina (concentración final 2 mM; ver Tabla de Materiales) a 485 mL de DMEM/F12. El medio básico es estable a 4 °C durante 4 semanas.
- Prepare el medio de cultivo de astrocitos agregando 1 ml de suplemento de B27 y 5 ml de suero fetal bovino (FBS) a 44 ml de medio de cultivo básico. Medio de suplementación con factor de crecimiento epidérmico (EGF) y factor de crecimiento de fibroblastos básicos (bFGF) (10 ng/mL cada uno). Añadir EGF y bFGF justo antes de usar a la cantidad apropiada de medio.
- Para la disección del tejido de la médula espinal, use un par de pinzas grandes con punta doblada, un par de pinzas pequeñas con punta doblada, un par de pinzas pequeñas, un par de tijeras pequeñas y una espátula pequeña.
2. Aislamiento de astrocitos
- Aislar astrocitos de la médula espinal de ratones postnatales para realizar su reprogramación directa en neuronas funcionales (Figura 1A). Para este protocolo, recolecte tejido de la médula espinal de ratones en el día 2-3 después del nacimiento. Recolectar de seis a ocho médulas espinales para el aislamiento de astrocitos. Use este mismo protocolo para aislar astrocitos de otras regiones del sistema nervioso, como la corteza, el mesencéfalo y el cerebelo. Para estas regiones, obtenga células de cinco a siete días después del nacimiento.
NOTA: Cuando se pretende aislar astrocitos de regiones que no se mencionan en este protocolo, la edad y el material de entrada deben determinarse experimentalmente.
3. Disección del tejido de la médula espinal
NOTA: La disección de tejido se puede realizar fuera de un gabinete de seguridad biológica.
- Sacrifica ratones en P2-P3 por decapitación sin anestesiar al animal. Coloque el torso en una placa de Petri de 35 mm y manténgalo en hielo.
- Abra la piel con tijeras, retire las vértebras con tijeras pequeñas, extraiga la médula espinal y colóquela en el tampón de disección sobre hielo. Bajo un microscopio de disección estereotáctica con aumento de 2x, retire las meninges de la médula espinal aislada usando fórceps y transfiera el tejido de la médula espinal diseccionado y limpiado a un tubo C.
4. Clasificación de células activadas magnéticamente (MACS)
- Agregue 50 μL de enzima P del kit de disociación del tejido neural (ver Tabla de Materiales) y 30 μL de mezcla de enzimas previamente preparada a cada tubo C. Invierta los tubos C y colóquelos en un disociador calentado (consulte la Tabla de materiales), asegurándose de que todo el tejido se recoja en la tapa del tubo.
- Ejecute el programa de disociación 37_NTDK_1 con un tiempo de ejecución de aproximadamente 22 min. Poco antes del final del programa, coloque un colador de 70 μm (consulte la Tabla de materiales) en un número de tubos de 15 ml igual al número de tubos C utilizados y moje previamente el colador con 2 ml de PBS helado. Guarde 1x PBS en hielo durante todo el procedimiento MACS.
- Después de completar el programa, retire los tubos C y centrímelos brevemente para recolectar el tejido en la parte inferior de los tubos. Transfiera el tejido disociado de los tubos C a los tubos de 15 ml preparados pasándolo a través del colador. Deje el colador en tubos de 15 ml.
- Enjuague el tubo C con 10 ml de 1x PBS para recoger el tejido sobrante y recójalo en el mismo tubo de 15 ml pasando a través del colador una vez más. Centrifugar los tubos de 15 ml que contienen tejido disociado a 300 x g durante 10 min a temperatura ambiente.
NOTA: Enfríe la centrífuga hasta 4 °C después de este paso. - Retire el sobrenadante sin alterar el gránulo celular antes de volver a depositar las células en 80 μL de 1x PBS; añadir 10 μL de reactivo de bloqueo del kit MicroBead anti-ACSA-2 del ratón (ver Tabla de Materiales). Mezclar suavemente mediante pipeteo.
- Incubar a 4 °C durante 10 min en la oscuridad (nevera). Agregue 10 μL de microperlas acopladas al antígeno 2 de la superficie de células antiatrocitadas (consulte la Tabla de materiales) y mezcle suavemente mediante pipeteo. Incubar durante 15 min a 4 °C en la oscuridad.
- Lavar las células añadiendo 3 mL de 1x PBS y centrifugar a 300 x g durante 10 min a 4 °C. Durante la centrifugación, ensamble un separador magnético (consulte la Tabla de materiales) colocando el número adecuado de columnas de clasificación magnética (consulte la Tabla de materiales) en el separador con un tubo de recolección de 15 ml debajo. Enjuague las columnas con 500 μL de 1x PBS.
- Retire el sobrenadante y resuspenda las células en 500 μL de 1x PBS antes de transferir las suspensiones celulares a las columnas magnéticas. Dejar drenar por gravedad. Lavar los tubos de 15 ml con 500 μL de 1x PBS y aplicar a la columna. Lave las columnas con 500 μL de 1x PBS para dos lavados adicionales.
- Elute células retirando la columna del separador, agregando 800 μL de medio de cultivo de astrocitos y empujando las células fuera de la columna con el émbolo incluido.
- Células de placa en los matraces de cultivo previamente preparados mediante la adición de 4,2 ml de medio de cultivo de astrocitos suplementado con EGF y bFGF y cultivo a 37 °C y 5% de CO2.
NOTA: El recubrimiento de matraces de cultivo no es necesario para los astrocitos aislados de otras regiones del cerebro, pero proporciona un mejor sustrato para los astrocitos aislados de la médula espinal. - Células de cultivo durante aproximadamente 7 días hasta la confluencia (80%-90%). Si las células no son confluentes después de 7 días, espere hasta 10 días antes de emplatarlas. Después de 10 días, las células ya no proliferan y la eficiencia de reprogramación disminuye.
5. Siembra de astrocitos para reprogramación
NOTA: Los siguientes pasos deben realizarse bajo un gabinete de seguridad biológica con un nivel de seguridad 1 (SL1).
- Prepare placas de 24 pocillos con cubiertas de vidrio recubiertas de poli-D-lisina de la misma manera que se prepararon previamente los matraces de cultivo. Para determinar el número de placas necesarias, considere que los astrocitos están chapados a una densidad de 5-5.5 x 104 células por pozo en una placa de 24 pocillos. Por lo general, aislar seis médulas espinales de ratones P2 produce alrededor de 1 x 106 células.
- Aspirar los medios de los matraces de cultivo T25 que contienen los astrocitos cultivados y lavar una vez con 1x PBS. Separe los astrocitos del matraz de cultivo añadiendo 0,5 ml de tripsina/EDTA al 0,05% e incube a 37 °C durante 5 min. Golpee suavemente el lado del matraz para liberar las células de la superficie del matraz de cultivo y verifique el desprendimiento bajo un microscopio de campo brillante utilizando un aumento de 10X.
- Detener la tripsinización con 2,5 ml de medio de cultivo de astrocitos y recoger la suspensión celular en tubos de 15 ml. Centrifugar a 300 x g durante 5 min, aspirar sobrenadante y resuspendir células en 1 mL de medio de cultivo de astrocitos. Calcule la concentración celular utilizando un hemocitómetro o un sistema automatizado de conteo celular.
- En función del número de células, diluir la suspensión celular con medio de astrocito fresco para obtener una solución de 1-1,1 x 105 células por ml. Suplementar el medio con EGF y bFGF a 10 ng/mL por factor. Añadir 500 μL de suspensión celular, equivalente a 5-5,5 x 104 células, a cada pocillo de las placas de 24 pocillos previamente preparadas y células de cultivo a 37 °C y 5% de CO2.
6. Expresión forzada de factores de transcripción
NOTA: Antes de continuar con el protocolo, es esencial diseñar correctamente el experimento. En particular, es importante incluir siempre un control negativo para la reprogramación, es decir, una condición en la que no se exprese ningún factor de reprogramación. Por ejemplo, cuando se utilizan vectores que transportan el ADNc para el factor de reprogramación y un informador (por ejemplo, proteína fluorescente verde (GFP), DsRed), el control negativo está representado por el mismo vector que lleva solo el informador. Al expresar múltiples factores que llevan diferentes reporteros, el control negativo debe ajustarse en consecuencia.
- El día después del recubrimiento, inspeccione las placas de 24 pocillos para asegurarse de que las células se hayan adherido a las cubiertas.
- Sobre la base del objetivo experimental y los recursos disponibles, la expresión forzada de los factores de reprogramación puede lograrse mediante transducción viral (véase el paso 6.3) o transfección de ADN (véase el paso 6.4).
NOTA: El uso de retrovirus o lentivirus requiere la aprobación de las autoridades gubernamentales y debe realizarse bajo un gabinete de seguridad biológica dentro de un laboratorio con nivel de seguridad 2 (SL2). - Reprogramar los astrocitos transduciendo las células con el retrovirus o lentivirus portador de la información genética para expresar el(los) factor(es) de reprogramación de interés como se describe a continuación.
- Transducir células con un título de virus alto de 1 x 1010-1 x 1012 partículas/ml agregando 1 μL de la suspensión celular directamente al medio de astrocitos. Esto asegura una alta tasa de infección. Cultive las células con el medio astrocito que contiene partículas virales a 37 °C durante 24-36 h antes de continuar con la sección 7 u sección 8, dependiendo del propósito del experimento.
NOTA: Se pueden utilizar diferentes promotores para impulsar la expresión de los transgenes (ver también Resultados Representativos). Los promotores constitutivos (por ejemplo, CMV, CAG) inducen la expresión del transgén antes que los promotores inducibles; sin embargo, ambos tipos de tipos de promotores se han utilizado con éxito para reprogramar las células en neuronas.
- Transducir células con un título de virus alto de 1 x 1010-1 x 1012 partículas/ml agregando 1 μL de la suspensión celular directamente al medio de astrocitos. Esto asegura una alta tasa de infección. Cultive las células con el medio astrocito que contiene partículas virales a 37 °C durante 24-36 h antes de continuar con la sección 7 u sección 8, dependiendo del propósito del experimento.
- Los plásmidos de ADN también se pueden introducir en los astrocitos a través de la transfección de ADN como se describe a continuación.
NOTA: Esto se puede hacer bajo un gabinete de seguridad biológica aprobado para SL1.- Antes de la transfección, obtenga el reactivo de transfección, un ADN plásmido de las construcciones deseadas, un medio de astrocito fresco y un medio reducido en suero (ver Tabla de materiales). Calcule la cantidad requerida de medio reducido en suero (consulte la Tabla de materiales) considerando que cada pocillo de una placa de 24 pocillos requiere 300 μL de medio reducido en suero. Agregue la cantidad adecuada de medio reducido en suero a un tubo de 50 ml y caliéntelo a 37 °C.
- Cuando el medio reducido en suero esté caliente, aspire el medio de astrocitos de todos los pocillos y recójalo en un tubo de 50 ml. Filtre el medio de astrocitos recolectado con un filtro de jeringa de 0,45 μM para eliminar las células desprendidas.
- Agregue un volumen igual de medio de astrocito fresco al medio filtrado para obtener una solución suficiente para agregar 1 ml de medio de astrocito por pozo. Mantenga el medio acondicionado por astrocitos en la incubadora a 37 °C hasta su uso (paso 6.4.9).
NOTA: El medio de cultivo se reutiliza ya que contiene varios factores secretos que apoyan la viabilidad del cultivo. - Agregue 300 μL de medio reducido en suero precalentado a cada pocillo y coloque la placa de 24 pocillos de nuevo en la incubadora.
- Prepare la solución A, que consiste en ADN y medio reducido en suero. Para cada pocillo, use un total de 0.6 μg de ADN y agréguelo a 50 μL de medio reducido en suero. Guarde la solución A a temperatura ambiente hasta su uso.
NOTA: Por lo general, se considera un triplicado técnico por condición. Por lo tanto, se prepara una mezcla suficiente para la reacción de 3,5 (por ejemplo, 2,1 μg de ADN total diluido en 175 μL de medio reducido en suero) para garantizar suficiente material para transfectar tres pocillos de una placa de 24 pocillos. - Prepare la solución B, compuesta por el reactivo de transfección y el medio reducido en suero. Para cada pocillo, agregue 0,75 μL de reactivo de transfección a 50 μL de medio reducido en suero. Como esta solución es común a todas las condiciones de transfección, prepárela a granel para reducir la variabilidad entre las transfecciones.
- Incubar la solución B a temperatura ambiente durante 5 min. Agregue la solución B a la solución A gota por gota en una proporción de 1: 1 y mezcle suavemente. No vórtice. Incubar la solución A + B durante 20-30 min a temperatura ambiente bajo el capó.
- Repita el paso 6.4.5-6.4.7 para todas las condiciones de transfección. Después de 20-30 min, agregue la solución A + B a cada pozo gota a gota para un volumen final de 100 μL. Agite suavemente la placa y coloque las células nuevamente en la incubadora a 37 ° C durante 4 h.
- Después de 4 h, retire el medio de transfección y agregue 1 ml del medio acondicionado de astrocitos precalentado preparado en el paso 6.4.3. Mantenga las células durante 36-48 h antes de continuar con la sección 7 o la sección 8, dependiendo del propósito del experimento.
7. Reprogramación de astrocitos (análisis de 7 días)
- Preparar el medio de diferenciación neuronal añadiendo 1 ml de suplemento de B27 a 49 ml de medio de cultivo básico (ver paso 1.4). Después de 24-48 h, dependiendo de si las células han sido transducidas o transfectadas (ver pasos 6.3 y 6.4, respectivamente), sustituir el medio de astrocitos por 1 mL de medio de diferenciación neuronal por pocillo y las células de cultivo a 37 °C y 9% de CO2.
NOTA: Las células también se pueden mantener al 5% de CO2 si no hay una incubadora de 9% de CO2 disponible. Sin embargo, la reprogramación neuronal es más eficiente en estas condiciones. - Opcional: Para aumentar la eficiencia de reprogramación, complemente el medio de diferenciación neuronal con forskolina (concentración final de 30 μM) y dorsomorfina (concentración final de 1 μM) al reemplazar el medio de astrocitos por medio de diferenciación. Cuando opte por tratar las células con forskolina y dorsomorfina, proporcione una segunda dosis de dorsomorfina 2 días después del tratamiento inicial. Agregue este segundo tratamiento directamente al medio de cultivo.
- La reprogramación directa de astrocitos murinos en células neuronales normalmente ocurre dentro de los 7 días posteriores al cambio del medio. Por lo tanto, 7 días después del inicio de la reprogramación neuronal, fije o recoja las células para el análisis posterior.
8. Reprogramación de astrocitos en neuronas maduras (cultivos a largo plazo)
- Preparar el medio de diferenciación neuronal añadiendo 1 ml de suplemento de B27 a 49 ml de medio de cultivo básico (ver paso 1.4). Después de 24-48 h, dependiendo de si las células fueron transducidas o transfectadas (ver pasos 6.3 y 6.4, respectivamente), reemplace el medio de astrocitos por 1 ml de medio de diferenciación neuronal suplementado con forskolina (concentración final de 30 μM) y dorsomorfina (concentración final de 1 μM) por pozo y células de cultivo a 37 ° C y 9% de CO2.
NOTA: Las células también se pueden mantener al 5% de CO2 si no hay una incubadora de 9% de CO2 disponible. Sin embargo, la reprogramación neuronal es más eficiente en estas condiciones. - Repita el tratamiento con dorsomorfina 2 días después del tratamiento inicial agregándolo directamente al medio de diferenciación neuronal.
- Después de 7 días desde el inicio de la reprogramación neuronal, prepare el medio de maduración agregando 6 μL de N2, 1.2 μL de NT3 (stock 20 μg / mL), 1.2 μL de BDNF (stock 20 μg / mL), 1.2 μL de GDNF (stock 20 μg / mL) y 1.2 μL de cAMP (stock 100 mM) a 189.2 μL de medio de diferenciación neuronal. Suplementar el medio de diferenciación neuronal presente en cada pozo con 200 μL de medio de maduración.
NOTA: El medio de maduración se complementa solo para el primer tratamiento. Todos los tratamientos posteriores se realizan reemplazando parcialmente el medio de diferenciación neuronal como se describe a continuación. - Repetir el tratamiento con moléculas pequeñas eliminando 200 μL de medio de diferenciación neuronal y añadiendo 200 μL de medio de maduración fresco dos veces por semana durante un máximo de 6 semanas. Durante la maduración, use células para experimentos electrofisiológicos (por lo general, en el día 21 o más tarde) o arregle para el análisis posterior (por ejemplo, inmunofluorescencia).
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Representative Results
Los cultivos primarios de astrocitos suelen alcanzar una confluencia del 80% al 90% entre 7 y 10 días después de la clasificación y el recubrimiento de MAC (Figura 1B). En general, un solo matraz de cultivo T25 produce alrededor de 1-1.5 x 106 células, lo que es suficiente para 20-30 hojas de cubierta cuando se siembran células a una densidad de 5-5.5 x 104 células por pozo. El día después del recubrimiento, las células generalmente cubren el 50% -60% de la superficie del deslizamiento (Figura 1C). En esta etapa, los cultivos consisten casi exclusivamente en astrocitos, mientras que otros tipos de células, como los neuroblastos, están prácticamente ausentes (Figura 1D)29.
Los factores de reprogramación se pueden administrar a los astrocitos a través de la transducción retroviral o lentiviral o a través de la transfección de plásmidos de ADN. Por lo general, la transducción viral infecta más células en comparación con la transfección. Como la conversión neuronal directa causa una cantidad sustancial de muerte celular34,35, se prefiere la transducción retroviral o lentiviral para maximizar el número de células para el análisis. Se pueden utilizar diferentes promotores para controlar la expresión de los factores de reprogramación: constitutivos (por ejemplo, CMV, CAG)15,32, inducibles (por ejemplo, elementos sensibles a Tet, Tet-ON)21, o específicos del tipo de célula (por ejemplo, promotor GFAP)36,37. Cuando se utilizan promotores constitutivos o específicos de tipo celular, los astrocitos comienzan a expresar niveles detectables de los transgenes, evaluados por la expresión del informador fluorescente (por ejemplo, GFP, DsRed), dentro de las 24 h posteriores a la entrega del gen, con cada célula independiente de las demás. Por el contrario, los promotores inducibles permiten sincronizar la expresión de los transgenes a través de las células transducidas, ya que se activan después de la adición de una molécula pequeña (por ejemplo, doxiciclina) al medio de cultivo. Los niveles detectables de los factores de transcripción generalmente se alcanzan 18-20 h después de la activación del promotor. En la mayoría de los casos, el pico de expresión del factor de reprogramación se alcanza alrededor de las 48 h, y la expresión mediada por lentivirus tarda un poco más.
Mientras que los cambios transcripcionales después de la reprogramación de la expresión de los factores se pueden detectar tan pronto como 4 h32, los cambios robustos ocurren después de 24 h y más tarde29,32. Los cambios morfológicos siguen a los cambios transcripcionales, y los primeros signos de conversión se pueden observar alrededor de 3 días después de la transducción / transfección (3 DPT). A 7 DPT, las células neuronales inducidas son claramente distinguibles de los astrocitos: su soma es más pequeño que los astrocitos control o no reprogramados, tienen procesos largos y son positivos para el marcador neuronal βIII-tub y son negativos para el marcador de astrocitos GFAP (Figura 1E). Sin embargo, vale la pena señalar que algunas células pueden ser positivas tanto para GFAP como para βIII-tub, lo que sugiere que el programa neuronal ha sido inducido pero la identidad de los astrocitos no ha sido inhibida, o negativas para ambos marcadores, lo que indica la represión de la identidad de los astrocitos pero la ausencia de inducción de la cascada neuronal. En cualquier caso, las células suelen mantener una morfología de astrocitos.
Para análisis más funcionales, como la electrofisiología o la evaluación de los subtipos neuronales generados, los cultivos generalmente se mantienen durante un mínimo de 21 DPT y se tratan con medio de maduración. A 21 DPT, muchas neuronas inducidas son capaces de disparar potenciales de acción y son positivas para el marcador neuronal maduro NeuN, así como para la proteína pansináptica Synaptophysin29 (Figura 1F).
Figura 1: Visión general del cultivo y la reprogramación de astrocitos. (A)Cronología de la conversión directa de astrocitos a neuronas. Cada línea negra representa un paso importante en el protocolo. (B) Imágenes representativas de campo brillante de astrocitos cultivados derivados de la médula espinal después de 7 días en cultivo. Las imágenes se tomaron con un microscopio de campo brillante y un objetivo 10x. La barra de escala representa 100 μm. (C) Imágenes representativas de campo brillante de astrocitos de la médula espinal 1 día después del rechapado a una densidad de 5,5 x 104 células por pozo en una placa de 24 pocillos. Las imágenes se tomaron utilizando un microscopio de campo brillante y un objetivo 10x. La barra de escala representa 100 μm. (D) Imagen de inmunofluorescencia de una βIII-tub, Sox9, GFAP triple tinción en astrocitos fijada 1 día después del recubrimiento para demostrar la pureza del cultivo. Las células se fijaron en paraformaldehído al 4% durante 10 min y se lavaron dos veces con 1x PBS. Las células se bloquearon utilizando un 3% de BSA, 0,5% triton-X 100 en 1 solución de PBS. Los anticuerpos primarios se diluyeron a la concentración adecuada (por ejemplo, anti-GFAP 1:250; anti-βIII-tub 1:250; anti-Syp1 1:500) en solución bloqueadora y se incubaron durante 2 h a temperatura ambiente. Las células se lavaron tres veces con 1x PBS y se incubaron con anticuerpos secundarios conjugados con fluoróforos durante 1 h a temperatura ambiente. Los cubrecolchas se lavaron tres veces con 1x PBS antes de montarlos con Aqua Poly/Mount. Las imágenes se adquirieron utilizando un microscopio de epifluorescencia y un objetivo 40x. La barra de escala representa 20 μm. (E) Imagen de inmunofluorescencia de una βIII-bañera, doble tinción DsRed para demostrar la conversión de astrocito a neurona con Ascl1 después de 7 DPT. Protocolo de inmunofluorescencia y adquisición de imágenes fue como se describió anteriormente. La barra de escala representa 20 μm. (F) Imágenes de inmunofluorescencia de una triple tinción de βIII-tub, DsRed, Synaptophysin 1 (Syp1) para demostrar la madurez neuronal después de 21 DPT de reprogramación con Ascl1. El protocolo de inmunofluorescencia y adquisición de imágenes fue el descrito anteriormente. La barra de escala representa 20 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Los cultivos primarios de astrocitos murinos son un notable sistema modelo in vitro para estudiar la reprogramación neuronal directa. De hecho, a pesar de estar aisladas en una etapa postnatal, las células expresan marcadores típicos de astrocitos29, retienen la expresión de genes de patrones28,29 y mantienen la capacidad de proliferación, similar a los astrocitos in vivo a una edad comparablede 38 años. Después del aislamiento mediado por MACS, las células primero se adhieren al matraz y luego comienzan a proliferar, dando lugar a cultivos de astrocitos altamente enriquecidos29. Es importante destacar que los astrocitos cultivados no se desdiferencian en un estado celular multipotente ni se inmortalizan. Además, no generan neuronas espontáneamente después de la expresión de una proteína reportera (por ejemplo, DsRed o GFP), sino que mantienen una identidad de astrocito. Además, no proliferan indefinidamente, sino que ralentizan su proliferación y transición a una etapa más madura, lo que reduce su potencial de reprogramación neuronal directa32,39.
Hay varios pasos críticos en este protocolo: primero, es esencial aislar cuidadosamente la región de interés y eliminar cualquier tejido contaminante. Por ejemplo, para preparar astrocitos de la médula espinal, la médula espinal se extrae de las vértebras y los ganglios de la raíz dorsal (DRG) se eliminan cuidadosamente. En segundo lugar, las células convertidoras sufren una muerte celular significativa34, lo que tiene un impacto negativo en las células transducidas y en el cultivo general, debido a la estimulación de la fagocitosis por los astrocitos circundantes, así como a la alteración de la osmolaridad de los medios. Por lo tanto, es importante reemplazar el medio de astrocitos con un volumen adecuado de medio de diferenciación (generalmente 1 ml / pozo de una placa de 24 pocillos). Además, la transfección de ADN plásmido es un enfoque fácil y más accesible en comparación con la transducción viral, que requiere una sala de cultivo celular de nivel de seguridad 2 aprobada. Sin embargo, la tasa de transfección y la eficiencia de reprogramación son menores en comparación con la administración mediada por virus de los factores de reprogramación. Por lo tanto, la transfección se puede utilizar como un método rápido para probar el potencial de reprogramación de nuevos factores de reprogramación candidatos o para detectar grupos de factores. Con respecto a la maduración neuronal, las células reprogramadas generalmente se vuelven electrofisiológicamente activas alrededor de las 3 semanas. Aunque no es necesario, el tratamiento de las células con moléculas pequeñas aumenta tanto la supervivencia como la maduración de las células reprogramadas, lo que lleva a una mayor densidad de neuronas inducidas y una morfología más madura.
Aunque el método descrito para aislar y cultivar astrocitos es robusto y confiable, se deben considerar algunos aspectos. En primer lugar, mientras que los métodos convencionales basados en la disociación mecánica del tejido producen un mayor número total de células en cultivo por tejido diseccionado40, un enfoque clasificado por MAC requiere la disección de tejido de seis a ocho crías para aislar un número adecuado de células para experimentos posteriores. Además, el aislamiento de los astrocitos se basa en la expresión de la proteína de la subunidad beta2 transportadora atPasa Na+/K+ (Atp1b2), reconocida por el anticuerpo ACSA-241. En principio, los astrocitos que no expresan Atp1b2 se perderían en la preparación, causando así un sesgo en la preparación. Aunque no podemos excluir que este sea el caso, nuestro análisis del flujo de MACS reveló que pocas células en la fracción negativa eran inmunorreactivas para los marcadores de astroglia Sox9, lo que sugiere la alta eficiencia del protocolo de clasificación MAC. Una segunda advertencia con respecto a Atp1b2 está relacionada con su expresión. Atp1b2 se expresa específicamente por los astrocitos en la etapa postnatal, mientras que en el cerebro adulto de ratón lo expresan otros tipos de células, en particular los oligodendrocitos mielinizantes y las células ependimarias27. Por lo tanto, se requiere una disección cuidadosa del área de interés y un paso de eliminación de mielina para aislar los astrocitos de los cerebros adultos.
En comparación con otros métodos para aislar astrocitos, el enfoque basado en MACS garantiza una alta pureza de los cultivos (>90% de las células Sox9+) y proporciona un procedimiento estandarizado para aislar astrocitos de diferentes regiones del SNC. Esto es particularmente importante cuando se comparan cultivos de diferentes regiones del SNC, ya que la pureza del cultivo obtenida por disociación mecánica clásica puede variar notablemente (>80% GFAP+/DAPI de materia gris cortical, ~50% GFAP+/DAPI de médula espinal)15,29. Un protocolo estandarizado reduce dicha variabilidad y proporciona un punto de partida común para los experimentos de reprogramación in vitro. Esto permite, por ejemplo, comparar sistemáticamente la identidad molecular de astrocitos de diferentes regiones28,29 e investigar el impacto del origen del desarrollo en la eficiencia de reprogramación y la identidad de subtipo de las neuronas inducidas.
En resumen, la reprogramación neuronal directa in vitro de cultivos optimizados de astrocitos es un enfoque muy poderoso para desentrañar los mecanismos moleculares universales y específicos de la región de conversión de astrocitos a neuronas, proporcionando información esencial para diseñar estrategias mejores y más efectivas para la conversión directa in vivo de astrocitos residentes del SNC.
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Disclosures
Los autores declaran que no hay conflictos de intereses.
Acknowledgments
Nos gustaría agradecer a Ines Mühlhahn por clonar los constructos para la reprogramación, a Paulina Chlebik por la producción viral y a Magdalena Götz y Judith Fischer-Sternjak por los comentarios sobre el manuscrito.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% Trypsin/EDTA | Life Technologies | 25300054 | |
| 4', 6-Diamidino-2-phenyindole, dilactate (DAPI) | Sigma-Aldrich | D9564 | |
| anti-mouse IgG1 Alexa 647 | Thermo Fisher | A21240 | |
| anti-Mouse IgG1 Biotin | Southernbiotech | Cat# 1070-08; RRID: AB_2794413 | |
| anti-mouse IgG2b Alexa 488 | Thermo Fisher | A21121 | |
| anti-rabbit Alexa 546 | Thermo Fisher | A11010 | |
| Aqua Poly/Mount | Polysciences | Cat# 18606-20 | |
| B27 Supplement | Life Technologies | 17504044 | |
| BDNF | Peprotech | 450-02 | |
| bFGF | Life Technologies | 13256029 | |
| Bovine Serum Albumine (BSA) | Sigma-Aldrich | Cat# A9418 | |
| cAMP | Sigma Aldrich | D0260 | |
| C-Tubes | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | |
| DMEM/F12 | Life Technologies | 21331020 | |
| Dorsomorphin | Sigma Aldrich | P5499 | |
| EGF | Life Technologies | PHG0311 | |
| Fetal Bovine Serum | PAN Biotech | P30-3302 | |
| Forskolin | Sigma Aldrich | F6886 | |
| GDNF | Peprotech | 450-10 | |
| gentleMACS Octo Dissociator | Miltenyi Biotec | 130-096-427 | |
| GFAP | Dako | Cat# Z0334; RRID: AB_100013482 | |
| Glucose | Sigma Aldrich | G8769 | |
| GlutaMax | Life Technologies | 35050038 | |
| HBSS | Life Technologies | 14025050 | |
| Hepes | Life Technologies | 15630056 | |
| Lipofectamine 2000 (Transfection reagent) | Thermo Fisher | Cat# 11668019 | |
| MACS SmartStrainer 70µm | Miltenyi Biotec | 130-098-462 | |
| MiniMACS Seperator | Miltenyi Biotec | 130-042-102 | |
| Mouse anti-ACSA-2 MicroBeat Kit | Miltenyi Biotec | 130-097-678 | |
| Mouse IgG1 anti-Synaptophysin 1 | Synaptic Systems | Cat# 101 011 RRID:AB_887824) | |
| Mouse IgG2b anti-Tuj-1 (βIII-tub) | Sigma Aldrich | T8660 | |
| MS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| N2 Supplement | Life Technologies | 17502048 | |
| Neural Tissue Dissociation Kit | Miltenyi Biotec | 130-092-628 | |
| NT3 | Peprotech | 450-03 | |
| octoMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-042-109 | |
| OptiMEM – GlutaMAX (serum-reduced medium) | Thermo Fisher | Cat# 51985-026 | |
| Penicillin/Streptomycin | Life Technologies | 15140122 | |
| Poly-D-Lysine | Sigma Aldrich | P1149 | |
| Rabbit anti-RFP | Rockland | Cat# 600-401-379; RRID:AB_2209751 | |
| Rabbit anti-Sox9 | Sigma-Aldrich | Cat# AB5535; RRID:AB_2239761 | |
| Streptavidin Alexa 405 | Thermo Fisher | Cat# S32351 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | Cat# T9284 |
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