Summary
Dit artikel stelt een nieuwe generatie multiparametrische analytische platforms voor met een verhoogde doorvoer voor de karakterisering van extracellulaire vesikelsubsets. De methode is gebaseerd op een combinatie van multiplexed biosensing-methoden met metrologische en morfomechanische analyses door atomaire krachtmicroscopie, gekoppeld aan Raman-spectroscopie, om vesiculaire doelen te kwalificeren die vastzitten op een microarray-biochip.
Abstract
Extracellulaire blaasjes (EV's) zijn membraan-afgeleide, kleine blaasjes geproduceerd door alle cellen die variëren van 50 tot enkele honderden nanometers in diameter en worden gebruikt als een middel voor intercellulaire communicatie. Ze zijn in opkomst als veelbelovende diagnostische en therapeutische hulpmiddelen voor een verscheidenheid aan ziekten. Er zijn twee belangrijke biogeneseprocessen die door cellen worden gebruikt om EV's te produceren met verschillen in grootte, samenstelling en inhoud. Vanwege hun hoge complexiteit in grootte, samenstelling en celoorsprong, vereist hun karakterisering een combinatie van analytische technieken. Dit project omvat de ontwikkeling van een nieuwe generatie multiparametrische analytische platforms met een verhoogde doorvoer voor de karakterisering van subpopulaties van EV's. Om dit doel te bereiken, vertrekt het werk van het nanobioanalytische platform (NBA) dat door de groep is opgericht, dat een origineel onderzoek van EV's mogelijk maakt op basis van een combinatie van multiplexed biosensing-methoden met metrologische en morfomechanische analyses door atomic force microscopy (AFM) van vesiculaire doelen gevangen op een microarray biochip. Het doel was om dit EV-onderzoek af te ronden met een fenotypische en moleculaire analyse door Raman-spectroscopie. Deze ontwikkelingen maken het mogelijk om een multimodale en gebruiksvriendelijke analytische oplossing voor de discriminatie van EV-subsets in biologische vloeistoffen met klinisch potentieel voor te stellen
Introduction
De groeiende belangstelling voor EV-onderzoek in diagnose en in therapeutica 1,2,3,4,5, in combinatie met de uitdagingen waarmee dit veld wordt geconfronteerd, heeft geresulteerd in de ontwikkeling en implementatie van een grote verscheidenheid aan benaderingen en technieken voor het kwantificeren of karakteriseren van deze blaasjes. De meest gebruikte methoden voor EV-identificatie zijn eiwitspecifieke immunoblotting en proteomics om de oorsprong van EV's te bevestigen, transmissie-elektronenmicroscopie (TEM) om hun structuur te bevestigen en nanodeeltjesvolganalyse (NTA) om hun aantal en grootteverdeling in een monstervolume te kwantificeren.
Geen van deze technieken op zichzelf geeft echter alle informatie die nodig is om EV-subsets te karakteriseren. De inherente heterogeniteit van EV's als gevolg van de diversiteit in hun biochemische en fysische eigenschappen belemmert wereldwijde analyses die betrouwbaar en reproduceerbaar zijn, vooral voor EV's in een mengsel (ruw monster). Detectie- en karakteriseringsmethoden zijn daarom nodig voor EV's, zowel individueel als in het algemeen als aanvulling op andere methoden die sneller maar niet selectief zijn6.
Hoge resolutie beeldvorming door TEM (of cryoTEM) of AFM maakt het mogelijk om de morfologie en metrologie van EV's te bepalen met een nanometrische resolutievan 7,8,9,10,11,12. De belangrijkste beperking van het gebruik van elektronenmicroscopie voor biologische objecten, zoals EV's, is echter de noodzaak van een vacuüm om het onderzoek uit te voeren dat de fixatie en uitdroging van het monster vereist. Een dergelijke voorbereiding maakt het moeilijk om te vertalen van de waargenomen structuren naar de in-oplossing EV-morfologie. Om deze uitdroging van het monster te voorkomen, is de techniek van cryoTEM het meest geschikt voor EV-karakterisering13. Het wordt veel gebruikt voor het bepalen van de ultrastructuur van EV's. De immunolabeling van blaasjes door biofunctionele gouden nanodeeltjes maakt het ook mogelijk om specifieke subpopulaties van EV's te identificeren en ze te onderscheiden van andere deeltjes die aanwezig zijn in een complex biologisch monster. Vanwege het lage aantal EV's dat door elektronische microscopie wordt geanalyseerd, is het echter vaak moeilijk om een karakterisering uit te voeren die representatief is voor een complex en heterogeen monster.
Om deze heterogeniteit van de grootte te onthullen, stelt de International Society for Extracellular Vesicles (ISEV) voor om een voldoende aantal widefield-afbeeldingen te analyseren, vergezeld van kleinere afbeeldingen, om individuele EV's met een hoge resolutie14 te onthullen. AFM is een alternatief voor optische benaderingen en elektronische diffractietechnieken voor de studie van EV's. Deze techniek maakt gebruik van een scherpe punt die wordt vastgehouden door een flexibele cantilever die het monster scant dat op één steun is afgezet, regel voor lijn, en de afstand tussen de punt en de aanwezige elementen aanpast via een feedbacklus. Dit maakt het mogelijk om de topografie van het monster te karakteriseren en morfomechanische informatie te verzamelen15,16,17,18. De EV's kunnen door de AFM worden gescand nadat ze zijn afgezet op een atomair vlak substraat of nadat ze zijn vastgelegd op een specifiek substraat dat is gefunctionaliseerd door antilichamen, peptiden of aptameren om de verschillende subpopulaties te karakteriseren18,19. Vanwege het vermogen om de structuur, biomechanica en vliezige biomoleculaire inhoud van EV's in complexe biologische monsters te kwantificeren en tegelijkertijd te onderzoeken zonder de noodzaak van voorbehandeling, etikettering of uitdroging, wordt AFM nu steeds vaker gebruikt om EV's op een fijne en multiparametrische manier te karakteriseren onder fysiologische omstandigheden van temperatuur en medium.
Dit artikel stelt een methodologie voor met behulp van een kern gouden biochip die (bio)chemisch gefunctionaliseerd kan worden in een gemultiplext formaat. Dit substraat is de hoeksteen van een krachtig analytisch platform dat de biodetectie van EV-subsets combineert door oppervlakteplasmonresonantie, en zodra de EV's zijn geadsorbeerd / geënt of immunocaptured op de chip, maakt AFM de metrologische en morfomechanische karakterisering van de EV's mogelijk. In combinatie met de Raman-handtekening van de EV-subsets die op de chip zijn vastgelegd, maakt dit analytische platform de kwalificatie van de EV's in biologische monsters mogelijk op een labelvrije manier en zonder dat er vooraf analytische stappen nodig zijn. Dit artikel laat zien dat de combinatie van krachtige technieken, ondersteund door een zeer rigoureuze methodologie in substraatvoorbereiding en data-acquisitie, de EV-analyse diep, definitief en robuust maakt.
Het principe van de voorgestelde aanpak is om een goudsubstraat voor te bereiden, de EV-subtypen te adsorberen / enten of af te vangen en ze door de AFM te scannen om de grootte en morfologie van elke EV-subset te schatten. Bovendien worden die geadsorbeerde EV's geanalyseerd door Raman-spectroscopie. Dit substraat kan inderdaad drie soorten interfaces van groeiende complexiteit vertonen: naakte, chemisch gefunctionaliseerde of ligandmicroarrays. Alvorens de verschillende stappen van het protocol te beschrijven, worden lezers verwezen naar de schematische presentatie van de nanobioanalytische platformbenadering (NBA) in figuur 1, waarbij oppervlakteplasmonresonantiebeeldvorming (SPRi), AFM en spectroscopie worden gecombineerd.
Figuur 1: Het NanoBioAnalytical platform. De aanpak combineert (A) oppervlakte plasmon resonantie beeldvorming, (B) atoomkracht microscopie, en infrarood / Raman (nano) spectroscopie, allemaal betrokken op hetzelfde substraat - een gemultiplexte gouden chip. Afkortingen: NBA = NanoBioAnalytical platform; SPRi =oppervlakte plasmon resonantie beeldvorming; AFM = atoomkrachtmicroscopie; EV = extracellulair blaasje. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
De kern gouden biochip vormt het hart van het platform, omdat alle labelvrije karakteriseringstechnieken op deze biochip worden uitgevoerd. Afhankelijk van de behoeften van de EV-karakterisering (globale / totale EV's of EV-subsets) en de beperkingen / eisen van de gebruikte methoden, zijn er drie soorten gouden biochipoppervlakken ontwikkeld: ofwel "naakt", chemisch gefunctionaliseerd "C11 / C16", of ligand-biofunctionalized, genaamd "ligand" goudoppervlak.
De naakte biochip, genaamd "naakt", maakt de eenvoudige adsorptie van EV's op goud mogelijk. Het is mogelijk om de gebruikte buffer te selecteren en deze adsorptie te realiseren, hetzij op een passieve manier (incubatie en vervolgens spoelstappen) of om deze onder stroom te bewaken (in SPRi). Bovendien kan deze passieve adsorptie worden gerealiseerd op de hele chip (als een macroarray) of gelokaliseerd in microarrays met behulp van een micropipette-spotter. De "under flow procedure" stelt onderzoekers in staat om de kinetiek en het niveau van EV-adsorptie te volgen. Deze benadering op het naakte gouden substraat wordt toegepast wanneer de chemische laaginterface de analysemethode kan verstoren (bijvoorbeeld voor Raman-spectroscopie).
De chemisch gefunctionaliseerde biochip, genaamd "C11 / C16", wordt gebruikt om een dicht en robuust "tapijt" te creëren van EV's die covalent op het gouden oppervlak zijn gebonden door primaire amidebindingen met de thiolaten te vormen wanneer het doel is om een globaal beeld van het EV-monster te hebben. Inderdaad, in dit geval wordt het goud gefunctionaliseerd door een thiolaatmengsel van mercapto-1-undecanol (11-MUOH: "C11") en mercapto-1-hexadecanoic acid (16-MHA: "C16"), en een fractie van de thiolaten wordt chemisch geactiveerd om covalente binding met de doelen tot stand te brengen. Nogmaals, deze strategie kan passief worden gerealiseerd (incubatie en vervolgens spoelstappen, hetzij in "macroarray" of in meerdere microarrays met behulp van een micropipette-spotter) of onder stroomsnelheden (in SPRi) om de kinetiek en het niveau van EV-enting op het goudoppervlak te volgen.
De ligand-biofunctionele biochip, genaamd "liganden", wordt chemisch geactiveerd om covalent verschillende liganden (bijv. Antilichamen, receptoren) te enten om selectief (met affiniteit) verschillende EV-subsets vast te leggen die naast elkaar bestaan in het biologische monster.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Goud substraat voorbereiding
OPMERKING: Drie soorten oppervlakken worden geproduceerd op goudsnippers: 1) naakt oppervlak, 2) chemisch gefunctionaliseerd en 3) biofunctioneel (liganden geënt op C11C16-laag). Ze zullen vanaf dit punt respectievelijk "naakt", "C11C16" en "liganden" worden genoemd.
- Goud substraat voorbereiding:
OPMERKING: Voor dit protocol werden de gouden biochips in eigen huis vervaardigd in de cleanroom. De zelfgemaakte biochips waren samengesteld uit glazen platen (SF11) met een coating van chroom (2 nm Cr) en goud (48 nm Au). De lengte van de biochip was 28 mm, de breedte was 12,5 mm en de dikte was 0,5 mm20.- Gebruik DC magnetron sputtering15 om de dia's te coaten door fysieke dampafzetting (PVD).
- Chemische functionalisatie:
- Functionaliseer de naakte chips door ze een nacht te incuberen in een mengsel van 90%/10% door mol mercapto-1-undecanol (11-MUOH: C11) en mercapto-1-hexadecaanzuur (16-MHA: C16) bij 1 mM in absolute ethanol, onder roeren en bij kamertemperatuur.
OPMERKING: Deze stap vormt een stabiele, zelfgeassembleerde monolaag (SAM), die nuttig is bij het enten van de liganden. - Reinig de biochip (voorzichtig wassen) met absolute ethanol en ultrapuur water, droog hem onder stikstof en bewaar hem onder cleanroomomstandigheden.
- Activering van de chemisch gefunctionaliseerde biochip:
OPMERKING: Vanaf deze stap moeten de experimenten worden uitgevoerd in een analytisch laboratorium.- Reinig de biochip met ultrapuur water door deze voorzichtig te wassen en droog de chip vervolgens onder een zachte luchtstroom. Om de C16-carbongroepen te activeren, incubeert u de biochip in een mengsel van 200 mM ethyl (dimethylaminopropyl) carbodiimide / N-hydroxysuccinimide (EDC) en 50 mmol / L N-hydroxysuccinimide (Sulfo-NHS) gedurende ten minste 30 minuten in het donker bij kamertemperatuur. Spoel vervolgens af met water voor de entexperimenten.
- Functionaliseer de naakte chips door ze een nacht te incuberen in een mengsel van 90%/10% door mol mercapto-1-undecanol (11-MUOH: C11) en mercapto-1-hexadecaanzuur (16-MHA: C16) bij 1 mM in absolute ethanol, onder roeren en bij kamertemperatuur.
- Enten van de liganden op de gefunctionaliseerde biochip:
OPMERKING: De immobilisatie van de liganden (of EV's voor sommige experimenten) op de chip kan passief buiten het SPRi-instrument worden gedaan (incubatie van een druppel op de geactiveerde chip) of dynamisch-onderstroom in het SPRi-instrument. Dit zijn de EV- of ligand-gemodificeerde chips. Figuur 2 toont de gouden biochip, de micropipettespotter en de biochip na spotting met 16 liganddruppels van elk 300 nL.- Gebruik voor ligandtransplantatie moleculen zoals antilichamen (bijv. immunoglobulinen-antiCD41 [specifiek voor EV's afgeleid van inheemse bloedplaatjes, N-PEV's genoemd], antiCD61, antiCD62P, antiCD9 en antiOVA [controleantilichaam tegen ovalbumine]) en Annexine V. Verdun ze tot 200 μg / ml in een zure oplossing (van pH 4,5 tot 6, afhankelijk van de optimale pH voor ligandactiviteit of -functie).
OPMERKING: De optimale pH voor het enten van antilichamen werd eerder bepaald door preconcentratie-experimenten uitgevoerd op een SPR-instrument voor de bepaling van de optimale pH voor ligandtransplantatie (zie figuur 3). Aangezien de entcondities veranderen met de klonen van antilichamen die worden gebruikt, wordt aanbevolen om deze voorwaarden te bepalen voordat u doorgaat met de SPRi-experimenten. - Voeg voor de entprocedure 300 nL EV's/ligandoplossing toe met behulp van de spotter.
OPMERKING: Een stuk papier ondergedompeld in water moet zowel in de linker- als in de rechterput worden bewaard om de verdamping van druppels te voorkomen. Deze stap is belangrijk om de EV's/liganden in hun optimale omstandigheden te houden voor stabiliteit en functionaliteit. - Houd de biochip na het spotten onder een sonische bad (frequentie: 37 kHz, vermogen: 30%) gedurende een incubatie van 30 minuten. Was de biochip vanaf de bovenkant met ultrapuur water en plaats deze voorzichtig op een prisma met dezelfde brekingsindex (RI) als de biochip. Voeg tijdens het aanpassen van de biochip aan de bovenkant van het prisma een druppel (~ 2,3 μL) olie toe met dezelfde RI als het prisma om een uniforme, dunne laag tussen de biochip en het prisma te creëren.
OPMERKING: Deze stap zorgt voor een continu medium van dezelfde RI in het optische pad. Het is belangrijk om bij deze stap geen bellen in de olielaag op te nemen, omdat dit de optische eigenschappen in het pad zal veranderen en verdere analyse zal belemmeren.
- Gebruik voor ligandtransplantatie moleculen zoals antilichamen (bijv. immunoglobulinen-antiCD41 [specifiek voor EV's afgeleid van inheemse bloedplaatjes, N-PEV's genoemd], antiCD61, antiCD62P, antiCD9 en antiOVA [controleantilichaam tegen ovalbumine]) en Annexine V. Verdun ze tot 200 μg / ml in een zure oplossing (van pH 4,5 tot 6, afhankelijk van de optimale pH voor ligandactiviteit of -functie).
Figuur 2: Biochip en handmatige spotter. Gouden biochip (links), micropipettespotter (midden) en de biochip na spotting met liganddruppeltjes van elk 300 nL (rechts). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Preconcentratietesten om de optimale pH voor ligandtransplantatie te bepalen. Het sensorgram presenteert het interactieniveau als een functie van de tijd voor één ligand dat willekeurig wordt geïnjecteerd (bij verschillende pH-waarden) in dezelfde concentratie gedurende 2 minuten op het oppervlak. OG is het wasmiddel, waarmee de basislijn tussen elke injectie kan worden hersteld. Hier geeft het sensorgram aan dat pH 6 de meeste ligandtransplantatie toeliet, met een SPRi-signaal van 1091 RU. Afkortingen: OG = octyl glucoside; RU = responseenheid. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
2. Oppervlakte plasmon resonantie beeldvorming
- Monteer de biochip op het SPRi-systeem. Houd het debiet van de PBS-buffer (lopende buffer) op 50 μL/min.
OPMERKING: Als er bubbels zijn, verhoog dan het debiet tot 500-1.000 μL / min en injecteer regelmatig 40 mM octylglucoside (OG) om ze zo snel mogelijk te verwijderen. - Conditionering van de gouden biochip in het SPRi-instrument: keuze van de werkhoeken
- Klik op het vervolgkeuzemenu aan de linkerkant van de software en klik op de werkmap om de map te definiëren waarin de experimentele gegevens moeten worden opgeslagen. Klik daarna op Plasmon | Beeldacquisitie.
- Zoek de afbeelding (zoals weergegeven in figuur 4A) waar verschillende vlekken zichtbaar zijn en klik om deze afbeelding te selecteren. Om de regio van belang (ROI) te definiëren, zoals weergegeven in figuur 4, klikt u op automatische detectie of handmatige definitie in de vlekken (figuur 4B) of op de chip om naar een specifieke locatie te verwijzen, zelfs zonder vlekken (figuur 4C).
- Wanneer gemultiplexte biochips worden gebruikt, schrijft u de naam van de ligandfamilies en klikt u vervolgens op de overeenkomstige plekken.
OPMERKING: Een ligandfamilie komt overeen met verschillende plekken die gefunctionaliseerd zijn met hetzelfde ligand. Meestal vertoont de chip minstens duplicaten en zelfs vaak drievoudige exemplaren van elke ligand. - Klik op de definities van de soort voltooien en wacht tot u naar het venster met de verkregen plasmoncurven wordt geleid.
- Kies een werkhoek. Sleep de zwarte lijn met de cursor naar de optimale werkhoek en klik op Spiegel naar werkhoek verplaatsen.
OPMERKING: De plasmoncurve bestaat uit de waarde van de reflectiviteit (%) versus de hoek, en de software geeft een andere curve met de waarde van de helling (%) versus de hoek. Om een goede werkhoek te selecteren, kiest u de hoek met de hoogste waarde van de helling.- In het geval van een passiverende stap (vanwege albumine) die in het apparaat wordt uitgevoerd, selecteert u een werkhoek om de optimale gevoeligheid voor het oppervlak te krijgen, waardoor een kwaliteitscontrole van de oppervlaktereactiviteit wordt ingesteld.
OPMERKING: Deze passiveringsstap is belangrijk wanneer de chip is voorbereid op affiniteit/capture biodetectie om niet-specifieke interacties tussen het monster en het oppervlak van de biochip te verminderen.
- In het geval van een passiverende stap (vanwege albumine) die in het apparaat wordt uitgevoerd, selecteert u een werkhoek om de optimale gevoeligheid voor het oppervlak te krijgen, waardoor een kwaliteitscontrole van de oppervlaktereactiviteit wordt ingesteld.
- Klik op Kinetics om de real-time kinetische monitoring te starten. Zodra de software de gebruiker vraagt om de negatieve controle te definiëren, kiest u op dit punt geen negatieve controle (omdat dit de observatie van de kinetiek op de negatieve controlevlekken mogelijk maakt).
- Injecteer rattenserumalbumine (RSA, 200 μg/ml, bereid in acetaatbuffer, pH 4,5) bij 50 μl/min gedurende 4 minuten om het oppervlak rond de vlekken te passiveren en mogelijk lege ruimtes in de ligandvlekken op te vullen.
OPMERKING: De RSA wordt geïnjecteerd om de biochip te bedekken, die niet gebonden is aan liganden. - Injecteer ethanolamine (1 M) bij 20 μL/min gedurende 10 minuten om de carbongroepen die nog steeds aanwezig en reactief zijn op het oppervlak te deactiveren.
- Was de biochip door 40 mM OG bij 50 μL/min gedurende 4 minuten te injecteren.
OPMERKING: Na de passiveringsstap wordt de werkhoek aangepast (als een nieuwe basislijnbepaling vóór monsterinjectie) om de hoogste gevoeligheid op de relevante plekken te hebben.
- Injecteer rattenserumalbumine (RSA, 200 μg/ml, bereid in acetaatbuffer, pH 4,5) bij 50 μl/min gedurende 4 minuten om het oppervlak rond de vlekken te passiveren en mogelijk lege ruimtes in de ligandvlekken op te vullen.
- Monster injectie:
- Herdefinieer de plasmoncurven na passivering en kies deze keer de werkhoek op basis van het ligand.
- Verlaag bij kinetische monitoring het debiet tot 20 μL/min en wacht tot de basislijn stabiel is.
- Injecteer het monster in een concentratie naar keuze (van 1 x 10 8 EV's/ml tot 1 x 10 10 EV's/ml, afhankelijk van de affiniteit tussen de EV's en de getransplanteerde liganden) en klik op handmatige injectie of automatische injectie. In het geval van handmatige injectie, na het injecteren van 200 μL van het monster, klikt u op stop de injectie. Aangezien de duur van de injectie over het algemeen 10 minuten is, begint u met het volgen van de kinetiek van de interactie en meet u de reflectiviteitsvariatie door het verschil in reflectiviteit tussen het begin en het einde van de injectie te berekenen dat tijdens de kinetische monitoring is waargenomen (figuur 5).
OPMERKING: De verschillende monsters die zijn geïnjecteerd, worden beschreven in de sectie representatieve resultaten.
- Volg na de monsterinjectie een van deze twee benaderingen om het SPRi-experiment te voltooien:
- Bij de unfixed/in-liquid benadering haalt u de biochip uit het SPRi-apparaat, voegt u er een vloeistofdruppel aan toe en gaat u verder met verdere AFM-karakterisering van het oppervlak in vloeistof.
- Injecteer in de vaste benadering glutaaraldehyde (0,5%) verdund in water met 20 μL/min gedurende 10 minuten om de moleculen die op de biochip zijn gevangen te fixeren. Injecteer water om het oppervlak te spoelen, haal de biochip eruit, was het heel voorzichtig met gedestilleerd water en droog het aan de lucht om verder te worden geanalyseerd onder AFM.
Figuur 4: SPRi CCD-beeld van de biochip. (A,B) Gemultiplexte biochip na albuminepassivering. (A) Een chip zonder standaard; (B) enkele defecten die op de chip verschenen: fusie van vlekken (i), zwakke enting (ii), of stof of "verontreinigingen" (iii). De ROIs, in kleur in de vlekken (één kleur per ligandfamilie), werden gekozen om die "verontreinigingen" te vermijden. Wanneer vlekken samensmolten, werden ze opgemerkt en genegeerd of benoemd als "mengsel van liganden 1 en 2". (C) Naakte goudchip zonder microarrays voor het experiment dat de adsorptie van EV's op goud onderzoekt. De blauwe pijl geeft de stroomrichting aan. Deze chip vertoonde geen vlekken en de ROIs werden gekozen om het reflectiviteitssignaal van lijn 1 (L1, rode cirkels) naar lijn 4 (L4, paarse cirkels) tijdens de monsterinjectie te registreren. Schaalbalk = 1 mm voor alle drie de afbeeldingen. Afkortingen: SPRi = oppervlakte plasmon resonantie beeldvorming; CCD = charge-coupled device; ROIs = interessante regio's; EV's = extracellulaire blaasjes. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: SPRi-experimenten met EV-injectie op een biochip. (A) Capture-experiment op een gemultiplexte biochip met de reflectiviteitssignalen van verschillende liganden. Hier was de signaal-ruisverhouding voor de verschillende liganden zeer goed (en vooral op de antiCD41-spots) omdat de respons van de negatieve controle verwaarloosbaar was. (B) Adsorptie-experiment van EV's op een naakte biochip. Sensorgram presenteert de conditionering van de chip met twee spoelingen van buffer- en OG-reiniging (1), met de EV-monsterinjectie (2) en het reflectiviteitssignaal na EV-interactie (3). Op deze biochip was er geen negatieve controle, maar het reflectiviteitssignaal (de kinetiek, de stabiliteit na injectie) was hoog, wat betekent dat die EV's in staat waren om te adsorberen en stabiel te blijven op de goudchip. Afkortingen: EV = extracellulair blaasje; OG = octylglucoside. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
3. Atoomkrachtmicroscopie
- Gebruik de contactmodus om de biochip in lucht te scannen en de kwantitatieve beeldvormingsmodus om de biochip in vloeibare omstandigheden te scannen.
- Lijn de biochip uit op de bovenkant van het masker op de glasplaat (ontwikkeld in het laboratorium) om de positie van de respectieve microvlekken op de biochip te identificeren (figuur 6A).
OPMERKING: Het masker bevat de markeringen van de vlekken, die overeenkomen met de posities van de vlekken van de liganden volgens de gebruikte spotter. Dit masker bestaat uit een glazen schuif waarop twee loodrechte wiggen de plaatsing van de chip mogelijk maken. Bovendien is de glasplaat gemarkeerd met 16 vilten stippen die overeenkomen met de vleklokalisatie op de chip, waardoor de vlekken door transparantie kunnen worden gelokaliseerd en het gewenste gebied kan worden gescand. - Positionering van de tip:
- Gebruik een CCD-camera bovenop de AFM om de cantilever te lokaliseren op de juiste plek die gescand moet worden. Gebruik voor het volgen van dit protocol driehoekige uitkragingen van 200 μm lengte, 28 μm breedte en een veerconstante van 0,08 N/m.
- Lijn de laser uit op de bovenkant van de cantilever op een positie die een optimale respons geeft in het feedbackcontrolemechanisme.
- Scannen:
- Eenmaal ingeschakeld en in contact met het biochipoppervlak, start u de AFM-acquisitie in contactmodus of in kwantitatieve beeldvormingsmodus van drie tot vijf grote gebieden (meestal 10 × 10 μm²) tot kleine gebieden (1 x 1 μm²).
OPMERKING: Een weergave van de verschillende gebieden die kunnen worden gescand, wordt weergegeven in figuur 6D. Zorg ervoor dat de AFM-karakterisering representatief is voor de hele mm²-spot en dat er voldoende EV's met een goede resolutie worden gevisualiseerd voor een robuuste analyse (minimaal 300 EV's geteld en geanalyseerd voor elke conditie), en voer de metrologie- en morfologiemetingen uit.
- Eenmaal ingeschakeld en in contact met het biochipoppervlak, start u de AFM-acquisitie in contactmodus of in kwantitatieve beeldvormingsmodus van drie tot vijf grote gebieden (meestal 10 × 10 μm²) tot kleine gebieden (1 x 1 μm²).
- AFM beeldbehandeling:
- Behandel de AFM-beelden met JPK-gegevensverwerkingssoftware door eerst het hoogtekanaal te selecteren.
- Kies een polynomiale pasvorm die van elke lijn moet worden afgetrokken om rechtgetrokken scanlijnen te verkrijgen.
- Selecteer de hoogtedrempel op goudkorrels om de ruwheid van het oppervlak te elimineren. Markeer in de software waarnaar wordt verwezen (zie de materiaaltabel) binnen de korrelextractiemodule de korrels met een hoogtedrempelwaarde van 8,5 nm. Zodra de korrels zijn gefilterd, verschijnt het aantal korrels .
OPMERKING: Gewoonlijk vereisen het ruwe gouden substraat (RMS van ~ 3 nm) en de aanwezigheid van de chemische en ligandlagen dat de drempel op 8,5 nm wordt ingesteld. - Als u verschillende eigenschappen van de gemarkeerde korrels wilt extraheren, zoals hoogte, volume en diameter, opent u de afbeelding in de software waarnaar wordt verwezen en selecteert u gegevensverwerking | Granen | Markeer op drempel.
- Kies filterkorrels in de functie van eigenschappen. Wanneer een nieuw venster verschijnt, kiest u de volgende parameters: Waarde = maximum z-max, Oppervlakte = geprojecteerd oppervlak A0. Kies vervolgens de criteria A EN B.
- Open graanverdeling; Kies in het venster dat wordt weergegeven waarde (maximum), volume (basis: nul) en grens (lengte). Let op de tabel (in .txt indeling) die wordt weergegeven, die drie kolommen bevat met de hoogte -, volume- en diameterwaarden voor alle korrels die zijn gedetecteerd bij de ingestelde drempel per afbeelding.
- Bereken uit de hoogte, h en diameter, D, de kromtestraal, Rc, van elke EV met behulp van vergelijking (1)8, en bereken vervolgens het volume, V, met behulp van vergelijking (2):
(1)
(2) - Bereken uit V de effectieve diameter, d eff, van elke EV (de diameter van een bol met hetzelfde volume) met behulp van vergelijking (3):
(3) - Plotgrafieken met de afmetingen (gemeten hoogte, gemeten diameter en berekende effectieve diameter) van de EV's, waarbij elk geteld deeltje wordt weergegeven door een punt.
OPMERKING: Aan het einde van de karakterisering maakt het NBA-platform dus de correlatie van het biodetectiesignaal en vervolgens de fenotypering mogelijk met de aantallen en maten van de EV-subsets.
(1)
(2)
(3)
Figuur 6: Biochipkarakterisering door AFM. Na het SPRi-experiment werd de chip gefixeerd en gedroogd of in vloeistof gehouden voor AFM-karakterisering. (A) De bewerkte glasplaat (met twee loodrechte positioneringswiggen, aangegeven met een "w" op de afbeelding) die een masker presenteert dat past bij de lokalisatie van de 16 biochipmicroarrays. Door lichtbelichting en transparantie maakt de glasplaat, eenmaal geïnstalleerd voor de AFM-karakterisering, het mogelijk om de AFM-tip op de gewenste plek te plaatsen om deze te karakteriseren. (B) De biochip geïnstalleerd op de "masker" dia en onder een druppel buffer om te scannen in vloeibare omstandigheden. (C) SPRi-beeld van de 16 microarrays. (D) Eén microarray in beeld gebracht door optische microscopie na de immunocapture van biofunctionele kalibratienanodeeltjes met een diameter van 920 nm. De witte vierkanten geven de steekproef aan van de verschillende gebieden die door de AFM op elke interessante plek zijn gescand om de AFM-karakterisering robuust te maken. Schaalstaven = (C) 1 mm, (D) 500 μm. Afkortingen: AFM = atoomkrachtmicroscopie; SPRi = oppervlakte plasmon resonantie beeldvorming. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
4. Raman spectroscopie
OPMERKING: Vervang voor Raman-spectroscopie de glasplaat die als substraat wordt gebruikt door een dia van CaF2, die een verwaarloosbare Raman-signatuur heeft.
- Optische voorwaarden voor de overname:
- Stel de volgende voorwaarden voor de Raman-beeldvormingsmicroscoop: microscoopobjectief: 50x; lasergolflengte: 532 nm; laservermogen: 10 mW; belichtingstijd: 500 ms; aantal accumulaties: 140; spectraal bereik: van 450 cm−1 tot 3.200 cm−1.
OPMERKING: Het gebruik van te veel vermogen en/of een te lange acquisitietijd kan leiden tot schade aan het monster, wat blijkt uit onstabiele spectra in de loop van de tijd. Begin met een lage hoeveelheid energie en verhoog deze als het signaal te zwak is. Hogere lasergolflengten kunnen worden gebruikt (633 nm, 785 nm) om de fluorescentie te verminderen die schadelijk is voor Raman-metingen. De intensiteit neemt echter af met de vierde kracht van de golflengte en er moet rekening worden gehouden met de spectrale gevoeligheid van de camera.
- Stel de volgende voorwaarden voor de Raman-beeldvormingsmicroscoop: microscoopobjectief: 50x; lasergolflengte: 532 nm; laservermogen: 10 mW; belichtingstijd: 500 ms; aantal accumulaties: 140; spectraal bereik: van 450 cm−1 tot 3.200 cm−1.
- Raman beeldvorming:
- Observeer eerst de live spectra met een verminderd aantal accumulaties (10) om het gebied te vinden met de beste signaal-ruisverhouding.
OPMERKING: Een sterk signaal in het hoogfrequente gebied (2.800-3.000 cm−1) kan de detectie van EV's op het oppervlak met lage belichtingstijden vergemakkelijken, zoals eerder getoond10. - Zodra de ROI is geselecteerd, kiest u de ruimtelijke resolutie op basis van de beschikbare tijd voor de acquisitie.
OPMERKING: De ruimtelijke resolutie wordt beperkt door de diffractielimiet (~500 nm). - Start de Raman mapping acquisitie.
- Observeer eerst de live spectra met een verminderd aantal accumulaties (10) om het gebied te vinden met de beste signaal-ruisverhouding.
- Voorbewerking van gegevens:
- Open met behulp van een Python integrated development environment (IDE) (bijvoorbeeld Spyder) het bestand met de spectra.
- Trek de basislijn van de spectra af om te corrigeren voor de interferentie van mogelijke fluorescentie. Gebruik bijvoorbeeld de functie "arpls" uit het pakket "irfpy"23. Test verschillende waarden van de parameter "lam" om degene te vinden die de beste basislijncorrectie geeft (meestal tussen 103 en 107).
- Normaliseer de spectra bijvoorbeeld door alle intensiteiten van een spectrum te delen door de intensiteit bij 2.900 cm−1 of door het gemiddelde van het spectrum af te trekken en het vervolgens te delen door de standaarddeviatie ("standaard normale variate" normalisatie).
OPMERKING: Deze stap is nodig om de relatieve moleculaire samenstelling van EV's te vergelijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bepaling van de optimale pH-condities voor ligandtransplantatie
De verschillende liganden die worden gebruikt om de biochips te bereiden, worden getest op basis van de pH en hun beschikbaarheid om te interageren met de thiolaatchemische laag (figuur 3). De liganden worden verdund in acetaatbuffer bij verschillende pH-waarden en geïnjecteerd op de biochip chemisch gefunctionaliseerd met een C11C16-laag. De oplossingen worden willekeurig op het oppervlak geïnjecteerd en na elke ligandinjectie wordt een reinigingsmiddel (OG bij 40 mM) geïnjecteerd om de basislijn te herstellen. Met deze voorconcentratietest kan de optimale pH voor elke ligandtransplantatie worden bepaald. In het voorbeeld in figuur 3 werd een pH van 6 geselecteerd als de beste pH in termen van de helling en het niveau van ligandtransplantatie.
SPRi CCD-afbeeldingen
De SPRi CCD-beelden die op de biochip zijn geregistreerd (naakt, chemisch gefunctionaliseerd of microarrays presenterend) na inbrenging in de SPRi-machine, worden weergegeven in figuur 4. In het geval van de microarray-presenterende biochip werd de opname genomen na albuminepassivering van het oppervlak. Duplicaten of drievoudigingen van vlekken werden systematisch op de chip gerealiseerd en er was automatisch ook een negatieve controle op de chip aanwezig. De negatieve controle bestond voornamelijk uit een irrelevant antilichaam. In SPRi, wanneer de biochip werd gebruikt zonder spotting - voor adsorptie op naakt goud of voor het direct enten van EV's op een chemisch gefunctionaliseerde biochip - werden de ROI's willekeurig gekozen in het detectiegebied. Figuur 4C toont bijvoorbeeld ROI's die zijn gekozen op een naakte gouden chip vóór de injectie van EV's.
Dankzij dit SPRi CCD-beeld is het mogelijk om bepaalde vlekken te negeren als dergelijke problemen optreden tijdens het enten. Het SPRi CCD-beeld maakt het ook mogelijk om de homogeniteit van de enting in de spot te schatten, zorgt voor de reproduceerbaarheid van de enting tussen verschillende plekken van hetzelfde ligand en zorgt er ten slotte voor dat de EV-biodetectie verloopt op arrays die gelijkwaardig zijn in termen van oppervlaktedichtheid.
SPRi resultaten
Wanneer de ROIs worden geselecteerd, is de basislijn stabiel, wat betekent dat het monster kan worden geïnjecteerd. Figuur 5 toont verschillende resultaten verkregen op een gemultiplexte biochip, die een hoge signaal-ruisverhouding voor bepaalde immunoarrays onthullen (het reflectiviteitssignaal is 1,4% op antiCD41 vergeleken met de respons op de negatieve controle van 0,02%). Figuur 5B toont de resultaten voor EV-adsorptie verkregen na de injectie van het EV-monster op een naakte goudchip. Het N-PEVs-monster was afkomstig van bloedplaatjes. De oplossing werd gecentrifugeerd bij 3.000 × g gedurende 15 minuten bij 22 °C; het supernatant werd vervolgens opnieuw gecentrifugeerd bij 20.000 × g gedurende 15 minuten bij 22 °C. De resulterende pellet werd geresuspendeerd in de buffer. Die SPRi-resultaten verkregen op immunocaptured N-PEV's werden vergeleken met de western blot (WB) resultaten. De WB onthulde een sterke expressie van CD41, CD62P en CD9 in die monsters, wat een goede correlatie met de SPRi-resultaten benadrukt (aanvullende figuur S1).
Figuur 5B toont de resultaten voor EV-adsorptie verkregen na de injectie van het EV-monster van menselijke primaire mamtheliale cellen (HMEC's) op een naakte goudchip. De HMEC-celcultuur werd gedurende 10 minuten gecentrifugeerd bij 3.650 × g en vervolgens werd het supernatant opnieuw gecentrifugeerd bij 10.000 × g gedurende 30 minuten bij 4 °C. De resulterende pellet werd geresuspendeerd in 1x PBS-buffer om het te wassen en centrifugeren werd opnieuw uitgevoerd bij 10.000 × g gedurende 30 minuten bij 4 °C. Tot slot werd de pellet gesuspendeerd in 1x PBS buffer.
Karakterisering AFM
Na de SPRi-experimenten en EV-laden op de biochips (hetzij door adsorptie, enten of affiniteitsvastlegging), werd AFM uitgevoerd door de methodologie te volgen om grote scans (10 x 10 μm²) en vervolgens (~ 10 ten minste) kleinere (een paar μm²) te scannen. Figuur 7 toont voorbeelden van grootschalige en kleinschalige AFM-beelden van EV's op biochips.
Figuur 7: AFM-karakterisering van EV's op een biochip. Beelden verkregen in contactmodus van een gedroogd monster. (A) Een voorbeeld van een groot scangebied om een representatief beeld te geven van de mm² ROI op de chip. Dit resultaat werd verkregen na het covalent enten van EV's op een chemisch gemodificeerd oppervlak. (B) Een ander voorbeeld van een groot scangebied verkregen na het vangen van EV's op immunoarrays. (C) Een beter zicht op de objecten om een hoge resolutie te krijgen en de metrologie (in hoogte en diameter) van EV's mogelijk te maken. (D) Een nadere weergave van de biochip in de afbeelding in (A) met een 3D-gekanteld beeld. (E) Een ingezoomde weergave van een grote EV geadsorbeerd aan een naakte gouden biochip in een gekanteld 3D-beeld. De Z-schaal is (A, B) 30 nm en (C) 20 nm. Schaalstaven = (A, B) 2 μm, (C) 500 nm. Afkortingen: AFM = Atomic Force Microscopy; EV's = extracellulaire blaasjes. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Gwyddion analyse
Gwyddioon-software werd gebruikt om de gegevens voor elk blaasje te verwerken dat op elke batch AFM-beelden werd gevisualiseerd. Eerst werd een groot gebied (in het bereik van 10 x 10 μm²) met een representatief beeld van de mm² ROI op de chip gescand. De afbeelding in figuur 7A laat zien dat het oppervlak dicht bedekt was met objecten. In dit geval werden de EV's (van rundermelk) geïnjecteerd met 2,5 × 1010 / ml op een geactiveerde thiol-gefunctionaliseerde chip. Na het elimineren van caseïne uit het monster werden wei-supernatanten geconcentreerd door centrifugatie bij 4.000 × g en 20 °C met behulp van Amicon 100 kDa centrifugaalfiltereenheden, en de EV's werden geïsoleerd met behulp van de sucrosegradiënt ultracentrifugatiebenadering. Dit resultaat komt overeen met covalent geënte EV's op een chemisch gemodificeerd oppervlak. Figuur 7B toont een ander voorbeeld van een groot scangebied verkregen na het vangen van EV's op immunoarrays. Ook hier waren objecten aanwezig op het oppervlak, maar vertoonden een minder dichte dekking dan wanneer de EV's covalent op de chip werden geënt. Een nadere blik, in figuur 7C, op verschillende plaatsen in de ROI maakt een hoge resolutie en de metrologie (in hoogte en diameter) van EV's mogelijk. Een andere nadere weergave (figuur 7D) van de biochip in figuur 7A, met een 3D-gekanteld beeld, onthult objecten die blaasjes zijn maar ook gloeidraad (linksboven). Inderdaad, terwijl immunochips de selectieve en differentiële vangst van EV-subsets mogelijk maken, transplanteert covalente enting alle objecten met vrije aminegroepen die in het monster aanwezig zijn. In figuur 7E toont AFM één enkele grote EV uit de HMEC-cultuur geadsorbeerd aan naakt goud. Zo is AFM in staat om kleine tot grote EV's te onthullen en te meten en helpt het het aantal objecten per mm² te tellen door de visualisatie van elke EV mogelijk te maken.
De gemeten hoogte en diameter van elke EV werden bepaald, waaruit de effectieve diameter werd verkregen. De EV-hoogtes besloegen een bereik van 10 nm tot 50 nm, met een gemiddelde van 15 nm; de gemeten EV-diameters besloegen een bereik van 50 nm tot 300 nm, met een gemiddelde van 100 nm. We zagen dat de effectieve diameter van de EV's varieerde van 30 nm tot 300 nm, met een grote meerderheid rond 60 nm (figuur 8A). Die metingen werden uitgevoerd in vloeistof of na fixatie en droging. Figuur 8B laat zien dat de resultaten die in deze twee omstandigheden werden verkregen vergelijkbaar waren.
Figuur 8: Resultaten gegenereerd door de AFM-karakterisering van EV's op een biochip. (A) Metrologie van EV's op één plek (antiCD41 immunoarray), bepaald met een drempelwaarde van 8,5 nm en na injectie van een EV-monster bij 2,5 × 1010/ml. De "effectief berekende diameter" wordt weergegeven, waarbij elke stip overeenkomt met een deeltje dat op de AFM-beelden is gevisualiseerd. B) Histogram gegenereerd op basis van de gegevens onder A, dat de verdeling van de effectieve diameter van de EV's weergeeft. Resultaten verkregen in lucht (in rood: monster gefixeerd en gedroogd) en in vloeistof (in blauw: ongefixeerd). Afkortingen: AFM = atoomkrachtmicroscopie; EV's = extracellulaire blaasjes . Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
De N-PEV-analyse van de AFM is vergeleken met de NTA-resultaten. Die laatste "in-solution" resultaten, door NTA, toonden een verdeling van EV-diameters van 32 nm tot 650 nm, met een grote meerderheid tussen 90 nm en 250 nm in diameter. Rekening houdend met het feit dat NTA niet gevoelig is voor kleine afmetingen (bijna 50 nm), vertonen deze AFM-metingen dus een goede correlatie met die resultaten (aanvullende figuur S2).
De Raman-experimenten, die werden uitgevoerd op EV's geadsorbeerd op een naakte chip, onthulden bemoedigende resultaten; in het bijzonder werd een duidelijk spectrum van de EV's verkregen (figuur 9). Raman-spectra kunnen worden onderverdeeld in drie verschillende bereiken: het "vingerafdrukgebied" (minder dan 1.800 cm−1), dat pieken bevat die moleculair-specifieke patronen vormen en dus het belangrijkste onderdeel is voor identificatiedoeleinden; het "bio-stille" gebied (1.800-2.800 cm−1), dat meestal wordt weggegooid bij het bestuderen van biologische monsters omdat het geen pieken bevat; en het gebied van "hoge frequenties", dat voornamelijk informatie over lipiden bevat en vaak het meest intense deel van het spectrum is, maar minder specifiek is. Het spectrum vertoont pieken die voornamelijk overeenkomen met CH 2-trillingen (2.853 cm−1, 1.444 cm−1 en 130 cm−1), die geassocieerd zijn met de lipiden van het membraan van de EV en een piek die overeenkomt met het fenylalanine-aminozuur 21. Een Raman-piektoewijzingstabel van veel voorkomende moleculen in EV's is te vinden in het artikel van Penders et al.22.
Figuur 9: Raman spectroscopie karakterisering van EV's op een biochip. Hier werd het EV-monster afgeleid van een HMEC-cultuur en teruggewonnen door centrifugatie bij 20.000 × g. (A) Voorbeeld van een Raman-afbeelding van EV's geadsorbeerd op een naakte biochip (gemiddelde intensiteit), bedekt met een brightfield-afbeelding. (B) Voorbeeld van gemeten Raman-spectra van EV's. De stippellijnen komen overeen met geïdentificeerde trillingen. α, scharen; τ, draaien; υ, uitrekken (s, symmetrisch; as, asymmetrisch). Schaalbalk = (A) 50 μm. Afkortingen: EV's = extracellulaire blaasjes. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Aanvullende figuur S1: Nanoparticle tracking analysis (NTA) metingen van N-PEV's. De EV's werden verdund in PBS; de experimenten werden in drievoud uitgevoerd met behulp van een MALVERN-instrument NS300. Gemiddelde diameter = 137,5 nm ± 1,3 nm; modusdiameter = 104,9 nm ± 13,3 nm. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende figuur S2: Western blot assays of N-PEVs. N-PEV's (1) en (2) komen overeen met twee partijen N-PEV's bereid uit twee trombocytenconcentraatpockets. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De recente methoden voor EV-identificatie die het meest worden gebruikt, zijn eiwitspecifieke immunoblotting om de oorsprong van EV's te bevestigen, TEM om hun structuur te bevestigen en NTA om hun aantal en grootteverdeling in een steekproefvolume3 te kwantificeren. Niettemin hebben de grote belangstelling voor EV's in (bio)medisch onderzoek en de beperkingen van bestaande analytische hulpmiddelen de wetenschappelijke gemeenschap ertoe aangezet nieuwe methoden te ontwikkelen voor EV-karakterisering, discriminatie en kwantificering.
De meeste ontwikkelingen richten zich op het combineren van de principes van immunolabeling of immunocapture met geavanceerde fysieke methoden voor EV-detectie. Sommige van deze benaderingen richten zich op de identificatie van individuele EV's om maximaal betrouwbare gegevens op nano-objectschaal te verkrijgen. Anderen houden zich meer bezig met het voorstellen van wereldwijde methoden die betaalbaar en betrouwbaar zijn voor klinisch gebruik.
Het NBA-platform, dat de biodetectie van EV's op een gemultiplext goudsubstraat en AFM-karakterisering combineert, maakt de diepe kwalificatie van de nanovesicles in complexe biologische vloeistoffen mogelijk. Inderdaad, vanwege de selectiviteit van de biochip kunnen ruwe monsters worden geïnjecteerd en kan de blaasjesbijdrage worden benadrukt.
De voorgestelde aanpak bestaat uit de karakterisering van EV's geadsorbeerd/geënt of gevangen door affiniteit op een ruw gouden substraat. AFM, dat conventioneel wordt gebruikt op atomair vlakke substraten, toont nog steeds optimale prestaties op de ruwe goudchip, waardoor verschillende interfaces worden onthuld die micro / nanogestructureerd zijn.
De gemultiplexte biochip met verschillende plekken om te scannen (tot nu toe tot 16) en de NBA-aanpak voor vaste en gedroogde monsters zijn ontwikkeld om de tijd te verkorten die nodig is voor een diep en zeer opgelost AFM-onderzoek van elke plek. Verschillende tests uitgevoerd in het laboratorium toonden aan dat deze procedure (fixatie, drogen en beeldvorming in lucht) geen significante invloed heeft op de metrologie van EV's.
Er zijn twee belangrijke kritieke stappen in de aanpak: het vinden van een compromis om de beste chipgevoeligheid te selecteren voor alle verschillende getransplanteerde liganden en EV-dissociatie van het substraat aan het einde na injectie. Hier werd een SPRi-machine gebruikt die met één enkele resonantiehoek werkte, wat aangeeft dat het beste compromis in plasmonrespons voor alle ligandenvlekken moet worden geselecteerd. Voor sommige liganden zal de detectie zeer gevoelig zijn (dicht bij de optimale hoek); Voor anderen zal de detectie minder gevoelig zijn als de vaste hoekwaarde afwijkt van de optimale hoek. Dit kan worden ondervangen door gebruik te maken van de laatste generatie SPRi-instrumentatie die tot 10 verschillende werkhoeken biedt.
De tweede kritische stap is de dissociatie van de EV's van het substraat na injectie. Als de dissociatie te hoog is (omdat de EV's bijvoorbeeld maar weinig specifieke eiwitten aan hun oppervlak vertonen), is het achteraf niet mogelijk om met AFM te scannen. Deze situaties zijn zeer zeldzaam, maar wanneer ze zich voordoen, moeten het debiet en de injectieduur worden geoptimaliseerd om het probleem op te lossen.
Een beperking van de voorgestelde methode zou een gebrek aan representativiteit kunnen zijn van de correlatie tussen de AFM-waarnemingen met het mm²-oppervlak van EV-interacties op de biochip. Daarvoor moeten verschillende gebieden ter plaatse worden gescand, ook van grote gebieden tot kleine gebieden en op verschillende plaatsen binnen de plek. Idealiter moet de scan worden uitgevoerd in het ROI-gebied voor een goede correlatie tussen de AFM-karakterisering en de SPRi-respons.
In andere werken gebruikten de auteurs van deze studie optische detectie en digitale telling van individuele EV's, die gebaseerd zijn op de interferometrische beeldvorming van EV's gevangen op een biofunctioneel siliciumsubstraat. Deze techniek maakt het mogelijk om de grootte van de EV's te schatten op basis van het waargenomen contrast. Dit platform maakte het dus mogelijk om, met behulp van de overvloedige markers CD9, CD63 en CD81, de analyse te multiplexen en de aanwezigheid van EV's te detecteren die een neuronale marker, CD171, tot expressie brengen in hersenvocht bij mensen24.
Deze gecombineerde en labelvrije aanpak, ondersteund door een rigoureuze methodologie bij de voorbereiding van de biochip en in de AFM-acquisitiemodus, vormt een voorkeursmethode voor het karakteriseren van EV's door hun vangst in realtime en onderstroom in zelfs complexe en ruwe monsters. Er zijn inderdaad geen preanalytische stappen met het monster en geen etiketterings- of ontmaskeringsstappen nodig in de gepresenteerde methode. In de literatuur onthulden Ertsgaard et al. verschillende overvloedige EV-membraanmarkers met behulp van een enkele deeltjes interferometrische reflectiebeeldvormingssensor (SP-IRIS), maar in statische modus (geen stroom) zonder kinetische metingen, en gaven slechts een schatting van de EV-grootte25.
Dankzij deze geoptimaliseerde procedure die de bereiding van reactieve, gecontroleerde bio-interfaces en gepassiveerde multiplex biochips mogelijk maakt, kunnen EV-subsets diep worden gekarakteriseerd wanneer ze als ruwe monsters worden geïnjecteerd. Deze verschillende elementen maken dit NBA-platform een zeer relevante methode voor de directe, diepe en opgeloste analyse van EV's in ruwe monsters.
Spectroscopie, en met name oppervlakte-verbeterde Raman-spectroscopie (SERS), is in opkomst als een voorkeursmethode voor de biochemische analyse van zwak tot expressie gebrachte EV-biomarkers. Deze strategie heeft de ontwikkeling mogelijk gemaakt van multiplexed assays met gevoeligheden van enkele tientallen EV's per μL. SERS-beeldvorming in combinatie met sorteermethoden (bijv. Dielectroforese) maakt de high-throughput analyse van EV-samenstelling mogelijk26.
In dit werk waren de Raman-experimenten uitgevoerd op gouden biochips ook zeer bemoedigend, omdat een duidelijk spectrum van EV's werd verkregen, waardoor inzicht werd verkregen in hun moleculaire samenstelling. Toekomstige ontwikkelingen kunnen ook SERS omvatten om het signaal afkomstig van de EV's aan het oppervlak van de biochip te verhogen en tip-enhanced Raman-spectroscopie (TERS) om beelden met nanometrische resolutie te verkrijgen, waardoor single-EV-karakterisering mogelijk wordt.
Recente ontwikkelingen in het lab zijn gemaakt om de gevoeligheid van biodetectie en de discriminatie tussen EV-subsets die naast elkaar bestaan in een monster en mogelijk co-interactie op dezelfde arrays te verbeteren. Om de gevoeligheid te verhogen, wordt geëxperimenteerd met het SPRi-systeem, dat de selectie van verschillende hoeken voor EV-detectie op verschillende plekken mogelijk maakt. Om de discriminatie van EV-subsets te verbeteren, moeten verschillende uitdagingen worden aangegaan: i) het verkrijgen van de spectroscopische Raman-handtekening van elke EV-subset op de biochip, ii) het verhogen van het aantal geïdentificeerde vlekken op de biochip (van 16 naar 100) en iii) het verhogen van de doorvoer van de analyse met behulp van high-speed AFM (HS AFM). Bovendien zal HS AFM ook de karakterisering van EV-subsets snel en in vloeibare omstandigheden mogelijk maken.
Enkele andere punten om op te merken zijn dat als de hydrofilie van de gouden biochip hoog is, er een risico bestaat dat de vlekken van de liganden elkaar overlappen en mengen (zoals weergegeven in figuur 4B). Het is noodzakelijk om te voorkomen dat luchtbellen worden geïnjecteerd tijdens de injectie van oplossingen onder SPRi, omdat dit zou leiden tot veranderingen in de reflectiviteit en zou bijdragen aan onjuiste bewaking van het SPRi-signaal.
Tijdens het scannen van de oppervlakken met AFM is het noodzakelijk om de afbeeldingen te observeren om te controleren of er drastische veranderingen zijn in de somwaarde of dat er artefacten zijn (bijvoorbeeld repetitief uiterlijk van objecten). Dit kan te wijten zijn aan AFM-tipbesmetting; In dit geval moet de tip worden vervangen.
Er zijn een paar beperkingen van de techniek die we hebben waargenomen: de gekozen chipgevoeligheid voor alle verschillende getransplanteerde liganden is niet optimaal voor allemaal; de ontkoppeling van de EV's van het substraat aan het einde van de injectie; en de lagere resolutie (dan AFM) van Raman-beeldvorming, waardoor de visualisatie van individuele EV's niet mogelijk is.
Ondanks de beperkingen heeft dit protocol veel belangrijke voordelen ten opzichte van bestaande methoden. Het combineren van de labelvrije methoden (SPRi + AFM + Raman-spectroscopie) op hetzelfde substraat en vervolgens op hetzelfde biologische monster voorkomt vertekening tussen de analyses als gevolg van het substraat en geeft een hoge originaliteit en vertrouwen aan de analyse van EV-subsets.
Zo'n ontwikkeld analytisch platform zou kunnen helpen bij EV-karakterisering in verschillende contexten, zoals op het gebied van diagnose en acellulaire biotherapie en biovloeistoffen van bloed tot cel supernatanten. Naast EV-kwalificatie kunnen andere nanoobjecten (bijv. Moleculaire complexen, synthetische nanodeeltjes, virussen) worden gekenmerkt door dit multimodale analytische platform.
Ondanks de grote verscheidenheid aan methoden die in de EV-gemeenschap zijn ontwikkeld en geïmplementeerd, heeft elk van deze technieken zijn eigen potentieel en verschillen in prestaties in termen van het dynamisch bereik, de nauwkeurigheid, de doorvoer en de toepassing voor de analyse van specifieke EV-parameters26. Innovatieve, ultragevoelige en meerstapsbenaderingen (de scheiding, selectie, spectrale signatuur en analyse van vesiculaire inhoud), zoals dit multimodale analytische platform, zelfs wanneer toegepast op kleine volumes op chips (lab-on-a-chip), bieden nieuwe perspectieven op het gebied van vloeibare biopsieën, biomonitoring en precisiegeneeskunde.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen belangenconflicten bekend te maken.
Acknowledgments
Kelly Aubertin en Fabien Picot van de IVETh-kernfaciliteit (Parijs) zijn erkend voor de Raman-beeldvormingsexperimenten. Thierry Burnouf (Taipei Medical University, Taiwan) en Zuzana Krupova (uit Helincourt, Frankrijk) zijn erkend voor het verstrekken van de EV-monsters afgeleid van respectievelijk bloedplaatjes- en rundermelkmonsters. Het werk werd ondersteund door de regio Bourgogne Franche-Comté en de EUR EIPHI graduate school (NOVICE-project, 2021-2024). Een deel van dit werk werd gedaan met behulp van het CLIPP-platform en in RENATECH cleanroomfaciliteiten in FEMTO-ENGINEERING, waarvoor we Rabah Zeggari bedanken.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CD41a antibody | Diaclone SAS (France) | 447528 | |
| CP920 | Microparticles GmbH, Germany | 448303 | |
| DXR3xi | Thermo Fisher Scientific | T1502 | |
| EDC | Sigma | A6272 | |
| Ethanolamine | Sigma | P5368-10PAK | |
| Evs derived from platelet concentrates | Collaboration : Pr T. Burnouf (TMU, Taipei) | S2889 | |
| Evs from bovine milk | Collaboration : Dr Z. Krupova (Excilone, Helincourt - France) | 3450 | |
| Glutaraldehyde | Sigma | 56845 | |
| Gwyddion | 853.223.020 | ||
| Magnetron sputtering | PLASSYS | SAB5300165 | |
| mercapto-1-hexadecanoic acid | Sigma | G5882 | |
| Mercapto-1-undecanol | Sigma | O8001 | |
| Mountains SPIP ones | Digital Surf | ||
| NanoWizard 3 Bioscience | Bruker-JPK | ||
| Octyl Glucoside (OG) | Sigma | ||
| Ovalbumine antibody | Sigma | ||
| Phosphate Buffer Saline (PBS) | Sigma | ||
| Rat Albumin Serum (RSA) | Sigma | ||
| Sodium acetate buffer | Sigma | ||
| SPR-Biacore 3000 | GE Healthcare/ Cytiva life sciences | ||
| SPRi Biochip | MIMENTO technology platform | The biochips were produced in-house in the clean room, Besancon | |
| SPRi Plex II | Horiba Scientific | ||
| Sulfo-NHS | Sigma |
References
- Silva, A. K. A., et al. Development of extracellular vesicle-based medicinal products: A position paper of the group "Extracellular Vesicle translatiOn to clinicaL perspectiVEs - EVOLVE France". Advanced Drug Delivery Reviews. 179, 114001 (2021).
- Xunian, Z., Kalluri, R. Biology and therapeutic potential of mesenchymal stem cell-derived exosomes. Cancer Science. 111 (9), 3100-3110 (2020).
- Hartjes, T. A., et al. Extracellular vesicle quantification and characterization: Common methods and emerging approaches. Bioengineering. 6 (1), 7 (2019).
- Xing, Y., et al. Analysis of extracellular vesicles as emerging theranostic nanoplatforms. Coordination Chemistry Reviews. 424, 213506 (2020).
- Wang, T., Xing, Y., Cheng, Z., Yu, F. Analysis of single extracellular vesicles for biomedical applications with especial emphasis on cancer investigations. Trends in Analytical Chemistry. 152, 116604 (2022).
- Boireau, W., Elie-Caille, C. Extracellular vesicles: Definition, isolation and characterization. Medecine Sciences: M/S. 37 (12), 1092-1100 (2021).
- Brisson, A. R., et al. Extracellular vesicles from activated platelets: A semiquantitative cryo-electron microscopy and immuno-gold labeling study. Platelets. 28 (3), 263-271 (2017).
- Yuana, Y., et al. Atomic force microscopy: A novel approach to the detection of nanosized blood microparticles. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 8 (2), 315-323 (2010).
- Sebaihi, N., de Boeck, B., Yuana, Y., Nieuwland, R., Pétry, J. Dimensional characterization of extracellular vesicles using atomic force microscopy. Measurement Science and Technology. 28 (3), 034006 (2017).
- Beekman, P., et al. Immuno-capture of extracellular vesicles for individual multi-modal characterization using AFM, SEM and Raman spectroscopy. Lab on a Chip. 19 (15), 2526-2536 (2019).
- Malenica, M., et al. Perspectives of microscopy methods for morphology characterisation of extracellular vesicles from human biofluids. Biomedicines. 9 (6), 603 (2021).
- Verweij, F. J., et al. The power of imaging to understand extracellular vesicle biology in vivo. Nature Methods. 18 (9), 1013-1026 (2021).
- Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): A position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).
- Obeid, S., et al. NanoBioAnalytical characterization of extracellular vesicles in 75-nm nanofiltered human plasma for transfusion: A tool to improve transfusion safety. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine. 20, 101977 (2019).
- Obeid, S., et al. Development of a NanoBioAnalytical platform for «on-chip» qualification and quantification of platelet-derived microparticles. Biosensors and Bioelectronics. 93, 250-259 (2017).
- Ridolfi, A., et al. AFM-based high-throughput nanomechanical screening of single extracellular vesicles. Analytical Chemistry. 92 (15), 10274-10282 (2020).
- Vorselen, D., et al. The fluid membrane determines mechanics of erythrocyte extracellular vesicles and is softened in hereditary spherocytosis. Nature Communications. 9 (1), 4960 (2018).
- Hardij, J., et al. Characterisation of tissue factor bearing extracellular vesicles with AFM: Comparison of air-tapping-mode AFM and liquid Peak Force AFM. Journal of Extracellular Vesicles. 2, 21045 (2013).
- Jorgensen, M., et al. Extracellular Vesicle (EV) Array: Microarray capturing of exosomes and other extracellular vesicles for multiplexed phenotyping. Journal of Extracellular Vesicles. 2, 20920 (2013).
- Remy-Martin, F., et al. Surface plasmon resonance imaging in arrays coupled with mass spectrometry (SUPRA-MS): Proof of concept of on-chip characterization of a potential breast cancer marker in human plasma. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 404 (2), 423-432 (2012).
- Czamara, K., et al. Raman spectroscopy of lipids: A review. Journal of Raman Spectroscopy. 46 (1), 4-20 (2015).
- Penders, J., et al. Single particle automated Raman trapping analysis of breast cancer cell-derived extracellular vesicles as cancer biomarkers. ACS Nano. 15 (11), 18192-18205 (2021).
- Baek, S. J., Park, A., Ahn, Y. J., Choo, J. Baseline correction using asymmetrically reweighted penalized least squares smoothing. Analyst. 140 (1), 250-257 (2015).
- Daaboul, G. G., et al. Digital detection of exosomes by interferometric imaging. Scientific Reports. 6, 37246 (2016).
- Ertsgaard, C. T., et al. Integrated nanogap platform for sub-volt dielectrophoretic trapping and real-time Raman imaging of biological nanoparticles. Nano Letters. 18 (9), 5946-5953 (2018).
- Maas, S. L., et al. Possibilities and limitations of current technologies for quantification of biological extracellular vesicles and synthetic mimics. Journal of Controlled Release. 200, 87-96 (2015).
