Summary
Questo articolo propone una nuova generazione di piattaforme analitiche multiparametriche con maggiore produttività per la caratterizzazione di sottoinsiemi di vescicole extracellulari. Il metodo si basa su una combinazione di metodi di biorilevamento multiplex con analisi metrologiche e morfomeccaniche mediante microscopia a forza atomica, accoppiata con spettroscopia Raman, per qualificare bersagli vescicolari intrappolati su un biochip microarray.
Abstract
Le vescicole extracellulari (EV) sono piccole vescicole derivate dalla membrana prodotte da tutte le cellule che vanno da 50 a diverse centinaia di nanometri di diametro e sono utilizzate come mezzo di comunicazione intercellulare. Stanno emergendo come promettenti strumenti diagnostici e terapeutici per una varietà di malattie. Esistono due principali processi di biogenesi utilizzati dalle cellule per produrre EV con differenze di dimensioni, composizione e contenuto. A causa della loro elevata complessità in termini di dimensioni, composizione e origine cellulare, la loro caratterizzazione richiede una combinazione di tecniche analitiche. Questo progetto prevede lo sviluppo di una nuova generazione di piattaforme analitiche multiparametriche con maggiore produttività per la caratterizzazione di sottopopolazioni di EV. Per raggiungere questo obiettivo, il lavoro parte dalla piattaforma nanobioanalitica (NBA) stabilita dal gruppo, che consente un'indagine originale delle EV basata su una combinazione di metodi di biorilevamento multiplex con analisi metrologiche e morfomeccaniche mediante microscopia a forza atomica (AFM) di bersagli vescicolari intrappolati su un biochip microarray. L'obiettivo era quello di completare questa indagine EV con un'analisi fenotipica e molecolare mediante spettroscopia Raman. Questi sviluppi consentono la proposta di una soluzione analitica multimodale e di facile utilizzo per la discriminazione dei sottogruppi di EV nei fluidi biologici con potenziale clinico
Introduction
Il crescente interesse per la ricerca EV nella diagnosi e nella terapia 1,2,3,4,5, combinato con le sfide che questo campo deve affrontare, ha portato allo sviluppo e all'implementazione di una grande varietà di approcci e tecniche per quantificare o caratterizzare queste vescicole. I metodi più utilizzati per l'identificazione delle EV sono l'immunoblotting e la proteomica specifici per confermare l'origine delle EV, la microscopia elettronica a trasmissione (TEM) per confermare la loro struttura e l'analisi di tracciamento delle nanoparticelle (NTA) per quantificare il loro numero e la distribuzione delle dimensioni in un volume di campione.
Nessuna di queste tecniche da sola, tuttavia, fornisce tutte le informazioni necessarie per caratterizzare i sottoinsiemi EV. L'eterogeneità intrinseca dei veicoli elettrici dovuta alla diversità delle loro proprietà biochimiche e fisiche impedisce analisi globali affidabili e riproducibili, in particolare per i veicoli elettrici contenuti in una miscela (campione grezzo). I metodi di rilevamento e caratterizzazione sono pertanto necessari per i veicoli elettrici, sia singolarmente che in generale per integrare altri metodi più rapidi ma non selettivi6.
L'imaging ad alta risoluzione mediante TEM (o cryoTEM) o AFM consente la determinazione della morfologia e della metrologia dei veicoli elettrici con una risoluzione nanometrica 7,8,9,10,11,12. Tuttavia, il principale limite dell'uso della microscopia elettronica per oggetti biologici, come i veicoli elettrici, è la necessità di un vuoto per eseguire lo studio che richiede la fissazione e la disidratazione del campione. Tale preparazione rende difficile la traduzione dalle strutture osservate alla morfologia EV in soluzione. Per evitare questa disidratazione del campione, la tecnica del cryoTEM è la più adatta per la caratterizzazione EV13. È ampiamente utilizzato per determinare l'ultrastruttura dei veicoli elettrici. L'immunomarcatura delle vescicole mediante nanoparticelle d'oro biofunzionalizzate consente inoltre di identificare specifiche sottopopolazioni di EV e distinguerle da altre particelle presenti in un campione biologico complesso. Tuttavia, a causa del basso numero di EV analizzate al microscopio elettronico, è spesso difficile eseguire una caratterizzazione rappresentativa di un campione complesso ed eterogeneo.
Per rivelare questa eterogeneità di dimensioni, l'International Society for Extracellular Vesicles (ISEV) suggerisce di analizzare un numero sufficiente di immagini a campo ampio, accompagnate da immagini più piccole, per rivelare singoli EV ad alta risoluzione14. L'AFM è un'alternativa agli approcci ottici e alle tecniche di diffrazione elettronica per lo studio dei veicoli elettrici. Questa tecnica utilizza una punta affilata tenuta da un cantilever flessibile che scansiona il campione depositato su un supporto, linea per linea, e regola la distanza tra la punta e gli elementi presenti attraverso un anello di feedback. Ciò consente di caratterizzare la topografia del campione e raccogliere informazioni morfomeccaniche15,16,17,18. Le EV possono essere scansionate mediante AFM sia dopo essere state depositate su un substrato atomicamente piatto o dopo essere state catturate su un substrato specifico funzionalizzato da anticorpi, peptidi o aptameri per caratterizzare le varie sottopopolazioni18,19. Grazie alla sua capacità di quantificare e sondare simultaneamente la struttura, la biomeccanica e il contenuto biomolecolare membranoso delle EV all'interno di campioni biologici complessi senza la necessità di pretrattamento, etichettatura o disidratazione, l'AFM è ora sempre più utilizzato per caratterizzare le EV in modo fine e multiparametrico in condizioni fisiologiche di temperatura e mezzo.
Questo articolo propone una metodologia che utilizza un biochip d'oro in grado di essere (bio)funzionalizzato chimicamente in un formato multiplexato. Questo substrato è la pietra angolare di una potente piattaforma analitica che combina la biorilevazione di sottoinsiemi di EV mediante risonanza plasmonica di superficie e, una volta che gli EV sono adsorbiti / innestati o immunocatturati sul chip, AFM consente la caratterizzazione metrologica e morfomeccanica degli EV. Accoppiata con la firma Raman dei sottoinsiemi EV catturati sul chip, questa piattaforma analitica consente la qualificazione dei veicoli elettrici presenti nei campioni biologici in modo label-free e senza alcuna necessità di passaggi preanalitici. Questo documento mostra che la combinazione di potenti tecniche, assistite da una metodologia altamente rigorosa nella preparazione del substrato e nell'acquisizione dei dati, rende l'analisi EV profonda, definitiva e robusta.
Il principio dell'approccio proposto è quello di preparare un substrato d'oro, di assorbire/innestare o catturare i sottotipi EV e di scansionarli mediante AFM per stimare le dimensioni e la morfologia di ciascun sottoinsieme EV. Inoltre, questi EV adsorbiti vengono analizzati mediante spettroscopia Raman. Questo substrato può, infatti, presentare tre tipi di interfacce di crescente complessità: nudi, chimicamente funzionalizzati o microarray di ligando. Prima di descrivere le diverse fasi del protocollo, i lettori sono rimandati alla presentazione schematica dell'approccio della piattaforma nanobioanalitica (NBA) nella Figura 1, combinando la risonanza plasmonica di superficie (SPRi), AFM e spettroscopia.
Figura 1: La piattaforma NanoBioAnalitica. L'approccio combina (A) risonanza plasmonica di superficie, (B) microscopia a forza atomica e spettroscopia infrarossa / Raman (nano) spettroscopia, tutti impegnati sullo stesso substrato: un chip d'oro multiplexato. Abbreviazioni: NBA = piattaforma NanoBioAnalitica; SPRi = risonanza plasmonica di superficie; AFM = microscopia a forza atomica; EV = vescicola extracellulare. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Il biochip d'oro costituisce il cuore della piattaforma poiché tutte le tecniche di caratterizzazione label-free sono condotte su questo biochip. In base alle esigenze della caratterizzazione dei veicoli elettrici (EV globali / totali o sottoinsiemi di EV) e ai limiti / richieste dei metodi utilizzati, sono stati sviluppati tre tipi di superfici di biochip d'oro: "nude", chimicamente funzionalizzate "C11 / C16" o biofunzionalizzate con ligando, chiamate superficie d'oro "ligando".
Il biochip nudo, chiamato "naked", consente il semplice adsorbimento di veicoli elettrici sull'oro. E' possibile selezionare il tampone utilizzato e realizzare questo adsorbimento sia in modo passivo (fasi di incubazione e poi risciacquo) sia monitorarlo sotto flusso (in SPRi). Inoltre, questo adsorbimento passivo può essere realizzato sia sull'intero chip (come macroarray) che localizzato in microarray utilizzando un micropipette spotter. La "procedura under flow" consente agli investigatori di seguire la cinetica e il livello di adsorbimento EV. Questo approccio sul substrato d'oro nudo viene adottato quando l'interfaccia dello strato chimico può interferire con il metodo analitico (ad esempio, per la spettroscopia Raman).
Il biochip funzionalizzato chimicamente, chiamato "C11/C16", viene utilizzato per creare un "tappeto" denso e robusto di EV legati covalentemente sulla superficie dell'oro formando legami ammidici primari con i tiolati quando l'obiettivo è quello di avere una visione globale del campione EV. Infatti, in questo caso, l'oro è funzionalizzato da una miscela tiolata di mercapto-1-undecanolo (11-MUOH: "C11") e acido mercapto-1-esadecanoico (16-MHA: "C16"), e una frazione dei tiolati viene attivata chimicamente per stabilire un legame covalente con i bersagli. Ancora una volta, questa strategia può essere realizzata passivamente (fasi di incubazione e poi risciacquo, sia in "macroarray" che in microarray multipli utilizzando uno spotter di micropipette) o sotto portate (in SPRi) per seguire la cinetica e il livello di innesto EV sulla superficie dell'oro.
Il biochip biofunzionalizzato del ligando, chiamato "ligandi", è attivato chimicamente per innestare covalentemente diversi ligandi (ad esempio, anticorpi, recettori) per catturare selettivamente (con affinità) diversi sottoinsiemi di EV che coesistono nel campione biologico.
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Protocol
1. Preparazione del substrato d'oro
NOTA: Tre tipi di superfici sono prodotte su trucioli d'oro: 1) superficie nuda, 2) funzionalizzata chimicamente e 3) biofunzionalizzata (ligandi innestati sullo strato C11C16). Saranno chiamati rispettivamente "nudi", "C11C16" e "ligandi", da questo punto in poi.
- Preparazione del substrato d'oro:
NOTA: Per questo protocollo, i biochip d'oro sono stati fabbricati internamente nella camera bianca. I biochip fatti in casa erano composti da vetrini (SF11) con un rivestimento di cromo (2 nm Cr) e oro (48 nm Au). La lunghezza del biochip era di 28 mm, la larghezza era di 12,5 mm e lo spessore era di 0,5 mm20.- Utilizzare lo sputtering magnetron DC15 per rivestire le diapositive mediante deposizione fisica da vapore (PVD).
- Funzionalizzazione chimica:
- Funzionalizzare i trucioli nudi incubandoli per una notte in una miscela 90%/10% di mole di mercapto-1-undecanolo (11-MUOH: C11) e acido mercapto-1-esadecanoico (16-MHA: C16) a 1 mM in etanolo assoluto, sotto agitazione e a temperatura ambiente.
NOTA: Questo passaggio formerà un monostrato (SAM) stabile e autoassemblato, utile nell'innesto dei leganti. - Pulire il biochip (lavare delicatamente) con etanolo assoluto e acqua ultrapura, asciugarlo sotto azoto e conservarlo in condizioni di camera bianca.
- Attivazione del biochip funzionalizzato chimicamente:
NOTA: Da questo passaggio in poi, gli esperimenti devono essere eseguiti in un laboratorio di analisi.- Pulire il biochip con acqua ultrapura lavandolo delicatamente, quindi asciugare il chip sotto un delicato flusso d'aria. Per attivare i gruppi carbossilici C16, incubare il biochip in una miscela di 200 mM di etile (dimetilamminopropil) carbodiimmide / N-idrossisuccinimide (EDC) e 50 mmol / L N-idrossisuccinimide (Sulfo-NHS) per almeno 30 minuti al buio a temperatura ambiente. Quindi risciacquare con acqua prima degli esperimenti di innesto.
- Funzionalizzare i trucioli nudi incubandoli per una notte in una miscela 90%/10% di mole di mercapto-1-undecanolo (11-MUOH: C11) e acido mercapto-1-esadecanoico (16-MHA: C16) a 1 mM in etanolo assoluto, sotto agitazione e a temperatura ambiente.
- Innesto dei ligandi sul biochip funzionalizzato:
NOTA: L'immobilizzazione dei ligandi (o EV per alcuni esperimenti) sul chip può essere effettuata passivamente all'esterno dello strumento SPRi (incubazione di una goccia sul chip attivato) o dinamicamente sotto flusso nello strumento SPRi. Questo costituisce i chip modificati EV o ligando. La figura 2 presenta il biochip d'oro, lo spotter di micropipette e il biochip dopo l'individuazione con 16 goccioline di ligando da 300 nL ciascuna.- Per l'innesto di ligando, utilizzare molecole come anticorpi (ad esempio, immunoglobuline-antiCD41 [specifici per EV derivati da piastrine native del sangue, chiamate N-PAV], antiCD61, antiCD62P, antiCD9 e antiOVA [anticorpo di controllo contro l'ovalbumina]) e Annexin V. Diluirli a 200 μg / ml in una soluzione acida (da pH 4,5 a 6 a seconda del pH ottimale per l'attività o la funzione del ligando).
NOTA: Il pH ottimale per l'innesto di anticorpi è stato determinato in precedenza mediante esperimenti di preconcentrazione eseguiti su uno strumento SPR per la determinazione del pH ottimale per l'innesto di ligando (vedere Figura 3). Poiché le condizioni di innesto cambiano con i cloni di anticorpi utilizzati, si raccomanda di determinare queste condizioni prima di procedere con gli esperimenti SPRi. - Per la procedura di innesto, aggiungere 300 nL di soluzione EV / ligando utilizzando lo spotter.
NOTA: Un pezzo di carta immerso nell'acqua deve essere conservato sia nel pozzetto sinistro che in quello destro per evitare l'evaporazione delle goccioline. Questo passaggio è importante per mantenere i veicoli elettrici / leganti nelle loro condizioni ottimali di stabilità e funzionalità. - Dopo l'individuazione, tenere il biochip sotto un bagno sonico (frequenza: 37 kHz, potenza: 30%) per un'incubazione di 30 minuti. Lavare il biochip dall'alto con acqua ultrapura e posizionarlo delicatamente su un prisma con lo stesso indice di rifrazione (RI) del biochip. Mentre si regola il biochip sulla parte superiore del prisma, aggiungere una goccia (~ 2,3 μL) di olio con lo stesso RI del prisma per creare uno strato uniforme e sottile tra il biochip e il prisma.
NOTA: Questo passaggio garantisce un mezzo continuo dello stesso RI nel percorso ottico. È importante evitare di incorporare bolle nello strato di olio in questa fase, poiché ciò cambierà le proprietà ottiche nel percorso e ostacolerà ulteriori analisi.
- Per l'innesto di ligando, utilizzare molecole come anticorpi (ad esempio, immunoglobuline-antiCD41 [specifici per EV derivati da piastrine native del sangue, chiamate N-PAV], antiCD61, antiCD62P, antiCD9 e antiOVA [anticorpo di controllo contro l'ovalbumina]) e Annexin V. Diluirli a 200 μg / ml in una soluzione acida (da pH 4,5 a 6 a seconda del pH ottimale per l'attività o la funzione del ligando).
Figura 2: Biochip e spotter manuale. Biochip d'oro (a sinistra), spotter di micropipette (al centro) e il biochip dopo l'individuazione con goccioline di ligando di 300 nL ciascuna (a destra). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3: Test di preconcentrazione per determinare il pH ottimale per l'innesto di ligando. Il sensorgramma presenta il livello di interazione in funzione del tempo per un ligando iniettato casualmente (a diversi valori di pH) alla stessa concentrazione su 2 minuti sulla superficie. OG è il detergente, che consente di recuperare la linea di base tra ogni iniezione. Qui, il sensorgramma indica che il pH 6 ha permesso il maggior numero di innesti di ligando, con un segnale SPRi di 1091 RU. Abbreviazioni: OG = octyl glucoside; UR = unità di risposta. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
2. Risonanza plasmonica superficiale
- Montare il biochip sul sistema SPRi. Mantenere la portata del tampone PBS (buffer corrente) a 50 μL/min.
NOTA: Se ci sono bolle, aumentare la portata fino a 500-1.000 μL / min e iniettare frequentemente 40 mM di glucoside ottilico (OG) per rimuoverle il prima possibile. - Condizionamento del biochip d'oro nello strumento SPRi: scelta degli angoli di lavoro
- Fare clic sul menu a tendina sul lato sinistro del software e fare clic sulla directory di lavoro per definire la cartella in cui salvare i dati sperimentali. Successivamente, fai clic su Plasmon | Acquisizione di immagini.
- Individuare l'immagine (come mostrato nella Figura 4A) in cui sono visibili diversi punti e fare clic per selezionare questa immagine. Per definire la regione di interesse (ROI), come rappresentato nella Figura 4, fare clic sul rilevamento automatico o sulla definizione manuale all'interno degli spot (Figura 4B) o sul chip per fare riferimento a una posizione specifica anche senza macchie (Figura 4C).
- Quando vengono utilizzati biochip multiplexati, scrivere il nome delle famiglie di liganti, quindi fare clic sui punti corrispondenti.
NOTA: Una famiglia di liganti corrisponde a più punti funzionalizzati con lo stesso ligando. Di solito, il chip presenta almeno duplicati e spesso anche triplicati di ciascun ligando. - Fare clic su Finish Species Definition e attendere di essere indirizzati alla finestra contenente le curve plasmoniche ottenute.
- Scegli un angolo di lavoro. Trascinare la linea nera con il cursore sull'angolo di lavoro ottimale e fare clic su Sposta specchia all'angolo di lavoro.
NOTA: La curva plasmonica è costituita dal valore della riflettività (%) rispetto all'angolo e il software fornisce un'altra curva con il valore della pendenza (%) rispetto all'angolo. Per selezionare un buon angolo di lavoro, scegliete l'angolo con il valore più alto della pendenza.- Nel caso di una fase passivante (a causa dell'albumina) eseguita all'interno dell'apparecchio, selezionare un angolo di lavoro per ottenere la sensibilità ottimale verso la superficie, stabilendo così un controllo di qualità della reattività superficiale.
NOTA: Questa fase di passivazione è importante quando il chip è preparato per il biorilevamento di affinità/cattura per ridurre le interazioni non specifiche tra il campione e la superficie del biochip.
- Nel caso di una fase passivante (a causa dell'albumina) eseguita all'interno dell'apparecchio, selezionare un angolo di lavoro per ottenere la sensibilità ottimale verso la superficie, stabilendo così un controllo di qualità della reattività superficiale.
- Fare clic su Kinetics per avviare il monitoraggio cinetico in tempo reale. Una volta che il software richiede all'utente di definire il controllo negativo, scegliere nessun controllo negativo a questo punto (in quanto ciò consentirà l'osservazione della cinetica sui punti di controllo negativi).
- Iniettare albumina sierica di ratto (RSA, 200 μg/ml, preparata in tampone acetato, pH 4,5) a 50 μL/min per 4 minuti per passivare la superficie intorno alle macchie e possibilmente per riempire gli spazi vuoti all'interno delle macchie del ligando.
NOTA: L'RSA viene iniettato per coprire il biochip, che non è legato ad alcun ligando. - Iniettare etanolammina (1 M) a 20 μL/min per 10 minuti per disattivare i gruppi carbossilici ancora presenti e reattivi sulla superficie.
- Lavare il biochip iniettando 40 mM OG a 50 μL/min per 4 minuti.
NOTA: Dopo la fase di passivazione, l'angolo di lavoro viene regolato (come nuova determinazione della linea di base prima dell'iniezione del campione) per essere alla massima sensibilità sui punti di interesse.
- Iniettare albumina sierica di ratto (RSA, 200 μg/ml, preparata in tampone acetato, pH 4,5) a 50 μL/min per 4 minuti per passivare la superficie intorno alle macchie e possibilmente per riempire gli spazi vuoti all'interno delle macchie del ligando.
- Iniezione del campione:
- Ridefinisci le curve del plasmone dopo la passivazione e scegli l'angolo di lavoro in base al ligando questa volta.
- Nel monitoraggio cinetico, ridurre la portata a 20 μL/min e attendere che la linea di base sia stabile.
- Iniettare il campione ad una concentrazione a scelta (da 1 x 10 8 EV / ml a 1 x 10 10 EV / ml a seconda dell'affinità tra EV e ligandi innestati) e fare clic su iniezione manuale o iniezione automatica. In caso di iniezione manuale, dopo aver iniettato 200 μL del campione, cliccare su interrompere l'iniezione. Poiché la durata dell'iniezione è generalmente di 10 minuti, iniziare a seguire la cinetica dell'interazione e misurare la variazione di riflettività calcolando la differenza di riflettività tra l'inizio e la fine dell'iniezione osservata durante il monitoraggio cinetico (Figura 5).
NOTA: I diversi campioni che sono stati iniettati sono descritti nella sezione dei risultati rappresentativi.
- Dopo l'iniezione del campione, seguire uno di questi due approcci per completare l'esperimento SPRi:
- Nell'approccio non fisso/in liquido, estrarre il biochip dall'apparato SPRi, aggiungere una goccia di liquido su di esso e procedere per un'ulteriore caratterizzazione AFM della superficie nel liquido.
- Nell'approccio fisso , iniettare glutaraldeide (0,5%) diluita in acqua a 20 μL / min per 10 minuti per fissare le molecole catturate sul biochip. Iniettare acqua per risciacquare la superficie, estrarre il biochip, lavarlo molto delicatamente con acqua distillata e asciugarlo all'aria per essere ulteriormente analizzato sotto AFM.
Figura 4: Immagine CCD SPRi del biochip. (A,B) Biochip multiplexed dopo passivazione dell'albumina. (A) Un chip senza default; (B) alcuni difetti che sono apparsi sul chip: fusione di macchie (i), innesto debole (ii), o polvere o "contaminanti" (iii). I ROI, a colori nelle macchie (un colore per famiglia di ligando), sono stati scelti per evitare quei "contaminanti". Quando le macchie si sono unite, sono state notate e ignorate o denominate come "miscela di ligandi 1 e 2". (C) Chip d'oro nudo senza microarray per l'esperimento che esamina l'adsorbimento dei veicoli elettrici sull'oro. La freccia blu indica la direzione del flusso. Questo chip non presentava macchie e i ROI sono stati scelti per registrare il segnale di riflettività dalla linea 1 (L1, cerchi rossi) alla linea 4 (L4, cerchi viola) durante l'iniezione del campione. Barra della scala = 1 mm per tutte e tre le immagini. Abbreviazioni: SPRi = surface plasmon resonance imaging; CCD = dispositivo ad accoppiamento di carica; ROI = regioni di interesse; EVs = vescicole extracellulari. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 5: Esperimenti SPRi di iniezione EV su un biochip. (A) Esperimento di cattura su un biochip multiplex che mostra i segnali di riflettività di diversi ligandi. Qui, il rapporto segnale-rumore per i diversi ligandi era molto buono (e specialmente sui punti antiCD41) poiché la risposta del controllo negativo era trascurabile. (B) Esperimento di adsorbimento di veicoli elettrici su un biochip nudo. Sensorgramma che presenta il condizionamento del chip con due lavaggi di tampone e pulizia OG (1), con l'iniezione del campione EV (2) e il segnale di riflettività dopo l'interazione EV (3). Su questo biochip, non c'era alcun controllo negativo, ma il segnale di riflettività (la sua cinetica, la sua stabilità dopo l'iniezione) era alto, il che significa che quei veicoli elettrici erano in grado di assorbire e rimanere stabili sul chip d'oro. Abbreviazioni: EV = vescicola extracellulare; OG = ottile glucoside. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
3. Microscopia a forza atomica
- Utilizzare la modalità di contatto per scansionare il biochip in aria e la modalità di imaging quantitativo per scansionare il biochip in condizioni liquide.
- Allineare il biochip sulla parte superiore della maschera sul vetrino (sviluppato in laboratorio) per identificare la posizione dei rispettivi micropunti sul biochip (Figura 6A).
NOTA: La maschera contiene i segni delle macchie, che corrispondono alle posizioni delle macchie dei ligandi in base allo spotter utilizzato. Questa maschera è costituita da un vetrino su cui due cunei perpendicolari consentono il posizionamento del chip. Inoltre, il vetrino è contrassegnato da 16 punti di feltro corrispondenti alla localizzazione spot sul chip, che consente, per trasparenza, di localizzare gli spot e scansionare l'area desiderata. - Posizionamento della punta:
- Utilizzare una telecamera CCD sulla parte superiore dell'AFM per localizzare il cantilever nel punto corretto che deve essere scansionato. Per seguire questo protocollo, utilizzare cantilever triangolari di 200 μm di lunghezza, 28 μm di larghezza e una costante di molla di 0,08 N/m.
- Allineare il laser sulla parte superiore del cantilever in una posizione che dia una risposta ottimale nel meccanismo di controllo del feedback.
- Scansione:
- Una volta innestato e a contatto con la superficie del biochip, avviare l'acquisizione AFM in modalità contatto o in modalità di imaging quantitativo da tre a cinque grandi aree (tipicamente 10 × 10 μm²) a piccole aree (1 x 1 μm²).
NOTA: nella Figura 6D è illustrata una rappresentazione delle diverse aree che possono essere scansionate. Assicurarsi che la caratterizzazione AFM sia rappresentativa dell'intero spot mm² e che venga visualizzato un numero sufficiente di veicoli elettrici a una buona risoluzione per un'analisi robusta (un minimo di 300 EV contati e analizzati per ogni condizione) ed eseguire le misurazioni metrologiche e morfologiche.
- Una volta innestato e a contatto con la superficie del biochip, avviare l'acquisizione AFM in modalità contatto o in modalità di imaging quantitativo da tre a cinque grandi aree (tipicamente 10 × 10 μm²) a piccole aree (1 x 1 μm²).
- Trattamento delle immagini AFM:
- Trattare le immagini AFM con il software di elaborazione dati JPK selezionando prima il canale di altezza.
- Scegliere un adattamento polinomiale da sottrarre da ogni linea per ottenere linee di scansione raddrizzate.
- Selezionate la soglia di altezza sui grani dorati per eliminare la rugosità della superficie. Nel software di riferimento (vedere la tabella dei materiali), all'interno del modulo di estrazione dei grani, contrassegnare i grani utilizzando un valore di soglia di altezza a 8,5 nm. Una volta che i grani sono stati filtrati, appare il numero di grani .
NOTA: Di solito, il substrato d'oro grezzo (RMS di ~ 3 nm) e la presenza degli strati chimici e liganti richiedono che la soglia sia impostata a 8,5 nm. - Per estrarre diverse proprietà dei grani marcati, come altezza, volume e diametro, aprire l'immagine nel software di riferimento e selezionare Trattamento dati | Cereali | Segna per soglia.
- Scegli i grani del filtro nella funzione delle proprietà. Quando viene visualizzata una nuova finestra, scegliere i seguenti parametri: Valore = massimo z-max, Superficie = superficie proiettata A0. Quindi, scegli i criteri A E B.
- Distribuzione di grano aperto; Nella finestra visualizzata, scegli Valore (massimo), Volume (base: zero) e Limite (lunghezza). Osservare la tabella (in formato .txt) che appare, che presenta tre colonne con i valori di altezza, volume e diametro per tutti i grani rilevati alla soglia impostata per immagine.
- Dall'altezza, h e diametro, D, calcolare il raggio di curvatura, Rc, di ogni EV usando l'equazione (1)8, e quindi calcolare il volume, V, usando l'equazione (2):
(1)
(2) - Da V, calcola il diametro effettivo, d eff, di ogni EV (il diametro di una sfera con lo stesso volume) usando l'equazione (3):
(3) - Grafici grafici che mostrano le dimensioni (altezza misurata, diametro misurato e diametro effettivo calcolato) dei veicoli elettrici, con ogni particella contata rappresentata da un punto.
NOTA: Pertanto, alla fine della caratterizzazione, la piattaforma NBA consente la correlazione del segnale di biorilevazione e quindi, la fenotipizzazione, con i numeri e le dimensioni dei sottoinsiemi EV.
(1)
(2)
(3)
Figura 6: Caratterizzazione dei biochip mediante AFM. Dopo l'esperimento SPRi, il chip è stato fissato ed essiccato o mantenuto in liquido per la caratterizzazione AFM. (A) Il vetrino lavorato (con due cunei di posizionamento perpendicolari, indicati con una "w" sull'immagine) che presenta una maschera che si adatta alla localizzazione dei 16 microarray di biochip. Grazie all'esposizione alla luce e alla trasparenza, una volta installato per la caratterizzazione AFM, il vetrino consente di posizionare la punta AFM nel punto desiderato per caratterizzarla. (B) Il biochip installato sul vetrino "maschera" e sotto una goccia di tampone per scansionare in condizioni liquide. (C) Immagine SPRi dei 16 microarray. (D) Un microarray ripreso mediante microscopia ottica dopo l'immunocattura di nanoparticelle di calibrazione biofunzionalizzate di 920 nm di diametro. I quadrati bianchi indicano il campionamento delle diverse aree scansionate dall'AFM in ogni punto di interesse per rendere robusta la caratterizzazione dell'AFM. Barre della scala = (C) 1 mm, (D) 500 μm. Abbreviazioni: AFM = microscopia a forza atomica; SPRi = risonanza plasmonica di superficie. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
4. Spettroscopia Raman
NOTA: Per la spettroscopia Raman, sostituire il vetrino usato come substrato con un vetrino di CaF2, che ha una firma Raman trascurabile.
- Condizioni ottiche per l'acquisizione:
- Impostare le seguenti condizioni per il microscopio di imaging Raman: obiettivo microscopio: 50x; lunghezza d'onda laser: 532 nm; potenza laser: 10 mW; tempo di esposizione: 500 ms; numero di accumuli: 140; gamma spettrale: da 450 cm-1 a 3.200 cm-1.
NOTA: L'utilizzo di troppa energia e/o di un tempo di acquisizione troppo lungo può causare danni al campione, evidenziati da spettri instabili nel tempo. Inizia con una bassa quantità di energia e aumenta questa se il segnale è troppo debole. È possibile utilizzare lunghezze d'onda laser più elevate (633 nm, 785 nm) per ridurre la fluorescenza dannosa per le misurazioni Raman. Tuttavia, l'intensità diminuisce con la quarta potenza della lunghezza d'onda e la sensibilità spettrale della fotocamera dovrebbe essere considerata.
- Impostare le seguenti condizioni per il microscopio di imaging Raman: obiettivo microscopio: 50x; lunghezza d'onda laser: 532 nm; potenza laser: 10 mW; tempo di esposizione: 500 ms; numero di accumuli: 140; gamma spettrale: da 450 cm-1 a 3.200 cm-1.
- Imaging Raman:
- In primo luogo, osservare gli spettri live con un numero ridotto di accumuli (10) per trovare l'area con il miglior rapporto segnale-rumore.
NOTA: Un segnale forte nella regione ad alta frequenza (2.800-3.000 cm-1) può facilitare il rilevamento di veicoli elettrici sulla superficie con bassi tempi di esposizione, come mostrato in precedenza10. - Una volta selezionato il ROI, scegli la risoluzione spaziale in base al tempo disponibile per l'acquisizione.
NOTA: La risoluzione spaziale è limitata dal limite di diffrazione (~500 nm). - Avviare l'acquisizione della mappatura Raman.
- In primo luogo, osservare gli spettri live con un numero ridotto di accumuli (10) per trovare l'area con il miglior rapporto segnale-rumore.
- Pretrattamento dei dati:
- Utilizzando un ambiente di sviluppo integrato (IDE) Python (ad esempio, Spyder), aprire il file contenente gli spettri.
- Sottrarre la linea di base degli spettri per correggere l'interferenza da possibile fluorescenza. Ad esempio, utilizzare la funzione "arpls" dal pacchetto "irfpy"23. Testare diversi valori del parametro "lam" per trovare quello che fornisce la migliore correzione di base (di solito tra 103 e 107).
- Normalizzare gli spettri, ad esempio, dividendo tutte le intensità di uno spettro per la sua intensità a 2.900 cm−1 o sottraendo la media dello spettro e quindi dividendola per la sua deviazione standard (normalizzazione "normale standard").
NOTA: Questo passaggio è necessario per confrontare la composizione molecolare relativa delle EV.
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Representative Results
Determinazione delle condizioni di pH ottimali per l'innesto di ligando
I diversi ligandi utilizzati per preparare i biochip sono testati in funzione del pH e della loro disponibilità ad interagire con lo strato chimico tiolato (Figura 3). I ligandi vengono diluiti in tampone acetato a diversi valori di pH e iniettati sul biochip chimicamente funzionalizzato con uno strato di C11C16. Le soluzioni vengono iniettate in modo casuale sulla superficie e un detergente (OG a 40 mM) viene iniettato dopo ogni iniezione di ligando per recuperare la linea di base. Questo test di preconcentrazione consente di determinare il pH ottimale per ogni innesto di ligando. Nell'esempio presentato in Figura 3, un pH di 6 è stato selezionato come il miglior pH in termini di pendenza e livello di innesto di ligando.
Immagini CCD SPRi
Le immagini CCD SPRi registrate sul biochip (nudo, chimicamente funzionalizzato o presentando microarray) dopo l'inserimento nella macchina SPRi sono presentate in Figura 4. Nel caso del biochip che presenta microarray, l'immagine è stata presa dopo la passivazione dell'albumina della superficie. Duplicati o triplicati di macchie sono stati sistematicamente realizzati sul chip e un controllo negativo è stato automaticamente presente anche sul chip. Il controllo negativo consisteva principalmente in un anticorpo irrilevante. In SPRi, quando il biochip è stato utilizzato senza spotting, per l'adsorbimento su oro nudo o per l'innesto diretto di EV su un biochip chimicamente funzionalizzato, i ROI sono stati scelti arbitrariamente nell'area di rilevamento. Ad esempio, la Figura 4C mostra i ROI scelti su un chip d'oro nudo prima dell'iniezione di EV.
Grazie a questa immagine CCD SPRi, è possibile ignorare alcuni punti se tali problemi compaiono durante l'innesto. L'immagine CCD SPRi consente inoltre di stimare l'omogeneità dell'innesto all'interno dello spot, garantisce la riproducibilità dell'innesto tra diversi punti dello stesso ligando e, infine, assicura che la biorilevazione EV proceda su array equivalenti in termini di densità superficiale.
Risultati SPRi
Quando vengono selezionati i ROI, la linea di base è stabile, il che significa che il campione può essere iniettato. La Figura 5 mostra diversi risultati ottenuti su un biochip multiplexato, rivelando un elevato rapporto segnale-rumore per alcuni immunoarray (il segnale di riflettività è dell'1,4% sull'antiCD41 rispetto alla risposta sul controllo negativo dello 0,02%). La figura 5B presenta i risultati per l'adsorbimento EV ottenuti dopo l'iniezione del campione EV su un chip d'oro nudo. Il campione di N-PEV proveniva da piastrine. La soluzione è stata centrifugata a 3.000 × g per 15 minuti a 22 °C; il surnatante è stato quindi nuovamente centrifugato a 20.000 × g per 15 minuti a 22 °C. Il pellet risultante è stato risospeso nel tampone. I risultati SPRi ottenuti su N-PEV immunocatturati sono stati confrontati con i risultati del western blot (WB). La WB ha rivelato una forte espressione di CD41, CD62P e CD9 in quei campioni, evidenziando una buona correlazione con i risultati SPRi (Figura supplementare S1).
La figura 5B presenta i risultati per l'adsorbimento EV ottenuti dopo l'iniezione del campione EV da cellule epiteliali mammarie primarie umane (HMEC) su un chip d'oro nudo. La coltura cellulare HMEC è stata centrifugata a 3.650 × g per 10 minuti, quindi il surnatante è stato nuovamente centrifugato a 10.000 × g per 30 minuti a 4 °C. Il pellet risultante è stato risospeso in 1x tampone PBS per lavarlo e la centrifugazione è stata eseguita nuovamente a 10.000 × g per 30 minuti a 4 °C. Infine, il pellet è stato sospeso in 1x tampone PBS.
Caratterizzazione AFM
Dopo gli esperimenti SPRi e il caricamento EV sui biochip (tramite adsorbimento, innesto o cattura di affinità), l'AFM è stato eseguito seguendo la metodologia per scansionare scansioni di grandi dimensioni (10 x 10 μm²) e poi (~ 10 almeno) più piccole (pochi μm²). La Figura 7 mostra esempi di immagini AFM su larga e piccola scala di veicoli elettrici su biochip.
Figura 7: Caratterizzazione AFM dei veicoli elettrici su un biochip. Immagini ottenute in modalità di contatto di un campione essiccato. (A) Un esempio di un'ampia area di scansione per fornire una visione rappresentativa del ROI in mm² sul chip. Questo risultato è stato ottenuto dopo l'innesto covalente di EV su una superficie chimicamente modificata. (B) Un altro esempio di un'ampia area di scansione ottenuta dopo la cattura di EV su immunoarray. (C) Una visione più ravvicinata degli oggetti per ottenere un'alta risoluzione e consentire la metrologia (in altezza e diametro) dei veicoli elettrici. (D) Una vista più ravvicinata del biochip nell'immagine in (A) con un'immagine inclinata 3D. (E) Una vista ingrandita di un grande EV adsorbito su un biochip d'oro nudo in un'immagine 3D inclinata. La scala Z è (A, B) 30 nm e (C) 20 nm. Barre di scala = (A, B) 2 μm, (C) 500 nm. Abbreviazioni: AFM = Microscopia a forza atomica; EVs = vescicole extracellulari. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Analisi di Gwyddion
Il software Gwyddion è stato utilizzato per elaborare i dati per ogni vescicola visualizzata su ogni lotto di immagini AFM. In primo luogo, è stata scansionata un'ampia area (nell'intervallo 10 x 10 μm²) che mostra una vista rappresentativa del ROI in mm² sul chip. L'immagine in Figura 7A mostra che la superficie era densamente coperta di oggetti. In questo caso, gli EV (dal latte bovino) sono stati iniettati a 2,5 × 1010 / ml su un chip tiolo-funzionalizzato attivato. Dopo aver eliminato la caseina dal campione, i surnatanti del siero di latte sono stati concentrati mediante centrifugazione a 4.000 × g e 20 °C utilizzando unità filtranti centrifughe Amicon da 100 kDa e gli EV sono stati isolati utilizzando l'approccio di ultracentrifugazione a gradiente di saccarosio. Questo risultato corrisponde a EV innestati covalentemente su una superficie chimicamente modificata. La Figura 7B mostra un altro esempio di un'ampia area di scansione ottenuta dopo la cattura di EV su immunoarray. Anche in questo caso, gli oggetti erano presenti sulla superficie ma mostravano una copertura meno densa rispetto a quando gli EV erano innestati covalentemente sul chip. Una visione più ravvicinata, nella Figura 7C, in diversi punti del ROI consente un'alta risoluzione e la metrologia (in altezza e diametro) dei veicoli elettrici. Un'altra vista più ravvicinata (Figura 7D) del biochip mostrato in Figura 7A, con un'immagine inclinata 3D, rivela oggetti che sono vescicole ma anche filamentosi (in alto a sinistra). Infatti, mentre gli immunochip consentono la cattura selettiva e differenziale di sottoinsiemi EV, l'innesto covalente innesta tutti gli oggetti con gruppi amminici liberi presenti nel campione. Nella Figura 7E, AFM rivela un singolo grande EV della cultura HMEC adsorbito su oro nudo. Pertanto, AFM è in grado di rivelare veicoli elettrici da piccoli a grandi e misurarli e aiuta a contare il numero di oggetti per mm² consentendo la visualizzazione di ciascun EV.
Sono stati determinati l'altezza e il diametro misurati di ciascun EV, da cui è stato ottenuto il diametro effettivo. Le altezze EV coprivano un intervallo da 10 nm a 50 nm, con una media di 15 nm; i diametri EV misurati coprivano un intervallo da 50 nm a 300 nm, con una media di 100 nm. Abbiamo osservato che il diametro effettivo dei veicoli elettrici variava da 30 nm a 300 nm, con una grande maggioranza intorno ai 60 nm (Figura 8A). Tali misurazioni sono state effettuate in liquido o dopo fissazione ed essiccazione. La figura 8B rivela che i risultati ottenuti in queste due condizioni erano comparabili.
Figura 8: Risultati generati dalla caratterizzazione AFM di EV su un biochip. (A) Metrologia delle EV su un punto (immunoarray antiCD41), determinata con una soglia di 8,5 nm e dopo l'iniezione di un campione EV a 2,5 × 1010/ml. Viene presentato il "diametro effettivo calcolato", con ogni punto corrispondente a una particella visualizzata sulle immagini AFM. (B) Istogramma generato dai dati di cui al punto (A), che mostra la distribuzione del diametro effettivo dei veicoli elettrici. Risultati ottenuti in aria (in rosso: campione fissato ed essiccato) e in liquido (in blu: non fissato). Abbreviazioni: AFM = microscopia a forza atomica; EVs = vescicole extracellulari . Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
L'analisi N-PEV di AFM è stata confrontata con i risultati NTA. Questi ultimi risultati "in soluzione", da parte di NTA, hanno mostrato una distribuzione dei diametri EV da 32 nm a 650 nm, con una grande maggioranza tra 90 nm e 250 nm di diametro. Pertanto, tenendo conto del fatto che NTA non è sensibile per piccole dimensioni (vicino a 50 nm), queste misurazioni AFM mostrano una buona correlazione con tali risultati (Figura supplementare S2).
Gli esperimenti Raman, che sono stati realizzati su EV adsorbiti su un chip nudo, hanno rivelato risultati incoraggianti; in particolare, è stato ottenuto uno spettro chiaro dei veicoli elettrici (Figura 9). Gli spettri Raman possono essere separati in tre diversi intervalli: la regione "impronta digitale" (inferiore a 1.800 cm-1), che contiene picchi che formano modelli molecolari specifici ed è, quindi, la parte più importante ai fini dell'identificazione; la regione "bio-silente" (1.800-2.800 cm−1), che di solito viene scartata quando si studiano campioni biologici in quanto non contiene picchi; e la regione "alte frequenze", che contiene principalmente informazioni sui lipidi ed è spesso la parte più intensa dello spettro ma è meno specifica. Lo spettro mostra picchi corrispondenti principalmente alle vibrazioni CH 2 (2.853 cm-1, 1.444 cm-1 e 130 cm-1), che sono associate ai lipidi della membrana dell'EV e un picco corrispondente all'amminoacido fenilalanina21. Una tabella di assegnazione del picco Raman delle molecole comuni presenti nelle EV può essere trovata nell'articolo di Penders et al.22.
Figura 9: Caratterizzazione spettroscopica Raman di EV su un biochip. Qui, il campione EV è stato derivato da una coltura HMEC e recuperato mediante centrifugazione a 20.000 × g. (A) Esempio di un'immagine Raman di EV adsorbiti su un biochip nudo (intensità media), sovrapposta a un'immagine in campo chiaro. (B) Esempio di spettri Raman misurati di veicoli elettrici. Le linee tratteggiate corrispondono alle vibrazioni identificate. α, forbice; τ, torsione; υ, allungamento (s, simmetrico; as, asimmetrico). Barra della scala = (A) 50 μm. Abbreviazioni: EVs = vescicole extracellulari. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura supplementare S1: Misurazioni dell'analisi di tracciamento delle nanoparticelle (NTA) degli N-PAV. I veicoli elettrici sono stati diluiti in PBS; gli esperimenti sono stati fatti in triplice copia utilizzando uno strumento MALVERN NS300. Diametro medio = 137,5 nm ± 1,3 nm; Diametro modale = 104,9 nm ± 13,3 nm. Clicca qui per scaricare questo file.
Figura supplementare S2: Saggi Western blot di N-PAV. Gli N-PEV (1) e (2) corrispondono a due lotti di N-PEV preparati da due tasche di concentrato piastrinico. Clicca qui per scaricare questo file.
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Discussion
I metodi recenti per l'identificazione delle EV che sono i più utilizzati sono l'immunoblotting protein-specific per confermare l'origine delle EV, TEM per confermare la loro struttura e NTA per quantificare il loro numero e la distribuzione delle dimensioni in un volume campione3. Tuttavia, l'elevato interesse per i veicoli elettrici nella ricerca (bio)medica e i limiti degli strumenti analitici esistenti hanno spinto la comunità scientifica a sviluppare nuovi metodi per la caratterizzazione, la discriminazione e la quantificazione delle EV.
La maggior parte degli sviluppi si concentra sulla combinazione dei principi di immunolabeling o immunocattura con metodi fisici avanzati per il rilevamento di EV. Alcuni di questi approcci si concentrano sull'identificazione di singoli veicoli elettrici per ottenere dati massimamente affidabili su scala nano-oggetto. Altri sono più interessati a proporre metodi globali che siano accessibili e affidabili per l'uso clinico.
La piattaforma NBA, che combina la biorilevazione di EV su un substrato d'oro multiplexato e la caratterizzazione AFM, consente la qualificazione profonda delle nanovescicole presenti in fluidi biologici complessi. Infatti, grazie alla selettività del biochip, è possibile iniettare campioni grezzi e evidenziare il contributo della vescicola.
L'approccio proposto consiste nella caratterizzazione di EV adsorbiti/innestate o catturati per affinità su un substrato di oro grezzo. AFM, che è convenzionalmente utilizzato su substrati atomicamente piatti, mostra ancora prestazioni ottimali sul chip d'oro grezzo, rivelando diverse interfacce che sono micro / nanostrutturate.
Il biochip multiplex che presenta diversi punti da scansionare (fino a 16 fino ad ora) e l'approccio NBA per campioni fissi ed essiccati sono stati sviluppati per ridurre il tempo necessario per un'indagine AFM profonda e altamente risolta di ciascun punto. Diversi test condotti in laboratorio hanno dimostrato che questa procedura (fissazione, essiccazione e imaging in aria) non ha un impatto significativo sulla metrologia dei veicoli elettrici.
Ci sono due passaggi principali critici nell'approccio: trovare un compromesso per selezionare la migliore sensibilità del chip per tutti i diversi ligandi innestati e dissociazione EV dal substrato alla fine dopo l'iniezione. Qui, è stata utilizzata una macchina SPRi che lavora con un singolo angolo di risonanza, indicando che deve essere selezionato il miglior compromesso nella risposta plasmonica per tutti i punti dei ligandi. Per alcuni ligandi, il rilevamento sarà molto sensibile (vicino all'angolo ottimale); Per altri, il rilevamento sarà meno sensibile se il valore dell'angolo fisso è diverso dall'angolo ottimale. Questo potrebbe essere superato utilizzando l'ultima generazione di strumentazione SPRi che fornisce fino a 10 diversi angoli di lavoro.
Il secondo passo critico è la dissociazione delle EV dal substrato dopo l'iniezione. Se la dissociazione è troppo elevata (perché le EV presentano, ad esempio, solo poche proteine specifiche sulla loro superficie), non sarà possibile eseguire la scansione utilizzando AFM in seguito. Queste situazioni sono molto rare, ma quando si verificano, la portata e la durata dell'iniezione devono essere ottimizzate per risolvere il problema.
Una limitazione del metodo proposto potrebbe essere una mancanza di rappresentatività della correlazione tra le osservazioni AFM e l'area mm² delle interazioni EV sul biochip. Per questo, devono essere scansionate diverse aree sul posto, comprese le grandi aree alle piccole aree e in diversi punti all'interno dello spot. Idealmente, la scansione dovrebbe essere eseguita nell'area ROI per una buona correlazione tra la caratterizzazione AFM e la risposta SPRi.
In altri lavori, gli autori di questo studio hanno utilizzato il rilevamento ottico e il conteggio digitale di singoli EV, che si basano sull'imaging interferometrico di EV catturati su un substrato di silicio biofunzionalizzato. Questa tecnica consente di stimare la dimensione dei veicoli elettrici a causa del contrasto osservato. Questa piattaforma, quindi, ha permesso, utilizzando gli abbondanti marcatori CD9, CD63 e CD81, di multiplexare l'analisi e rilevare la presenza di EV che esprimono un marcatore neuronale, CD171, nel liquido cerebrospinale nell'uomo24.
Questo approccio combinato e label-free, assistito da una rigorosa metodologia nella preparazione del biochip e nella modalità di acquisizione AFM, costituisce un metodo di scelta per caratterizzare i veicoli elettrici attraverso la loro cattura in tempo reale e sotto flusso anche in campioni complessi e grezzi. In effetti, non sono necessari passaggi preanalitici con il campione e non sono necessari passaggi di etichettatura o smascheramento nel metodo presentato. In letteratura, Ertsgaard et al. hanno rivelato diversi marcatori di membrana EV abbondanti utilizzando un sensore di imaging a riflettanza interferometrica a singola particella (SP-IRIS), ma in modalità statica (nessun flusso) senza misurazioni cinetiche, e hanno fornito solo una stima della dimensione EV25.
Grazie a questa procedura ottimizzata che consente la preparazione di biointerfacce reattive e controllate e biochip multipli passivati, i sottogruppi EV possono essere profondamente caratterizzati quando vengono iniettati come campioni grezzi. Questi diversi elementi rendono questa piattaforma NBA un metodo altamente rilevante per l'analisi diretta, profonda e risolta di EV in campioni grezzi.
La spettroscopia, e in particolare la spettroscopia Raman potenziata dalla superficie (SERS), sta emergendo come metodo di scelta per l'analisi biochimica di biomarcatori EV debolmente espressi. Questa strategia ha permesso lo sviluppo di saggi multiplex con sensibilità di poche decine di EV per μL. L'imaging SERS abbinato a metodi di ordinamento (ad esempio, dielettroforesi) rende possibile l'analisi ad alta produttività della composizione EV26.
In questo lavoro, anche gli esperimenti Raman eseguiti su biochip d'oro sono stati molto incoraggianti, poiché è stato ottenuto un chiaro spettro di EV, fornendo così informazioni sulla loro composizione molecolare. Gli sviluppi futuri potrebbero anche includere SERS per aumentare il segnale proveniente dagli EV sulla superficie del biochip e la spettroscopia Raman potenziata con punta (TERS) per ottenere immagini con risoluzione nanometrica, consentendo così la caratterizzazione di un singolo EV.
Recenti sviluppi in laboratorio sono stati fatti per migliorare la sensibilità della biorilevazione e la discriminazione tra sottoinsiemi di EV che coesistono in un campione e potenzialmente co-interagiscono sugli stessi array. Per aumentare la sensibilità, gli esperimenti vengono passati al sistema SPRi, che consente la selezione di diversi angoli per il rilevamento di EV su punti diversi. Per migliorare la discriminazione dei sottoinsiemi di EV, devono essere affrontate diverse sfide: i) ottenere la firma Raman spettroscopica di ciascun sottoinsieme EV sul biochip, ii) aumentare il numero di punti identificati sul biochip (da 16 a 100) e iii) aumentare il throughput dell'analisi utilizzando AFM ad alta velocità (HS AFM). Inoltre, HS AFM consentirà anche la caratterizzazione di sottoinsiemi di veicoli elettrici rapidamente e in condizioni liquide.
Alcuni altri punti da notare sono che se l'idrofilia del biochip d'oro è alta, c'è il rischio che le macchie dei ligandi si sovrappongano e si mescolino (come mostrato nella Figura 4B). È necessario evitare di iniettare bolle d'aria durante l'iniezione di soluzioni sotto SPRi, poiché ciò porterebbe a cambiamenti nella riflettività e contribuirebbe a un monitoraggio errato del segnale SPRi.
Durante la scansione delle superfici con AFM, è necessario osservare le immagini per verificare se ci sono cambiamenti drastici nel valore della somma o se ci sono artefatti (ad esempio, aspetto ripetitivo degli oggetti). Ciò può essere dovuto alla contaminazione della punta AFM; In questo caso, la punta deve essere sostituita.
Ci sono alcuni limiti della tecnica che abbiamo osservato: la sensibilità del chip scelta per tutti i diversi ligandi innestati non è ottimale per tutti; la dissociazione delle EV dal substrato al termine dell'iniezione; e la risoluzione inferiore (rispetto all'AFM) dell'imaging Raman, che non consente la visualizzazione dei singoli veicoli elettrici.
Nonostante le limitazioni, questo protocollo presenta molti vantaggi significativi rispetto ai metodi esistenti. La combinazione dei metodi label-free (spettroscopia SPRi + AFM + Raman) sullo stesso substrato e quindi sullo stesso campione biologico evita distorsioni tra le analisi dovute al substrato e conferisce elevata originalità e fiducia all'analisi dei sottoinsiemi di EV.
Tale piattaforma analitica ingegnerizzata potrebbe aiutare nella caratterizzazione delle EV in diversi contesti, come nei campi della diagnosi e della bioterapia acellulare e dei biofluidi dal sangue ai supernatanti cellulari. Oltre alla qualifica EV, altri nanooggetti (ad esempio, complessi molecolari, nanoparticelle sintetiche, virus) possono essere caratterizzati da questa piattaforma analitica multimodale.
Nonostante l'ampia varietà di metodi sviluppati e implementati nella comunità EV, ognuna di queste tecniche ha il proprio potenziale e differenze nelle prestazioni in termini di gamma dinamica, precisione, throughput e applicazione per l'analisi di specifici parametri EV26. Approcci innovativi, ultrasensibili e multistep (separazione, selezione, firma spettrale e analisi del contenuto vescicolare), come questa piattaforma analitica multimodale, anche se applicata a piccoli volumi su chip (lab-on-a-chip), forniscono nuove prospettive nel campo delle biopsie liquide, del biomonitoraggio e della medicina di precisione.
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Disclosures
Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.
Acknowledgments
Kelly Aubertin e Fabien Picot della struttura centrale IVETh (Parigi) sono riconosciuti per gli esperimenti di imaging Raman. Thierry Burnouf (Taipei Medical University, Taiwan) e Zuzana Krupova (di Helincourt, Francia) sono riconosciuti per aver fornito i campioni EV derivati rispettivamente da campioni di piastrine nel sangue e latte bovino. Il lavoro è stato sostenuto dalla regione Bourgogne Franche-Comté e dalla scuola di specializzazione EUR EIPHI (progetto NOVICE, 2021-2024). Parte di questo lavoro è stato svolto utilizzando la piattaforma CLIPP e nelle camere bianche RENATECH in FEMTO-ENGINEERING, per le quali ringraziamo Rabah Zeggari.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CD41a antibody | Diaclone SAS (France) | 447528 | |
| CP920 | Microparticles GmbH, Germany | 448303 | |
| DXR3xi | Thermo Fisher Scientific | T1502 | |
| EDC | Sigma | A6272 | |
| Ethanolamine | Sigma | P5368-10PAK | |
| Evs derived from platelet concentrates | Collaboration : Pr T. Burnouf (TMU, Taipei) | S2889 | |
| Evs from bovine milk | Collaboration : Dr Z. Krupova (Excilone, Helincourt - France) | 3450 | |
| Glutaraldehyde | Sigma | 56845 | |
| Gwyddion | 853.223.020 | ||
| Magnetron sputtering | PLASSYS | SAB5300165 | |
| mercapto-1-hexadecanoic acid | Sigma | G5882 | |
| Mercapto-1-undecanol | Sigma | O8001 | |
| Mountains SPIP ones | Digital Surf | ||
| NanoWizard 3 Bioscience | Bruker-JPK | ||
| Octyl Glucoside (OG) | Sigma | ||
| Ovalbumine antibody | Sigma | ||
| Phosphate Buffer Saline (PBS) | Sigma | ||
| Rat Albumin Serum (RSA) | Sigma | ||
| Sodium acetate buffer | Sigma | ||
| SPR-Biacore 3000 | GE Healthcare/ Cytiva life sciences | ||
| SPRi Biochip | MIMENTO technology platform | The biochips were produced in-house in the clean room, Besancon | |
| SPRi Plex II | Horiba Scientific | ||
| Sulfo-NHS | Sigma |
References
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