Summary
Este trabalho propõe uma nova geração de plataformas analíticas multiparamétricas com maior rendimento para a caracterização de subconjuntos de vesículas extracelulares. O método é baseado em uma combinação de métodos de biossensoriamento multiplexado com análises metrológicas e morfomecânicas por microscopia de força atômica, juntamente com espectroscopia Raman, para qualificar alvos vesiculares presos em um biochip de microarray.
Abstract
As vesículas extracelulares (EVs) são minúsculas vesículas derivadas de membrana produzidas por todas as células que variam de 50 a várias centenas de nanômetros de diâmetro e são usadas como meio de comunicação intercelular. Eles estão emergindo como ferramentas diagnósticas e terapêuticas promissoras para uma variedade de doenças. Existem dois processos principais de biogênese usados pelas células para produzir EVs com diferenças de tamanho, composição e conteúdo. Devido à sua alta complexidade em tamanho, composição e origem celular, sua caracterização requer uma combinação de técnicas analíticas. Este projeto envolve o desenvolvimento de uma nova geração de plataformas analíticas multiparamétricas com maior rendimento para a caracterização de subpopulações de VEs. Para atingir esse objetivo, o trabalho parte da plataforma nanobioanalítica (NBA) estabelecida pelo grupo, que permite uma investigação original de EVs com base em uma combinação de métodos de biossensoriamento multiplexados com análises metrológicas e morfomecânicas por microscopia de força atômica (AFM) de alvos vesiculares presos em um biochip de microarray. O objetivo foi completar esta investigação de EV com uma análise fenotípica e molecular por espectroscopia Raman. Esses desenvolvimentos permitem a proposta de uma solução analítica multimodal e fácil de usar para a discriminação de subconjuntos de EV em fluidos biológicos com potencial clínico
Introduction
O crescente interesse na pesquisa de EV em diagnóstico e terapêutica 1,2,3,4,5, aliado aos desafios enfrentados por esse campo, resultou no desenvolvimento e implementação de uma grande variedade de abordagens e técnicas para quantificar ou caracterizar essas vesículas. Os métodos mais utilizados para a identificação de EV são imunoblotting e proteômica específicos de proteínas para confirmar a origem dos EVs, microscopia eletrônica de transmissão (MET) para confirmar sua estrutura e análise de rastreamento de nanopartículas (NTA) para quantificar sua distribuição de número e tamanho em um volume de amostra.
Nenhuma dessas técnicas, por si só, no entanto, fornece todas as informações necessárias para caracterizar os subconjuntos de EV. A heterogeneidade inerente dos VEs devido à diversidade em suas propriedades bioquímicas e físicas impede análises globais confiáveis e reprodutíveis, especialmente para EVs contidos em uma mistura (amostra bruta). Métodos de detecção e caracterização são, portanto, necessários para os VEs, tanto individualmente quanto em geral, para complementar outros métodos mais rápidos, mas não seletivos6.
A imagem de alta resolução por MET (ou cryoTEM) ou AFM permite a determinação da morfologia e metrologia de EVs com resolução nanométrica 7,8,9,10,11,12. No entanto, a principal limitação do uso da microscopia eletrônica para objetos biológicos, como os EVs, é a necessidade de um vácuo para realizar o estudo, o que requer a fixação e desidratação da amostra. Tal preparo dificulta a tradução das estruturas observadas para a morfologia do VE em solução. Para evitar essa desidratação da amostra, a técnica de crioTEM é a mais adequada para caracterização do VE13. É amplamente utilizado para determinar a ultraestrutura dos VEs. A imunomarcação de vesículas por nanopartículas de ouro biofuncionalizadas também permite identificar subpopulações específicas de EVs e distingui-las de outras partículas presentes em uma amostra biológica complexa. No entanto, devido ao baixo número de EVs analisados por microscopia eletrônica, muitas vezes é difícil realizar uma caracterização que seja representativa de uma amostra complexa e heterogênea.
Para revelar essa heterogeneidade de tamanho, a International Society for Extracellular Vesicles (ISEV) sugere a análise de um número suficiente de imagens de campo amplo, acompanhadas de imagens menores, para revelar EVs individuais com alta resolução14. O AFM é uma alternativa às abordagens ópticas e técnicas de difração eletrônica para o estudo de VEs. Esta técnica usa uma ponta afiada mantida por um cantilever flexível que digitaliza a amostra depositada em um suporte, linha por linha, e ajusta a distância entre a ponta e os elementos presentes através de um loop de feedback. Isso permite caracterizar a topografia da amostra e coletar informações morfomecânicas15,16,17,18. Os EVs podem ser escaneados por AFM após serem depositados em um substrato atomicamente plano ou após terem sido capturados em um substrato específico funcionalizado por anticorpos, peptídeos ou aptâmeros para caracterizar as várias subpopulações18,19. Devido à sua capacidade de quantificar e sondar simultaneamente a estrutura, a biomecânica e o conteúdo biomolecular membranoso de EVs dentro de amostras biológicas complexas sem a necessidade de pré-tratamento, marcação ou desidratação, o AFM é agora cada vez mais usado para caracterizar EVs de maneira fina e multiparamétrica sob condições fisiológicas de temperatura e meio.
Este trabalho propõe uma metodologia utilizando um núcleo de biochip de ouro capaz de ser (bio)quimicamente funcionalizado em um formato multiplexado. Este substrato é a pedra angular de uma poderosa plataforma analítica que combina a biodetecção de subconjuntos de EV por ressonância plasmônica de superfície e, uma vez que os EVs são adsorvidos / enxertados ou imunocapturados no chip, o AFM permite a caracterização metrológica e morfomecânica dos EVs. Juntamente com a assinatura Raman dos subconjuntos EV capturados no chip, esta plataforma analítica permite a qualificação dos EVs presentes em amostras biológicas de forma livre de rótulo e sem qualquer necessidade de etapas pré-analíticas. Este trabalho mostra que a combinação de técnicas poderosas, auxiliadas por uma metodologia altamente rigorosa na preparação de substratos e aquisição de dados, torna a análise de EV profunda, definitiva e robusta.
O princípio da abordagem proposta é preparar um substrato de ouro, adsorver/enxertar ou capturar os subtipos de EV e digitalizá-los por AFM para estimar o tamanho e a morfologia de cada subconjunto de EV. Além disso, esses EVs adsorvidos são analisados por espectroscopia Raman. Esse substrato pode, de fato, apresentar três tipos de interfaces de complexidade crescente: microarrays nus, quimicamente funcionalizados ou ligantes. Antes de descrever as diferentes etapas do protocolo, os leitores são encaminhados para a apresentação esquemática da abordagem da plataforma nanobioanalítica (NBA) na Figura 1, combinando ressonância plasmônica de superfície (SPRi), AFM e espectroscopia.
Figura 1: A plataforma NanoBioAnalítica. A abordagem combina (A) ressonância plasmônica de superfície, (B) microscopia de força atômica e (nano)espectroscopia de infravermelho/Raman, todos engajados no mesmo substrato - um chip de ouro multiplexado. Abreviaturas: NBA = plataforma NanoBioAnalítica; SPRi = ressonância plasmônica de superfície; AFM = microscopia de força atômica; EV = vesícula extracelular. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
O biochip de ouro principal constitui o coração da plataforma, uma vez que todas as técnicas de caracterização sem rótulo são conduzidas neste biochip. De acordo com as necessidades de caracterização do EV (global/total de EVs ou subconjuntos de EV) e as limitações/demandas dos métodos utilizados, três tipos de superfícies de biochip de ouro foram desenvolvidas: ou "nuas", quimicamente funcionalizadas "C11/C16", ou ligantes-biofuncionalizadas, chamadas de superfície de ouro "ligante".
O biochip nu, chamado de "nu", permite a simples adsorção de EVs em ouro. É possível selecionar o tampão utilizado e realizar essa adsorção de forma passiva (etapas de incubação e depois enxágue) ou monitorá-lo sob fluxo (em SPRi). Além disso, essa adsorção passiva pode ser realizada em todo o chip (como um macroarray) ou localizada em microarrays usando um spotter de micropipeta. O "procedimento sob fluxo" permite que os investigadores acompanhem a cinética e o nível de adsorção do EV. Essa abordagem no substrato de ouro nu é adotada quando a interface da camada química pode interferir no método analítico (por exemplo, para espectroscopia Raman).
O biochip quimicamente funcionalizado, chamado "C11/C16", é usado para criar um "tapete" denso e robusto de EVs covalentemente ligados na superfície do ouro, formando ligações amidas primárias com os tiolatos quando o objetivo é ter uma visão global da amostra de EV. De fato, neste caso, o ouro é funcionalizado por uma mistura de tiolato de mercapto-1-undecanol (11-MUOH: "C11") e ácido mercapto-1-hexadecanóico (16-MHA: "C16"), e uma fração dos tiolatos é quimicamente ativada para estabelecer ligação covalente com os alvos. Novamente, essa estratégia pode ser realizada passivamente (etapas de incubação e depois enxágue, seja em "macroarray" ou em vários microarrays usando um observador de micropipetas) ou sob taxas de fluxo (em SPRi) para seguir a cinética e o nível de enxerto de EV na superfície de ouro.
O biochip biofuncionalizado por ligante, chamado de "ligantes", é quimicamente ativado para enxertar covalentemente diferentes ligantes (por exemplo, anticorpos, receptores) para capturar seletivamente (com afinidade) diferentes subconjuntos de EV que coexistem na amostra biológica.
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Protocol
1. Preparação do substrato de ouro
NOTA: Três tipos de superfícies são produzidas em lascas de ouro: 1) superfície nua, 2) quimicamente funcionalizada e 3) biofuncionalizada (ligantes enxertados na camada C11C16). Eles serão chamados de "nus", "C11C16" e "ligantes", respectivamente, a partir deste ponto.
- Preparação do substrato de ouro:
NOTA: Para este protocolo, os biochips de ouro foram fabricados internamente na sala limpa. Os biochips caseiros foram compostos por lâminas de vidro (SF11) com revestimento de cromo (2 nm Cr) e ouro (48 nm Au). O comprimento do biochip foi de 28 mm, a largura foi de 12,5 mm e a espessura foi de 0,5 mm20.- Use magnetron DC sputtering15 para revestir as lâminas por deposição física de vapor (PVD).
- Funcionalização química:
- Funcionalizar os chips nus incubando-os durante a noite em uma mistura de 90%/10% por mole de mercapto-1-undecanol (11-MUOH: C11) e ácido mercapto-1-hexadecanóico (16-MHA: C16) a 1 mM em etanol absoluto, sob agitação e à temperatura ambiente.
NOTA: Esta etapa formará uma monocamada (SAM) estável e automontada, que é útil no enxerto dos ligantes. - Limpe o biochip (lave suavemente) com etanol absoluto e água ultrapura, seque-o sob nitrogênio e armazene-o em condições de sala limpa.
- Ativação do biochip quimicamente funcionalizado:
NOTA: A partir desta etapa, os experimentos devem ser realizados em um laboratório analítico.- Limpe o biochip com água ultrapura, lavando-o suavemente e, em seguida, seque o chip sob um fluxo de ar suave. Para ativar os grupos carboxílicos C16, incubar o biochip em uma mistura de 200 mM de carbodiimida de etila (dimetilaminopropil) / N-hidroxisuccinimida (EDC) e 50 mmol / L de N-hidroxisuccinimida (Sulfo-NHS) por pelo menos 30 min no escuro à temperatura ambiente. Em seguida, enxágue com água antes dos experimentos de enxerto.
- Funcionalizar os chips nus incubando-os durante a noite em uma mistura de 90%/10% por mole de mercapto-1-undecanol (11-MUOH: C11) e ácido mercapto-1-hexadecanóico (16-MHA: C16) a 1 mM em etanol absoluto, sob agitação e à temperatura ambiente.
- Enxerto dos ligantes no biochip funcionalizado:
NOTA: A imobilização dos ligantes (ou EVs para alguns experimentos) no chip pode ser feita passivamente fora do instrumento SPRi (incubação de uma gota no chip ativado) ou dinamicamente sob o fluxo para o instrumento SPRi. Isso constitui os chips modificados por EV ou ligantes. A Figura 2 apresenta o biochip de ouro, o observador de micropipeta e o biochip após a mancha com 16 gotículas de ligante de 300 nL cada.- Para o enxerto de ligantes, use moléculas como anticorpos (por exemplo, imunoglobulinas-antiCD41 [específicas para EVs derivadas de plaquetas sanguíneas nativas, chamadas N-PEVs], antiCD61, antiCD62P, antiCD9 e antiOVA [anticorpo de controle contra a ovalbumina]) e Anexina V. Dilua-as a 200 μg/mL em uma solução ácida (de pH 4,5 a 6, dependendo do pH ideal para atividade ou função do ligante).
NOTA: O pH ótimo para o enxerto de anticorpos foi determinado previamente por experimentos de pré-concentração realizados em um instrumento SPR para a determinação do pH ótimo para enxerto de ligantes (ver Figura 3). À medida que as condições de enxerto mudam com os clones de anticorpos que são usados, recomenda-se determinar essas condições antes de prosseguir com os experimentos SPRi. - Para o procedimento de enxerto, adicione 300 nL de EVs/solução de ligante usando o spotter.
NOTA: Um pedaço de papel submerso em água deve ser mantido nos poços esquerdo e direito para evitar a evaporação de gotículas. Esta etapa é importante para manter os EVs/ligantes em suas condições ideais de estabilidade e funcionalidade. - Após a mancha, mantenha o biochip sob um banho sônico (frequência: 37 kHz, potência: 30%) por uma incubação de 30 minutos. Lave o biochip de cima com água ultrapura e coloque-o suavemente em um prisma com o mesmo índice de refratividade (IR) que o biochip. Ao ajustar o biochip na parte superior do prisma, adicione uma gota (~ 2,3 μL) de óleo com o mesmo IR que o prisma para criar uma camada uniforme e fina entre o biochip e o prisma.
NOTA: Esta etapa garante um meio contínuo do mesmo RI no caminho óptico. É importante evitar a incorporação de bolhas na camada de óleo nesta etapa, pois isso alterará as propriedades ópticas no caminho e dificultará uma análise mais aprofundada.
- Para o enxerto de ligantes, use moléculas como anticorpos (por exemplo, imunoglobulinas-antiCD41 [específicas para EVs derivadas de plaquetas sanguíneas nativas, chamadas N-PEVs], antiCD61, antiCD62P, antiCD9 e antiOVA [anticorpo de controle contra a ovalbumina]) e Anexina V. Dilua-as a 200 μg/mL em uma solução ácida (de pH 4,5 a 6, dependendo do pH ideal para atividade ou função do ligante).
Figura 2: Biochip e spotter manual. Biochip de ouro (esquerda), observador de micropipeta (meio) e o biochip após a mancha com gotículas de ligante de 300 nL cada (direita). Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Testes de pré-concentração para determinar o pH ideal para enxerto de ligantes. O sensorgrama apresenta o nível de interação em função do tempo para um ligante injetado aleatoriamente (em diferentes valores de pH) na mesma concentração durante 2 min na superfície. OG é o detergente, que permite que a linha de base seja recuperada entre cada injeção. Aqui, o sensorgrama indica que o pH 6 permitiu a maior enxertia de ligantes, com um sinal SPRi de 1091 RU. Abreviaturas: OG = octil glicosídeo; RU = unidade de resposta. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
2. Ressonância plasmônica de superfície
- Monte o biochip no sistema SPRi. Mantenha a taxa de fluxo do buffer PBS (buffer em execução) em 50 μL/min.
NOTA: Se houver bolhas, aumente a taxa de fluxo até 500-1.000 μL / min e injete 40 mM de glicosídeo octil (OG) com frequência para removê-las o mais rápido possível. - Condicionamento do biochip de ouro no instrumento SPRi: Escolha dos ângulos de trabalho
- Clique no menu suspenso no lado esquerdo do software e clique no diretório de trabalho para definir a pasta onde os dados experimentais devem ser salvos. Depois, clique em Plasmon | Aquisição de imagens.
- Localize a imagem (como mostra a Figura 4A) onde diferentes pontos estão visíveis e clique para selecioná-la. Para definir a região de interesse (ROI), conforme representado na Figura 4, clique em detecção automática ou definição manual dentro dos pontos (Figura 4B) ou no chip para se referir a um local específico mesmo sem pontos (Figura 4C),.
- Quando biochips multiplexados são usados, escreva o nome das famílias de ligantes e, em seguida, clique nos pontos correspondentes.
NOTA: Uma família de ligantes corresponde a vários pontos funcionalizados com o mesmo ligante. Normalmente, o chip apresenta pelo menos duplicatas e até triplicados de cada ligante. - Clique na definição da espécie de acabamento e aguarde para ser direcionado para a janela que contém as curvas plasmônicas obtidas.
- Escolha um ângulo de trabalho. Arraste a linha preta com o cursor para o ângulo de trabalho ideal e clique em Mover espelho para o ângulo de trabalho.
NOTA: A curva plasmônica consiste no valor da refletividade (%) versus o ângulo, e o software fornece outra curva com o valor da inclinação (%) versus o ângulo. Para selecionar um bom ângulo de trabalho, escolha o ângulo com o maior valor da inclinação.- No caso de um passo passivante (por causa da albumina) realizado no interior do aparelho, selecione um ângulo de trabalho para obter a sensibilidade ideal em relação à superfície, estabelecendo assim um controle de qualidade da reatividade da superfície.
NOTA: Esta etapa de passivação é importante quando o chip é preparado para biodetecção de afinidade/captura para reduzir interações não específicas entre a amostra e a superfície do biochip.
- No caso de um passo passivante (por causa da albumina) realizado no interior do aparelho, selecione um ângulo de trabalho para obter a sensibilidade ideal em relação à superfície, estabelecendo assim um controle de qualidade da reatividade da superfície.
- Clique em Cinética para iniciar o monitoramento cinético em tempo real. Uma vez que o software solicita ao usuário para definir o controle negativo, escolha nenhum controle negativo neste momento (pois isso permitirá a observação da cinética nos pontos de controle negativos).
- Injetar albumina sérica de ratos (RSA, 200 μg/mL, preparada em tampão acetato, pH 4,5) a 50 μL/min por 4 min para passivar a superfície ao redor dos pontos e, possivelmente, para preencher espaços vazios dentro dos pontos de ligante.
NOTA: O RSA é injetado para cobrir o biochip, que não está ligado a nenhum ligante. - Injetar etanolamina (1 M) a 20 μL/ min por 10 min para desativar os grupos carboxílicos ainda presentes e reativos na superfície.
- Lave o biochip injetando 40 mM OG a 50 μL/ min por 4 min.
NOTA: Após a etapa de passivação, o ângulo de trabalho é ajustado (como uma nova determinação de linha de base antes da injeção da amostra) para estar na sensibilidade mais alta nos pontos de interesse.
- Injetar albumina sérica de ratos (RSA, 200 μg/mL, preparada em tampão acetato, pH 4,5) a 50 μL/min por 4 min para passivar a superfície ao redor dos pontos e, possivelmente, para preencher espaços vazios dentro dos pontos de ligante.
- Injeção de amostra:
- Redefina as curvas plasmônicas após a passivação e escolha o ângulo de trabalho de acordo com o ligante desta vez.
- No monitoramento cinético, reduza a taxa de fluxo para 20 μL/min e aguarde que a linha de base fique estável.
- Injete a amostra em uma concentração de escolha (de 1 x 10 8 EVs/mL a 1 x 1010 EVs/mL, dependendo da afinidade entre os EVs e os ligantes enxertados) e clique em injeção manual ou injeção automática. No caso de injeção manual, depois de injetar 200 μL da amostra, clique em parar a injeção. Como a duração da injeção é geralmente de 10 min, comece a seguir a cinética da interação e meça a variação da refletividade calculando a diferença na refletividade entre o início e o final da injeção observada durante o monitoramento cinético (Figura 5).
NOTA: As diferentes amostras que foram injetadas são descritas na seção de resultados representativos.
- Após a injeção da amostra, siga uma destas duas abordagens para concluir o experimento SPRi:
- Na abordagem não fixa/ em líquido, retire o biochip do aparelho SPRi, adicione uma gota líquida sobre ele e prossiga para uma caracterização AFM adicional da superfície em líquido.
- Na abordagem fixa , injetar glutaraldeído (0,5%) diluído em água a 20 μL/ min por 10 min para fixar as moléculas capturadas no biochip. Injete água para enxaguar a superfície, retire o biochip, lave-o muito suavemente com água destilada e seque-o ao ar para ser analisado mais detalhadamente sob AFM.
Figura 4: Imagem SPRi CCD do biochip. (A,B) Biochip multiplexado após passivação de albumina. (A) Um chip sem padrão; (B) alguns defeitos que apareceram no chip: fusão de manchas (i), enxerto fraco (ii), ou poeira ou "contaminantes" (iii). Os ROIs, em cor nas manchas (uma cor por família de ligantes), foram escolhidos para evitar esses "contaminantes". Quando as manchas se fundiam, elas eram notadas e ignoradas ou nomeadas como "mistura de ligantes 1 e 2". (C) Chip de ouro nu sem microarrays para o experimento que examina a adsorção de EVs em ouro. A seta azul indica a direção do fluxo. Esse chip não apresentava manchas, e as ROIs foram escolhidas para registrar o sinal de refletividade da linha 1 (L1, círculos vermelhos) para a linha 4 (L4, círculos roxos) durante a injeção da amostra. Barra de escala = 1 mm para as três imagens. Abreviaturas: SPRi = ressonância plasmônica de superfície; CCD = dispositivo de carga acoplada; ROIs = regiões de interesse; EVs = vesículas extracelulares. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Experimentos SPRi de injeção de EV em um biochip. (A) Experimento de captura em um biochip multiplexado mostrando os sinais de refletividade de diferentes ligantes. Aqui, a relação sinal-ruído para os diferentes ligantes foi muito boa (e especialmente nos pontos antiCD41), uma vez que a resposta do controle negativo foi insignificante. (B) Experimento de adsorção de EVs em um biochip nu. Sensorgrama apresentando o condicionamento do chip com duas descargas de tampão e limpeza OG (1), com a injeção de amostra EV (2) e o sinal de refletividade após interação EV (3). Neste biochip, não houve controle negativo, mas o sinal de refletividade (sua cinética, sua estabilidade após a injeção) foi alto, o que significa que esses EVs foram capazes de adsorver e permanecer estáveis no chip de ouro. Abreviaturas: EV = vesícula extracelular; OG = octil glicosídeo. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
3. Microscopia de força atômica
- Use o modo de contato para digitalizar o biochip no ar e o modo de imagem quantitativa para digitalizar o biochip em condições líquidas.
- Alinhar o biochip na parte superior da máscara na lâmina de vidro (desenvolvida em laboratório) para identificar a posição dos respectivos micropontos no biochip (Figura 6A).
NOTA: A máscara contém as marcações das manchas, que correspondem às posições das manchas dos ligantes de acordo com o spotter utilizado. Esta máscara consiste em uma lâmina de vidro na qual duas cunhas perpendiculares permitem a colocação do chip. Além disso, a lâmina de vidro é marcada com 16 pontos de feltro correspondentes à localização pontual no chip, o que permite, por transparência, localizar os pontos e escanear a área desejada. - Posicionamento da ponta:
- Use uma câmera CCD na parte superior do AFM para localizar o cantilever no local correto que deve ser digitalizado. Para seguir este protocolo, use balanços triangulares de 200 μm de comprimento, 28 μm de largura e uma constante de mola de 0,08 N/m.
- Alinhe o laser na parte superior do cantilever em uma posição que dê uma resposta ideal no mecanismo de controle de feedback.
- Escaneamento:
- Uma vez engajado e em contato com a superfície do biochip, inicie a aquisição do AFM no modo de contato ou no modo de imagem quantitativa de três a cinco grandes áreas (tipicamente 10 × 10 μm²) para pequenas áreas (1 x 1 μm²).
NOTA: Uma representação das diferentes áreas que podem ser verificadas é mostrada na Figura 6D. Garantir que a caracterização do AFM seja representativa de todo o ponto mm² e que EVs suficientes sejam visualizados em uma boa resolução para uma análise robusta (um mínimo de 300 EVs contados e analisados para cada condição) e realizar as medições de metrologia e morfologia.
- Uma vez engajado e em contato com a superfície do biochip, inicie a aquisição do AFM no modo de contato ou no modo de imagem quantitativa de três a cinco grandes áreas (tipicamente 10 × 10 μm²) para pequenas áreas (1 x 1 μm²).
- Tratamento de imagem AFM:
- Trate as imagens AFM com o software de processamento de dados JPK selecionando primeiro o canal de altura.
- Escolha um ajuste polinomial a ser subtraído de cada linha para obter linhas de varredura endireitadas.
- Selecione o limite de altura em grãos de ouro para eliminar a rugosidade da superfície. No software referenciado (consulte a Tabela de Materiais), dentro do módulo de extração de grãos, marque os grãos usando um valor limite de altura de 8,5 nm. Uma vez que os grãos foram filtrados, o número de grãos aparece.
NOTA: Normalmente, o substrato de ouro bruto (RMS de ~3 nm) e a presença das camadas químicas e de ligantes requerem que o limiar seja definido em 8,5 nm. - Para extrair várias propriedades dos grãos marcados, como altura, volume e diâmetro, abra a imagem no software referenciado e selecione o tratamento de dados | Grãos | Marque por limite.
- Escolha grãos de filtro na função de propriedades. Quando uma nova janela for exibida, escolha os seguintes parâmetros: Valor = z-max máximo, Superfície = superfície projetada A0. Em seguida, escolha os critérios A E B.
- Distribuição aberta de grãos; na janela exibida, escolha valor (máximo), volume (base: zero) e limite (comprimento). Observe a tabela (em formato .txt) que aparece, que apresenta três colunas com os valores de altura, volume e diâmetro para todos os grãos detectados no limite definido por imagem.
- A partir da altura, h e diâmetro, D, calcule o raio de curvatura, Rc, de cada EV usando a equação (1)8 e, em seguida, calcule o volume, V, usando a equação (2):
(1)
(2) - A partir de V, calcular o diâmetro efetivo, d eff, de cada EV (o diâmetro de uma esfera com o mesmo volume) usando a equação (3):
(3) - Gráficos de gráficos mostrando os tamanhos (altura medida, diâmetro medido e diâmetro efetivo calculado) dos EVs, com cada partícula contada representada por um ponto.
NOTA: Assim, ao final da caracterização, a plataforma NBA possibilita a correlação do sinal de biodetecção e, em seguida, a fenotipagem, com os números e tamanhos dos subconjuntos de EV.
(1)
(2)
(3)
Figura 6: Caracterização do biochip por AFM. Após o experimento SPRi, o cavaco foi fixado e seco ou mantido em líquido para caracterização da AFM. (A) A lâmina de vidro usinado (com duas cunhas de posicionamento perpendiculares, indicadas com um "w" na figura) apresentando um encaixe de máscara com a localização dos 16 microarrays de biochip. Por exposição à luz e transparência, uma vez instalada para a caracterização do AFM, a lâmina de vidro permite que a ponta do AFM seja colocada no local desejado para caracterizá-la. (B) O biochip instalado na lâmina "máscara" e sob uma gota de tampão para varredura em condições líquidas. (C) Imagem SPRi dos 16 microarrays. (D) Um microarray fotografado por microscopia óptica após a imunocaptura de nanopartículas de calibração biofuncionalizadas de 920 nm de diâmetro. Os quadrados brancos indicam a amostragem das diferentes áreas escaneadas pelo AFM em cada ponto de interesse para tornar a caracterização do AFM robusta. Barras de escala = (C) 1 mm, (D) 500 μm. Abreviaturas: AFM = microscopia de força atômica; SPRi = ressonância plasmônica de superfície. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
4. Espectroscopia Raman
NOTA: Para espectroscopia Raman, substitua a lâmina de vidro usada como substrato por uma lâmina de CaF2, que tenha uma assinatura Raman insignificante.
- Condições ópticas para a aquisição:
- Defina as seguintes condições para o microscópio de imagem Raman: objetiva do microscópio: 50x; comprimento de onda do laser: 532 nm; potência do laser: 10 mW; tempo de exposição: 500 ms; número de acúmulos: 140; faixa espectral: de 450 cm−1 a 3.200 cm−1.
NOTA: O uso de muita energia e/ou um tempo de aquisição muito longo pode levar a danos à amostra, evidenciados por espectros instáveis ao longo do tempo. Comece com uma baixa quantidade de energia e aumente isso se o sinal for muito fraco. Comprimentos de onda de laser mais altos podem ser usados (633 nm, 785 nm) para reduzir a fluorescência prejudicial às medições Raman. No entanto, a intensidade diminui com a quarta potência do comprimento de onda, e a sensibilidade espectral da câmera deve ser considerada.
- Defina as seguintes condições para o microscópio de imagem Raman: objetiva do microscópio: 50x; comprimento de onda do laser: 532 nm; potência do laser: 10 mW; tempo de exposição: 500 ms; número de acúmulos: 140; faixa espectral: de 450 cm−1 a 3.200 cm−1.
- Imagem Raman:
- Primeiro, observe os espectros ao vivo com um número reduzido de acúmulos (10) para encontrar a área com a melhor relação sinal-ruído.
NOTA: Um sinal forte na região de alta frequência (2.800-3.000 cm−1) pode facilitar a detecção de EVs na superfície com baixos tempos de exposição, como mostrado anteriormente10. - Uma vez selecionado o ROI, escolha a resolução espacial de acordo com o tempo disponível para a aquisição.
NOTA: A resolução espacial é limitada pelo limite de difração (~500 nm). - Inicie a aquisição de mapeamento Raman.
- Primeiro, observe os espectros ao vivo com um número reduzido de acúmulos (10) para encontrar a área com a melhor relação sinal-ruído.
- Pré-processamento de dados:
- Usando um ambiente de desenvolvimento integrado Python (IDE) (por exemplo, Spyder), abra o arquivo que contém os espectros.
- Subtraia a linha de base dos espectros para corrigir a interferência de uma possível fluorescência. Por exemplo, use a função "arpls" do pacote "irfpy"23. Teste diferentes valores do parâmetro "lam" para encontrar aquele que dá a melhor correção de linha de base (geralmente entre 103 e 107).
- Normalize os espectros, por exemplo, dividindo todas as intensidades de um espectro por sua intensidade a 2.900 cm−1 ou subtraindo a média do espectro e, em seguida, dividindo-o por seu desvio padrão (normalização "normal padrão").
NOTA: Esta etapa é necessária para comparar a composição molecular relativa dos VEs.
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Representative Results
Determinação das condições ótimas de pH para enxerto de ligantes
Os diferentes ligantes utilizados para o preparo dos biochips são testados em função do pH e de sua disponibilidade para interagir com a camada química tiolato (Figura 3). Os ligantes são diluídos em tampão acetato em diferentes valores de pH e injetados no biochip quimicamente funcionalizado com uma camada C11C16. As soluções são injetadas aleatoriamente na superfície e um detergente (OG a 40 mM) é injetado após cada injeção de ligante para recuperar a linha de base. Este teste de pré-concentração permite a determinação do pH ideal para cada enxerto de ligante. No exemplo apresentado na Figura 3, um pH de 6 foi selecionado como o melhor pH em termos de inclinação e nível de enxerto de ligante.
Imagens do SPRi CCD
As imagens do SPRi CCD registradas no biochip (nu, quimicamente funcionalizado ou apresentando microarrays) após a inserção na máquina SPRi são apresentadas na Figura 4. No caso do biochip que apresenta microarray, a imagem foi obtida após a passivação da albumina da superfície. Duplicatas ou triplicados de pontos foram sistematicamente realizados no chip, e um controle negativo também estava automaticamente presente no chip. O controle negativo consistiu principalmente de um anticorpo irrelevante. No SPRi, quando o biochip foi utilizado sem mancha - para adsorção em ouro nu ou para enxerto direto de EVs em um biochip quimicamente funcionalizado - os ROIs foram escolhidos arbitrariamente na área de detecção. Como exemplo, a Figura 4C mostra os ROIs escolhidos em um chip de ouro nu antes da injeção de EVs.
Graças a esta imagem SPRi CCD, é possível ignorar certos pontos se tais problemas aparecerem durante o enxerto. A imagem do SPRi CCD também permite estimar a homogeneidade do enxerto dentro do ponto, garante a reprodutibilidade do enxerto entre diferentes pontos do mesmo ligante e, finalmente, garante que a biodetecção de EV prossiga em matrizes equivalentes em termos de densidade superficial.
Resultados do SPRi
Quando os ROIs são selecionados, a linha de base é estável, o que significa que a amostra pode ser injetada. A Figura 5 mostra diferentes resultados obtidos em um biochip multiplexado, revelando uma alta relação sinal-ruído para determinados imunoarrays (o sinal de refletividade foi de 1,4% no antiCD41 em comparação com a resposta no controle negativo de 0,02%). A Figura 5B apresenta os resultados de adsorção de EV obtidos após a injeção da amostra de EV em um chip de ouro nu. A amostra de N-PEVs foi de plaquetas. A solução foi centrifugada a 3.000 × g por 15 min a 22 °C; o sobrenadante foi então centrifugado novamente a 20.000 × g por 15 min a 22 °C. O pellet resultante foi ressuspenso no buffer. Os resultados de SPRi obtidos em N-PEVs imunocapturados foram comparados com os resultados de western blot (WB). O BM revelou forte expressão de CD41, CD62P e CD9 nessas amostras, destacando uma boa correlação com os resultados do SPRi (Figura Suplementar S1).
A Figura 5B apresenta os resultados para a adsorção de EV obtidos após a injeção da amostra de EV de células epiteliais mamárias primárias humanas (HMECs) em um chip de ouro nu. A cultura de células HMEC foi centrifugada a 3.650 × g por 10 min e, em seguida, o sobrenadante foi centrifugado novamente a 10.000 × g por 30 min a 4 °C. O pellet resultante foi ressuspenso em tampão PBS 1x para lavá-lo, e a centrifugação foi realizada novamente a 10.000 × g por 30 min a 4 °C. Finalmente, o pellet foi suspenso em buffer PBS 1x.
Caracterização do AFM
Após os experimentos de SPRi e carregamento de EV nos biochips (seja por adsorção, enxerto ou captura de afinidade), o AFM foi realizado seguindo a metodologia para escanear varreduras grandes (10 x 10 μm²) e depois (~10 pelo menos) menores (alguns μm²). A Figura 7 mostra exemplos de imagens AFM em grande e pequena escala de EVs em biochips.
Figura 7: Caracterização AFM de EVs em um biochip. Imagens obtidas em modo de contato de uma amostra seca. (A) Um exemplo de uma grande área de varredura para fornecer uma visão representativa do ROI de mm² no chip. Esse resultado foi obtido após o enxerto covalente de EVs em superfície quimicamente modificada. (B) Outro exemplo de uma grande área de varredura obtida após a captura de EVs em imunoarrays. (C) Uma visão mais próxima dos objetos para obter alta resolução e permitir a metrologia (em altura e diâmetro) dos VEs. (D) Uma visão mais próxima do biochip na imagem em (A) com uma imagem inclinada em 3D. (E) Uma visão ampliada de um grande EV adsorvido em um biochip de ouro nu em uma imagem 3D inclinada. A escala Z é (A, B) 30 nm e (C) 20 nm. Barras de escala = (A, B) 2 μm, (C) 500 nm. Abreviaturas: AFM = Microscopia de Força Atômica; EVs = vesículas extracelulares. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Análise de Gwyddion
O software Gwyddion foi utilizado para processar os dados de cada vesícula visualizada em cada lote de imagens AFM. Primeiro, uma grande área (na faixa de 10 x 10 μm²) mostrando uma visão representativa do ROI mm² no chip foi digitalizada. A imagem da Figura 7A mostra que a superfície estava densamente coberta de objetos. Neste caso, os EVs (de leite bovino) foram injetados a 2,5 × 1010/mL em um chip funcionalizado com tiol ativado. Após a eliminação da caseína da amostra, os sobrenadantes do soro de leite foram concentrados por centrifugação a 4.000 × g e 20 °C utilizando unidades filtrantes centrífugas Amicon 100 kDa, e os EVs foram isolados pela via de ultracentrifugação gradiente de sacarose. Este resultado corresponde a EVs enxertados covalentemente em uma superfície quimicamente modificada. A Figura 7B mostra outro exemplo de uma grande área de varredura obtida após a captura de EVs em imunoarrays. Aqui também, os objetos estavam presentes na superfície, mas mostraram uma cobertura menos densa do que quando os EVs foram enxertados covalentemente no chip. Uma visão mais próxima, na Figura 7C, em vários locais do ROI permite alta resolução e metrologia (em altura e diâmetro) dos EVs. Outra visão mais próxima (Figura 7D) do biochip mostrado na Figura 7A, com uma imagem inclinada em 3D, revela objetos que são vesículas, mas também filamentosos (canto superior esquerdo). De fato, enquanto os imunochips permitem a captura seletiva e diferencial dos subconjuntos de EV, o enxerto covalente enxerta todos os objetos com grupos amina livre que estão presentes na amostra. Na Figura 7E, o AFM revela um único EV grande da cultura HMEC adsorvido em ouro nu. Assim, o AFM é capaz de revelar EVs pequenos a grandes e medi-los e ajuda a contar o número de objetos por mm², permitindo a visualização de cada EV.
A altura e o diâmetro medidos de cada VE foram determinados, a partir dos quais o diâmetro efetivo foi obtido. As alturas do EV cobriram uma faixa de 10 nm a 50 nm, com uma média de 15 nm; os diâmetros medidos do VE cobriram uma faixa de 50 nm a 300 nm, com uma média de 100 nm. Observou-se que o diâmetro efetivo dos EVs variou de 30 nm a 300 nm, com grande maioria em torno de 60 nm (Figura 8A). Essas medidas foram realizadas em líquido ou após fixação e secagem. A Figura 8B revela que os resultados obtidos nessas duas condições foram comparáveis.
Figura 8: Resultados gerados pela caracterização AFM de EVs em um biochip. (A) Metrologia de EVs em um ponto (imunoarray antiCD41), determinado com limiar de 8,5 nm e após a injeção de uma amostra de EV a 2,5 × 1010/mL. O "diâmetro efetivo calculado" é apresentado, com cada ponto correspondendo a uma partícula visualizada nas imagens AFM. (B) Histograma gerado a partir dos dados em (A), mostrando a distribuição do diâmetro efetivo dos EVs. Resultados obtidos no ar (em vermelho: amostra fixa e seca) e em líquido (em azul: não fixo). Abreviaturas: AFM = microscopia de força atômica; EVs = vesículas extracelulares . Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
A análise do N-PEV por AFM foi comparada com os resultados do NTA. Esses últimos resultados "em solução", da NTA, mostraram uma distribuição dos diâmetros do VE de 32 nm a 650 nm, com uma grande maioria entre 90 nm e 250 nm de diâmetro. Assim, levando em conta que a NTA não é sensível para tamanhos pequenos (próximo a 50 nm), essas medidas de AFM mostram boa correlação com esses resultados (Figura Suplementar S2).
Os experimentos Raman, que foram realizados em EVs adsorvidos em um chip nu, revelaram resultados encorajadores; especificamente, obteve-se um espectro claro dos VE (Figura 9). Os espectros Raman podem ser separados em três faixas diferentes: a região da "impressão digital" (abaixo de 1.800 cm−1), que contém picos que formam padrões moleculares específicos e é, portanto, a parte mais importante para fins de identificação; a região "bio-silenciosa" (1.800-2.800 cm−1), que geralmente é descartada quando se estudam amostras biológicas, pois não contém picos; e a região de "altas frequências", que contém principalmente informações sobre lipídios e é frequentemente a parte mais intensa do espectro, mas é menos específica. O espectro apresenta picos correspondentes principalmente às vibrações CH 2 (2.853 cm−1, 1.444 cm−1 e 130 cm−1), que estão associados aos lipídios da membrana do EV e a um pico correspondente ao aminoácido fenilalanina 21. Uma tabela de atribuição de pico Raman de moléculas comuns presentes em EVs pode ser encontrada no artigo de Penders et al.22.
Figura 9: Caracterização por espectroscopia Raman de EVs em um biochip. Aqui, a amostra de EV foi derivada de uma HMECculture e recuperada por centrifugação a 20.000 × g. (A) Exemplo de uma imagem Raman de EVs adsorvidos em um biochip nu (intensidade média), sobrepostos em uma imagem de campo brilhante. (B) Exemplo de espectros Raman medidos de VEs. As linhas pontilhadas correspondem a vibrações identificadas. α, tesoura; τ, torção; υ, alongamento (s, simétrico; como, assimétrico). Barra de escala = (A) 50 μm. Abreviaturas: EVs = vesículas extracelulares. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura suplementar S1: Medições de análise de rastreamento de nanopartículas (NTA) de N-PEVs. Os EVs foram diluídos em PBS; os experimentos foram realizados em triplicado utilizando um instrumento MALVERN NS300. Diâmetro médio = 137,5 nm ± 1,3 nm; diâmetro do modo = 104,9 nm ± 13,3 nm. Clique aqui para baixar este arquivo.
Figura Suplementar S2: Ensaios de Western blot de N-PEVs. Os N-PEV (1) e (2) correspondem a dois lotes de N-PEV preparados a partir de duas bolsas de concentrado de plaquetas. Clique aqui para baixar este arquivo.
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Discussion
Os métodos recentes para identificação de EV que são os mais amplamente utilizados são imunoblotting específico de proteína para confirmar a origem de EVs, TEM para confirmar sua estrutura e NTA para quantificar seu número e distribuição de tamanho em um volume de amostra3. No entanto, o alto interesse em VEs em pesquisa (bio)médica e as limitações das ferramentas analíticas existentes levaram a comunidade científica a desenvolver novos métodos para caracterização, discriminação e quantificação de VE.
A maioria dos desenvolvimentos se concentra na combinação dos princípios de imunomarcação ou imunocaptura com métodos físicos avançados para detecção de EV. Algumas dessas abordagens se concentram na identificação de EVs individuais para obter dados maximamente confiáveis na escala de nano-objetos. Outros estão mais preocupados em propor métodos globais que sejam acessíveis e confiáveis para uso clínico.
A plataforma NBA, que combina a biodetecção de EVs em um substrato de ouro multiplexado e a caracterização AFM, permite a qualificação profunda das nanovesículas presentes em fluidos biológicos complexos. De fato, devido à seletividade do biochip, amostras brutas podem ser injetadas e a contribuição da vesícula pode ser destacada.
A abordagem proposta consiste na caracterização de EVs adsorvidos/enxertados ou capturados por afinidade em um substrato de ouro bruto. O AFM, que é convencionalmente usado em substratos atomicamente planos, ainda mostra um desempenho ideal no chip de ouro bruto, revelando diferentes interfaces que são micro / nanoestruturadas.
O biochip multiplexado apresentando vários pontos para varredura (até 16 até agora) e a abordagem NBA para amostras fixas e secas foram desenvolvidas para reduzir o tempo necessário para uma investigação AFM profunda e altamente resolvida de cada ponto. Diferentes testes realizados em laboratório mostraram que esse procedimento (fixação, secagem e imagem no ar) não afeta significativamente a metrologia dos VEs.
Existem duas etapas críticas principais na abordagem: encontrar um compromisso para selecionar a melhor sensibilidade do chip para todos os diferentes ligantes enxertados e dissociação EV do substrato no final após a injeção. Aqui, foi utilizada uma máquina SPRi trabalhando com um único ângulo de ressonância, indicando que o melhor comprometimento na resposta plasmônica para todos os pontos de ligantes deve ser selecionado. Para alguns ligantes, a detecção será muito sensível (perto do ângulo ideal); para outros, a detecção será menos sensível se o valor do ângulo fixo for diferente do ângulo ideal. Isso pode ser superado usando a última geração de instrumentação SPRi que fornece até 10 ângulos de trabalho diferentes.
O segundo passo crítico é a dissociação dos EVs do substrato após a injeção. Se a dissociação for muito alta (porque os EVs apresentam, por exemplo, apenas algumas proteínas específicas em sua superfície), não será possível escanear usando AFM depois. Essas situações são muito raras, mas quando ocorrem, a vazão e a duração da injeção devem ser otimizadas para resolver o problema.
Uma limitação do método proposto poderia ser a falta de representatividade da correlação entre as observações do AFM com a área mm² das interações do VE no biochip. Para isso, diferentes áreas no local devem ser escaneadas, inclusive de grandes áreas a pequenas áreas e em diferentes lugares dentro do local. Idealmente, o exame deve ser realizado na área de ROI para uma boa correlação entre a caracterização da AFM e a resposta do SPRi.
Em outros trabalhos, os autores deste estudo utilizaram a detecção óptica e a contagem digital de EVs individuais, que se baseiam na imagem interferométrica de EVs capturados em um substrato de silício biofuncionalizado. Essa técnica permite estimar o tamanho dos EVs devido ao contraste observado. Essa plataforma, assim, possibilitou, utilizando os abundantes marcadores CD9, CD63 e CD81, multiplexar a análise e detectar a presença de EVs expressando um marcador neuronal, CD171, no líquido cefalorraquidiano em humanos24.
Essa abordagem combinada e livre de rótulos, auxiliada por uma metodologia rigorosa no preparo do biochip e no modo de aquisição do AFM, constitui um método de escolha para caracterizar os VEs por meio de sua captura em tempo real e sob fluxo em amostras complexas e brutas. De fato, nenhuma etapa pré-analítica com a amostra e nenhuma etapa de rotulagem ou desmascaramento é necessária no método apresentado. Na literatura, Ertsgaard et al. revelaram diferentes marcadores de membrana EV abundantes usando um único sensor de imagem de reflectância interferométrica de partículas (SP-IRIS), mas em modo estático (sem fluxo) sem medidas cinéticas, e deram apenas uma estimativa do tamanho do EV25.
Devido a este procedimento otimizado que permite a preparação de biointerfaces reativas e controladas e biochips multiplexados passivados, os subconjuntos de EV podem ser profundamente caracterizados quando são injetados como amostras brutas. Esses diferentes elementos tornam esta plataforma da NBA um método altamente relevante para a análise direta, profunda e resolvida de EVs em amostras brutas.
A espectroscopia, e especialmente a espectroscopia Raman aprimorada pela superfície (SERS), está emergindo como um método de escolha para a análise bioquímica de biomarcadores EV fracamente expressos. Essa estratégia permitiu o desenvolvimento de ensaios multiplexados com sensibilidades de algumas dezenas de EVs por μL. A imagem SERS aliada a métodos de classificação (por exemplo, dieletroforese) possibilita a análise de alto rendimento da composição do EV26.
Neste trabalho, os experimentos Raman realizados em biochips de ouro também foram muito encorajadores, uma vez que um espectro claro de EVs foi obtido, dando assim uma visão de sua composição molecular. Desenvolvimentos futuros também podem incluir SERS para aumentar o sinal proveniente dos EVs na superfície do biochip e espectroscopia Raman aprimorada por ponta (TERS) para obter imagens com resolução nanométrica, permitindo assim a caracterização de EV único.
Desenvolvimentos recentes no laboratório foram feitos para melhorar a sensibilidade da biodetecção e a discriminação entre subconjuntos de EV que coexistem em uma amostra e potencialmente co-interagem nas mesmas matrizes. Para aumentar a sensibilidade, os experimentos estão sendo trocados para o sistema SPRi, que permite a seleção de vários ângulos para detecção de EV em diferentes pontos. Para melhorar a discriminação dos subconjuntos de EV, diferentes desafios devem ser enfrentados: i) obter a assinatura Raman espectroscópica de cada subconjunto de EV no biochip, ii) aumentar o número de pontos identificados no biochip (de 16 para 100) e iii) aumentar o rendimento da análise usando AFM DE ALTA VELOCIDADE (HS AFM). Além disso, o HS AFM também permitirá a caracterização de subconjuntos de EV rapidamente e em condições líquidas.
Alguns outros pontos a serem observados são que, se a hidrofilicidade do biochip de ouro for alta, há o risco de que as manchas dos ligantes se sobreponham e se misturem (como mostrado na Figura 4B). É necessário evitar a injeção de bolhas de ar durante a injeção de soluções sob SPRi, pois isso levaria a mudanças na refletividade e contribuiria para o monitoramento incorreto do sinal SPRi.
Ao digitalizar as superfícies com AFM, é necessário observar as imagens para verificar se há mudanças drásticas no valor da soma ou se há artefatos (por exemplo, aparência repetitiva de objetos). Isso pode ser devido à contaminação da ponta do AFM; nesse caso, a gorjeta precisa ser substituída.
Existem algumas limitações da técnica que observamos: a sensibilidade do chip escolhido para todos os diferentes ligantes enxertados não é a ideal para todos eles; a dissociação dos EVs do substrato no final da injeção; e a menor resolução (que a AFM) da imagem Raman, que não permite a visualização de EVs individuais.
Apesar das limitações, este protocolo tem muitas vantagens significativas em relação aos métodos existentes. A combinação dos métodos livres de rótulo (SPRi + AFM + espectroscopia Raman) no mesmo substrato e, em seguida, na mesma amostra biológica evita o viés entre as análises devido ao substrato e confere alta originalidade e confiança à análise dos subconjuntos de EV.
Tal plataforma analítica projetada poderia ajudar na caracterização de EV em diferentes contextos, como nos campos de diagnóstico e bioterapia acelular e biofluidos do sangue para sobrenadantes celulares. Além da qualificação EV, outros nanoobjetos (por exemplo, complexos moleculares, nanopartículas sintéticas, vírus) podem ser caracterizados por essa plataforma analítica multimodal.
Apesar da grande variedade de métodos desenvolvidos e implementados na comunidade de VE, cada uma dessas técnicas tem seu próprio potencial e diferenças de desempenho em termos de faixa dinâmica, precisão, rendimento e aplicação para a análise de parâmetros específicos de EV26. Abordagens inovadoras, ultrassensíveis e de várias etapas (separação, seleção, assinatura espectral e análise do conteúdo vesicular), como essa plataforma analítica multimodal, mesmo quando aplicada a pequenos volumes em chips (lab-on-a-chip), fornecem novas perspectivas no campo de biópsias líquidas, biomonitoramento e medicina de precisão.
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Disclosures
Os autores não têm conflitos de interesse a divulgar.
Acknowledgments
Kelly Aubertin e Fabien Picot, da instalação central do IVETh (Paris), são reconhecidas pelos experimentos de imagem Raman. Thierry Burnouf (Taipei Medical University, Taiwan) e Zuzana Krupova (de Helincourt, França) são reconhecidos por fornecer as amostras de EV derivadas de amostras de plaquetas sanguíneas e leite bovino, respectivamente. O trabalho foi apoiado pela região de Bourgogne Franche-Comté e pela escola de pós-graduação EUR EIPHI (projeto NOVICE, 2021-2024). Parte deste trabalho foi feito usando a plataforma CLIPP e nas instalações de sala limpa da RENATECH na FEMTO-ENGINEERING, pelas quais agradecemos a Rabah Zeggari.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CD41a antibody | Diaclone SAS (France) | 447528 | |
| CP920 | Microparticles GmbH, Germany | 448303 | |
| DXR3xi | Thermo Fisher Scientific | T1502 | |
| EDC | Sigma | A6272 | |
| Ethanolamine | Sigma | P5368-10PAK | |
| Evs derived from platelet concentrates | Collaboration : Pr T. Burnouf (TMU, Taipei) | S2889 | |
| Evs from bovine milk | Collaboration : Dr Z. Krupova (Excilone, Helincourt - France) | 3450 | |
| Glutaraldehyde | Sigma | 56845 | |
| Gwyddion | 853.223.020 | ||
| Magnetron sputtering | PLASSYS | SAB5300165 | |
| mercapto-1-hexadecanoic acid | Sigma | G5882 | |
| Mercapto-1-undecanol | Sigma | O8001 | |
| Mountains SPIP ones | Digital Surf | ||
| NanoWizard 3 Bioscience | Bruker-JPK | ||
| Octyl Glucoside (OG) | Sigma | ||
| Ovalbumine antibody | Sigma | ||
| Phosphate Buffer Saline (PBS) | Sigma | ||
| Rat Albumin Serum (RSA) | Sigma | ||
| Sodium acetate buffer | Sigma | ||
| SPR-Biacore 3000 | GE Healthcare/ Cytiva life sciences | ||
| SPRi Biochip | MIMENTO technology platform | The biochips were produced in-house in the clean room, Besancon | |
| SPRi Plex II | Horiba Scientific | ||
| Sulfo-NHS | Sigma |
References
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