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Biology

Plate-forme analytique multimodale sur une puce d’imagerie par résonance plasmonique de surface multiplexée pour l’analyse de sous-ensembles de vésicules extracellulaires

Published: March 17, 2023 doi: 10.3791/64210
Automatic Translation
1, 2, 3, 1, 1, 4, 1
1Université de Franche-Comté, CNRS UMR-6174, FEMTO-ST Institute, 2Lille Neuroscience & Cognition research centre, 3Institut Galien Paris-Saclay, CNRS UMR-8612 , Université Paris-Saclay, 4Interdisciplinary Lab Carnot Bourgogne LICB, CNRS UMR-6303, Université de Bourgogne Franche-Comté

Summary

Cet article propose une nouvelle génération de plateformes analytiques multiparamétriques avec un débit accru pour la caractérisation des sous-ensembles de vésicules extracellulaires. La méthode est basée sur une combinaison de méthodes de biodétection multiplexées avec des analyses métrologiques et morphomécaniques par microscopie à force atomique, couplée à la spectroscopie Raman, pour qualifier des cibles vésiculaires piégées sur une biopuce de microréseau.

Abstract

Les vésicules extracellulaires (VE) sont de minuscules vésicules dérivées de la membrane produites par toutes les cellules qui vont de 50 à plusieurs centaines de nanomètres de diamètre et sont utilisées comme moyen de communication intercellulaire. Ils apparaissent comme des outils diagnostiques et thérapeutiques prometteurs pour diverses maladies. Il existe deux principaux processus de biogenèse utilisés par les cellules pour produire des VE avec des différences de taille, de composition et de contenu. En raison de leur grande complexité en taille, composition et origine cellulaire, leur caractérisation nécessite une combinaison de techniques analytiques. Ce projet comprend le développement d’une nouvelle génération de plateformes analytiques multiparamétriques avec un débit accru pour la caractérisation de sous-populations de VE. Pour atteindre cet objectif, les travaux partent de la plateforme nanobioanalytique (NBA) mise en place par le groupe, qui permet une étude originale des VE basée sur une combinaison de méthodes de biodétection multiplexées avec des analyses métrologiques et morphomécaniques par microscopie à force atomique (AFM) de cibles vésiculaires piégées sur une biopuce de microarray. L’objectif était de compléter cette étude EV par une analyse phénotypique et moléculaire par spectroscopie Raman. Ces développements permettent de proposer une solution analytique multimodale et facile à utiliser pour la discrimination des sous-ensembles de VE dans les fluides biologiques à potentiel clinique

Introduction

L’intérêt croissant pour la recherche sur les VE dans le diagnostic et la thérapeutique 1,2,3,4,5, combiné aux défis auxquels ce domaine est confronté, a entraîné le développement et la mise en œuvre d’une grande variété d’approches et de techniques pour quantifier ou caractériser ces vésicules. Les méthodes les plus largement utilisées pour l’identification des VE sont l’immunoblot et la protéomique spécifiques aux protéines pour confirmer l’origine des VE, la microscopie électronique à transmission (MET) pour confirmer leur structure et l’analyse de suivi des nanoparticules (NTA) pour quantifier leur nombre et leur distribution de taille dans un volume d’échantillon.

Cependant, aucune de ces techniques ne donne à elle seule toutes les informations nécessaires pour caractériser les sous-ensembles de véhicules électriques. L’hétérogénéité inhérente des VE due à la diversité de leurs propriétés biochimiques et physiques empêche les analyses globales fiables et reproductibles, en particulier pour les VE contenus dans un mélange (échantillon brut). Des méthodes de détection et de caractérisation sont donc nécessaires pour les véhicules électriques, à la fois individuellement et généralement pour compléter d’autres méthodes plus rapides mais non sélectives6.

L’imagerie haute résolution par TEM (ou cryoTEM) ou AFM permet de déterminer la morphologie et la métrologie des VE avec une résolution nanométrique 7,8,9,10,11,12. Cependant, la principale limitation de l’utilisation de la microscopie électronique pour les objets biologiques, tels que les véhicules électriques, est la nécessité d’un vide pour effectuer l’étude qui nécessite la fixation et la déshydratation de l’échantillon. Une telle préparation rend difficile la traduction des structures observées à la morphologie EV en solution. Pour éviter cette déshydratation de l’échantillon, la technique de cryoTEM est la plus adaptée à la caractérisation EV13. Il est largement utilisé pour déterminer l’ultrastructure des véhicules électriques. L’immunomarquage des vésicules par des nanoparticules d’or biofonctionnalisées permet également d’identifier des sous-populations spécifiques de VE et de les distinguer des autres particules présentes dans un échantillon biologique complexe. Cependant, en raison du faible nombre de VE analysés par microscopie électronique, il est souvent difficile d’effectuer une caractérisation représentative d’un échantillon complexe et hétérogène.

Pour révéler cette hétérogénéité de taille, l’International Society for Extracellular Vesicles (ISEV) suggère d’analyser un nombre suffisant d’images à grand champ, accompagnées d’images plus petites, pour révéler des VE individuels à haute résolution14. L’AFM est une alternative aux approches optiques et aux techniques de diffraction électronique pour l’étude des véhicules électriques. Cette technique utilise une pointe tranchante maintenue par un porte-à-faux flexible qui scanne l’échantillon déposé sur un support, ligne par ligne, et ajuste la distance entre la pointe et les éléments présents grâce à une boucle de rétroaction. Cela permet de caractériser la topographie de l’échantillon et de recueillir des informations morphomécaniques15,16,17,18. Les VE peuvent être scannés par AFM soit après avoir été déposés sur un substrat atomiquement plat, soit après avoir été capturés sur un substrat spécifique fonctionnalisé par des anticorps, des peptides ou des aptamères pour caractériser les différentes sous-populations18,19. En raison de sa capacité à quantifier et à sonder simultanément la structure, la biomécanique et le contenu biomoléculaire membraneux des VE dans des échantillons biologiques complexes sans avoir besoin de prétraitement, d’étiquetage ou de déshydratation, l’AFM est maintenant de plus en plus utilisé pour caractériser les VE de manière fine et multiparamétrique dans des conditions physiologiques de température et de milieu.

Cet article propose une méthodologie utilisant une biopuce d’or de base capable d’être (bio)chimiquement fonctionnalisée dans un format multiplexé. Ce substrat est la pierre angulaire d’une puissante plateforme analytique combinant la biodétection de sous-ensembles de VE par résonance plasmonique de surface, et une fois les VE adsorbés/greffés ou immunocapturés sur la puce, AFM permet la caractérisation métrologique et morphomécanique des VE. Couplée à la signature Raman des sous-ensembles EV capturés sur la puce, cette plateforme analytique permet la qualification des VE présents dans les échantillons biologiques de manière sans marquage et sans aucune étape préanalytique. Cet article montre que la combinaison de techniques puissantes, assistées par une méthodologie très rigoureuse dans la préparation du substrat et l’acquisition de données, rend l’analyse EV approfondie, définitive et robuste.

Le principe de l’approche proposée est de préparer un substrat aurifère, d’adsorber/greffer ou de capturer les sous-types de VE, et de les scanner par AFM pour estimer la taille et la morphologie de chaque sous-ensemble de VE. De plus, ces VE adsorbés sont analysés par spectroscopie Raman. Ce substrat peut, en effet, présenter trois types d’interfaces de plus en plus complexes : nues, fonctionnalisées chimiquement, ou puces à lignand. Avant de décrire les différentes étapes du protocole, les lecteurs sont invités à se reporter à la présentation schématique de l’approche de la plateforme nanobioanalytique (NBA) à la figure 1, combinant l’imagerie par résonance plasmonique de surface (SPRi), l’AFM et la spectroscopie.

Figure 1
Figure 1 : La plateforme NanoBioAnalytical L’approche combine (A) l’imagerie par résonance plasmonique de surface, (B) la microscopie à force atomique et la (nano)spectroscopie infrarouge / Raman, toutes engagées sur le même substrat - une puce d’or multiplexée. Abréviations : NBA = NanoBioAnalytical platform; SPRi =imagerie par résonance plasmonique de surface; AFM = microscopie à force atomique; EV = vésicule extracellulaire. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

La biopuce d’or de base constitue le cœur de la plateforme puisque toutes les techniques de caractérisation sans marquage sont réalisées sur cette biopuce. Selon les besoins de la caractérisation des VE (VE globaux/totaux ou sous-ensembles de VE) et les limites/exigences des méthodes utilisées, trois types de surfaces de biopuce d’or ont été développées : soit « nues », « C11/C16 » chimiquement fonctionnalisées ou biofonctionnalisées par ligand, appelées surface dorée « ligand ».

La biopuce nue, appelée « nue », permet l’adsorption simple de véhicules électriques sur l’or. Il est possible de sélectionner le tampon utilisé et de réaliser cette adsorption soit de manière passive (étapes d’incubation puis de rinçage), soit de la surveiller sous flux (en SPRi). De plus, cette adsorption passive peut être réalisée soit sur l’ensemble de la puce (sous forme de macroarray), soit localisée dans des microarrays à l’aide d’un observateur de micropipettes. La « procédure sous débit » permet aux enquêteurs de suivre la cinétique et le niveau d’adsorption de l’EV. Cette approche sur le substrat d’or nu est adoptée lorsque l’interface de la couche chimique peut interférer avec la méthode analytique (par exemple, pour la spectroscopie Raman).

La biopuce fonctionnalisée chimiquement, appelée « C11/C16 », est utilisée pour créer un « tapis » dense et robuste de véhicules électriques liés de manière covalente sur la surface de l’or en formant des liaisons amides primaires avec les thiolates lorsque l’objectif est d’avoir une vue globale de l’échantillon de VE. En effet, dans ce cas, l’or est fonctionnalisé par un mélange thiolate de mercapto-1-undécanol (11-MUOH : « C11 ») et d’acide mercapto-1-hexadécanoïque (16-MHA : « C16 »), et une fraction des thiolates est activée chimiquement pour établir une liaison covalente avec les cibles. Encore une fois, cette stratégie peut être réalisée soit passivement (étapes d’incubation puis de rinçage, soit dans un « macroarray » ou dans plusieurs microarrays à l’aide d’un observateur de micropipette) ou sous des débits (dans SPRi) pour suivre la cinétique et le niveau de greffage EV sur la surface de l’or.

La biopuce biofonctionnalisée par ligand, appelée « ligands », est activée chimiquement pour greffer par covalence différents ligands (p. ex. anticorps, récepteurs) afin de capturer sélectivement (avec affinité) différents sous-ensembles de VE qui coexistent dans l’échantillon biologique.

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Protocol

1. Préparation du substrat d’or

NOTE: Trois types de surfaces sont produites sur des copeaux d’or: 1) surface nue, 2) fonctionnalisée chimiquement et 3) biofonctionnalisée (ligands greffés sur couche C11C16). Ils seront appelés « nus », « C11C16 » et « ligands », respectivement, à partir de ce moment.

  1. Préparation du substrat d’or:
    REMARQUE: Pour ce protocole, les biopuces d’or ont été fabriquées en interne dans la salle blanche. Les biopuces artisanales étaient composées de lames de verre (SF11) avec un revêtement de chrome (2 nm Cr) et d’or (48 nm Au). La longueur de la biopuce était de 28 mm, la largeur était de 12,5 mm et l’épaisseur était de 0,5 mm20.
    1. Utilisez un magnétron à courant continupulvérisant 15 pour recouvrir les lames par dépôt physique en phase vapeur (PVD).
  2. Fonctionnalisation chimique :
    1. Fonctionnaliser les copeaux nus en les incubant pendant une nuit dans un mélange à 90%/10% par mole de mercapto-1-undécanol (11-MUOH: C11) et d’acide mercapto-1-hexadécanoïque (16-MHA: C16) à 1 mM dans de l’éthanol absolu, sous agitation et à température ambiante.
      REMARQUE: Cette étape formera une monocouche stable et auto-assemblée (SAM), ce qui est utile dans la greffe des ligands.
    2. Nettoyez la biopuce (lavez doucement) avec de l’éthanol absolu et de l’eau ultrapure, séchez-la sous azote et conservez-la dans des conditions de salle blanche.
    3. Activation de la biopuce fonctionnalisée chimiquement :
      NOTE: À partir de cette étape, les expériences doivent être effectuées dans un laboratoire d’analyse.
      1. Nettoyez la biopuce avec de l’eau ultrapure en la lavant doucement, puis séchez-la sous un flux d’air doux. Pour activer les groupes carboxyliques C16, incuber la biopuce dans un mélange de 200 mM d’éthyl(diméthylaminopropyl)carbodiimide/N-hydroxysuccinimide (EDC) et de 50 mmol/L de N-hydroxysuccinimide (Sulfo-NHS) pendant au moins 30 min dans l’obscurité à température ambiante. Rincez ensuite à l’eau avant les expériences de greffe.
  3. Greffe des ligands sur la biopuce fonctionnalisée :
    REMARQUE: L’immobilisation des ligands (ou EV pour certaines expériences) sur la puce peut être effectuée passivement en dehors de l’instrument SPRi (incubation d’une goutte sur la puce activée) ou dynamiquement sous l’écoulement dans l’instrument SPRi. Il s’agit des puces modifiées par EV ou ligand. La figure 2 présente la biopuce d’or, l’observateur de micropipette et la biopuce après repérage avec 16 gouttelettes de ligand de 300 nL chacune.
    1. Pour la greffe de ligand, utilisez des molécules telles que des anticorps (p. ex. immunoglobulines-antiCD41 [spécifiques aux VE dérivés de plaquettes sanguines natives, appelées N-PEV], antiCD61, antiCD62P, antiCD9 et antiOVA [anticorps de contrôle contre l’ovalbumine]) et l’annexine V. Diluez-les à 200 μg/mL dans une solution acide (de pH 4,5 à 6 selon le pH optimal pour l’activité ou la fonction du ligand).
      NOTE: Le pH optimal pour la greffe d’anticorps a été déterminé précédemment par des expériences de préconcentration effectuées sur un instrument SPR pour la détermination du pH optimal pour la greffe de ligand (voir Figure 3). Comme les conditions de greffe changent avec les clones d’anticorps utilisés, il est recommandé de déterminer ces conditions avant de procéder aux expériences SPRi.
    2. Pour la procédure de greffe, ajoutez 300 nL de solution EVs/ligand en utilisant l’observateur.
      REMARQUE: Un morceau de papier immergé dans l’eau doit être conservé dans les puits gauche et droit pour éviter l’évaporation des gouttelettes. Cette étape est importante pour maintenir les VE/ligands dans leurs conditions optimales de stabilité et de fonctionnalité.
    3. Après le repérage, conserver la biopuce sous un bain sonique (fréquence : 37 kHz, puissance : 30 %) pendant une incubation de 30 minutes. Lavez la biopuce par le haut avec de l’eau ultrapure et placez-la délicatement sur un prisme ayant le même indice de réfraction (IR) que la biopuce. Tout en ajustant la biopuce au sommet du prisme, ajoutez une gouttelette (~ 2,3 μL) d’huile avec le même RI que le prisme pour créer une couche mince uniforme entre la biopuce et le prisme.
      Remarque : Cette étape garantit un support continu du même RI dans le chemin optique. Il est important d’éviter d’incorporer des bulles dans la couche d’huile à cette étape, car cela modifierait les propriétés optiques du trajet et entraverait une analyse ultérieure.

Figure 2
Figure 2 : Biopuce et observateur manuel. Biopuce d’or (à gauche), observateur de micropipette (au milieu) et la biopuce après repérage avec des gouttelettes de ligand de 300 nL chacune (à droite). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Tests de préconcentration pour déterminer le pH optimal pour la greffe de ligand. Le sensorgramme présente le niveau d’interaction en fonction du temps pour un ligand injecté aléatoirement (à différentes valeurs de pH) à la même concentration sur 2 min en surface. OG est le détergent, ce qui permet de récupérer la ligne de base entre chaque injection. Ici, le sensorgramme indique que pH 6 a permis le plus de greffes de ligands, avec un signal SPRi de 1091 RU. Abréviations : OG = glucoside d’octyle; EF = unité d’intervention. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

2. Imagerie par résonance plasmonique de surface

  1. Montez la biopuce sur le système SPRi. Maintenir le débit du tampon PBS (tampon courant) à 50 μL/min.
    REMARQUE: S’il y a des bulles, augmenter le débit jusqu’à 500-1 000 μL / min, et injecter 40 mM octyl glucoside (OG) fréquemment pour les enlever dès que possible.
  2. Conditionnement de la biopuce d’or dans l’instrument SPRi : Choix des angles de travail
    1. Cliquez sur le menu déroulant sur le côté gauche du logiciel, puis cliquez sur le répertoire de travail pour définir le dossier dans lequel les données expérimentales doivent être enregistrées. Ensuite, cliquez sur Plasmon | Acquisition d’images.
    2. Recherchez l’image (comme illustré à la figure 4A) où différents points sont visibles, puis cliquez pour sélectionner cette image. Pour définir la région d’intérêt (ROI), telle que représentée à la figure 4, cliquez sur détection automatique ou définition manuelle à l’intérieur des spots (Figure 4B) ou sur la puce pour faire référence à un emplacement spécifique même sans spots (Figure 4C).
    3. Lorsque des biopuces multiplexées sont utilisées, écrivez le nom des familles de ligands, puis cliquez sur les taches correspondantes.
      NOTE: Une famille de ligands correspond à plusieurs taches fonctionnalisées avec le même ligand. Habituellement, la puce présente au moins des doublons et même souvent des triplicates de chaque ligand.
    4. Cliquez sur la définition de l’espèce de finition et attendez d’être dirigé vers la fenêtre contenant les courbes plasmoniques obtenues.
    5. Choisissez un angle de travail. Faites glisser la ligne noire avec le curseur vers l’angle de travail optimal, puis cliquez sur Déplacer le miroir à l’angle de travail.
      REMARQUE: La courbe plasmonique se compose de la valeur de la réflectivité (%) par rapport à l’angle, et le logiciel donne une autre courbe avec la valeur de la pente (%) par rapport à l’angle. Pour sélectionner un bon angle de travail, choisissez l’angle avec la valeur la plus élevée de la pente.
      1. Dans le cas d’une étape de passivation (à cause de l’albumine) effectuée à l’intérieur de l’appareil, sélectionner un angle de travail pour obtenir la sensibilité optimale vers la surface, établissant ainsi un contrôle de qualité de la réactivité de surface.
        REMARQUE : Cette étape de passivation est importante lorsque la puce est préparée pour la biodétection d’affinité/capture afin de réduire les interactions non spécifiques entre l’échantillon et la surface de la biopuce.
  3. Cliquez sur Cinétique pour lancer la surveillance cinétique en temps réel. Une fois que le logiciel invite l’utilisateur à définir le contrôle négatif, choisissez aucun contrôle négatif à ce stade (car cela permettra l’observation de la cinétique sur les points de contrôle négatif ).
    1. Injecter de l’albumine sérique de rat (RSA, 200 μg/mL, préparée dans un tampon d’acétate, pH 4,5) à 50 μL/min pendant 4 min pour passiver la surface autour des taches et éventuellement pour remplir les espaces vides à l’intérieur des taches de ligand.
      REMARQUE: Le RSA est injecté pour couvrir la biopuce, qui n’est liée à aucun ligand.
    2. Injecter de l’éthanolamine (1 M) à 20 μL/ min pendant 10 min pour désactiver les groupes carboxyliques encore présents et réactifs en surface.
    3. Laver la biopuce en injectant 40 mM OG à 50 μL/ min pendant 4 min.
      NOTE: Après l’étape de passivation, l’angle de travail est ajusté (comme une nouvelle détermination de base avant l’injection de l’échantillon) pour être à la sensibilité la plus élevée sur les points d’intérêt.
  4. Injection d’échantillon :
    1. Redéfinissez les courbes plasmoniques après passivation, et choisissez l’angle de travail en fonction du ligand cette fois.
    2. Dans la surveillance cinétique, réduire le débit à 20 μL/min et attendre que la ligne de base soit stable.
    3. Injectez l’échantillon à la concentration de votre choix (de 1 x 10 8 EV/mL à 1 x 10 10 EV/mL selon l’affinité entre les VE et les ligands greffés), puis cliquez sur injection manuelle ou injection automatique. Dans le cas d’une injection manuelle, après injection de 200 μL de l’échantillon, cliquez sur arrêter l’injection. Comme la durée de l’injection est généralement de 10 min, commencer en suivant la cinétique de l’interaction, et mesurer la variation de réflectivité en calculant la différence de réflectivité entre le début et la fin de l’injection observée lors du suivi cinétique (Figure 5).
      REMARQUE : Les différents échantillons qui ont été injectés sont décrits dans la section des résultats représentatifs.
  5. Après l’injection de l’échantillon, suivez l’une de ces deux approches pour terminer l’expérience SPRi :
    1. Dans l’approche non fixée/ dans un liquide, retirer la biopuce de l’appareil SPRi, y ajouter une goutte liquide et procéder à une caractérisation AFM plus poussée de la surface dans un liquide.
    2. Dans l’approche fixe , injecter du glutaraldéhyde (0,5%) dilué dans de l’eau à 20 μL/ min pendant 10 min pour fixer les molécules capturées sur la biopuce. Injectez de l’eau pour rincer la surface, retirez la biopuce, lavez-la très doucement avec de l’eau distillée et séchez-la à l’air libre pour une analyse plus approfondie sous AFM.

Figure 4
Figure 4 : Image CCD SPRi de la biopuce. (A,B) Biopuce multiplexée après passivation de l’albumine. (A) Une puce sans défaut ; (B) quelques défauts apparus sur la puce : fusion de taches (i), greffe faible (ii), poussières ou « contaminants » (iii). Les ROIs, en couleur dans les taches (une couleur par famille de ligands), ont été choisis pour éviter ces « contaminants ». Lorsque les taches fusionnaient, elles étaient notées et ignorées ou nommées comme « mélange de ligands 1 et 2 ». (C) Des puces d’or nues sans microréseaux pour l’expérience examinant l’adsorption des VE sur l’or. La flèche bleue indique la direction de l’écoulement. Cette puce n’a pas présenté de taches, et les ROI ont été choisis pour enregistrer le signal de réflectivité de la ligne 1 (L1, cercles rouges) à la ligne 4 (L4, cercles violets) pendant l’injection de l’échantillon. Barre d’échelle = 1 mm pour les trois images. Abréviations : SPRi = imagerie par résonance plasmonique de surface; CCD = dispositif à couplage de charge; ROI = régions d’intérêt; EVs = vésicules extracellulaires. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Figure 5 : Expériences SPRi d’injection de VE sur une biopuce. (A) Expérience de capture sur une biopuce multiplexée montrant les signaux de réflectivité de différents ligands. Ici, le rapport signal sur bruit pour les différents ligands était très bon (et surtout sur les spots antiCD41) puisque la réponse du témoin négatif était négligeable. (B) Expérience d’adsorption de VE sur une biopuce nue. Sensorgramme présentant le conditionnement de la puce avec deux buffers de tampon et un nettoyage OG (1), avec l’injection d’échantillon EV (2) et le signal de réflectivité après interaction EV (3). Sur cette biopuce, il n’y avait pas de contrôle négatif, mais le signal de réflectivité (sa cinétique, sa stabilité après injection) était élevé, ce qui signifie que ces VE étaient capables de s’adsorber et de rester stables sur la puce d’or. Abréviations : EV = vésicule extracellulaire; OG = octyl glucoside. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

3. Microscopie à force atomique

  1. Utilisez le mode contact pour scanner la biopuce dans l’air et le mode d’imagerie quantitative pour scanner la biopuce dans des conditions liquides.
  2. Alignez la biopuce sur le dessus du masque sur la lame de verre (développée en laboratoire) pour identifier la position des microspots respectifs sur la biopuce (Figure 6A).
    REMARQUE: Le masque contient les marques des taches, qui correspondent aux positions des taches des ligands selon l’observateur utilisé. Ce masque consiste en une lame de verre sur laquelle deux coins perpendiculaires permettent le placement de la puce. De plus, la lame de verre est marquée de 16 points de feutre correspondant à la localisation du spot sur la puce, ce qui permet, par transparence, de localiser les spots et de scanner la zone souhaitée.
  3. Positionnement de la pointe :
    1. Utilisez une caméra CCD au-dessus de l’AFM pour localiser le porte-à-faux au bon endroit qui doit être scanné. Pour suivre ce protocole, utilisez des porte-à-faux triangulaires de 200 μm de longueur, 28 μm de largeur et une constante de ressort de 0,08 N/m.
  4. Alignez le laser sur le dessus du porte-à-faux à une position qui donne une réponse optimale dans le mécanisme de contrôle de rétroaction.
  5. Balayage:
    1. Une fois engagé et en contact avec la surface de la biopuce, commencer l’acquisition AFM en mode contact ou en mode imagerie quantitative de trois à cinq grandes zones (généralement 10 × 10 μm²) à de petites zones (1 x 1 μm²).
      REMARQUE: Une représentation des différentes zones qui peuvent être numérisées est montrée à la figure 6D. S’assurer que la caractérisation AFM est représentative de l’ensemble du point mm² et que suffisamment de VE sont visualisés à une bonne résolution pour une analyse robuste (un minimum de 300 EV comptés et analysés pour chaque condition), et effectuer les mesures métrologiques et morphologiques.
  6. Traitement d’image AFM :
    1. Traitez les images AFM avec le logiciel de traitement de données JPK en sélectionnant d’abord le canal de hauteur.
    2. Choisissez un ajustement polynomial à soustraire de chaque ligne pour obtenir des lignes de balayage redressées.
    3. Sélectionnez le seuil de hauteur sur les grains d’or pour éliminer la rugosité de la surface. Dans le logiciel référencé (voir le tableau des matériaux), dans le module d’extraction des grains, marquez les grains en utilisant une valeur seuil de hauteur à 8,5 nm. Une fois les grains filtrés, le nombre de grains apparaît.
      REMARQUE: Habituellement, le substrat d’or brut (RMS de ~3 nm) et la présence des couches chimiques et ligands nécessitent que le seuil soit fixé à 8,5 nm.
    4. Pour extraire plusieurs propriétés des grains marqués, telles que la hauteur, le volume et le diamètre, ouvrez l’image dans le logiciel référencé et sélectionnez Traitement des données | Céréales | Marquer par seuil.
    5. Choisissez les grains filtrants dans la fonction des propriétés. Lorsqu’une nouvelle fenêtre apparaît, choisissez les paramètres suivants : Valeur = maximum z-max, Surface = surface projetée A0. Ensuite, choisissez les critères A ET B.
    6. Distribution ouverte des grains; Dans la fenêtre qui s’affiche, choisissez Valeur (maximum), Volume (base : zéro) et Limite (longueur). Observez le tableau (au format .txt) qui s’affiche, qui présente trois colonnes avec les valeurs de hauteur, de volume et de diamètre pour tous les grains détectés au seuil défini par image.
    7. À partir de la hauteur, h, et du diamètre, D, calculez le rayon de courbure, Rc, de chaque EV à l’aide de l’équation (1)8, puis calculez le volume, V, à l’aide de l’équation (2) :
      Equation 1(1)
      Equation 2(2)
    8. À partir de V, calculer le diamètre effectif, d eff, de chaque EV (le diamètre d’une sphère de même volume) en utilisant l’équation (3):
      Equation 3(3)
    9. Graphiques de tracé montrant les tailles (hauteur mesurée, diamètre mesuré et diamètre effectif calculé) des VE, chaque particule comptée étant représentée par un point.
      NOTE: Ainsi, à la fin de la caractérisation, la plateforme NBA permet la corrélation du signal de biodétection puis du phénotypage, avec les nombres et les tailles des sous-ensembles EV.

Figure 6
Figure 6 : Caractérisation des biopuces par AFM. Après l’expérience SPRi, la puce a été fixée et séchée ou maintenue dans un liquide pour la caractérisation AFM. (A) La lame de verre usiné (avec deux coins de positionnement perpendiculaires, indiqués par un « w » sur la photo) présentant un masque ajusté à la localisation des 16 puces à puces. Par exposition à la lumière et transparence, une fois installée pour la caractérisation AFM, la lame de verre permet de placer la pointe AFM à l’endroit souhaité pour la caractériser. (B) La biopuce installée sur la lame « masque » et sous une goutte de tampon pour scanner dans des conditions liquides. (C) Image SPRi des 16 puces. (D) Un microréseau imagé par microscopie optique après immunocapture de nanoparticules d’étalonnage biofonctionnalisées de 920 nm de diamètre. Les carrés blancs indiquent l’échantillonnage des différentes zones balayées par AFM dans chaque point d’intérêt pour rendre la caractérisation AFM robuste. Barres d’échelle = (C) 1 mm, (D) 500 μm. Abréviations : AFM = microscopie à force atomique; SPRi = imagerie par résonance plasmonique de surface. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

4. Spectroscopie Raman

REMARQUE: Pour la spectroscopie Raman, remplacez la lame de verre utilisée comme substrat par une lame de CaF2, qui a une signature Raman négligeable.

  1. Conditions optiques pour l’acquisition :
    1. Réglez les conditions suivantes pour le microscope imageur Raman : objectif du microscope : 50x ; longueur d’onde laser : 532 nm ; puissance laser : 10 mW ; temps d’exposition : 500 ms ; nombre d’accumulations : 140 ; gamme spectrale : de 450 cm−1 à 3 200 cm−1.
      REMARQUE: L’utilisation d’une trop grande puissance et / ou d’un temps d’acquisition trop long peut endommager l’échantillon, comme en témoignent des spectres instables au fil du temps. Commencez avec une faible quantité d’énergie et augmentez-la si le signal est trop faible. Des longueurs d’onde laser plus élevées peuvent être utilisées (633 nm, 785 nm) pour réduire la fluorescence préjudiciable aux mesures Raman. Cependant, l’intensité diminue avec la quatrième puissance de la longueur d’onde, et la sensibilité spectrale de la caméra doit être prise en compte.
  2. Imagerie Raman:
    1. Tout d’abord, observez les spectres en direct avec un nombre réduit d’accumulations (10) pour trouver la zone avec le meilleur rapport signal sur bruit.
      REMARQUE: Un signal fort dans la région des hautes fréquences (2 800-3 000 cm-1) peut faciliter la détection des véhicules électriques à la surface avec de faibles temps d’exposition, comme indiqué précédemment10.
    2. Une fois le ROI sélectionné, choisissez la résolution spatiale en fonction du temps disponible pour l’acquisition.
      REMARQUE: La résolution spatiale est limitée par la limite de diffraction (~500 nm).
    3. Démarrez l’acquisition de mappage Raman.
  3. Prétraitement des données :
    1. À l’aide d’un environnement de développement intégré (IDE) Python (par exemple, Spyder), ouvrez le fichier contenant les spectres.
    2. Soustrayez la ligne de base des spectres pour corriger l’interférence de la fluorescence possible. Par exemple, utilisez la fonction « arpls » du paquet « irfpy"23. Testez différentes valeurs du paramètre « lam » pour trouver celle qui donne la meilleure correction de base (généralement entre 103 et 107).
    3. Normaliser les spectres, par exemple, en divisant toutes les intensités d’un spectre par son intensité à 2 900 cm−1 ou en soustrayant la moyenne du spectre, puis en la divisant par son écart-type (normalisation de la variable normale standard).
      REMARQUE: Cette étape est nécessaire pour comparer la composition moléculaire relative des VE.

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Representative Results

Détermination des conditions optimales de pH pour la greffe de ligand
Les différents ligands utilisés pour préparer les biopuces sont testés en fonction du pH et de leur disponibilité à interagir avec la couche chimique thiolate (Figure 3). Les ligands sont dilués dans un tampon acétate à différentes valeurs de pH et injectés sur la biopuce fonctionnalisée chimiquement avec une couche C11C16. Les solutions sont injectées aléatoirement en surface, et un détergent (OG à 40 mM) est injecté après chaque injection de ligand pour récupérer la ligne de base. Ce test de préconcentration permet de déterminer le pH optimal pour chaque greffage de ligand. Dans l’exemple présenté à la figure 3, un pH de 6 a été choisi comme le meilleur pH en termes de pente et de niveau de greffe de ligand.

Images CCD SPRi
Les images CCD SPRi enregistrées sur la biopuce (puces nues, fonctionnalisées chimiquement ou présentant des puces) après insertion dans la machine SPRi sont présentées à la figure 4. Dans le cas de la biopuce présentant un microréseau, l’image a été prise après passivation de l’albumine de la surface. Des doublons ou des triplements de taches ont été systématiquement réalisés sur la puce, et un contrôle négatif était automatiquement également présent sur la puce. Le contrôle négatif consistait principalement en un anticorps non pertinent. Dans SPRi, lorsque la biopuce a été utilisée sans tache - pour l’adsorption sur de l’or nu ou pour greffer directement des véhicules électriques sur une biopuce chimiquement fonctionnalisée - les ROI ont été choisis arbitrairement dans la zone de détection. À titre d’exemple, la figure 4C montre les ROI choisis sur une puce d’or nue avant l’injection de VE.

Grâce à cette image CCD SPRi, il est possible d’ignorer certaines taches si de tels problèmes apparaissent lors de la greffe. L’image CCD SPRi permet également d’estimer l’homogénéité de la greffe à l’intérieur du spot, assure la reproductibilité de la greffe entre différents spots d’un même ligand, et enfin, assure que la biodétection EV se déroule sur des réseaux équivalents en termes de densité de surface.

Résultats SPRi
Lorsque les ROI sont sélectionnés, la ligne de base est stable, ce qui signifie que l’échantillon peut être injecté. La figure 5 montre différents résultats obtenus sur une biopuce multiplexée, révélant un rapport signal/bruit élevé pour certains immunoréseaux (le signal de réflectivité étant de 1,4% sur l’antiCD41 par rapport à la réponse sur le contrôle négatif de 0,02%). La figure 5B présente les résultats de l’adsorption EV obtenus après l’injection de l’échantillon EV sur une puce d’or nue. L’échantillon de N-PEV provenait de plaquettes. La solution est centrifugée à 3 000 × g pendant 15 min à 22 °C ; le surnageant a ensuite été centrifugé à nouveau à 20 000 × g pendant 15 min à 22 °C. Le plomb résultant a été remis en suspension dans le tampon. Les résultats de SPRi obtenus sur des VEP-N immunocapturés ont été comparés aux résultats du transfert Western (WB). La Banque mondiale a révélé une forte expression de CD41, CD62P et CD9 dans ces échantillons, ce qui met en évidence une bonne corrélation avec les résultats de la SPRi (figure supplémentaire S1).

La figure 5B présente les résultats de l’adsorption EV obtenue après l’injection de l’échantillon EV de cellules épithéliales mammaires primaires humaines (HMEC) sur une puce d’or nue. La culture cellulaire HMEC a été centrifugée à 3 650 × g pendant 10 min, puis le surnageant a été centrifugé à nouveau à 10 000 × g pendant 30 min à 4 °C. La pastille résultante a été remise en suspension dans 1x tampon PBS pour la laver, et la centrifugation a été effectuée à nouveau à 10 000 × g pendant 30 minutes à 4 °C. Enfin, la pastille a été suspendue dans 1x tampon PBS.

Caractérisation AFM
Après les expériences SPRi et le chargement de l’EV sur les biopuces (soit par adsorption, greffe ou capture d’affinité), l’AFM a été réalisée en suivant la méthodologie pour scanner de grands scans (10 x 10 μm²) puis (~10 au moins) plus petits (quelques μm²). La figure 7 montre des exemples d’images AFM à grande et à petite échelle de véhicules électriques sur des biopuces.

Figure 7
Figure 7 : Caractérisation AFM des VE sur une biopuce. Images obtenues en mode contact d’un échantillon séché. (A) Un exemple de grande zone de balayage pour donner une vue représentative du retour sur investissement mm² sur la puce. Ce résultat a été obtenu après greffe covalente de VE sur une surface chimiquement modifiée. (B) Un autre exemple de grande zone de balayage obtenue après la capture de VE sur des puces d’immunoréseaux. (C) Une vue plus rapprochée des objets pour obtenir une haute résolution et permettre la métrologie (en hauteur et diamètre) des véhicules électriques. (D) Une vue rapprochée de la biopuce dans l’image en (A) avec une image inclinée 3D. (E) Une vue agrandie d’un gros véhicule électrique adsorbé sur une biopuce en or nue dans une image 3D inclinée. L’échelle Z est (A, B) 30 nm et (C) 20 nm. Barres d’échelle = (A, B) 2 μm, (C) 500 nm. Abréviations : AFM = Microscopie à force atomique; EVs = vésicules extracellulaires. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Analyse de Gwyddion
Le logiciel Gwyddion a été utilisé pour traiter les données de chaque vésicule visualisée sur chaque lot d’images AFM. Tout d’abord, une grande zone (de l’ordre de 10 x 10 μm²) montrant une vue représentative du retour sur investissement en mm² sur la puce a été numérisée. L’image de la figure 7A montre que la surface était densément recouverte d’objets. Dans ce cas, les VE (à partir de lait de vache) ont été injectés à 2,5 × 1010/mL sur une puce activée fonctionnalisée au thiol. Après élimination de la caséine de l’échantillon, les surnageants de lactosérum ont été concentrés par centrifugation à 4 000 × g et 20 °C à l’aide d’unités de filtration centrifuges Amicon 100 kDa, et les VE ont été isolés à l’aide de l’approche par ultracentrifugation à gradient de saccharose. Ce résultat correspond à des VE greffés par covalence sur une surface chimiquement modifiée. La figure 7B montre un autre exemple de grande zone de balayage obtenue après la capture de VE sur des puces d’immunogènes. Ici aussi, des objets étaient présents à la surface mais présentaient une couverture moins dense que lorsque les véhicules électriques ont été greffés de manière covalente sur la puce. Une vue plus rapprochée, à la figure 7C, à plusieurs endroits du retour sur investissement permet une haute résolution et la métrologie (en hauteur et en diamètre) des véhicules électriques. Une autre vue rapprochée (Figure 7D) de la biopuce illustrée à la Figure 7A, avec une image inclinée en 3D, révèle des objets vésicules mais aussi filamenteux (en haut à gauche). En effet, alors que les immunopuces permettent la capture sélective et différentielle de sous-ensembles EV, la greffe covalente greffe tous les objets avec des groupes amines libres présents dans l’échantillon. Dans la figure 7E, AFM révèle un seul gros EV de la culture HMEC adsorbé sur de l’or nu. Ainsi, AFM est capable de révéler des VE petits à grands et de les mesurer et aide à compter le nombre d’objets par mm² en permettant la visualisation de chaque VE.

La hauteur et le diamètre mesurés de chaque VE ont été déterminés, à partir desquels le diamètre effectif a été obtenu. Les hauteurs des véhicules électriques couvraient une plage de 10 nm à 50 nm, avec une moyenne de 15 nm; les diamètres de VE mesurés couvraient une plage de 50 nm à 300 nm, avec une moyenne de 100 nm. Nous avons observé que le diamètre effectif des VE variait de 30 nm à 300 nm, avec une grande majorité autour de 60 nm (Figure 8A). Ces mesures ont été effectuées dans un liquide ou après fixation et séchage. La figure 8B révèle que les résultats obtenus dans ces deux conditions étaient comparables.

Figure 8
Figure 8 : Résultats générés par la caractérisation AFM des VE sur une biopuce. (A) Métrologie des VE en un point (immunoarray antiCD41), déterminée avec un seuil de 8,5 nm et après injection d’un échantillon de VE à 2,5 × 1010/mL. Le « diamètre effectif calculé » est présenté, chaque point correspondant à une particule visualisée sur les images AFM. (B) Histogramme généré à partir des données de (A), montrant la distribution du diamètre effectif des VE. Résultats obtenus à l’air (en rouge : échantillon fixe et séché) et en liquide (en bleu : non fixé). Abréviations : AFM = microscopie à force atomique; EVs = vésicules extracellulaires . Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

L’analyse N-PEV par AFM a été comparée aux résultats de la NTA. Ces derniers résultats « en solution », par NTA, ont montré une distribution des diamètres EV de 32 nm à 650 nm, avec une grande majorité entre 90 nm et 250 nm de diamètre. Ainsi, compte tenu du fait que le NTA n’est pas sensible pour les petites tailles (près de 50 nm), ces mesures AFM montrent une bonne corrélation avec ces résultats (figure supplémentaire S2).

Les expériences Raman, qui ont été réalisées sur des véhicules électriques adsorbés sur une puce nue, ont révélé des résultats encourageants; plus précisément, un spectre clair des VE a été obtenu (figure 9). Les spectres Raman peuvent être séparés en trois plages différentes : la région « empreinte digitale » (inférieure à 1 800 cm−1), qui contient des pics qui forment des motifs moléculaires spécifiques et constitue donc la partie la plus importante à des fins d’identification ; la région « bio-silencieuse » (1 800-2 800 cm−1), qui est généralement écartée lors de l’étude d’échantillons biologiques car elle ne contient pas de pics ; et la région des « hautes fréquences », qui contient principalement des informations sur les lipides et constitue souvent la partie la plus intense du spectre mais moins spécifique. Le spectre montre des pics correspondant principalement aux vibrationsCH2 (2 853 cm−1, 1 444 cm−1 et 130 cm−1), qui sont associées aux lipides de la membrane de l’EV et un pic correspondant à l’acide aminéphénylalanine 21. Un tableau d’affectation des pics Raman des molécules communes présentes dans les VE peut être trouvé dans l’article de Penders et al.22.

Figure 9
Figure 9 : Caractérisation par spectroscopie Raman des VE sur une biopuce. Ici, l’échantillon EV a été dérivé d’une culture HMEC et récupéré par centrifugation à 20 000 × g. (A) Exemple d’une image Raman de véhicules électriques adsorbés sur une biopuce nue (intensité moyenne), superposée à une image en fond clair. (B) Exemple de spectres Raman mesurés des VE. Les lignes pointillées correspondent aux vibrations identifiées. α, scissoring; τ, torsion; υ, étirement (s, symétrique; as, asymétrique). Barre d’échelle = (A) 50 μm. Abréviations : EVs = vésicules extracellulaires. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure supplémentaire S1 : Mesures de l’analyse de suivi des nanoparticules (NTA) des N-PEV. Les VE ont été dilués dans du PBS; les expériences ont été réalisées en triple exemplaire à l’aide d’un instrument MALVERN NS300. Diamètre moyen = 137,5 nm ± 1,3 nm; diamètre du mode = 104,9 nm ± 13,3 nm. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure supplémentaire S2 : Tests Western par transfert de N-PEV. Les N-PEV (1) et (2) correspondent à deux lots de N-PEV préparés à partir de deux poches concentrées de plaquettes. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

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Discussion

Les méthodes récentes d’identification des VE les plus largement utilisées sont l’immunoblot spécifique aux protéines pour confirmer l’origine des VE, la TEM pour confirmer leur structure et la NTA pour quantifier leur nombre et leur distribution granulométrique dans un échantillonde volume 3. Néanmoins, le grand intérêt pour les véhicules électriques dans la recherche (bio)médicale et les limites des outils analytiques existants ont incité la communauté scientifique à développer de nouvelles méthodes de caractérisation, de discrimination et de quantification des véhicules électriques.

La plupart des développements se concentrent sur la combinaison des principes de l’immunomarquage ou de l’immunocapture avec des méthodes physiques avancées pour la détection des VE. Certaines de ces approches se concentrent sur l’identification de VE individuels afin d’obtenir des données fiables au maximum à l’échelle des nano-objets. D’autres sont plus préoccupés par la proposition de méthodes globales abordables et fiables pour un usage clinique.

La plateforme NBA, qui combine la biodétection de VE sur un substrat d’or multiplexé et la caractérisation AFM, permet la qualification profonde des nanovésicules présentes dans des fluides biologiques complexes. En effet, en raison de la sélectivité de la biopuce, des échantillons bruts peuvent être injectés, et la contribution des vésicules peut être mise en évidence.

L’approche proposée consiste à caractériser les VE adsorbés/greffés ou capturés par affinité sur un substrat aurifère brut. L’AFM, qui est classiquement utilisé sur des substrats atomiquement plats, montre toujours des performances optimales sur la puce d’or brute, révélant différentes interfaces micro/nanostructurées.

La biopuce multiplexée présentant plusieurs taches à scanner (jusqu’à 16 jusqu’à présent) et l’approche NBA pour les échantillons fixes et séchés ont été développées pour réduire le temps nécessaire à une enquête AFM profonde et hautement résolue de chaque tache. Différents tests effectués en laboratoire ont montré que cette procédure (fixation, séchage et imagerie dans l’air) n’a pas d’impact significatif sur la métrologie des véhicules électriques.

Il y a deux étapes critiques principales dans l’approche : trouver un compromis pour sélectionner la meilleure sensibilité de la puce pour tous les différents ligands greffés et la dissociation EV du substrat à la fin après l’injection. Ici, une machine SPRi fonctionnant avec un seul angle de résonance a été utilisée, indiquant que le meilleur compromis dans la réponse plasmonique pour toutes les taches de ligands doit être sélectionné. Pour certains ligands, la détection sera très sensible (proche de l’angle optimal) ; Pour d’autres, la détection sera moins sensible si la valeur de l’angle fixe est différente de l’angle optimal. Cela pourrait être surmonté en utilisant la dernière génération d’instrumentation SPRi qui fournit jusqu’à 10 angles de travail différents.

La deuxième étape critique est la dissociation des VE du substrat après injection. Si la dissociation est trop élevée (parce que les VE ne présentent, par exemple, que quelques protéines spécifiques à leur surface), il ne sera pas possible de scanner par la suite à l’aide de l’AFM. Ces situations sont très rares, mais lorsqu’elles se produisent, le débit et la durée d’injection doivent être optimisés pour résoudre le problème.

Une limite de la méthode proposée pourrait être un manque de représentativité de la corrélation entre les observations AFM et la zone mm² des interactions EV sur la biopuce. Pour cela, différentes zones sur place doivent être scannées, y compris des grandes zones aux petites zones et à différents endroits à l’intérieur du spot. Idéalement, l’analyse devrait être effectuée dans la zone de retour sur investissement pour une bonne corrélation entre la caractérisation AFM et la réponse SPRi.

Dans d’autres travaux, les auteurs de cette étude ont utilisé la détection optique et le comptage numérique de VE individuels, qui sont basés sur l’imagerie interférométrique des VE capturés sur un substrat de silicium biofonctionnalisé. Cette technique permet d’estimer la taille des VE en raison du contraste observé. Cette plateforme a ainsi permis, en utilisant les marqueurs abondants CD9, CD63 et CD81, de multiplexer l’analyse et de détecter la présence de VE exprimant un marqueur neuronal, CD171, dans le liquide céphalorachidien chezl’homme24.

Cette approche combinée et sans marquage, assistée par une méthodologie rigoureuse dans la préparation de la biopuce et dans le mode d’acquisition AFM, constitue une méthode de choix pour caractériser les VE par leur capture en temps réel et sous flux dans des échantillons même complexes et bruts. En effet, aucune étape préanalytique avec l’échantillon et aucune étape d’étiquetage ou de démasquage n’est nécessaire dans la méthode présentée. Dans la littérature, Ertsgaard et al. ont révélé différents marqueurs membranaires EV abondants à l’aide d’un capteur d’imagerie à réflectance interférométrique à particules unique (SP-IRIS), mais en mode statique (pas de débit) sans mesures cinétiques, et n’ont donné qu’une estimation de la taille EV25.

Grâce à cette procédure optimisée permettant la préparation de biointerfaces réactives et contrôlées et de biopuces multiplexées passivées, les sous-ensembles de véhicules électriques peuvent être caractérisés en profondeur lorsqu’ils sont injectés sous forme d’échantillons bruts. Ces différents éléments font de cette plate-forme NBA une méthode très pertinente pour l’analyse directe, profonde et résolue des VE dans des échantillons bruts.

La spectroscopie, et en particulier la spectroscopie Raman améliorée en surface (SERS), est en train de devenir une méthode de choix pour l’analyse biochimique des biomarqueurs EV faiblement exprimés. Cette stratégie a permis le développement de tests multiplexés avec des sensibilités de quelques dizaines de VE par μL. L’imagerie SERS couplée à des méthodes de tri (par exemple, la diélectrophorèse) rend possible l’analyse à haut débit de la composition des VE26.

Dans ce travail, les expériences Raman réalisées sur des biopuces d’or ont également été très encourageantes, car un spectre clair de VE a été obtenu, donnant ainsi un aperçu de leur composition moléculaire. Les développements futurs pourraient également inclure le SERS pour augmenter le signal provenant des VE à la surface de la biopuce et la spectroscopie Raman améliorée par pointe (TERS) pour obtenir des images avec une résolution nanométrique, permettant ainsi la caractérisation d’un seul EV.

Des développements récents en laboratoire ont été réalisés pour améliorer la sensibilité de la biodétection et la discrimination entre les sous-ensembles de VE qui coexistent dans un échantillon et co-interagissent potentiellement sur les mêmes réseaux. Pour augmenter la sensibilité, les expériences sont passées au système SPRi, qui permet de sélectionner plusieurs angles pour la détection des véhicules électriques à différents endroits. Pour améliorer la discrimination des sous-ensembles EV, différents défis doivent être relevés: i) obtenir la signature Raman spectroscopique de chaque sous-ensemble EV sur la biopuce, ii) augmenter le nombre de taches identifiées sur la biopuce (de 16 à 100), et iii) augmenter le débit de l’analyse à l’aide de l’AFM à grande vitesse (HS AFM). De plus, HS AFM permettra également la caractérisation de sous-ensembles de véhicules électriques rapidement et dans des conditions liquides.

D’autres points à noter sont que si l’hydrophilie de la biopuce d’or est élevée, il y a un risque que les taches des ligands se chevauchent et se mélangent ensemble (comme le montre la figure 4B). Il est nécessaire d’éviter l’injection de bulles d’air lors de l’injection de solutions sous SPRi, car cela entraînerait des modifications de la réflectivité et contribuerait à une surveillance incorrecte du signal SPRi.

Lors de la numérisation des surfaces avec AFM, il est nécessaire d’observer les images pour vérifier s’il y a des changements drastiques dans la valeur de la somme ou s’il y a des artefacts (par exemple, l’apparence répétitive d’objets). Cela peut être dû à la contamination de la pointe AFM; Dans ce cas, la pointe doit être remplacée.

Il y a quelques limites à la technique que nous avons observée: la sensibilité de la puce choisie pour tous les différents ligands greffés n’étant pas optimale pour tous; la dissociation des VE du substrat à la fin de l’injection; et la résolution inférieure (AFM) de l’imagerie Raman, qui ne permet pas la visualisation des véhicules électriques individuels.

Malgré les limites, ce protocole présente de nombreux avantages significatifs par rapport aux méthodes existantes. La combinaison des méthodes sans marquage (spectroscopie SPRi + AFM + Raman) sur le même substrat puis sur le même échantillon biologique évite les biais entre les analyses dues au substrat et donne une grande originalité et confiance à l’analyse des sous-ensembles EV.

Une telle plate-forme analytique d’ingénierie pourrait aider à la caractérisation des VE dans différents contextes, tels que dans les domaines du diagnostic et de la biothérapie acellulaire et des biofluides du sang aux surnageants cellulaires. En plus de la qualification EV, d’autres nanoobjets (par exemple, complexes moléculaires, nanoparticules synthétiques, virus) peuvent être caractérisés par cette plate-forme analytique multimodale.

Malgré la grande variété de méthodes développées et mises en œuvre dans la communauté des véhicules électriques, chacune de ces techniques a son propre potentiel et ses propres différences de performance en termes de plage dynamique, de précision, de débit et d’application pour l’analyse de paramètres spécifiques des véhicules électriques26. Des approches innovantes, ultrasensibles et en plusieurs étapes (séparation, sélection, signature spectrale et analyse du contenu vésiculeux), telles que cette plateforme analytique multimodale, même lorsqu’elles sont appliquées à de petits volumes sur puces (lab-on-a-chip), offrent de nouvelles perspectives dans le domaine des biopsies liquides, de la biosurveillance et de la médecine de précision.

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Disclosures

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.

Acknowledgments

Kelly Aubertin et Fabien Picot de l’IVETh (Paris) sont reconnus pour les expériences d’imagerie Raman. Thierry Burnouf (Taipei Medical University, Taïwan) et Zuzana Krupova (d’Helincourt, France) sont reconnus pour avoir fourni les échantillons EV dérivés d’échantillons de plaquettes sanguines et de lait bovin, respectivement. Les travaux ont été soutenus par la région Bourgogne Franche-Comté et l’école doctorale EUR EIPHI (projet NOVICE, 2021-2024). Une partie de ce travail a été réalisée à l’aide de la plateforme CLIPP et dans les salles blanches RENATECH de FEMTO-ENGINEERING, pour lesquelles nous remercions Rabah Zeggari.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
CD41a antibody Diaclone SAS (France) 447528
CP920 Microparticles GmbH, Germany 448303
DXR3xi  Thermo Fisher Scientific T1502
EDC Sigma A6272
Ethanolamine Sigma P5368-10PAK
Evs derived from platelet concentrates Collaboration : Pr T. Burnouf (TMU, Taipei) S2889
Evs from bovine milk Collaboration : Dr Z. Krupova (Excilone, Helincourt - France) 3450
Glutaraldehyde Sigma 56845
Gwyddion  853.223.020
Magnetron sputtering PLASSYS SAB5300165
mercapto-1-hexadecanoic acid Sigma G5882
Mercapto-1-undecanol  Sigma O8001
Mountains SPIP ones Digital Surf
NanoWizard 3 Bioscience  Bruker-JPK 
Octyl Glucoside (OG)  Sigma
Ovalbumine antibody Sigma
Phosphate Buffer Saline (PBS) Sigma
Rat Albumin Serum (RSA) Sigma
Sodium acetate buffer  Sigma
SPR-Biacore 3000 GE Healthcare/ Cytiva life sciences
SPRi Biochip MIMENTO technology platform The biochips were produced in-house in the clean room, Besancon
SPRi Plex II Horiba Scientific 
Sulfo-NHS Sigma

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References

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Biologie numéro 193
Plate-forme analytique multimodale sur une puce d’imagerie par résonance plasmonique de surface multiplexée pour l’analyse de sous-ensembles de vésicules extracellulaires
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