Summary
这里提出了一个协议，用于构建一个基于声流体微器件的快速且无损的系统来测量细胞或细胞核的可压缩性。考察了上皮-间充质转化或电离辐射后肿瘤细胞力学性能的变化，证明了该方法在科学研究和临床上的应用前景。
Abstract
细胞力学在肿瘤转移、细胞恶性转化和放射敏感性中起重要作用。在这些过程中，研究细胞的机械性能通常具有挑战性。传统的基于接触的测量方法，如压缩或拉伸，容易造成细胞损伤，影响测量精度和后续细胞培养。贴壁状态下的测量也会影响准确性，尤其是在照射后，因为电离辐射会使细胞变平并增强粘附。在这里，已经开发出一种基于声流体方法的细胞力学测量系统。通过记录细胞在声力作用下的运动轨迹可以获得细胞压缩性，可以实现悬浮状态下的快速无损测量。本文详细介绍了芯片设计、样品制备、轨迹记录、参数提取和分析的协议。基于该方法测量了不同类型肿瘤细胞的压缩性。通过调整压电陶瓷的谐振频率和微通道的宽度，也实现了原子核压缩性的测量。结合免疫荧光实验的分子水平验证，比较药物诱导的上皮到间充质转化（EMT）前后的细胞压缩性。此外，揭示了不同剂量X射线照射后细胞压缩性的变化。本文提出的细胞力学测量方法具有通用性和灵活性，在科学研究和临床实践中具有广阔的应用前景。
Introduction
细胞力学特性在肿瘤转移、细胞恶性转化和放射敏感性中起重要作用1，2。为了深入了解细胞力学性能在上述过程中的作用，准确测量细胞力学至关重要，并且测量不应对细胞造成损害，以便进行后续培养和分析。测量过程应尽可能快，否则如果将细胞长时间从培养环境中取出，可能会影响细胞活力。
现有的电池力学测量方法面临一些局限性。一些方法，如磁扭曲细胞术、磁镊和粒子跟踪微流变学，由于将颗粒引入细胞3，4，5 而引起细胞损伤。通过与细胞接触进行测量的方法，如原子力显微镜（AFM），微量移液器抽吸，微收缩和平行板技术，也容易发生细胞损伤，并且通量难以提高6，7，8。此外，电离辐射会使细胞变平并增加其附着力9;因此，有必要测量悬浮液中的全细胞力学。
针对上述挑战，研制了一种基于声流体方法10、11、12、13、14的细胞力学测量系统。通道宽度与声学半波长相匹配，从而在微通道的中线处创建一个驻波节点。在声辐射力的作用下，细胞或标准珠可以移动到声压节点。由于标准磁珠的物理性质（尺寸、密度和可压缩性）是已知的，因此可以确定声能密度。然后，通过记录细胞在声场中的运动轨迹，可以获得细胞的可压缩性。可以实现悬浮状态细胞的无损高通量测量。本文将介绍微流控芯片的设计、系统的建立和测量步骤。已经对各种类型的肿瘤细胞进行了测量，以验证该方法的准确性。通过调节压电陶瓷的共振频率和微通道的宽度，该方法的应用范围已扩展到亚细胞结构（如细胞核）。此外，还研究了不同剂量药物诱导的EMT或X射线照射后细胞压缩性的变化。结果表明，该方法作为研究生化变化与细胞力学性能之间相关性的有力工具具有广泛的适用性。
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Protocol
1. 声流体微器件的制造与组装
- 微流控芯片的制造。
- 设计一个只有一个入口和出口的单通道芯片，如图 1所示。对于测量单元，将微通道的矩形横截面保持在 740 μm 宽和 100 μm 深。为了测量细胞核，将微通道的宽度和深度分别更改为250μm和100μm。
- 通过反应离子蚀刻 在 硅晶片上制备微通道。通过阳极粘合15用一块透明耐热玻璃密封微通道的顶部。用超声波清洗机清洗芯片10分钟。在50°C的干燥炉中干燥以备后用。
- 制造聚二甲基硅氧烷（PDMS）块。
- 将 30 mL 预聚物加入 100 mm（直径）的玻璃培养皿中。用注射器向预聚物中加入 3 mL 固化剂。
注意：固化剂和预聚物的体积比为1：10。 - 将PDMS预聚物和固化剂与玻璃棒剧烈混合约10分钟。在溶液中寻找小且均匀分离的气泡，这表明PDMS预聚物和固化剂充分混合。
- 将玻璃盘放入真空干燥器中并抽真空15-25秒。重复此过程，直到混合物中没有气泡。
- 将玻璃盘放入设置为50°C的干燥炉中1小时，以使混合物固化。孵育后，使用手术刀将PDMS切成合适大小的块，长约1.2厘米，宽1厘米。
注意：PDMS块的长度与芯片的宽度一致，选择宽度以确保当两个PDMS块粘附在芯片上时，中间有足够的空间供压电陶瓷使用。
- 将 30 mL 预聚物加入 100 mm（直径）的玻璃培养皿中。用注射器向预聚物中加入 3 mL 固化剂。
- 将 PDMS 模块绑定到芯片。
- PDMS 块上的打孔，用于入口和出口，直径为 1 mm 的空心针。将PDMS块和芯片（背面朝上）放入等离子清洁器中1分钟。
- 将 PDMS 模块上的孔与芯片入口和出口对齐。轻轻地将PDMS块按压到芯片上15秒。这应该会导致PDMS块和芯片表面之间发生粘合。
- 将聚四氟乙烯（PTFE）导管连接到芯片（图2B）。
- 切割两根内径为0.8毫米，长度为10厘米的PTFE导管。将内径为 0.7 毫米、长度为 1.5 厘米乘 90° 的不锈钢针弯曲成 L 形。将其连接到导管的一端。用针头准备两个这样的导管。
- 将不锈钢针插入PDMS块的孔中。对于入口，将 19 G 分配针连接到导管的另一端，作为注射器的连接器。
- 完成上述步骤后，注入去离子水以测试整个通道的密封性。不透水意味着良好的密封性。
- 压电陶瓷组件（图2C）
- 使用金刚石线切割机将直径为 2 厘米的压电陶瓷片切割成四条宽度为 5 毫米的条带。
- 确保压电陶瓷的谐振频率与芯片微通道的宽度相匹配。对于 740 μm 和 250 μm 宽的微通道，使用谐振频率分别为 1 MHz 和 3 MHz 的压电陶瓷。
- 一端在压电陶瓷的两侧焊丝。
- 用氰基丙烯酸酯胶将压电陶瓷粘在芯片背面的中间。
- 为了均匀地涂抹胶水，将一滴胶水放在压电陶瓷上，用牙签将胶水平滑并去除多余的胶水。然后，快速将其按压在芯片上并继续按压约1分钟。确保压电陶瓷与芯片牢固结合并均匀接触。
- 安装微设备（图2D）。
- 切一块PDMS（长约1.5厘米，宽约1厘米）作为微器件的底座。使用双面胶带，将底座的一面粘在入口和出口 PDMS 块上，另一面粘在透明载玻片上。将整个微器件固定在显微镜载物台上，以将芯片保持在一个焦平面上。
2. 样品制备
- 聚苯乙烯标准颗粒溶液的制备。
- 将 0.05 mL 聚苯乙烯颗粒（直径 6 μm）溶液 （2.1 x 108 颗粒/ mL） 加入 10 mL 磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 中并充分混合。
注意：为了减少由声能量密度变化引起的测量误差，在每次实验中将聚苯乙烯颗粒溶液与样品溶液混合作为校准。
- 将 0.05 mL 聚苯乙烯颗粒（直径 6 μm）溶液 （2.1 x 108 颗粒/ mL） 加入 10 mL 磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 中并充分混合。
- 细胞悬液的制备。
- 用PBS以90%汇合度（~5 x 105 个细胞）洗涤贴壁细胞（例如MCF7，MDA-MB-231，HCT116）。在室温（25°C）下加入500μL 0.25%胰蛋白酶（1x）1-2分钟。除去胰蛋白酶，加入1 mL完全培养基，并通过移液形成细胞悬液。
- 将细胞悬液以100× g 离心5分钟。除去上清液并重悬于0.5-1mL的PBS中以获得细胞悬液。用血细胞计数器计数细胞，浓度约为3-5×105 个细胞/mL。
- 细胞核悬液的制备
- 执行步骤 2.2。然后，除去上清液，每 20 μL 细胞沉淀（约 500 万个细胞）加入 200 μL 细胞质蛋白提取试剂 A（补充有 1% PMSF）并充分混合。
- 将上述混合物以220× g 涡旋5秒，然后置于冰浴上10分钟。孵育后，向溶液中加入 10 μL 细胞质蛋白提取试剂 B。
- 以 220 x g 涡旋 5 秒。置于冰浴上1分钟，再次以220× g 涡旋5秒。然后，最后在4°C下以1，000× g 离心5分钟。
注意：细胞质蛋白提取试剂A和B的体积比为20：1。 - 除去上清液并将沉淀重悬于1mL PBS中。然后，在4°C下以1，000× g 离心4分钟。除去上清液并重悬于 100 μL PBS 中作为细胞核悬液。
- 向上述细胞核悬浮液中加入台盼蓝，并在室温（25°C）下染色4分钟。台盼蓝溶液与细胞核悬浮液的体积比为1：1。用10倍物镜计算倒置显微镜下的细胞核数。
注意：为了在显微镜下清楚地识别细胞核，需要台盼蓝染色。台盼蓝溶液在使用前需要在37°C水浴中放置10分钟，以便进行有效染色。 - 用PBS缓冲液稀释上述细胞核悬液至2-3 x 105 细胞核/ mL的浓度。通过70μm筛过滤细胞核悬浮液。
3. 测量细胞和细胞核的可压缩性
- 设置测量系统（图3）
- 打开显微镜的光源，打开相机软件。使用4x物镜找到微通道的中间位置，即压电陶瓷的位置。
- 连接导线并分别将它们焊接到压电陶瓷上信号发生器输出的正极和负极。
- 将注射器放在显微注射泵上并将其连接到入口导管。在出口导管的末端放置一个小容器，以保持流出微通道的液体。
- 确定测量参数
- 用注射器吸出聚苯乙烯颗粒溶液并将其注入芯片微通道。避免芯片微通道内出现气泡，确保测量准确。确保颗粒均匀分布在芯片微通道中。
注意：测量可以在没有流量或注射泵的情况下进行。如果需要，应将显微注射泵的流量设置为适当的值。在这里，流速范围为 0-20 μL/h。 - 将信号发生器的输出设置为频率为 1 MHz（细胞核测量为 3 MHz）和峰峰值电压 （Vpp） 为 10 V 的正弦信号。
- 微调信号的频率，直到观察到粒子向微通道的中线移动，并在到达中线后沿中线保持向前运动（图 4）。
注意：粒子向中线移动的速度由电压幅度决定，电压幅度可以在 5 Vpp 和 20 Vpp 之间调节。
- 用注射器吸出聚苯乙烯颗粒溶液并将其注入芯片微通道。避免芯片微通道内出现气泡，确保测量准确。确保颗粒均匀分布在芯片微通道中。
- 测量细胞和细胞核
- 将1mL细胞或细胞核悬浮液与标准颗粒溶液以1：1的比例混合，并用注射器将其注入微通道。
- 当细胞或细胞核进入视野时，开始使用CCD相机进行记录。然后，打开信号发生器。当细胞或细胞核到达中线时停止记录。
- 依次用去离子水、75% 酒精和去离子水冲洗微通道，以备后用。
4. 数据处理
- 映射粒子或细胞轨迹。
- 将捕获的视频导入ImageJ软件： 文件>打开>选择文件夹。单击 ImageJ 软件工具栏中的椭圆形状，选择感兴趣的单元格及其相邻粒子（图 5）。
- 如图5所示，在ImageJ软件中预设测量参数为分析→设置测量→面积、质心、显示标签。
- 以目标细胞或粒子发生纵向位移的帧为起始帧;记录每帧中细胞或粒子的像素位置和大小，直到它到达微通道的中线。将数据导出为电子表格文件并重复该步骤，直到获得所有感兴趣单元格的轨迹。
- 协调转换和校正。
- 将微通道四个角在此视场中的像素坐标记录为（0，y1），（0，y2），（x3，y3），（x4，y4）。这里 x3 = x4。
- 对于每个测量点（xi，yi），使用以下公式计算旋转校正后的新坐标（xi'，yi'）：
- 将像素坐标转换为实际大小坐标。实际坐标可以通过将像素坐标乘以比率来获得。该比率是微通道的实际宽度除以微通道的像素宽度（H）。
- 将步骤4.1中获得的细胞和粒子的像素坐标变换并校正为最终的运动轨迹数据。所有坐标减去左下角的坐标，即 （0， y2）。视频的帧速率为每秒 40 帧，因此将每个坐标对应的帧数乘以 0.025 s 即可得到粒子运动的时间，从而得到 y 方向上的位置随时间的变化。
- 计算声能密度（图6A，B）。
- 细胞或粒子在Y方向上的运动由声力F ac和流体动力FD驱动。使用以下公式计算运动轨迹：
(1)
(2)
(3)
其中 r 和 D 是细胞或粒子的半径和直径， ρ 和 β 是密度和可压缩性，ν是速度矢量。下标 c 和 f 分别表示细胞和液体。 d 是到最近的声压节点的距离， μ 是流体的动态粘度， k 是波数， E 是声能密度。
注：MCF7、HCT116、A549和细胞核的密度分别为1068 kg/m 3、1077 kg/m 3、1073 kg/m 3和1155 kg/m 3，分别为12，16，17。 - 根据步骤4.3.1中描述的公式，使用MATLAB软件以有限差分法得到声场下标准粒子轨迹的数值解。
- 在预设的声场范围内，改变标准粒子的声能密度并拟合数值解（步骤4.3.2获得）和被测运动轨迹（步骤4.2获得）。根据拟合均方误差选择最佳拟合结果。此处获得的声能密度用作后续计算单元可压缩性的参数。
- 细胞或粒子在Y方向上的运动由声力F ac和流体动力FD驱动。使用以下公式计算运动轨迹：
- 计算细胞压缩率（图6C，D）。
- 将声能密度设置为步骤4.3.3中获得的值。
- 根据步骤4.3.1中描述的公式，使用MATLAB软件以有限差分法得到声场下细胞轨迹的数值解。
- 与步骤4.3.3类似，在预设的可压缩性范围内，改变压缩性并拟合数值解（在步骤4.4.2中获得）和测量的单元运动轨迹（在步骤4.2中获得）。使用与最佳拟合结果对应的压缩系数作为测量的单元压缩系数。
(1)
(2)
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Representative Results
本文提出了一种基于声流体微器件的快速无损细胞可压缩性测量系统的构建协议，并展示了其在不同情况下测量细胞和细胞核的优势。 图1 显示了微流体通道的示意图。声流体微器件的组件和组件如图 2所示。 图3 显示了测量系统的设置。在声场力的作用下，细胞和粒子将向微通道的中线移动，如图 4A所示。细胞或颗粒的大小和位置的测量如图 5所示。通过拟合计算能量密度和单元可压缩性如图 6所示。为了将该装置的应用范围扩展到细胞器，特别是细胞核，从细胞中分离出高纯度和完整的细胞核（图7A）。通过相应地调整压电陶瓷的谐振频率和微通道的宽度，获得了原子核的运动轨迹（图4B），并实现了原子核压缩性的测量（图7B）。
基于该系统，测量和比较了不同类型癌细胞的可压缩性（图8A）。此外，还研究了不同剂量的药物诱导EMT或X射线照射后细胞压缩性的变化（图8B，C）。对于EMT诱导，使用生长因子，例如转化生长因子β（TGFβ），表皮生长因子（EGF）和碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）。对于照射，剂量率为153 mU / min，使用的剂量为1，2，4和8 Gy。这些结果表明，该方法作为研究生化变化与细胞力学性能之间相关性的有力工具具有广泛的适用性。最重要的是，这种方法是一种非破坏测量。将测量的细胞收集并接种在细胞培养皿中，发现培养48小时后与未处理组相比，细胞增殖和活力没有显着差异，如图 9所示，表明测量对细胞增殖和存活没有影响。
图 1：芯片微通道示意图。 该图显示了具有单个入口和出口的芯片微通道的结构和尺寸。单位为毫米。 请点击此处查看此图的大图。
图 2：声流体微器件的组装 照片。 （A）芯片的正面和背面照片。（B） 此图像显示了带有 19 G 分配针和不锈钢针头的入口 PTFE 导管。（C）此图像显示了焊接导线的压电陶瓷。（D）该图像显示了带有用于固定的底座的声流体微装置的组装。 请点击此处查看此图的大图。
图 3：单元压缩率测量系统的设置。 该图像显示了由信号发生器、注射泵、声流体微器件、显微镜和CCD相机组成的测量系统的设置。这个数字是从10修改而来的。 请点击此处查看此图的大图。
图4：细胞和细胞核的运动。 该图显示了细胞（A）和细胞核（B）在声场力的作用下向微通道中线的运动。比例尺 = 250 μm。 请点击此处查看此图的大图。
图 5：使用 ImageJ 软件测量细胞或颗粒的大小和位置。 此图显示了在 ImageJ 软件中获取面积和质心等参数的按钮单击。微通道四个角的像素坐标记录为（0，y1），（0，y2），（x3，y3），（x4，y4）。像素宽度表示为H. 请单击此处查看此图的大图。
图 6：通过拟合计算能量密度和单元可压缩性。 （A） 不同能量密度下的均方误差 （LS） 值。从最佳拟合结果中获得声能密度。能量密度的单位是J/m3。（B）该图显示了数值解的拟合和测量的粒子运动轨迹。（C） 不同单元压缩率下的均方误差 （LS） 值。从最佳拟合结果中获得细胞压缩性。（D）该图显示了数值解的拟合和测量的细胞运动轨迹。细胞压缩率的单位是10-10 Pa-1。请点击此处查看此图的大图。
图 7：细胞核提取和压缩性测量。 （A）该图像显示了用40倍物镜观察从A549细胞中提取的细胞核。比例尺 = 20 μm。 （B） 该图像显示了 A549 细胞 （N = 38） 及其细胞核 （N = 45） 的测量压缩性比较。细胞压缩率的单位是10-10 Pa-1。框的长度表示标准偏差。学生的t检验和卡方分析用于评估显著性。**P < 0.01。请点击此处查看此图的大图。
图8：不同类型癌细胞和药物诱导的EMT或X射线照射后细胞的可压缩性。 （A）各种癌细胞的细胞可压缩性。HCT116 （N = 36）、A549 （N = 68） 和 MDA-MB-231 （N = 32） 分别是结直肠癌、肺腺癌和乳腺腺癌的细胞系。（B）MCF7和A549在EMT诱导前后的细胞压缩性。（C）在用不同剂量照射后3小时测量的细胞压缩性。细胞压缩率的单位是10-10 Pa-1。箱线图的结束条分别表示 10% 和 90% 的值。框的长度表示标准偏差。中间水平线表示中值。ns 表示无统计显著性。学生的t检验和卡方分析用于评估显著性。*P < 0.05，**P < 0.01。这个数字的一部分是从18，19修改的。请点击此处查看此图的大图。
图9：压缩性测量后的细胞增殖和活力。 该图显示了压缩性测量后的A549细胞增殖（A）和活力（B）。对照组是未经处理的细胞。测试组是在可压缩性测量后生长48小时的细胞。每个实验至少有三个重复。对于细胞活力，至少计数300个细胞。学生的 t检验和卡方分析用于评估显著性。NS 表示无统计显著性。 请点击此处查看此图的大图。
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Discussion
常用的细胞力学测量方法有AFM、微量移液器抽吸、微流控方法、平行板技术、光学镊子、光学拉伸器和声学方法20。微流体方法可以使用三种方法：微收缩，拉伸流和剪切流。其中，光学担架、光镊、声学方法、拉伸流和剪切流方法都是非接触式测量。与接触式测量相比，非接触式测量可以有效避免接触或局部变形引起的电池损坏问题。光镊对测量环境非常敏感21.光学条件下的扰动会导致测量结果的显着差异，测量过程中的高激光功率也可能导致电池损坏。此外，光学担架和光学镊子通常具有低吞吐量20，22。拉伸流和剪切流等微流体方法不能直接测量肿瘤细胞的微观力学23。与其他方法相比，声学方法在电池力学测量中具有无损、高通量和适用性广等优点。
本文设计的基于声流体微器件的测量方法使用非接触式声辐射力，最大的好处是不损伤细胞，这里显示的实验结果证实了这一点（图9）。该方法的另一个优点是高通量，可以通过改变细胞浓度来调节。目前，在保证后续数据分析精度的前提下，可以达到50-70个细胞/分钟的测量速度。由于细胞是悬浮测量的，因此还可以实现对非贴壁细胞的测量，这扩大了其应用范围。此外，本文还实现了照射后细胞压缩性的测量，并揭示了细胞压缩性与照射剂量之间的关系（图8）。此外，还可以通过调节压电陶瓷的共振频率和微通道的宽度来调整不同刚度的细胞或细胞核的测量。如图 7所示，实现了原子核可压缩性的测量。
在这里，仅考虑细胞沿微流体通道的长度和宽度的运动。细胞被认为是悬浮的，因为细胞的密度接近液体的密度。如果像元沉降或与底部摩擦，则会在随后的轨迹拟合过程中发现。此类数据将被删除。为了验证所提方法的有效性，对两种不同直径（6 μm和10 μm）的聚苯乙烯珠进行了测试。使用直径为6 μm的磁珠作为对照。直径为 10 μm 的磁珠的可压缩性为 2.37 ± 0.11 x 10-10 Pa-1，与另一项研究中报告的值 （2.1-2.4 x 10-10 Pa-1） 一致15，24。
基于该方法，测量了细胞和细胞核的压缩性。由于原子核在机械传感和机械转导中起着重要作用，因此测量原子核的机械性能有助于更好地了解它们如何响应外部刺激，例如电离辐射诱导的DNA损伤（图8）。此外，实验表明，细胞可压缩性可以作为监测EMT过程的新指标（图8），显示了其在癌症诊断中的应用前景。由于声辐射力与细胞大小、细胞密度和可压缩性有关，因此该方法也可用于细胞分离，例如从血液样本中分离循环肿瘤细胞（CTC）或其簇。CTC及其簇在转移性肿瘤的早期发现和放疗效果的监测中起着重要作用25，26。因此，该方法在癌症早期筛查和疗效评价中具有很大的临床应用前景。
值得注意的是，影响该方法测量的关键因素是谐振频率与微通道宽度的匹配，导致在微通道中线出现驻波节点。同时，应注意压电陶瓷的粘贴。此外，为了准确识别和跟踪细胞或颗粒的轨迹，避免由于粘附而导致细胞聚集的问题，通量不宜过高。其他参数（如像元大小、像元密度等）的变化如何影响可压缩性的测量已在以前的工作中进行了研究18.而且，在测量细胞核时，由于它们的柔软性，需要较大的声辐射驱动力才能使它们平稳地移动到微通道的中线，因此需要快速相机来准确捕捉轨迹。
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Disclosures
作者没有相互竞争的经济利益或其他利益冲突。
Acknowledgments
本研究得到了中国国家自然科学基金（批准号12075330和U1932165）和中国广东省自然科学基金（批准号2020A1515010270）的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% trypsin(1x) | GIBCO | 15050-065 | |
| 502 glue | Evo-bond | cyanoacrylate glue | |
| A549 | ATCC | CCL-185 | lung adenocarcinoma |
| Cytonucleoprotein and cytoplasmic protein extraction kit | Beyotime | P0027 | Contains cytoplasmic protein extraction reagents A and B |
| Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM) | corning | 10-013-CVRC | |
| Fetal Bovine Srum(FBS) | AUSGENEX | FBS500-S | |
| HCT116 | ATCC | CCL247 | colorectal carcinoma |
| Heat-resistant glass | Pyrex | ||
| Leibovitz’s L-15 medium | GIBCO | 11415-064 | |
| MCF-7 | ATCC | HTB-22 | breast Adenocarcinoma |
| MDA-MB-231 | ATCC | HTB-26 | breast Adenocarcinoma |
| Minimum Essential Medium (MEM) | corning | 10-010-CV | |
| Penicillin-Streptomycin | GIBCO | 15140-122 | |
| Phosphate buffer | corning | 21-040-cvc | |
| PMSF | Beyotime | ST506 | 100mM |
| Polybead Polystyrene Red Dyed Microsphere | polysciences | 15714 | The diameter of microshpere is 6.00µm |
| propidium iodide(PI) | Sigma-Aldrich | P4170 | |
| SYLGARD 184Silicone ELASTOMER | Dow-Corning | 1673921 | Contains prepolymers and curing agents |
| Trypan Blue | Beyotime | C0011 |
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