Dette manuskript beskriver en metode til screening af moderat størrelse Candida albicans mutantbiblioteker for morfogenesefænotyper under aktiv infektion i en pattedyrsvært ved hjælp af ikke-invasiv konfokal mikroskopi.
Candida albicans er et vigtigt humant patogen. Dens evne til at skifte mellem morfologiske former er central for dens patogenese; Disse morfologiske ændringer reguleres af et komplekst signalnetværk, der styres som reaktion på miljømæssige stimuli. Disse regulatoriske komponenter er blevet stærkt undersøgt, men næsten alle undersøgelser bruger en række in vitro-stimuli til at udløse filamentering. For at bestemme, hvordan morfogenese reguleres under patogeneseprocessen, udviklede vi et in vivo-mikroskopisystem for at opnå billeder med høj rumlig opløsning af organismer, der gennemgår hyphaldannelse i pattedyrsværten. Protokollen, der præsenteres her, beskriver brugen af dette system til at screene små samlinger af C. albicans mutante stammer, så vi kan identificere nøgleregulatorer af morfogenese, som det forekommer på infektionsstedet. Repræsentative resultater præsenteres, hvilket viser, at nogle regulatorer af morfogenese, såsom transkriptionsregulatoren Efg1, har konsistente fænotyper in vitro og in vivo, mens andre regulatorer, såsom adenylcyklase (Cyr1), har signifikant forskellige fænotyper in vivo sammenlignet med in vitro.
Candida albicans er et almindeligt humant svampepatogen, der forårsager mucokutan sygdom, dissemineret sygdom og lokaliserede vævsinfektioner1. Et centralt træk ved C. albicans fysiologi er dens komplekse polymorfe vækst, som er knyttet til dens rolle som både en kommensal og et patogen 2,3,4. Under rige næringsstofforhold in vitro ved 30 °C vokser den typisk som en ovoid spirende gær. En række miljømæssige udløsere, herunder næringsstofmangel, pH-ændringer, vækst ved 37 °C, eksponering for serum og vækst, når de er indlejret i agar, resulterer i overgangen til et polariseret vækstmønster, hvilket resulterer i dannelse af ægte hyfer og / eller pseudohyphae5. Initieringen af polariseret vækst og den resulterende vækst af filamentøse organismer kaldes morfogenese.
På grund af betydningen af morfogenese i organismens virulens er reguleringen af hyphaldannelse blevet grundigt undersøgt 6,7. Der er et komplekst netværk af signalveje og transkriptionel regulering, der udløser morfogenese. På trods af forholdet mellem C. albicans morfogenese og patogenese har de fleste undersøgelser, der undersøger morfogenese, brugt in vitro-stimuli til at udløse hyphaldannelse. Det bliver mere og mere klart, at de forskellige in vitro-modeller for filamentering ikke er identiske med hensyn til de enkelte reguleringsveje, der stimuleres. Desuden svarer ingen in vitro-vækstbetingelser tæt til værtens komplekse miljø. I betragtning af betydningen af C. albicans som et humant patogen er målet med denne protokol at undersøge dets morfogenese under aktiv infektion i en pattedyrvært ved hjælp af et system med moderat gennemstrømning, hvilket gør det muligt for en efterforsker at screene C. albicans mutantbiblioteker.
For at lette disse undersøgelser blev der udviklet et in vivo-billeddannelsessystem, der giver os mulighed for at opnå billeder med høj rumlig opløsning af C. albicans-celler under infektion af pinna fra en bedøvet mus ved hjælp af et omvendt konfokalt mikroskop 8,9,10. Fordi pinnaens hud er ret tynd, kan disse billeder opnås uden behov for vævsdissektion. Således kan kvantitative fænotypedata måles på stedet for aktive infektioner i værtsvævet. Den her beskrevne protokol indebærer omdannelse af en referencestamme og en eller flere mutante stammer med forskellige fluorescerende proteinekspressionskassetter11,12. De fluorescerende proteinekspressive stammer blandes derefter og co-injiceres intradermalt. Efter at infektionen er etableret, anvendes konfokal billeddannelse til at kvantificere både hyppigheden af filamentering og længden af de dannede filamenter. De data, der opnås fra de mutante stammer, normaliseres til dem, der opnås fra referencestammen, som er til stede i samme vævsområde, hvilket giver en intern kontrol. Dette system har gjort det muligt for os med succes at screene flere serier af C. albicans mutantstammer, hvoraf mange har morfogenesefejl in vitro 9,10. Mange af disse stammer filament let in vivo, hvilket fremhæver betydningen af in vivo-modeller til undersøgelse af morfogenese.
Denne model bruger konfokal mikroskopi til at opnå billeder af C. albicans organismer, når de vokser i vævet hos en pattedyrsvært, hvilket giver os mulighed for at evaluere morfogenesefænotyper under aktiv infektion. Morfogeneseprocessen er central for C. albicans patogenese og er blevet bredt undersøgt ved hjælp af en række in vitro-assays 2,3,4. Imidlertid kan intet in vitro-assay fuldt ud modellere værtens komplekse biokemiske og strukturelle miljø.
Protokollen beskrevet her er fokuseret på brugen af dette in vivo-billeddannelsessystem til at screene en serie / bibliotek af C. albicans mutanter for at identificere de gener, der er involveret i morfogenese under infektion. Brugen af C. albicans stammer, der udtrykker forskellige fluorescerende proteiner, giver os mulighed for at kvantificere in vivo morfogenese af C. albicans mutante stammer sammenlignet med en referencestamme. Sammenligning af morfogenese i mutanten med referencestammen inden for samme infektionsområde sikrer, at organismerne udsættes for identiske miljøer. Dette giver mulighed for kvantitativ måling af procentdelen af celler, der gennemgår filamentering, samt omfanget af filamentering. Normalisering af målingerne af mutantstammen/mutantstammerne til målingerne af referencestammen giver os mulighed for bedre at sammenligne en mutants ydeevne med en anden.
De repræsentative resultater, der præsenteres her, viser potentialet for en betydelig uoverensstemmelse mellem in vitro- og in vivo-fænotyper. C. albicans efg1ΔΔ mutant stamme bruges ofte som en negativ kontrol for morfogenese assays, da den ikke filament i næsten alle in vitro betingelser20. Selv om in vivo-resultaterne var meget lig in vitro-resultaterne, dannede selv denne stærkt hæmmede stamme lejlighedsvis filamenter i værtsvævsmiljøet (figur 3). Dette understreger værtsmiljøets styrke ved at udløse morfogenese.
I modsætning hertil viser cyr1ΔΔ mutantstammen en betydelig uoverensstemmelse mellem in vitro og in vivo vækst; selvom ingen af de mutante celler gennemgår filamentation in vitro, vokser ca. halvdelen af cellerne som filamenter in vivo (figur 4)10,21. Interessant nok var disse filamenter signifikant kortere end dem, der blev dannet af referencestammen, hvilket tyder på, at CYR1 bidrager til enten filamentvæksthastigheden eller evnen til at opretholde en filamentøs fænotype. For at lette analysen af filamentlængden blev filamenternes kurvebanelængde målt ved hjælp af en todimensionel projektion af billederne. I todimensionale fremskrivninger af filamenter, der vokser i tre dimensioner, vil ethvert filament, der vokser på en akse, der ikke er parallelt med xy-planet, projicere som kortere end dets sande længde. Da denne forkortning også forekommer for referencestammen, tillader evaluering af fordelingen af filamentlængder i en todimensionel projektion stadig en kvantitativ sammenligning mellem reference- og mutantstammerne. Analyse af filamentlængde i to snarere end tre dimensioner kræver mindre intensiv billedanalyse; Således kan det udføres relativt hurtigt på en typisk stationær computer. Brug af denne enklere analyse gør det muligt at inkludere filamentlængdefordeling som en del af en screeningsprotokol, hvilket giver en mere nuanceret forståelse af hver mutants evne til at gennemgå morfogenese uden at forårsage væsentlige forsinkelser i gennemstrømningen.
De repræsentative undersøgelser, der præsenteres her, blev udført ved hjælp af DBA2/N-mus, som har en defekt i deres komplementsystem, der forårsager manglende rekruttering af neutrofiler til stedet for C. albicans-infektion 22. Målet med disse undersøgelser var at undersøge mekanismer til regulering af C. albicans filamentation i værtsvævet. Derfor blev DBA2/N-mus brugt til at undgå at forvirre resultaterne på grund af en individuel stammes modtagelighed eller resistens over for neutrofiler. Da det neutrofile anti-C. albicans-respons kan påvirke filamentation23, kan neutrofilrekruttering til infektionsstedet påvirke resultaterne af et morfogeneseassay. Hvis en stamme er i stand til at filamentere in vivo , men hæmmes kraftigt fra filamentering, når neutrofiler er til stede, vil filamentation blive påvist i DBA2/N-mus, men det vil sandsynligvis ikke ses, når mus med intakt neutrofil kemotaxis anvendes. Således er belastningen af musen, der bruges som vært, en vigtig faktor, når du bruger denne protokol.
Observationen af, at efg1ΔΔ-mutantstammen ikke filamenterer in vivo , er sandsynligvis ikke relateret til værtsneutrofile reaktioner, fordi denne stamme heller ikke filamenterer in vitro. Filamentationen, der observeres in vivo med cyr1ΔΔ-stammen, er uoverensstemmende med dens manglende filamentation in vitro. Data fra zebrafiskmodellen af C. albicans infektion indikerer, at reagerende neutrofiler er vigtige i forebyggelsen af morfogenese24. Derfor er det usandsynligt, at brugen af DBA2/N-mus, som mangler neutrofilresponser, vil forklare stigningen i filamentation af cyr1ΔΔ in vivo sammenlignet med in vitro. Ikke desto mindre påvirker in vivo-miljøet klart morfogenesen af cyr1ΔΔ-stammen; yderligere undersøgelse af denne stamme kan således give vigtige oplysninger om reguleringen af C. albicans morfogenese under aktive infektioner. Protokollen, der er beskrevet her, er designet som et screeningsassay for at identificere stammer såsom cyr1ΔΔ-stammen, der skal bruges i fremtidige undersøgelser.
Brugen af et lavstrømsgasbedøvelsessystem er meget nyttigt for denne protokol (figur 1A, B). Under den indledende udvikling af denne protokol blev mus bedøvet ved hjælp af en injicerbar bedøvelsescocktail af ketamin blandet med xylazin. Mens det var muligt at udføre begrænset billeddannelse med den bedøvelsesmetode, var varigheden af anæstesi uforudsigelig, hvilket krævede, at billeddannelsessessioner blev afsluttet hurtigt for at undgå, at musen kom sig efter anæstesi under billeddannelse. Traditionelle inhalerede bedøvelsessystemer er omfangsrige og kræver høje strømningshastigheder af bedøvelsesgasser, hvilket ofte kræver, at de bruges i en røghætte. Således ville traditionelle inhalerede bedøvelsessystemer være meget vanskelige at bruge med pladsbegrænsningerne i et konfokalmikroskop uden utilsigtet at udsætte efterforskerne for bedøvelsesmidlerne. Brugen af et inhaleret bedøvelsessystem med lav strømning muliggør ensartet anæstesi af dyret, samtidig med at der opretholdes et sikkert miljø for efterforskeren. Den lavstrøms næsekegle muliggør nem positionering af dyret til både podning og mikroskopi. Den lille kaliber, lavvolumen leveringsrør tillader brug af relativt lange rør, hvilket gør det muligt at placere anæstesimaskinen i en tilstrækkelig afstand for ikke at forstyrre mikroskopi.
Klorofyl til stede i typisk musechow fører til signifikant vævsautofluorescens25. Dette skaber betydelig støj i billederne, hvilket gør det vanskeligt at få billeder af høj kvalitet og høj rumlig opløsning. Når dyr blev fodret med klorofylfri chow i 7 dage før billeddannelse, blev baggrunden fra autofluorescens væsentligt reduceret i væv, men klorofyl deponeret i håret fortsatte med at være problematisk. Fjernelse af håret på pinnae ved hjælp af en over-the-counter kemisk hårfjerningscreme er effektiv til at minimere autofluorescens i håret (figur 1C, D). Således reducerede kombinationen af klorofylfri chow og tilstrækkelig hårfjerning væsentligt autofluorescens og forbedrede billedkvaliteten dramatisk. Fordi håret fjernes fra øret inden billeddannelse, påvirker farven på dyrets hår ikke dette system. Denne protokol er blevet brugt med succes til at studere C. albicans infektioner i BALB / c (hvid), C57BL / 6 (sort) og DBA2 / N (brun) mus. Protokollen kan også bruges med C57BL/6 knockout-mus, der mangler forskellige værtsgener; Dette vil muliggøre fremtidige undersøgelser af, hvordan pattedyrets værtsimmunsystem påvirker filamentering. Et træk ved denne model, der ikke er diskuteret i denne protokol, er, at fordi dette billeddannelsessystem er ikke-invasivt, kan det samme dyr afbildes gentagne gange over flere dage, hvilket gør det muligt at følge udviklingen af individuel infektion over tid. Denne funktion vil sandsynligvis spille en central rolle i fremtidige undersøgelser af værtspatogeninteraktionen.
Sammenfattende resulterer denne protokol i billeder med høj rumlig opløsning af C. albicans, der vokser i vævet hos en levende pattedyrvært, hvilket muliggør nøjagtig evaluering af morfogenese i mutante stammer 8,9,10. Resultaterne, der præsenteres her, viser, hvordan denne protokol kan bruges til at screene et bibliotek af C. albicans mutanter. Af de C. albicans mutanter, der er testet til dato, gennemgår en stor del af mutanter med kendte defekter i morfogenese in vitro let filamentation in vivo 9,10. Dette understreger vigtigheden af at inkludere et in vivo-system som dette i eksperimenter designet til at belyse mekanismerne i C. albicans patogenese.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af NIH-tilskud 1R01AI33409 og Institut for Pædiatri, Carver College of Medicine, University of Iowa.
#1.5 coverslips | Thermo-Fisher | 20811 | large enough to cover the universal stage opening |
0.1 mL Insulin syringes | EXELint | 26018 | Can use syringes that are 5/16"–1/2" long and 29–32 G |
3.7% formaldehyde in dPBS | Sigma-Aldrich | SHBJ5734 | |
70% Ethanol/30% water | Decon Laboratories | A05061001A | |
Alcohol prep pads | Covidien | 5110 | Alternative: gauze pads soaked in 70% isopropyl alcohol |
C.albicans reference strain and experimental strains | SN250 | FGSC Online Catalog | The specific C. albicans strain varies with experiment and the investigators goals. We have used strains derived from SC5314 as well as other clinical isolates. |
Chlorophyl free mouse chow | Envigo | 2920x | |
Computer | Dell | Optiplex 7050 | Computer that can run imaging software for acquisition and for analysis of images. A variety of imaging software is available and varies with the specific microscope and user system. |
Cotton tip applicator | Pro Advantage | 76200 | |
DBA2/N (6-12 week old mice) | BALB/c and C57/BL6 mice can also be used. The latter allow for the use of widely available knockout mouse models as well as mouse models in which individual cell types, such as phagocytes, are identified by their expression of fluorescent proteins. | ||
Double sided tape designed to hold fabric to skin (fashion tape) | local pharmacy or grocery store | Double sided adhesive tape designed for keeping clothing in place over human skin. This is typically available over the counter in pharmacies and variety stores. It is important to use this type of tape as it is designed for gentle adherence to skin. Examples: https://www.amazon.com/Womens-Fashion-Clothing-Transparent-Suitable/dp/B08S3TWR3H/ref=sr_1_40?crid=2UWFL8FMFAKGM&keywords =fashion+tape&qid=1649174406&sprefix= fashion+tape%2Caps%2C70&sr=8-40 https://www.amazon.com/Fearless-Tape-Sensitive-Clothing-Transparent/dp/B07QY8V5XT/ref=sr_1_26?crid=2UWFL8FMFAKGM&keywords =fashion+tape&qid=1649174320&sprefix= fashion+tape%2Caps%2C70&sr=8-26 https://www.amazon.com/Hollywood-Fashion-Secrets-Tape-Floral/dp/B009RX77MK/ref=sr_1_29?crid=2UWFL8FMFAKGM&keywords =fashion+tape&qid=1649174406&sprefix= fashion+tape%2Caps%2C70&sr=8-29 |
|
Dulbecco's phosphate buffered saline | Gibco / Thermo-Fisher | 14190-144 | Must be sterile; open a new container for every experiment |
Fetal bovine serum | Gibco / Thermo-Fisher | 26140-079 | |
Gauze pad | Pro Advantage | P157112 | |
Gel eye lurbicant | local pharmacy or grocery store | ||
ImageJ or FIJI analysis software | NIH | ImageJ (FIJI) | |
Isoflurane | Akorn | J119005 | |
Leica DMi8 (SP8 platform) with Leica 11506375 objective lens | Leica | DMi8 (SP8) | The objective lens (Leica 11506375) used here is a 25x water immersion lens to allow us to have a high NA (0.95) while approximating the refractive index of the ear tissue. The microscope (Leica DMi8 (SP8 platform) has 488 nm and 638 nm diode laser lines and is equipped with filter-free spectral detection with computer controlled adjustable bandwidth for detection of emission light. The stage must have enough clearance to allow the objective to reach the bottom coverslip without hitting the stage. |
Low-flow anesthesia system or traditional anesthesia vaporizer | Kent Scientific International | SomnoSuite | |
Nair hair remover lotion | local pharmacy or grocery store | Over the counter depilatory cream | |
Nourseothricin | Jena Bioscience | AB-101L | |
pENO1-NEON-NATR pENO1-iRFP-NATR plasmids | Fluorescent protein expression transformation constructs generously given to us by Dr. Robert Wheeler (Seman, et al., 2018, Infection and Immunity; Bergeron, et al., 2017, Infection and Immunity) | ||
Pressure sensitive laboratory tape | Tape & Label Graphic Systems Inc | 1007910 | |
RPMI1640 cell culture medium | Gibco / Thermo-Fisher | 11875-093 | |
Thimble, plastic 15 mL conical tube, or Falcon 5 mL round bottom polystyrene tubes | Falcon | 352196 | To safely hold the animals ear during injectinos |