Summary
이 원고는 비침습적 공초점 현미경을 사용하여 포유류 숙주에서 활성 감염 동안 형태 형성 표현형에 대해 중간 크기의 칸 디다 알비칸스 돌연변이 라이브러리를 스크리닝하는 방법을 설명합니다.
Abstract
칸디다 알비 칸스는 중요한 인간 병원체입니다. 형태 학적 형태 사이를 전환하는 능력은 발병 기전의 핵심입니다. 이러한 형태학적 변화는 환경 자극에 반응하여 제어되는 복잡한 신호 네트워크에 의해 조절됩니다. 이러한 조절 성분은 고도로 연구되었지만 거의 모든 연구에서 다양한 체외 자극을 사용하여 필라멘트를 유발합니다. 병인 과정에서 형태 형성이 어떻게 조절되는지 확인하기 위해 우리는 포유류 숙주 내에서 균사 형성을 겪는 유기체의 높은 공간 해상도 이미지를 얻기 위해 생체 내 현미경 시스템을 개발했습니다. 여기에 제시된 프로토콜은 이 시스템을 사용하여 C. albicans의 돌연변이 균주의 작은 컬렉션을 스크리닝하여 감염 부위에서 발생하는 형태 형성의 주요 조절자를 식별할 수 있도록 하는 방법을 설명합니다. 대표적인 결과가 제시되어 전사 조절자 Efg1과 같은 형태 형성의 일부 조절자가 시험관 내 및 생체 내에서 일관된 표현형을 갖는 반면, 아데닐 사이클라제(Cyr1)와 같은 다른 조절자는 시험관 내와 비교하여 생체 내에서 상당히 다른 표현형을 갖는다는 것을 보여줍니다.
Introduction
칸디다 알비칸스는 점막 피부 질환, 파종성 질환 및 국소 조직 감염을 일으키는 일반적인 인간 곰팡이 병원체입니다1. C. albicans의 주요 특징은 복잡한 다형성 성장이며, 이는 공생 및 병원체 2,3,4로서의 역할과 관련이 있습니다. 30°C에서 시험관내 풍부한 영양 조건 하에서, 전형적으로 난형 출아 효모로서 성장한다. 영양소 결핍, pH 변화, 37°C에서의 성장, 혈청 노출 및 한천에 매립될 때의 성장을 포함한 다양한 환경 유발 요인은 분극화된 성장 패턴으로 전환하여 진정한 균사 및/또는 가성 균사5의 형성을 초래합니다. 분극화 된 성장의 시작과 그에 따른 사상 유기체의 성장을 형태 형성이라고합니다.
유기체의 독성에서 형태 형성의 중요성 때문에 균사 형성의 조절이 광범위하게 연구되었습니다 6,7. 형태 형성을 유발하는 신호 전달 경로와 전사 조절의 복잡한 네트워크가 있습니다. C. albicans의 형태 형성과 병인의 관계에도 불구하고, 형태 형성을 조사하는 대부분의 연구는 균사 형성을 유발하기 위해 시험관 내 자극을 사용했습니다. 필라멘트의 다양한 시험관 내 모델이 자극 된 개별 조절 경로의 관점에서 동일하지 않다는 것이 점점 더 분명 해지고 있습니다. 또한, 시험관 내 성장 조건은 숙주의 복잡한 환경과 밀접하게 일치하지 않습니다. 인간 병원체로서 C. albicans의 중요성을 감안할 때, 이 프로토콜의 목표는 중간 처리량의 시스템을 사용하여 포유류 숙주에서 활성 감염 중 형태 형성을 조사하여 조사자가 C. albicans의 돌연변이 라이브러리를 스크리닝할 수 있도록 하는 것입니다.
이러한 조사를 용이하게하기 위해 도 립 컨 포칼 현미경 8,9,10을 사용하여 마취 된 마우스의 귓바퀴에 감염되는 동안 C. albicans 세포의 높은 공간 해상도 이미지를 얻을 수있는 생체 내 이미징 시스템이 개발되었습니다. 귓바퀴의 피부는 매우 얇기 때문에 조직 해부 없이 이러한 이미지를 얻을 수 있습니다. 따라서, 정량적 표현형 데이터는 숙주 조직 내의 활성 감염 부위에서 측정될 수 있다. 여기에 설명된 프로토콜은 기준 균주 및 하나 이상의 돌연변이 균주를 상이한 형광 단백질 발현 카세트(11,12)로 형질전환시키는 것을 포함한다. 형광 단백질 발현 균주는 혼합되고 피내 동시 주사됩니다. 감염이 확립 된 후, 컨 포칼 이미징은 필라멘트의 빈도와 형성된 필라멘트의 길이를 정량화하는 데 사용됩니다. 돌연변이 균주로부터 수득된 데이터는 동일한 조직 영역에 존재하는 기준 균주로부터 수득된 것으로 정규화되어, 내부 대조군을 제공한다. 이 시스템을 통해 우리는 여러 일련의 C. albicans 돌연변이 균주를 성공적으로 스크리닝 할 수 있었으며, 그 중 다수는 시험관 내 9,10에서 형태 형성 결함을 가지고 있습니다. 이러한 균주의 대부분은 생체 내에서 쉽게 필라멘트되며, 형태 형성 조사를 위한 생체 내 모델의 중요성을 강조합니다.
Protocol
이 프로토콜의 연구는 아이오와 대학 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)의 승인을 받았습니다. BSL2 유기체 작업을 위한 장비 및 절차에 대한 CDC 지침을 참조하십시오13.
1. 칸 디다 알비칸스 균주 준비
- 양성 대조군으로 사용하기 위한 적절한 기준 균주를 식별합니다. 이 균주가 혈통 및 유전자 조작 측면에서 실험 균주와 밀접하게 일치하는지 확인하십시오.
참고: 여기에 제시된 대표적인 실험을 위해, 돌연변이체는 SN152로부터 구축된 Homann, et al.14에 기술된 균주로부터 생성되었다. 이 돌연변이는 Arg-입니다. 따라서, 선택된 기준 균주는 SN250이었고, 이는 또한 SN152로부터 생성되었고 또한 Arg-이다. 영양 스트레스 요인은 효모 사카로마이세스 세레비시아에15; 그들은 또한 C. albicans와 다른 곰팡이16,17,18의 필라멘트와 관련이 있습니다. 따라서 영양 스트레스로 인한 잠재적인 교란 효과를 피하기 위해 가능할 때마다 영양 요구성 균주와 실험 균주를 기준 균주와 일치시켜야 합니다. - 형광 단백질 발현 구조체를 선택합니다. 다양한 실험 균주를 스크리닝할 때 하나의 형광 단백질을 발현하는 기준 균주를 만들고 다른 형광 단백질을 사용하여 돌연변이 균주를 표시합니다.
참고: 여기에 제시된 대표적인 데이터는 참조 균주에 대해 NEON을 사용하고 돌연변이 균주에 대해 iRFP를 사용합니다. 모든 형광 단백질은 발현이 높고 상대적으로 밝으며 사용되는 현미경으로 여기/감지할 수 있는 경우 사용할 수 있습니다. 상이한 형광 단백질을 발현하는 기준 균주를 비교하는 대조 실험은 형태형성에 대한 형광 단백질 발현의 어떠한 영향도 입증하지 않았다. - 균주를 형광 단백질 발현 작제물로 형질전환시킨다.
알림: 많은 기관에서는 C. albicans와 함께 작업하기 위해 생물학적 안전 레벨 2 예방 조치를 사용하도록 요구합니다. 모든 작업은 현지 안전 규정을 따라야합니다. 현지 규정에 관계없이 C. albicans 와 함께 일하는 조사관은 유기체의 안전한 취급에 대한 교육을 받아야합니다.- 표준 리튬 아세테이트 프로토콜을 사용하여 기준 및 실험 균주를 변형시킨다19.
참고 : 여기에 설명 된 실험은 Robert Wheeler 박사 11,12가 관대하게 제공 한 pENO1-NEON-NAT R 및 pENO1-iRFP-NATR 플라스미드를 사용합니다. 플라스미드는 NotI9를 사용하여 선형화하였다. - 누르세오트리신 또는 다른 관련 선택 배지 상의 성장에 기초하여 형질전환체를 선택한다.
- 성공적인 형질전환체를 식별합니다. 이쑤시개를 사용하여 각 콜로니에서 작은 세포 덩어리를 선택한 다음 현미경 슬라이드에서 2.5μL의 물방울로 혼합합니다. 커버슬립을 적용하고 10x-40x 배율로 검사합니다. 컨포칼 이미징 시스템(프로토콜의 나머지 부분에 사용됨) 또는 표준 광시야 형광 현미경으로 검사합니다. 적절한 형질전환체는 적절한 여기 및 방출 파장을 갖는 밝은 신호를 가질 것이다.
참고: 대표적인 결과를 위해 NEON 발현 균주는 472/30nm 대역통과 여기 필터, 520/35nm 대역통과 방출 필터 및 495nm 단일 에지 이색성 빔 스플리터가 있는 장통과 필터 세트가 있는 정립 형광 현미경을 사용하여 시각화되었습니다. iRFP는 눈으로 볼 수 없기 때문에 iRFP 발현 균주는 생체 내 이미징에 사용되는 컨포칼 현미경 시스템을 사용하여 시각화하고 여기에는 638nm 레이저를 사용하고 655-755nm의 방출광을 감지했습니다.- 또는 형광 입체 현미경, 휴대용 형광 여기 시스템 또는 일반적으로 젤 및 웨스턴 블롯에 사용되는 형광 검출 시스템을 사용하여 거시적 콜로니 형광을 평가합니다.
- 선택한 형질전환체의 냉동고 스톡을 생성합니다.
- 표준 리튬 아세테이트 프로토콜을 사용하여 기준 및 실험 균주를 변형시킨다19.
- 주사 3일 전에 YPD(효모 추출물 펩톤 덱스트로스) 고체 배지에 형광 단백질 발현 참조 및 실험 균주를 접종하고 이쑤시개를 사용하여 냉동고 스톡에서 YPD 고체 배지로 유기체를 옮깁니다. 30°C에서 2일 동안 배양합니다.
- 각 균주에 대해 주사 1일 전에 여러 콜로니에서 채취한 C. albicans 세포와 YPD 25mL가 포함된 플라스크를 접종합니다. 이쑤시개를 사용하여 한 식민지에서 YPD로 유기체를 옮기십시오. 여러 다른 콜로니에서 세포를 얻기 위해 여러 번 반복하십시오. 오비탈 쉐이커 인큐베이터에서 30°C에서 175 rpm으로 밤새 배양한다.
참고: C. albicans 는 자발적인 유전적 변형의 빈도가 높기 때문에 여러 콜로니를 접종원으로 사용하는 것이 중요합니다. 접종물 배양을 시작할 때 여러 콜로니를 사용하면 접종물의 모든 유기체가 상당한 자발적인 변화가 있는 부모로부터 발생할 가능성을 최소화할 수 있습니다. - 주사 당일 :
- 배양액 1mL를 500 x g에서 2분 동안 원심분리합니다 .
- 1mL의 멸균 Dulbecco의 인산염 완충 식염수(dPBS)로 배양액을 3회 세척합니다. 최종 세척 후 펠릿을 멸균 dPBS 1mL에 재현탁합니다.
- 세척된 배양물의 샘플을 1:100으로 희석하고 혈구계를 이용하여 계수한다.
- 세척된 배양물의 밀도를 dPBS를 사용하여 mL당 1 x 108 유기체로 조정한다.
- 주입할 각 균주 세트에 대해 동일한 부피의 기준 균주와 실험 균주를 혼합하여 접종물을 만듭니다. 이것은 접종 물의 밀도를 mL 당 1 x 108 유기체로 유지합니다.
참고: 귀당 평가할 수 있는 균주의 수는 각 형광 단백질의 신호를 명확하게 구별하는 데 사용되는 현미경 시스템의 능력에 의해 제한됩니다. - 접종물이 준비되면 직접 동물 주사로 진행합니다. 사용하기 전에 접종물을 보관하지 마십시오.
2. 동물 준비
- 지역 기관 동물 관리 및 사용위원회 또는 관련 지역 치리회의 승인을 받으십시오.
- 공급 업체 또는 번식 프로그램에서 6-12 주 된 마우스를 얻습니다. 하우스 마우스는 접종 전 적어도 1주일 동안 실험 전반에 걸쳐 살게 될 시설에서.
참고: 대표적인 결과를 위해, 6주령의 암컷 DBA2/N 마우스를 사용하였다. - 접종 전에 최소 7 일 동안 엽록소가없는 차우를 동물에게 먹이십시오.
3. 제모 및 접종
- 수술 평면의 마취를 유도합니다 (그림 1).
주의 : 흡입 마취제는 위험한 물질이며 신경계 독성뿐만 아니라 눈이나 피부 자극을 유발할 수 있습니다. 흡입 마취제 사용에 대한 모든 제도적 정책 및 절차와 일반적인 실험실 안전 관행을 따라야합니다. 흡입 마취제 사용 훈련을받은 사람 만이 단계를 수행 할 수 있습니다. 표준 관행에는 장갑 착용, 실험실 코트, 보안경, 마취 청소부 시스템 사용 및 기관 지침에 따른 신중한 기록 보관이 포함됩니다.- 예열 된 마취 유도 챔버에 마우스를 놓습니다. 전신 마취를 통해 동물을 따뜻한 환경에 두십시오. 이러한 목적으로 설계된 온난화 패드와 온난화된 현미경 스테이지를 사용하여 이를 수행합니다. 처방전 없이 살 수 있는 가열 패드는 과열되어 화상을 입을 수 있으므로 사용하지 마십시오.
- 마우스가 교정 반사를 잃고 호흡이 느리고 안정적일 때까지 유도 챔버에 2%-3% 이소플루란을 제공합니다. 마취의 유도 챔버를 퍼지하고 동물을 1%-2% 이소플루란을 제공하는 비재호흡기 코뿔로 옮깁니다.
- 발가락 핀치 반사 또는 다른 검증 메커니즘을 사용하여 마취면을 검증하십시오. 실험 전반에 걸쳐 동물의 호흡 패턴과 마취면을 모니터링하고 필요에 따라 마취 농도를 조정합니다.
- 각막 건조를 방지하기 위해 눈 윤활제를 바르십시오.
- 제모(그림 1C, D)
- 면봉을 사용하여 양쪽 귀의 안쪽과 바깥쪽에 처방전 없이 살 수 있는 제모 크림을 듬뿍 바르십시오.
- 2-3분 후(또는 제조업체의 지침에 따라) 마른 거즈 패드로 귀를 부드럽게 닦아 크림과 머리카락을 모두 제거합니다. 제모 크림 잔여 물을 완전히 제거하기 위해 멸균 된 물에 포화 된 거즈 패드로 두 번 더 닦으십시오. 모든 제모 크림을 제거하지 않으면 피부 자극 / 염증이 발생합니다.
- 주입(그림 1E, F)
- 주입 할 귀 표면을 70 % 에탄올로 포화 된 거즈 패드로 닦고 자연 건조시킵니다.
- 여러 번 뒤집거나 와동하여 접종물을 잘 섞습니다.
- 인슐린 주사기에 20-30 μL의 접종 물을 추출하십시오. 바늘이 위를 향하도록 잡고 주사기를 부드럽게 두드려 배럴의 공기가 상단에 있는지 확인합니다. 플런저가 10μL 표시에 오도록 공기와 초과 접종물을 접종 튜브 또는 폐기물 튜브로 조심스럽게 다시 배출합니다.
- 지배적이지 않은 손의 손가락이나 엄지 손가락에 골무를 착용하고 골무를 가로 질러 귀를 감싸서 귀를 안정시킵니다. 또는 처방전 없이 살 수 있는 양면 스킨 테이프(패션 테이프)를 작은 원뿔형 또는 둥근 바닥의 플라스틱 튜브에 바르고 테이프를 가로질러 귀를 드레이프합니다. 이 작업을 수행하는 동안 마취 코 콘이 빠지지 않도록주의하십시오. 노즈콘을 작업 표면에 테이프로 붙이는 것이 도움이 될 수 있습니다.
알림: 조사자의 신체적 편안함에 따라 귀의 안쪽 또는 바깥쪽을 주사할 수 있습니다. 현미경 검사의 경우 주입된 귀의 측면이 대물 렌즈를 향하도록 마우스를 배치해야 합니다. - 주사기 바늘을 피부와 거의 완전히 평행하게 유지하고 큰 정맥을 피하면서 경사가 막 덮일 때까지 바늘 끝을 피부의 가장 바깥쪽 층에 삽입합니다.
- 천천히 접종 물을 피내 주사하십시오. 좋은 피내 주사는 피부에 작은 거품을 일으 킵니다. 누출을 최소화하기 위해 귀에서 바늘을 제거하기 전에 바늘을 15-20초 동안 제자리에 두십시오.
- 동물의 귀 아래쪽이 촉촉 해지면 바늘이 너무 깊어서 귀를 완전히 통과했습니다. 이 경우 귀의 다른 부위에 주사를 반복하십시오.
- 동물의 다른 귀를 사용하여 과정을 반복하십시오. 이것은 복제에 대해 동일한 C. albicans 균주 또는 다른 C. albicans 균주 세트로 수행 할 수 있습니다.
- 즉시 이미징하지 않으면 동물을 따뜻한 회복실에 두십시오. 마취에서 회복 될 때까지 동물을 관찰 한 다음 주거 케이지로 되돌립니다.
- 제도적 프로토콜에 따라 케이지에 생물학적 위험 라벨을 명확하게 표시하고 케이지의 동물이 칸디다 알비 칸스에 감염되었음을 나타냅니다.
- 동물 마취 및 기타 필요한 기관 관행과 관련된 모든 필수 기록 보관을 완료하십시오.
- 동물 생물학적 안전 레벨 2 예방 조치를 사용하여 동물 시설 조건에서 동물을 수용합니다.
4. 생체 내 결과와 비교하기 위해 시험관 내 형태 형성 정량화
- 접종물을 제조하는데 사용된 동일한 세척된 배양물을 사용하여, RPMI1640 + 10% 열-불활성화된 태아 소 혈청에 유기체의 1:50 희석액을 만들고, 4시간 동안 텀블링하면서 37°C에서 배양한다. 대안적으로, 시험관내에서 형태형성을 자극하는 다른 배지가 사용될 수 있다.
- 샘플을 500 x g 에서 5분 동안 원심분리하고 0.5mL의 dPBS에 재현탁합니다.
- 샘플을 1:10의 비율로 희석하고 희석된 샘플 2.5μL를 현미경 슬라이드에 놓고 커버슬립으로 덮습니다.
- 형광 현미경을 사용하여 샘플을 검사합니다. 적어도 100 개의 세포를 세고 각 균주에 대한 효모 및 사상 세포의 수를 기록합니다. 여기에 제시된 대표적인 결과에서, 필라멘트 세포는 모세포 길이의 두 배 이상의 길이를 가진 임의의 세포로 정의된다.
참고: 시험관내 형태형성의 정량화는 동물의 접종과 같은 날에 수행될 수 있다. 주사를 위한 접종물을 준비하는 동안 시험관내 형태형성 분석을 개시하고 4시간 배양 기간 동안 동물의 접종을 수행할 수 있습니다. 모든 동물 절차가 4 시간 배양 기간이 끝나기 전에 완료되면, 시험 관 내 자극 세포의 검사로 직접 진행하십시오. 대안적으로, 세포를 dPBS 중 3.7% 포름알데히드에 재현탁시키고(단계 4.2에서) 며칠 동안 4°C에서 저장할 수 있다. 고정 된 유기체는 시간이 허락하는 한 정량화 될 수 있습니다. 동물의 접종은 시험관내 정량화 분석을 위해 지연되어서는 안 된다.
5. 생체 내 이미징 준비
- 현미경을 준비합니다(그림 2A).
- 모든 현미경 장비를 켜고 이미징 소프트웨어를 시작합니다.
- 사용 가능한 경우 미리 결정된 이미징 설정을 로드합니다.
- 사용 중인 형광 단백질을 검출하는 데 필요한 레이저와 검출기를 활성화합니다.
- 가열된 현미경 스테이지를 켜고 37°C로 예열합니다.
알림: 가열된 스테이지가 아닌 완전히 밀폐된 환경 챔버가 있는 현미경을 사용할 수 있습니다. - 초점면이 커버슬립의 상단 표면에 있는 z축 기준점을 설정합니다. 이것은 무대 개구부 위에 커버 슬립을 제자리에 테이프로 붙이고 커버 슬립에 물방울을 넣어 수행할 수 있습니다. 저배율(10x) "건조" 대물렌즈를 사용하여 물방울의 가장자리에 초점을 맞춘 다음 z축 기준점을 설정합니다. 무대에서 제거하기 전에 커버슬립에서 물을 흡수하기 위해 수건을 사용하십시오.
- 작동 거리가 매우 긴 대물렌즈를 제자리로 돌리고 렌즈에 액침액 방울을 놓습니다. 커버슬립을 놓을 때 발생할 수 있는 손상을 방지하기 위해 렌즈를 내립니다.
- 무대 개구부 위에 #1.5 커버슬립을 놓고 제자리에 테이프로 붙입니다. 테이프가 커버슬립의 모든 가장자리를 완전히 덮어 유체가 커버슬립 아래로 현미경으로 스며드는 것을 방지하십시오. 액침 유체가 대물 렌즈와 커버슬립 모두에 닿도록 대물렌즈를 z축 기준점까지 올립니다.
- 노즈콘과 마우스를 배치할 때 사용할 수 있도록 여러 조각의 압력 감지 테이프를 준비합니다.
- 모든 현미경 장비를 켜고 이미징 소프트웨어를 시작합니다.
- 위와 같이 영상화되는 마우스에 전신 마취를 유도한다(단계 3.1).
- 마우스를 배치합니다(그림 2B-D).
- 동물이 이미징 위치에 있을 때 동물의 코를 완전히 덮을 수 있도록 노즈콘이 배치된 상태에서 현미경 스테이지에 마취 노즈콘을 고정합니다. 이것은 두 명의 조사관으로 더 쉽게 수행 할 수 있습니다. 첫 번째 조사자에게 마취된 마우스의 코를 코콘에 넣고 동물의 코 위에 노즈콘을 계속 유지하면서 마우스를 이미징을 위한 위치로 이동하게 합니다. 다른 조사관에게 노즈콘과 튜브를 제자리에 테이프로 고정하여 쥐의 코 위에 안정적으로 고정되도록 합니다. 노즈콘이 제자리에 테이프로 고정되면 이미징 세션의 나머지 기간 동안 그대로 두십시오.
- 노즈콘을 놓을 가장 좋은 장소를 정한 후 그 위치를 기록해 두십시오. 후속 이미징 세션의 경우 동물을 현미경으로 가져오기 전에 노즈콘을 스테이지에 고정할 수 있습니다.
- 대물 렌즈 위의 커버슬립에 멸균수 한 방울을 놓습니다.
- 마우스를 현미경 스테이지에 놓습니다. 귀가 물방울 위에 있고 커버슬립에 평평한지 확인합니다.
- 두 번째(상단) 커버슬립을 사용하여 귀를 평평하게 합니다.
- 커버슬립의 가장자리를 마우스 본체와 평행하게 놓고 가장자리가 귀와 머리가 만나는 마우스에 닿도록 합니다.
- 힌지 동작으로 커버슬립의 자유 가장자리를 현미경 스테이지로 내립니다. 커버슬립이 현미경 스테이지에 닿으면 귀가 납작해집니다. 귀에 주름이나 융기가 생기지 않도록주의하십시오.
- 상단 커버슬립을 제자리에 단단히 테이프로 고정하여 귀를 평평하게 유지하기에 충분한 압력을 유지합니다. 테이프에 쥐의 머리카락이나 수염이 걸리지 않도록 주의하십시오.
- 환경 챔버가 있는 현미경을 사용하지 않는 한, 정상적인 발열 환경을 유지하기 위해 멸균 드레이프로 마우스의 몸을 느슨하게 덮으십시오.
- 관심 분야를 식별합니다.
- 대물렌즈가 z축 기준점에 있는지 확인합니다.
- 백색광/광시야 이미징을 사용하여 초점면을 귀 조직으로 조정합니다. 좋은 전략은 혈관에 초점을 맞추는 것입니다 - 적혈구가 혈관에서 움직이는 것을 볼 수 있다면, 초점면은 조직 내에 있습니다.
- 현미경에 광시야 형광 기능이 장착되어 있으면 이를 사용하여 관심 분야를 식별하십시오. 그렇지 않은 경우 컨포칼 이미징을 사용합니다. 일반적으로 광시야 현미경을 사용하여 관심 영역을 식별하는 것이 더 빠르고 귀 조직의 조사가 덜 필요합니다.
- 기준 균주에서 발현된 형광 단백질의 검출을 위해 필터 큐브를 이용하여, 기준 균주로부터 형광 신호를 갖는 시야를 동정한다. 초점이 맞지 않는 빛은 개별 유기체에 초점을 맞추는 능력을 방해할 가능성이 있음을 명심하십시오. 이 단계의 목표는 컨포칼 이미징의 관심 영역을 식별하는 것입니다.
- 실험 균주에서 발현된 형광 단백질을 감지하고 선택한 시야에서 그 존재를 확인하는 필터 큐브로 변경합니다.
6. 이미징
- 설정을 결정합니다.
- 이미징 소프트웨어가 라이브 컨포칼 모드에 있는 동안 초점면이 z축을 통해 이동할 때 관심 필드를 검사합니다. 사용되는 모든 형광 단백질의 신호가 강한 z축 평면을 선택하십시오.
- 레이저 출력 및/또는 이미징 속도를 조정하여 시야의 모든 세포에 대해 형태를 결정할 수 있을 만큼 충분히 강한 신호를 얻습니다. 조직 손상을 방지하려면 가능한 가장 낮은 레이저 출력을 사용하십시오.
참고: 모든 이미징과 마찬가지로 레이저 출력, 획득 속도 및 해상도 간에 균형이 있습니다. 귀 조직의 조사를 최소화하기 위해 속도와 레이저 출력의 균형을 맞추면서 유기체 형태를 명확하게 식별하는 설정을 식별합니다. 이미징은 외부 진피를 통해 발생하기 때문에 슬라이드에 장착된 기존 샘플의 컨포칼 이미징에 일반적으로 필요한 것보다 여기에는 더 높은 레이저 출력이 필요합니다. 다행히도 형태 분석에 필요한 공간 해상도 수준은 극단적이지 않습니다. 따라서 조직 손상을 일으키지 않고 유기체 형태를 결정하기에 충분한 신호로 이미지를 얻는 것이 쉽게 달성 될 수 있습니다. - 이러한 파라미터가 설정되면 이미징 세션 전체에서 이를 사용하여 후속 이미징 세션의 시작점으로 사용할 수 있습니다. 따라서 이미징 설정을 저장하는 것이 좋습니다.
참고: 감염의 개별 영역은 조직 내에서 더 얕거나 깊을 수 있습니다. 더 깊은 영역에서는 레이저 출력의 증가가 필요할 수 있습니다. 이 분석은 강도보다는 신호의 공간적 분포에 의존하기 때문에 필요에 따라 필드 간에 이미지 설정을 변경할 수 있습니다.
- 이미지를 가져옵니다.
- 기준 균주에서 필라멘트 형성이 명확하고 대부분의 유기체가 형태를 결정할 수 있을 만큼 충분히 퍼져 있는 시야를 선택하십시오.
- Z 스택의 상단 및 하단 초점 평면을 설정합니다. 감염된 영역의 전체 깊이를 덮을 필요는 없지만 이미징 된 볼륨의 상단 또는 하단에있는 유기체는 일반적으로 분석에서 제외됩니다.
- z-스택 이미지를 획득하고, 각 채널을 의사 색상으로 지정하여 각 변형을 구별하고, 채널을 오버레이합니다. 이미지를 저장합니다.
- 다른 보기 필드에 대해 반복합니다. 형태 형성은 위치마다 다를 수 있습니다. 따라서 각 귀에서 최소 3 개의 필드를 수집하고 분석하는 것이 중요합니다.
7. 수동 2차원 분석: 필라멘트의 빈도
- 이미징 소프트웨어를 사용하여 z 스택을 2차원 이미지로 최대 투영합니다. 여기에 제공된 지침은 피지/이미지 J에 대한 것입니다.
- ImageJ 소프트웨어를 사용하여 현미경 이미지를 엽니다.
- 필요한 경우 각 채널에 의사 색상을 적용하여 각 C. albicans 균주를 직접 식별 할 수 있습니다. 이를 위해 LUT 색상> 이미지 > 조회 테이블을 클릭하고 선택한 의사 색상을 선택하십시오.
- 스택 파일을 최대 강도 투영 2차원 이미지로 변환합니다.
- z 스택 파일을 선택합니다. 이미지 > 스택 > Z 투영을 클릭합니다.
- 상단 및 하단 평면을 선택하고 투영 유형 최대 강도를 선택합니다.
- 최대 투영 이미지에서 볼 수 있는 각 유기체를 균주 유형(채널 색상으로 구별됨) 및 형태별로 계산합니다.
- 상당히 겹치는 유기체 또는 유기체 밀도가 매우 높은 영역은 정확하게 계산하기 어렵습니다. 이를 카운트에서 제외하되 겹칠 가능성이 더 높은 필라멘트 형태에 대한 편향을 도입하지 않도록 주의하십시오.
- z-스택 안팎으로 직선으로 돌출된 필라멘트 형태는 최대 투영에서 작은 원형 개체로 나타납니다. 마찬가지로, 이미지의 경계에 의해 잘린 유기체는 필라멘트가 시야를 벗어나기 때문에 효모로 보일 수 있습니다. 따라서 2 차원 분석은 항상 효모 형태의 비율을 과대 평가합니다. 이것은 참조 균주와 실험 균주에서 동등하게 발생하므로 항상 실험 결과를 기준 균주의 결과와 비교하십시오.
- 실험 설계에 따라 결과의 통계적 비교를 수행합니다.
8. 수동 2차원 분석: 필라멘트 길이
- C. albicans의 경우, a) 더 적은 수의 "모체"효모 세포가 형태 형성을 겪거나, b) 필라멘트가 더 느린 속도로 성장하거나, c) 필라멘트 성장이 시작되지만 유지되지 않기 때문에 비정상적인 필라멘트 형성이 발생할 수 있습니다. 이러한 가능성을 평가하려면 최대 투영 이미지에서 각 필라멘트의 곡선 경로 길이를 실제 3차원 길이에 대한 대용으로 정량화합니다(아래 설명 참조).
- 모세포에서 새싹이 생길 때 필라멘트가 될지 효모가 될지 알 수 없습니다. 이 분석에 사상 세포만 포함되도록 하려면 딸 세포가 모세포 길이의 두 배 이상인 유기체만 측정하십시오.
- 7단계에서 만든 최대 투영 이미지를 엽니다.
- ImageJ 도구 집합에서 직선/분할선 도구를 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 분할된 선 옵션을 선택합니다. 분할 된 선 옵션을 사용하면 사용자가 곡선 경로를 따라 필라멘트 길이를 측정 할 수 있으며, 이는 C. albicans 필라멘트의 가소성을 고려할 때 필요합니다.
- 새싹 목에서 필라멘트의 성장 끝까지의 필라멘트 길이를 측정합니다. 새싹 목을 마우스 왼쪽 버튼으로 클릭하십시오. 포인터가 작은 사각형으로 바뀝니다. 필라멘트의 길이를 따라 필라멘트를 추적하여 필라멘트의 장축이 곡선, 회전 또는 변경될 때마다 필라멘트의 중심을 클릭합니다. 필라멘트의 성장하는 끝을 두 번 클릭합니다.
- 컨트롤 + M을 누릅니다. 그러면 면적, 평균, 최소, 최대 및 길이 측정값을 표로 만드는 팝업 창이 열립니다. 각 필라멘트를 측정한 후 Control + M을 다시 눌러 현재 측정값을 측정 표에 추가합니다.
- 모든 필라멘트가 측정되면 길이 측정값을 복사하여 데이터 분석 파일에 붙여넣습니다.
- 통계 분석을 수행하여 기준 균주와 돌연변이 균주에서 필라멘트 길이의 분포를 평가합니다.
9. 수동 3차원 분석
- 효모 형태의 과대 평가를 피하고 유사 균사와 균사를 구별 할 수있는 형태 형성을보다 정확하게 측정하려면 각 유기체의 형태를 3 차원으로 평가하면서 z 스택을 수동으로 위아래로 스크롤하십시오.
- 또는 각 z 스택의 3차원 이미지를 만들고 이미지를 회전하면서 각 유기체의 모양을 분석합니다.
10. 자동 분석
- 이미징 소프트웨어를 사용하여 유기체와 그 형태를 2차원 또는 3차원으로 열거하는 작업을 자동화합니다.
참고: 형태학 유형을 구별하기 위한 일부 알고리즘은 편향을 유발할 수 있습니다. 따라서 자동화 전략은 실험 설계와 관련하여 신중하게 검증되어야 합니다. 잘 설계되고 검증된 자동 이미지 분석은 분석 단계의 처리량을 높일 수 있습니다.
Representative Results
여기에 제시된 결과는 이전에 발표 된 보고서 9,10을 기반으로합니다. 이 분석의 목표는 돌연변이 C. albicans가 활성 감염 중에 형태 형성을 겪는 능력을 정량적으로 평가하는 것입니다. 유사 균사와 균사를 구별하는 전형적인 매개 변수는 복잡한 생체 내 환경에서 3 차원으로 성장하는 유기체에서 평가하기 어려울 수 있습니다. 이는 컨포칼 이미징으로 생성된 2차원 단면을 볼 때 특히 그렇습니다. 따라서이 선별 분석은 사상 대 효모로 성장하는 유기체를 식별하는 데 중점을 둡니다. 3차원 재구성을 포함하여 보다 심층적인 분석을 사용하는 후속 연구의 경우 이 방법을 효모, 균사 및 유사 균사를 구별하는 데 적용할 수 있습니다.
C. albicans의 기준 또는 돌연변이 균주에서 형광 단백질의 발현은 생체 내에서 균주 형태를 간단하게 검출 할 수있게합니다 (그림 3 및 그림 4). 일반적으로 정량적 광학 현미경 분석은 이미지의 픽셀이 거의 또는 전혀 포화되지 않을 때 가장 잘 수행됩니다. 그러나 이 프로토콜의 경우 이미지의 채도가 분석을 단순화하는 경우가 많습니다. 형광 단백질 국소화는 세포 전체에 걸쳐 균일하지 않으며 종종 필라멘트보다 모효모에서 더 높습니다. 다행스럽게도 형태 형성을 조사하기 위해서는 신호의 강도보다는 신호의 공간 분포가 결과를 정의합니다. 따라서 많은 픽셀이 포화 된 이미지를 얻음은이 분석에서 형태 형성을 정량화하는 능력을 향상시킵니다.
생체내에서 형태형성 평가의 중요성을 설명하기 위해, 참조 균주 (SN250) 및 2개의 돌연변이체에 대한 대표적인 결과가 제시된다: 하나는 전사 인자 Efg1이 결여되고 다른 하나는 아데닐릴 사이클라제 Cyr1이 결여된다. 시험관 내에서 이러한 균주 중 어느 것도 필라멘트20,21로 성장하지 않습니다. 10% 혈청이 보충된 RPMI 배지에서 시험관 내에서 성장하면 기준 균주가 빠르게 필라멘트를 형성하는 반면 efg1ΔΔ 및 cyr1ΔΔ 균주는 그렇지 않습니다(그림 3 및 그림 4). 이러한 조건 하에서, efg1ΔΔ 돌연변이체는 다소 분극화된 성장을 나타내며, 딸 세포는 모세포에 비해 약간 길다. 이것은 필라멘트에 대한 명확한 정의를 사용하는 것의 중요성을 강조합니다. 그러한 정의는 기본적으로 임의적이지만 표현형의 일관된 평가를 위해 필요합니다. 이러한 연구에서 필라멘트 성장 패턴은 딸 세포의 가장 긴 차원을 모세포의 두 배 이상 가진 유기체로 정의됩니다. 이 정의를 사용하여, 길쭉한 efg1ΔΔ 세포는 필라멘트가 아니다.
시험관내 표현형과 일치하게, efg1 ΔΔ는 생체내에서 현저한 필라멘테이션 결함을 나타낸다: efg1ΔΔ 세포의 약 9%가 생체내에서 필라멘트로 성장하였다(도 3). 대조적으로, cyr1ΔΔ 돌연변이 세포의 53%는 생체 내에서 필라멘트로 성장했습니다(그림 4). 생체내에서 필라멘테이션을 받는 cyr1 ΔΔ 돌연변이체 세포의 수는 기준 균주보다 현저히 낮았지만, 생체내에서 필라멘트를 형성하는 cyr1ΔΔ 돌연변이체의 능력은 시험관내에서 형태형성의 완전한 결핍으로부터 실질적인 변화를 나타낸다. 시각적으로, cyr1ΔΔ 돌연변이체에 의해 형성된 필라멘트는 기준 균주보다 짧은 것으로 나타났다. 이를 정량적으로 평가하기 위해, 필라멘트 세포의 곡선 경로 길이는 in vivo 이미지의 2차원 투영을 이용하여 측정하였다(도 4E). cyr1ΔΔ 필라멘트의 중간 길이는 기준 균주의 필라멘트보다 29 % 짧았습니다.
그림 1: 마취 및 접종 . (A) 유도 챔버를 이용한 마취 유도. (B) 마취는 코 원뿔을 사용하여 유지되어 필요에 따라 마우스를 재배치 할 수 있습니다. (C) 제모 크림은 면봉 어플리케이터를 사용하여 도포한다. 눈 윤활 젤은 마취 중에 눈을 보호하기 위해 적용되었습니다. (D) 오른쪽 귀의 효과적인 제모. 치료되지 않은 왼쪽 귀와 비교하십시오. (E) 마우스 귀에 C. albicans 의 피내 주사. 귀는 양면 피부 테이프 (패션 테이프)로 감싼 원추형 튜브의 끝을 사용하여 제자리에 고정됩니다. (F) 피내 주사의 클로즈업. 피부에 창백한 거품이 형성되어 성공적인 피내 배치의 신호입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 이미징 준비 . (A) 이미징을 위해 준비된 현미경 스테이지. 마취 코 콘이 제자리에 고정됩니다. 커버 슬립은 렌즈 개구부를 덮는 무대에 테이프로 붙여져 있습니다. 추가 테이프 조각을 사용할 수 있습니다. 가열된 스테이지는 37°C로 예열된다(도시되지 않음). (b) 마취된 마우스를 마취된 코뿔 내로 배치하는 단계. (C) 접종된 귀의 측면이 하단 커버슬립/대물 렌즈를 향하도록 마우스를 약간 회전시킵니다. 그런 다음 귀를 하단 커버슬립에 대해 평평하게 만들고 두 번째 커버슬립을 귀 위에 놓아 제자리에 고정합니다. (D) 상단 커버 슬립은 현미경 스테이지를 기준으로 귀를 제자리에 고정하기 위해 스테이지에 테이프로 고정됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 3: efg1ΔΔ 돌연변이 균주의 시험관내 및 생체내 형태. (a) 4시간 동안 37°C에서 RPMI + 10% 혈청에서 성장 세포에 의한 필라멘션의 시험관내 유도 후 WT 및 efg1ΔΔ 돌연변이 균주의 광시야 이미지. 스케일 바는 10μm를 나타냅니다. 보기 쉽도록 사진 편집 소프트웨어를 사용하여 이미지 대비를 조정했습니다. (B) WT 및 efg1ΔΔ 돌연변이체 균주에서 관찰된 시험관내 필라멘테이션의 백분율. Und = 감지할 수 없음(필라멘트가 감지되지 않음). 바 높이는 적어도 100개의 세포가 정량화된 3개의 독립적인 실험으로부터의 사상 세포의 중간 백분율을 나타낸다. 오차 막대는 표준 편차를 나타냅니다(스튜던트 t-검정으로 비교한 결과, p < 0.001). (c) 접종 후 24시간 동안 생체내에서 성장하는 WT(녹색) 및 efg1ΔΔ 돌연변이체(적색)의 공초점 현미경 사진. 화살표는 "사상"의 정의를 충족하는 efg1ΔΔ 돌연변이 세포의 예를 나타냅니다. 스케일 바는 50 μm를 나타낸다. (D) WT 및 efg1ΔΔ 돌연변이체 균주에서 관찰된 생체내 필라멘션의 백분율. 막대 높이는 두 개의 독립적인 실험에서 나온 사상 세포의 중간 백분율을 나타냅니다. 오차 막대는 표준 편차를 나타냅니다(스튜던트 t-검정으로 비교한 결과, p < 0.001). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 4: cyr1 ΔΔ 돌연변이 균주의 시험관내 및 생체내 형태. (A) 4시간 동안 37°C에서 RPMI + 10% 혈청에서 성장 세포에 의한 필라멘션의 시험관 내 유도 후 cyr1ΔΔ 돌연변이 균주의 광시야 이미지. 스케일 바는 10 μm를 나타냅니다. 보기 쉽도록 사진 편집 소프트웨어를 사용하여 이미지 대비를 조정했습니다. (B) WT 및 cyr1ΔΔ 돌연변이체 균주에서 관찰된 시험관내 필라멘테이션의 백분율. Und = 감지할 수 없음(필라멘트가 감지되지 않음). 바 높이는 적어도 100개의 세포가 정량화된 3개의 독립적인 실험으로부터의 사상 세포의 중간 백분율을 나타낸다. 오차 막대는 표준 편차를 나타냅니다(스튜던트 t-검정으로 비교한 결과, p < 0.001). (c) 접종 후 24시간 생체내에서 성장하는 WT(녹색) 및 cyr1ΔΔ 돌연변이체(적색)의 공초점 현미경 사진. 스케일 바는 50μm를 나타냅니다. (d) WT 및 cyr1ΔΔ 돌연변이체 균주에서 관찰된 생체내 필라멘트의 백분율. 막대 높이는 두 개의 독립적인 실험에서 나온 사상 세포의 중간 백분율을 나타냅니다. 오차 막대는 표준 편차를 나타냅니다(스튜던트 t-검정으로 비교한 결과, p < 0.001). (E) z-stack의 2차원 투영에서 곡선 경로 길이로 측정된 생체 내 필라멘트 길이의 분포. 각 점은 한 필라멘트의 길이를 나타냅니다. 효모로서 성장하는 세포는 이 분석에 포함되지 않았다. 막대는 중간 필라멘트 길이를 나타냅니다. 길이 분포는 Mann-Whitney U 검정을 사용하여 분석할 때 유의하게 다릅니다(p < 0.001). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Discussion
이 모델은 컨포칼 현미경을 사용하여 포유류 숙주의 조직 내에서 성장하는 C. albicans 유기체의 이미지를 얻음으로써 활성 감염 동안 형태 형성 표현형을 평가할 수 있습니다. 형태 형성 과정은 C. albicans의 발병 기전의 중심이며 다양한 시험관 내 분석 2,3,4를 사용하여 널리 연구되었습니다. 그러나, 시험관내 분석은 숙주의 복잡한 생화학적 및 구조적 환경을 완전히 모델링할 수 없다.
여기에 설명된 프로토콜은 감염 중 형태형성에 관여하는 유전자를 확인하기 위해 C. albicans 돌연변이체의 시리즈/라이브러리를 스크리닝하기 위해 이 생체 내 이미징 시스템의 사용에 중점을 둡니다. 다른 형광 단백질을 발현하는 C. albicans 균주를 사용하면 기준 균주와 비교하여 C. albicans 돌연변이 균주의 생체 내 형태 형성을 정량화 할 수 있습니다. 돌연변이의 형태 형성을 동일한 감염 영역 내의 기준 균주와 비교하면 유기체가 동일한 환경에 노출됩니다. 이를 통해 필라멘테이션을 받는 세포의 비율과 필라멘테이션 정도를 정량적으로 측정할 수 있습니다. 돌연변이 균주의 측정값을 기준 균주의 측정값으로 정규화하면 한 돌연변이의 성능을 다른 돌연변이와 더 잘 비교할 수 있습니다.
여기에 제시된 대표적인 결과는 시험관 내 표현형과 생체 내 표현형 사이에 상당한 불일치의 가능성을 보여줍니다. C. albicans efg1ΔΔ 돌연변이 균주는 거의 모든 시험관 내 조건20에서 필라멘트에 실패하기 때문에 형태 형성 분석을위한 음성 대조군으로 자주 사용됩니다. 생체 내 결과는 시험관 내 결과와 매우 유사했지만,이 심하게 방해받은 균주조차도 때때로 숙주 조직 환경에서 필라멘트를 형성했습니다 (그림 3). 이것은 형태 형성을 유발하는 숙주 환경의 강도를 강조합니다.
대조적으로, cyr1ΔΔ 돌연변이체 균주는 시험관내 및 생체내 성장 사이에 실질적인 불일치를 입증하고; 돌연변이 세포 중 어느 것도 시험관 내에서 필라멘트를 거치지 않지만 세포의 약 절반은 생체 내에서 필라멘트로 성장합니다(그림 4)10,21. 흥미롭게도, 이들 필라멘트는 기준 균주에 의해 형성된 필라멘트보다 상당히 짧았으며, 이는 CYR1이 필라멘트 성장 속도 또는 필라멘트 표현형을 유지하는 능력에 기여한다는 것을 시사한다. 필라멘트 길이의 분석을 용이하게하기 위해, 필라멘트의 곡선 경로 길이는 이미지의 2 차원 투영을 사용하여 측정되었다. 3차원으로 성장하는 필라멘트의 2차원 투영에서 xy 평면과 평행하지 않은 축에서 성장하는 모든 필라멘트는 실제 길이보다 짧게 투영됩니다. 이러한 단축법은 기준 균주에 대해서도 발생하므로 2차원 투영에서 필라멘트 길이의 분포를 평가하면 기준 균주와 돌연변이 균주 간의 정량적 비교가 가능합니다. 필라멘트 길이를 3 차원이 아닌 2 차원으로 분석하려면 덜 집중적 인 이미지 분석이 필요합니다. 따라서 일반적인 데스크톱 컴퓨터에서 비교적 빠르게 수행할 수 있습니다. 이 간단한 분석을 사용하면 스크리닝 프로토콜의 일부로 필라멘트 길이 분포를 포함할 수 있으므로 처리량에 상당한 지연을 일으키지 않고 형태 형성을 겪을 수 있는 각 돌연변이의 능력에 대한 보다 미묘한 이해를 제공할 수 있습니다.
여기에 제시된 대표적인 연구는 보체 시스템에 결함이 있는 DBA2/N 마우스를 사용하여 수행되었으며, 이로 인해 C. albicans 감염 부위에 호중구를 모집하는 데 실패했습니다.22. 이 연구의 목표는 숙주 조직 내에서 C. albicans 필라멘트 조절 메커니즘을 조사하는 것이 었습니다. 따라서 DBA2/N 마우스는 개별 균주의 감수성 또는 호중구에 대한 저항성 때문에 결과를 혼동하지 않도록 사용했습니다. 호중구 항-C. 알비칸스 반응이 필라멘테이션23에 영향을 미칠 수 있기 때문에, 감염 부위로의 호중구 모집은 형태형성 분석의 결과에 영향을 미칠 수 있다. 균주가 생체 내에서 필라멘팅이 가능하지만 호중구가 존재할 때 필라멘트가 강하게 억제되는 경우 DBA2/N 마우스에서 필라멘트가 감지되지만 손상되지 않은 호중구 화학주성을 가진 마우스를 사용할 때는 나타나지 않을 것입니다. 따라서, 숙주로 사용되는 마우스의 변형은 이 프로토콜을 사용할 때 중요한 요소이다.
efg1ΔΔ 돌연변이 균주가 생체 내에서 필라멘트에 실패한다는 관찰은 숙주 호중구 반응과 관련이 없을 것인데, 이는 이 균주가 또한 시험관 내에서 필라멘트에 실패하기 때문이다. cyr1ΔΔ 균주와 함께 생체 내에서 관찰된 필라멘션은 시험관 내 필라멘테이션 실패와 불일치합니다. C. albicans의 제브라 피쉬 모델의 데이터는 반응하는 호중구가 형태 형성24의 예방에 중요하다는 것을 나타냅니다. 따라서, 호중구 반응이 없는 DBA2/N 마우스의 사용은 시험관내와 비교하여 생체내에서 cyr1ΔΔ의 필라멘테이션 증가를 설명할 가능성이 낮다. 그럼에도 불구하고, 생체내 환경은 cyr1ΔΔ 균주의 형태형성에 명백히 영향을 미치고; 따라서이 균주에 대한 추가 조사는 활성 감염 동안 C. albicans의 형태 형성 조절에 대한 중요한 정보를 제공 할 수 있습니다. 여기에 설명된 프로토콜은 향후 연구에 사용될 cyr1ΔΔ 균주와 같은 균주를 식별하기 위한 스크리닝 분석으로 설계되었습니다.
저유량 가스 마취 시스템의 사용은 이 프로토콜에 매우 유용합니다(그림 1A,B). 이 프로토콜의 초기 개발 동안, 마우스는 자일라진과 혼합 된 케타민의 주사 가능한 마취 칵테일을 사용하여 마취되었다. 이러한 마취 방법으로 제한된 영상을 수행할 수 있었지만 마취 기간을 예측할 수 없었기 때문에 영상화 중 마우스가 마취에서 회복되는 것을 방지하기 위해 영상 세션을 신속하게 종료해야 했습니다. 전통적인 흡입 마취 시스템은 부피가 크고 마취 가스의 높은 흐름 속도가 필요하며 종종 흄 후드 내에서 사용해야합니다. 따라서 기존의 흡입 마취 시스템은 조사자가 실수로 마취제에 노출되지 않고는 컨포칼 현미경의 공간 제약으로 사용하기가 매우 어렵습니다. 저 유량 흡입 마취 시스템을 사용하면 조사자에게 안전한 환경을 유지하면서 동물을 지속적으로 마취 할 수 있습니다. 저유량 노즈콘을 사용하면 접종과 현미경 검사를 위해 동물을 쉽게 배치할 수 있습니다. 소구경, 소량 전달 튜브는 비교적 긴 튜브를 사용할 수 있어 현미경 검사를 방해하지 않도록 마취 기계를 충분한 거리에 배치할 수 있습니다.
전형적인 마우스 차우에 존재하는 엽록소는 상당한 조직 자가형광을 유도한다(25). 이로 인해 이미지에 상당한 노이즈가 발생하여 고품질의 높은 공간 해상도 이미지를 얻기가 어렵습니다. 동물에게 이미징 전 7일 동안 엽록소가 없는 차우를 먹였을 때, 자가형광으로 인한 배경은 조직에서 실질적으로 감소했지만 모발에 침착된 엽록소는 계속해서 문제가 되었습니다. 처방전 없이 살 수 있는 화학 제모 크림을 사용하여 귓바퀴의 모발을 제거하면 모발의 자가형광을 최소화하는 데 효과적입니다(그림 1C,D). 따라서, 엽록소가 없는 차우와 적절한 제모의 조합은 자가형광을 실질적으로 감소시키고 이미지 품질을 극적으로 개선시켰다. 이미징 전에 머리카락이 귀에서 제거되기 때문에 동물의 머리카락 색깔은이 시스템에 영향을 미치지 않습니다. 이 프로토콜은 BALB / c (흰색), C57BL / 6 (검은 색) 및 DBA2 / N (갈색) 마우스에서 C. albicans의 감염을 연구하는 데 성공적으로 사용되었습니다. 이 프로토콜은 다양한 숙주 유전자가 결핍된 C57BL/6 녹아웃 마우스에도 사용할 수 있습니다. 이를 통해 포유류 숙주 면역 체계가 필라멘트에 어떻게 영향을 미치는지에 대한 향후 조사가 가능합니다. 이 프로토콜에서 논의되지 않은이 모델의 한 가지 특징은이 이미징 시스템이 비 침습적이기 때문에 동일한 동물을 며칠에 걸쳐 반복적으로 이미징 할 수 있으므로 시간이 지남에 따라 개별 감염의 진행 상황을 추적 할 수 있다는 것입니다. 이 기능은 숙주-병원체 상호 작용에 대한 향후 연구에서 중요한 역할을 할 것입니다.
요약하면, 이 프로토콜은 살아있는 포유류 숙주의 조직에서 자라는 C. albicans의 고공간 해상도 이미지를 생성하여 돌연변이 균주 8,9,10에서 형태 형성을 정확하게 평가할 수 있습니다. 여기에 제시된 결과는 이 프로토콜이 C. albicans 돌연변이체 라이브러리를 스크리닝하는 데 어떻게 사용될 수 있는지 보여줍니다. 현재까지 시험된 C. albicans의 돌연변이체 중, 시험관 내에서 형태형성에 공지된 결함이 있는 돌연변이체의 상당 부분이 생체내필라멘테이션을 쉽게 겪는다 9,10. 이것은 C. albicans의 발병 기전의 메커니즘을 밝히기 위해 고안된 실험에서 이와 같은 생체 내 시스템을 포함하는 것의 중요성을 강조합니다.
Disclosures
저자는 공개 할 이해 상충이 없습니다.
Acknowledgments
이 작업은 NIH 보조금 1R01AI33409와 아이오와 대학교 카버 의과 대학 소아과에서 지원했습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| #1.5 coverslips | Thermo-Fisher | 20811 | large enough to cover the universal stage opening |
| 0.1 mL Insulin syringes | EXELint | 26018 | Can use syringes that are 5/16"–1/2" long and 29–32 G |
| 3.7% formaldehyde in dPBS | Sigma-Aldrich | SHBJ5734 | |
| 70% Ethanol/30% water | Decon Laboratories | A05061001A | |
| Alcohol prep pads | Covidien | 5110 | Alternative: gauze pads soaked in 70% isopropyl alcohol |
| C.albicans reference strain and experimental strains | SN250 | FGSC Online Catalog | The specific C. albicans strain varies with experiment and the investigators goals. We have used strains derived from SC5314 as well as other clinical isolates. |
| Chlorophyl free mouse chow | Envigo | 2920x | |
| Computer | Dell | Optiplex 7050 | Computer that can run imaging software for acquisition and for analysis of images. A variety of imaging software is available and varies with the specific microscope and user system. |
| Cotton tip applicator | Pro Advantage | 76200 | |
| DBA2/N (6-12 week old mice) | BALB/c and C57/BL6 mice can also be used. The latter allow for the use of widely available knockout mouse models as well as mouse models in which individual cell types, such as phagocytes, are identified by their expression of fluorescent proteins. | ||
| Double sided tape designed to hold fabric to skin (fashion tape) | local pharmacy or grocery store | Double sided adhesive tape designed for keeping clothing in place over human skin. This is typically available over the counter in pharmacies and variety stores. It is important to use this type of tape as it is designed for gentle adherence to skin. Examples: https://www.amazon.com/Womens-Fashion-Clothing-Transparent-Suitable/dp/B08S3TWR3H/ref=sr_1_40?crid=2UWFL8FMFAKGM&keywords =fashion+tape&qid=1649174406&sprefix= fashion+tape%2Caps%2C70&sr=8-40 https://www.amazon.com/Fearless-Tape-Sensitive-Clothing-Transparent/dp/B07QY8V5XT/ref=sr_1_26?crid=2UWFL8FMFAKGM&keywords =fashion+tape&qid=1649174320&sprefix= fashion+tape%2Caps%2C70&sr=8-26 https://www.amazon.com/Hollywood-Fashion-Secrets-Tape-Floral/dp/B009RX77MK/ref=sr_1_29?crid=2UWFL8FMFAKGM&keywords =fashion+tape&qid=1649174406&sprefix= fashion+tape%2Caps%2C70&sr=8-29 |
|
| Dulbecco's phosphate buffered saline | Gibco / Thermo-Fisher | 14190-144 | Must be sterile; open a new container for every experiment |
| Fetal bovine serum | Gibco / Thermo-Fisher | 26140-079 | |
| Gauze pad | Pro Advantage | P157112 | |
| Gel eye lurbicant | local pharmacy or grocery store | ||
| ImageJ or FIJI analysis software | NIH | ImageJ (FIJI) | |
| Isoflurane | Akorn | J119005 | |
| Leica DMi8 (SP8 platform) with Leica 11506375 objective lens | Leica | DMi8 (SP8) | The objective lens (Leica 11506375) used here is a 25x water immersion lens to allow us to have a high NA (0.95) while approximating the refractive index of the ear tissue. The microscope (Leica DMi8 (SP8 platform) has 488 nm and 638 nm diode laser lines and is equipped with filter-free spectral detection with computer controlled adjustable bandwidth for detection of emission light. The stage must have enough clearance to allow the objective to reach the bottom coverslip without hitting the stage. |
| Low-flow anesthesia system or traditional anesthesia vaporizer | Kent Scientific International | SomnoSuite | |
| Nair hair remover lotion | local pharmacy or grocery store | Over the counter depilatory cream | |
| Nourseothricin | Jena Bioscience | AB-101L | |
| pENO1-NEON-NATR pENO1-iRFP-NATR plasmids | Fluorescent protein expression transformation constructs generously given to us by Dr. Robert Wheeler (Seman, et al., 2018, Infection and Immunity; Bergeron, et al., 2017, Infection and Immunity) | ||
| Pressure sensitive laboratory tape | Tape & Label Graphic Systems Inc | 1007910 | |
| RPMI1640 cell culture medium | Gibco / Thermo-Fisher | 11875-093 | |
| Thimble, plastic 15 mL conical tube, or Falcon 5 mL round bottom polystyrene tubes | Falcon | 352196 | To safely hold the animals ear during injectinos |
References
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