Utilisation de l’imagerie in vivo pour dépister les phénotypes de morphogenèse chez les souches mutantes de Candida albicans au cours d’une infection active chez un mammifère hôte

Summary

Ce manuscrit décrit une méthode de criblage de banques mutantes de Candida albicans de taille moyenne pour les phénotypes de morphogenèse au cours d’une infection active chez un hôte mammifère en utilisant la microscopie confocale non invasive.

Abstract

Candida albicans est un agent pathogène humain important. Sa capacité à basculer entre les formes morphologiques est au cœur de sa pathogenèse; Ces changements morphologiques sont régulés par un réseau de signalisation complexe contrôlé en réponse à des stimuli environnementaux. Ces composants régulateurs ont été très étudiés, mais presque toutes les études utilisent une variété de stimuli in vitro pour déclencher la filamentation. Pour déterminer comment la morphogenèse est régulée au cours du processus de pathogenèse, nous avons développé un système de microscopie in vivo pour obtenir des images à haute résolution spatiale d’organismes subissant la formation d’hyphes chez l’hôte mammifère. Le protocole présenté ici décrit l’utilisation de ce système pour dépister de petites collections de souches mutantes de C. albicans, ce qui nous permet d’identifier les principaux régulateurs de la morphogenèse telle qu’elle se produit sur le site de l’infection. Des résultats représentatifs sont présentés, démontrant que certains régulateurs de la morphogenèse, tels que le régulateur transcriptionnel Efg1, ont des phénotypes cohérents in vitro et in vivo, tandis que d’autres régulateurs, tels que l’adénylcyclase (Cyr1), ont des phénotypes significativement différents in vivo par rapport à in vitro.

Introduction

Candida albicans est un pathogène fongique humain commun, causant des maladies cutanéo-muqueuses, des maladies disséminées et des infections tissulaires localisées¹. Une caractéristique clé de la physiologie de C. albicans est sa croissance polymorphe complexe, qui est liée à son rôle à la fois de commensal et d’agent pathogène 2,3,4. Dans des conditions nutritives riches in vitro à 30 °C, il se développe généralement comme une levure bourgeonnante ovoïde. Une variété de déclencheurs environnementaux, y compris la privation de nutriments, les changements de pH, la croissance à 37 ° C, l’exposition au sérum et la croissance lorsqu’il est incorporé dans l’agar-agar, entraînent la transition vers un modèle de croissance polarisé, entraînant la formation de vrais hyphes et / ou de pseudohyphes⁵. L’initiation de la croissance polarisée et la croissance résultante des organismes filamenteux est appelée morphogenèse.

En raison de l’importance de la morphogenèse dans la virulence de l’organisme, la régulation de la formation des hyphes a été largement étudiée ^6,7. Il existe un réseau complexe de voies de signalisation et de régulation transcriptionnelle qui déclenche la morphogenèse. Malgré la relation entre la morphogenèse de C. albicans et la pathogenèse, la plupart des études portant sur la morphogenèse ont utilisé des stimuli in vitro pour déclencher la formation d’hyphes. Il devient de plus en plus clair que les différents modèles in vitro de filamentation ne sont pas identiques en termes de voies de régulation individuelles stimulées. De plus, aucune condition de croissance in vitro ne correspond étroitement à l’environnement complexe de l’hôte. Compte tenu de l’importance de C. albicans en tant qu’agent pathogène humain, l’objectif de ce protocole est d’étudier sa morphogenèse au cours d’une infection active chez un hôte mammifère en utilisant un système à débit modéré, permettant ainsi à un chercheur de cribler les bibliothèques de mutants de C. albicans.

Pour faciliter ces investigations, un système d’imagerie in vivo a été développé qui nous permet d’obtenir des images à haute résolution spatiale des cellules de C. albicans lors de l’infection du pavillon d’une souris anesthésiée à l’aide d’un microscope confocale inversé 8,9,10. Parce que la peau du pavillon est assez mince, ces images peuvent être obtenues sans avoir besoin de dissection tissulaire. Ainsi, les données quantitatives de phénotype peuvent être mesurées sur le site des infections actives dans le tissu hôte. Le protocole décrit ici implique la transformation d’une souche de référence et d’une ou plusieurs souches mutantes avec différentes cassettes d’expression protéique fluorescente^11,12. Les souches exprimant des protéines fluorescentes sont ensuite mélangées et co-injectées par voie intradermique. Une fois l’infection établie, l’imagerie confocale est utilisée pour quantifier à la fois la fréquence de filamentation et la longueur des filaments formés. Les données obtenues à partir des souches mutantes sont normalisées à celles obtenues à partir de la souche de référence, qui est présente dans la même région tissulaire, assurant ainsi un contrôle interne. Ce système nous a permis de cribler avec succès plusieurs séries de souches mutantes de C. albicans, dont beaucoup présentent des défauts de morphogenèse in vitro ^9,10. Beaucoup de ces souches filamentent facilement in vivo, ce qui souligne l’importance des modèles in vivo pour l’étude de la morphogenèse.

Protocol

Les études de ce protocole ont été approuvées par le Comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux (IACUC) de l’Université de l’Iowa. Se reporter aux lignes directrices des CDC sur l’équipement et les procédures de travail avec des organismes BSL2¹³.

1. Préparation des souches de Candida albicans

1. Identifier une souche de référence appropriée à utiliser comme témoin positif. S’assurer que cette souche correspond étroitement aux souches expérimentales en termes de lignée et de manipulations génétiques.
   NOTE: Pour les expériences représentatives présentées ici, les mutants ont été créés à partir des souches décrites dans Homann, et ^al.14, qui ont été construites à partir de SN152. Ces mutants sont Arg^-. Par conséquent, la souche de référence sélectionnée était SN250, qui a également été créée à partir de SN152 et est également Arg^-. Les facteurs de stress nutritionnels sont essentiels dans la régulation de la croissance polarisée chez la levure Saccharomyces cerevisiae¹⁵; ils ont également été impliqués dans la filamentation chez C. albicans et d’autres champignons^16,17,18. Par conséquent, la souche de référence doit être appariée pour les auxotrophies avec les souches expérimentales dans la mesure du possible afin d’éviter les effets confusionnels potentiels du stress nutritionnel.
2. Choisissez des constructions d’expression de protéines fluorescentes. Lors du criblage d’une variété de souches expérimentales, créez une souche de référence qui exprime une protéine fluorescente et utilisez d’autres protéines fluorescentes pour marquer les souches mutantes.
   NOTE: Les données représentatives présentées ici utilisent NEON pour la souche de référence et iRFP pour les souches mutantes. Toute protéine fluorescente peut être utilisée si elle est fortement exprimée, relativement brillante et capable d’être excitée / détectée par le microscope utilisé. Les expériences de contrôle comparant des souches de référence qui expriment différentes protéines fluorescentes n’ont démontré aucun impact de l’expression des protéines fluorescentes sur la morphogenèse.
3. Transformez les souches avec des constructions d’expression de protéines fluorescentes.
   REMARQUE : De nombreux établissements exigent l’utilisation de précautions de niveau de sécurité biologique 2 pour travailler avec C. albicans. Tous les travaux doivent respecter les règles de sécurité locales. Indépendamment des réglementations locales, les chercheurs travaillant avec C. albicans doivent être formés à la manipulation sécuritaire de l’organisme.
   1. Transformer les souches de référence et expérimentales à l’aide de protocoles standard d’acétate^{de lithium 19}.
      NOTE: Les expériences décrites ici utilisent les plasmides pENO1-NEON-NAT R et pENO1-iRFP-NAT^R, généreusement fournis par le Dr Robert Wheeler ^11,12. Les plasmides ont été linéarisés à l’aide de NotI⁹.
   2. Sélectionnez les transformants en fonction de la croissance sur la nourséothricine ou un autre milieu de sélection pertinent.
   3. Identifiez les transformateurs qui réussissent. Choisissez une petite noisette de cellules de chaque colonie à l’aide d’un cure-dent, puis mélangez-les en une gouttelette d’eau de 2,5 μL sur une lame de microscope. Appliquez une lame-couverture et examinez à un grossissement de 10x-40x. Examiner avec un système d’imagerie confocale (utilisé pour le reste du protocole) ou tout microscope à fluorescence à grand champ standard. Les transformants appropriés auront un signal lumineux avec des longueurs d’onde d’excitation et d’émission appropriées.
      REMARQUE: Pour les résultats représentatifs, les souches exprimant NEON ont été visualisées à l’aide d’un microscope à fluorescence verticale avec un filtre passe-long avec un filtre d’excitation passe-bande 472/30 nm, un filtre d’émission passe-bande 520/35 nm et un séparateur de faisceau dichroïque à bord unique de 495 nm. Étant donné que l’iRFP n’est pas visible à l’œil, les souches exprimant l’iRFP ont été visualisées à l’aide du système de microscopie confocale utilisé pour l’imagerie in vivo , en utilisant un laser de 638 nm pour l’excitation et la détection de la lumière d’émission de 655 à 755 nm.
      1. Vous pouvez également évaluer la fluorescence macroscopique des colonies à l’aide de la stéréomicroscopie de fluorescence, des systèmes d’excitation de fluorescence portatifs ou des systèmes de détection de fluorescence généralement utilisés pour les gels et les Western blots.
      2. Créer des stocks congélateurs de transformants sélectionnés.
4. Inoculer le milieu solide YPD (extrait de levure peptone dextrose) avec une référence fluorescente exprimant une protéine et des souches expérimentales provenant de stocks de congélation 3 jours avant l’injection, en utilisant un cure-dent pour transférer une noisette d’organismes du stock congélateur au milieu solide YPD. Incuber à 30 °C pendant 2 jours.
5. Pour chaque souche, inoculer une fiole contenant 25 mL de YPD avec des cellules de C. albicans prélevées dans plusieurs colonies 1 jour avant l’injection. Pour ce faire, utilisez un cure-dent pour transférer une noisette d’organismes d’une colonie dans le YPD; Répétez plusieurs fois pour obtenir des cellules de plusieurs colonies différentes. Incuber pendant une nuit à 30 °C dans un incubateur à agitateur orbital à 175 tr/min.
   REMARQUE : Il est important d’utiliser plusieurs colonies comme source pour l’inoculum, car C. albicans a une fréquence élevée d’altérations génétiques spontanées. L’utilisation de plusieurs colonies lors du début de la culture d’inoculum minimise le risque que tous les organismes de l’inoculum proviennent d’un parent présentant des altérations spontanées importantes.
6. Le jour de l’injection :
   1. Centrifuger 1 mL de culture pendant 2 min à 500 x g.
   2. Lavez la culture trois fois avec 1 mL de solution saline tamponnée au phosphate (dPBS) stérile de Dulbecco. Après le lavage final, remettre en suspension la pastille dans 1 mL de dPBS stérile.
   3. Diluer un échantillon de la culture lavée à 1:100 et compter à l’aide d’un hémocytomètre.
   4. Ajuster la densité de la culture lavée à 1 x 10⁸ organismes par mL à l’aide de dPBS.
   5. Pour chaque ensemble de souches à injecter, créer l’inoculum en mélangeant des volumes égaux de la souche de référence et de la ou des souches expérimentales. Cela maintient la densité de l’inoculum à 1 x 10⁸ organismes par mL.
      REMARQUE : Le nombre de souches pouvant être évaluées par oreille est limité par la capacité du système de microscopie utilisé à distinguer clairement le signal de chaque protéine fluorescente.
   6. Une fois l’inoculum préparé, passez directement aux injections animales. Ne conservez pas l’inoculum avant utilisation.

2. Préparation des animaux

1. Obtenir l’approbation du comité local de soin et d’utilisation des animaux de l’établissement ou de l’organisme directeur local concerné.
2. Procurez-vous des souris âgées de 6 à 12 semaines auprès d’un fournisseur ou d’un programme d’élevage. Souris domestiques dans l’installation dans laquelle elles vivront tout au long de l’expérience pendant au moins 1 semaine avant l’inoculation.
   REMARQUE : Pour les résultats représentatifs, des souris DBA2/N femelles âgées de 6 semaines ont été utilisées.
3. Nourrir les animaux sans chlorophylle pendant au moins 7 jours avant l’inoculation.

3. Épilation et inoculation

1. Induire un plan chirurgical d’anesthésie (Figure 1).
   ATTENTION : Les agents anesthésiques inhalés sont des matières dangereuses et peuvent causer une irritation des yeux ou de la peau ainsi qu’une toxicité pour le système nerveux. Toutes les politiques et procédures de l’établissement et les pratiques générales de sécurité des laboratoires pour l’utilisation d’anesthésiques inhalés doivent être suivies. Seules les personnes formées à l’utilisation d’anesthésiques inhalés peuvent effectuer ces étapes. Les pratiques standard comprennent le port de gants, d’une blouse de laboratoire, d’une protection oculaire, l’utilisation d’un système de récupération d’anesthésie et une tenue minutieuse des dossiers conformément aux lignes directrices de l’établissement.
   1. Placez une souris dans une chambre d’induction d’anesthésie préchauffée. Gardez l’animal dans un environnement chaud tout au long de l’anesthésie générale. Pour ce faire, utilisez des coussinets chauffants conçus à cet effet et un étage de microscope chauffé. N’utilisez pas de coussin chauffant en vente libre, car il peut surchauffer et causer des brûlures.
   2. Fournir 2% à 3% d’isoflurane à la chambre d’induction jusqu’à ce que la souris ait perdu son réflexe de redressement et que les respirations soient lentes et régulières. Purger la chambre d’induction de l’anesthésie et transférer l’animal dans un cône nasal non recycleur fournissant 1% à 2% d’isoflurane.
   3. Valider le plan de l’anesthésie à l’aide du réflexe de pincement des orteils ou d’autres mécanismes de vérification. Tout au long de l’expérience, surveillez le schéma respiratoire et le plan anesthésique de l’animal, et ajustez la concentration anesthésique au besoin.
   4. Appliquez un lubrifiant pour les yeux pour prévenir la dessiccation cornéenne.
2. Épilation (Figure 1C,D)
   1. Appliquez généreusement une crème dépilatoire en vente libre sur la surface interne et externe des deux oreilles à l’aide d’un coton-tige.
   2. Après 2-3 minutes (ou selon les instructions du fabricant), essuyez doucement l’oreille avec un tampon de gaze sec pour enlever toute la crème et les cheveux. Essuyez deux fois de plus avec des compresses de gaze saturées d’eau stérile pour éliminer complètement les résidus de crème dépilatoire. Le défaut d’enlever toute la crème dépilatoire entraînera une irritation / inflammation de la peau.
3. Injection (figure 1E, F)
   1. Essuyez la surface de l’oreille à injecter avec un tampon de gaze saturé en éthanol à 70% et laissez sécher à l’air.
   2. Bien mélanger l’inoculum en l’inversant plusieurs fois ou en tourbillonnant.
   3. Aspirer 20 à 30 μL d’inoculum dans une seringue à insuline. En tenant l’aiguille pointée vers le haut, tapotez doucement la seringue pour vous assurer que tout l’air dans le canon est en haut. Éjectez soigneusement l’air et l’excès d’inoculum dans le tube d’inoculum ou un tube de déchets de sorte que le piston soit à la marque de 10 μL.
   4. En portant un dé à coudre sur un doigt ou un pouce de la main non dominante, stabilisez l’oreille en l’enroulant sur le dé à coudre. Vous pouvez également appliquer du ruban adhésif double face en vente libre (ruban adhésif de mode) sur un petit tube en plastique conique ou à fond rond et draper l’oreille sur le ruban. Prenez soin de ne pas déloger le cône nasal d’anesthésie pendant ce processus. Il peut être utile de coller le nez sur la surface de travail.
      REMARQUE: Le côté interne ou externe de l’oreille peut être injecté en fonction du confort physique de l’investigateur. Pour la microscopie, assurez-vous de placer la souris de manière à ce que le côté de l’oreille injectée soit orienté vers la lentille de l’objectif.
   5. En gardant l’aiguille de la seringue presque complètement parallèle à la peau et en évitant les grosses veines, insérez l’extrémité de l’aiguille dans la couche la plus externe de la peau jusqu’à ce que le biseau soit juste couvert.
   6. Injectez lentement l’inoculum par voie intradermique. Une bonne injection intradermique fera monter une petite bulle dans la peau. Gardez l’aiguille en place pendant 15 à 20 secondes avant de la retirer de l’oreille pour minimiser les fuites.
      1. Si le côté inférieur de l’oreille de l’animal devient humide, l’aiguille était trop profonde et passait entièrement à travers l’oreille. Dans ce cas, répétez l’injection dans une zone différente de l’oreille.
   7. Répétez le processus en utilisant l’autre oreille de l’animal. Cela peut être fait avec les mêmes souches de C. albicans pour une réplique ou avec un ensemble différent de souches de C. albicans.
   8. Si ce n’est pas l’imagerie immédiatement, placez l’animal dans une chambre de récupération chauffée. Observez l’animal jusqu’à ce qu’il se soit remis de l’anesthésie, puis retournez-le dans sa cage de logement.
   9. En suivant les protocoles institutionnels, marquer clairement la cage avec des étiquettes de danger biologique et indiquer que les animaux dans la cage sont infectés par Candida albicans.
   10. Remplir tous les dossiers requis liés à l’anesthésie animale et à toute autre pratique institutionnelle requise.
   11. Héberger l’animal dans des conditions animales en utilisant les précautions de niveau de sécurité biologique des animaux 2.

4. Quantifier la morphogenèse in vitro pour comparaison avec les résultats in vivo

1. En utilisant les mêmes cultures lavées que celles utilisées pour préparer l’inoculum, créer une dilution 1:50 des organismes dans du sérum fœtal bovin inactivé à la chaleur RPMI1640 + 10% et incuber à 37 °C avec culbutage pendant 4 h. Alternativement, d’autres milieux qui stimulent la morphogenèse in vitro peuvent être utilisés.
2. Centrifuger l’échantillon pendant 5 min à 500 x g et remettre en suspension dans 0,5 mL de dPBS.
3. Diluer l’échantillon dans un rapport de 1:10, placer 2,5 μL de l’échantillon dilué sur une lame de microscope et le recouvrir d’une lame.
4. Examiner l’échantillon à l’aide d’un microscope à fluorescence. Comptez au moins 100 cellules, en notant le nombre de cellules de levure et de filamenteuses pour chaque souche. Dans les résultats représentatifs présentés ici, une cellule filamenteuse est définie comme toute cellule d’une longueur supérieure à deux fois la longueur de la cellule mère.
   NOTE: La quantification de la morphogenèse in vitro peut être effectuée le même jour que l’inoculation des animaux. Il est possible de lancer le test de morphogenèse in vitro tout en préparant l’inoculum pour l’injection et d’effectuer l’inoculation des animaux pendant la période d’incubation de 4 heures. Si toutes les procédures animales sont terminées avant la fin de la période d’incubation de 4 heures, procéder directement à l’examen des cellules stimulées in vitro . Alternativement, les cellules peuvent être remises en suspension dans du formaldéhyde à 3,7% dans du dPBS (à l’étape 4.2) et stockées à 4 °C pendant plusieurs jours. Les organismes fixes peuvent ensuite être quantifiés si le temps le permet. L’inoculation des animaux ne doit pas être retardée pour l’essai de quantification in vitro .

5. Préparation à l’imagerie in vivo

1. Préparez le microscope (Figure 2A).
   1. Allumez tout l’équipement de microscopie et démarrez le logiciel d’imagerie.
      1. Si disponible, chargez tous les paramètres d’imagerie prédéterminés.
      2. Activer les lasers et les détecteurs nécessaires pour détecter les protéines fluorescentes utilisées.
   2. Allumez l’étage du microscope chauffé et laissez-le chauffer à 37 °C.
      NOTE: Il est possible d’utiliser un microscope avec une chambre environnementale entièrement fermée plutôt qu’une platine chauffée.
   3. Définissez un point de référence de l’axe z dont le plan de mise au point se trouve sur la surface supérieure de la lamelle de couverture.  Cela peut être fait en collant un bordereau de couverture en place sur l’ouverture de la scène et en mettant une gouttelette d’eau sur le couvercle.  Utilisez un objectif « sec » à faible grossissement (10x) pour effectuer la mise au point sur le bord de la gouttelette d’eau, puis définissez le point de référence de l’axe z.  Utilisez un morceau de serviette pour absorber l’eau de la lamelle de couverture avant de la retirer de la scène.
   4. Faites pivoter l’objectif à très longue distance de travail et placez une gouttelette de liquide d’immersion sur l’objectif. Abaissez l’objectif pour éviter d’éventuels dommages lors de la pose de la lame.
   5. Placez un capset #1.5 sur l’ouverture de la scène et collez-le en place. Assurez-vous que le ruban recouvre complètement tous les bords de la lamelle de couverture pour empêcher tout fluide de pénétrer sous la lamelle de couverture dans le microscope. Placez l’objectif au point de référence de l’axe z afin que le fluide d’immersion soit en contact avec la lentille de l’objectif et la lamelle de couverture.
   6. Préparez plusieurs morceaux de ruban adhésif sensible à la pression afin qu’ils soient prêts à l’emploi lors du positionnement du nez et de la souris.
2. Induire une anesthésie générale chez la souris à imager comme ci-dessus (étape 3.1).
3. Positionnez la souris (Figure 2B-D).
   1. Fixez un cône nasal d’anesthésie sur la scène du microscope avec le nez positionné de manière à couvrir complètement le nez de l’animal lorsque celui-ci est en position pour l’imagerie. Cela peut être accompli plus facilement avec deux enquêteurs. Demandez au premier chercheur de placer le nez de la souris anesthésiée dans le nez et de déplacer la souris en position pour l’imagerie tout en continuant à tenir le nez au-dessus du nez de l’animal. Demandez à l’autre enquêteur de scotcher le nez et le tube en place de manière à ce qu’ils reposent de manière stable sur le nez de la souris. Une fois que le nez est collé en place, laissez-le là pour le reste de la séance d’imagerie.
   2. Après avoir établi le meilleur endroit pour placer le nez, notez sa position. Pour les séances d’imagerie ultérieures, le nez peut être fixé à la scène avant d’amener un animal au microscope.
   3. Placez une goutte d’eau stérile sur la lamelle de couverture au-dessus de la lentille de l’objectif.
   4. Placez la souris sur la platine du microscope. Assurez-vous que l’oreille est au-dessus de la gouttelette d’eau et à plat contre la lamelle de couverture.
   5. Utilisez un deuxième couvercle (supérieur) pour aplatir l’oreille.
      1. Placez le bord de la lamelle de couverture parallèle au corps de la souris, le bord touchant la souris à l’endroit où l’oreille rencontre la tête.
      2. Abaissez le bord libre de la lamelle de couverture jusqu’à l’étage du microscope avec un mouvement de charnière. Comme le capot vient contre l’étage du microscope, il aplatira l’oreille. Veillez à ne pas créer de plis ou de crêtes dans l’oreille.
      3. Collez le couvercle supérieur en place de manière à ce qu’il maintienne juste assez de pression pour maintenir l’oreille à plat. Veillez à ne pas attraper les poils ou les moustaches de la souris dans la bande.
   6. À moins qu’un microscope avec une chambre environnementale ne soit utilisé, couvrez lâchement le corps de la souris avec un champ stérile pour maintenir un environnement normothermique.
4. Identifiez un domaine d’intérêt.
   1. Assurez-vous que l’objectif se trouve au point de référence de l’axe z.
   2. À l’aide de la lumière blanche/imagerie à grand champ, ajustez le plan de mise au point dans le tissu de l’oreille. Une bonne stratégie consiste à se concentrer sur les vaisseaux sanguins - si l’on peut voir les globules rouges se déplacer dans les vaisseaux sanguins, le plan de focalisation est à l’intérieur du tissu.
   3. Si le microscope est équipé d’une capacité de fluorescence à grand champ, utilisez-le pour identifier un champ d’intérêt. Si ce n’est pas le cas, utilisez l’imagerie confocale. En général, l’utilisation de la microscopie à grand champ pour identifier les zones d’intérêt est plus rapide et nécessite moins d’irradiation du tissu de l’oreille.
      1. À l’aide d’un cube filtrant pour la détection de la protéine fluorescente exprimée dans la souche de référence, identifiez un champ de vision qui a un signal fluorescent de la souche de référence. Gardez à l’esprit qu’une lumière floue empêchera probablement la capacité de se concentrer sur des organismes individuels. Le but de cette étape est d’identifier un domaine d’intérêt pour l’imagerie confocale.
      2. Passez à un cube filtrant qui détectera la protéine fluorescente exprimée par la ou les souches expérimentales et vérifiera leur présence dans le champ de vision sélectionné.

6. Imagerie

1. Déterminez les paramètres.
   1. Lorsque le logiciel d’imagerie est en mode confocale en direct, examinez le champ d’intérêt lorsque le plan focal est déplacé sur l’axe z. Choisissez un plan de l’axe z avec un signal fort de toutes les protéines fluorescentes utilisées.
   2. Ajustez la puissance du laser et/ou la vitesse d’imagerie pour obtenir un signal suffisamment fort pour que la morphologie puisse être déterminée pour toutes les cellules du champ de vision. Pour éviter les dommages tissulaires, utilisez la puissance laser la plus faible possible.
      REMARQUE: Comme pour toute imagerie, il existe un équilibre entre la puissance laser, la vitesse d’acquisition et la résolution. Identifier les paramètres qui identifient clairement la morphologie de l’organisme tout en équilibrant la vitesse et la puissance laser pour minimiser l’irradiation du tissu de l’oreille. Étant donné que l’imagerie se produit à travers le derme externe, une puissance laser plus élevée est requise pour l’excitation que ce qui est généralement nécessaire pour l’imagerie confocale d’échantillons traditionnels montés sur des lames. Heureusement, le niveau de résolution spatiale requis pour l’analyse de la morphologie n’est pas extrême. Ainsi, il est facilement possible d’obtenir des images avec un signal suffisant pour déterminer la morphologie de l’organisme sans causer de lésions tissulaires.
   3. Une fois ces paramètres établis, utilisez-les tout au long de la session d’imagerie pour servir de point de départ aux séances d’imagerie suivantes. Il est donc utile d’enregistrer les paramètres d’imagerie.
      REMARQUE: Les zones individuelles d’infection peuvent être moins profondes ou plus profondes dans le tissu. Les zones plus profondes peuvent nécessiter une augmentation de la puissance laser. Étant donné que ce test repose sur la distribution spatiale du signal plutôt que sur son intensité, il est acceptable de modifier les paramètres d’image entre les champs au besoin.
2. Obtenez les images.
   1. Choisissez un champ de vision qui présente une formation de filament claire dans la souche de référence et où la plupart des organismes sont suffisamment dispersés pour que leur morphologie puisse être déterminée.
   2. Définissez les plans de mise au point supérieur et inférieur d’une pile z. Il n’est pas nécessaire de couvrir toute la profondeur de la zone infectée, mais gardez à l’esprit que les organismes situés en haut ou en bas du volume imagé sont généralement exclus de l’analyse.
   3. Acquérir des images z-stack, pseudo colorer chaque canal pour distinguer chaque souche et superposer les canaux. Enregistrez les images.
   4. Répétez l’opération pour les autres champs de vision. La morphogenèse peut varier d’un endroit à l’autre; Par conséquent, il est important d’acquérir et d’analyser au moins trois champs de chaque oreille.

7. Analyse bidimensionnelle manuelle : fréquence de filamentation

1. Utilisez un logiciel d’imagerie pour effectuer une projection maximale de la pile z dans une image bidimensionnelle. Les instructions fournies ici sont pour FIJI/Image J.
   1. Ouvrez des images de microscopie à l’aide du logiciel ImageJ.
   2. Si nécessaire, appliquez une pseudo-couleur sur chaque canal pour permettre une identification simple de chaque souche de C. albicans. Pour cela, cliquez sur Image > Lookup Table > LUT Color et sélectionnez la pseudo-couleur choisie.
   3. Convertissez le fichier de pile en une image bidimensionnelle de projection d’intensité maximale :
      1. Sélectionnez le fichier z-stack. Cliquez sur Image > Stacks > Z Projection.
      2. Sélectionnez les plans supérieur et inférieur et sélectionnez le type de projection Intensité maximale.
2. Compter chaque organisme vu dans les images de projection maximale par type de souche (distingué par la couleur du canal) et la morphologie.
   1. Les organismes qui se chevauchent considérablement ou les zones à très forte densité d’organismes seront difficiles à compter avec précision. Excluez-les du dénombrement, mais veillez à ne pas introduire de biais contre les formes filamenteuses, qui sont plus susceptibles de se chevaucher.
   2. Les formes filamenteuses projetant directement dans ou hors de la pile z apparaîtront comme de petits objets ronds dans une projection maximale. De même, les organismes qui sont coupés par la bordure de l’image peuvent sembler être de la levure parce que le filament est hors du champ de vision. Ainsi, l’analyse bidimensionnelle surestimera toujours le pourcentage de formes de levure. Comme cela se produira de la même manière avec la souche de référence et la souche expérimentale, comparez toujours les résultats expérimentaux à ceux d’une souche de référence.
3. Effectuer des comparaisons statistiques des résultats dictées par le plan expérimental.

8. Analyse bidimensionnelle manuelle : longueur du filament

1. Pour C. albicans, la formation aberrante de filaments peut se produire parce que: a) moins de cellules de levure « mères » subissent une morphogenèse, b) les filaments se développent à un rythme plus lent, ou c) la croissance filamenteuse est initiée mais non maintenue. Pour évaluer ces possibilités, quantifier la longueur du trajet de la courbe de chaque filament dans l’image de projection maximale comme substitut de la longueur tridimensionnelle réelle (discutée ci-dessous).
   1. Lorsqu’un bourgeon se développe sur une cellule mère, il n’est pas possible de dire s’il deviendra un filament ou une levure. Pour vous assurer que seules les cellules filamenteuses sont incluses dans cette analyse, mesurer uniquement les organismes dans lesquels la cellule fille est au moins deux fois plus longue que la cellule mère.
2. Ouvrez l’image de projection maximale créée à l’étape 7.
3. Dans le jeu d’outils ImageJ, cliquez avec le bouton droit sur l’outil Ligne droite/segmentée et choisissez l’option Ligne segmentée. L’option de ligne segmentée permet à l’utilisateur de mesurer la longueur du filament le long d’un chemin courbe, une nécessité compte tenu de la plasticité des filaments de C. albicans.
4. Mesurez la longueur du filament du col du bourgeon à l’extrémité croissante du filament. Faites un clic gauche sur le col du bourgeon; Le pointeur se transforme en un petit carré. Tracez le filament le long de sa longueur, en cliquant sur le centre du filament chaque fois qu’il y a une courbe, un tour ou un changement de l’axe long du filament. Double-cliquez à l’extrémité croissante du filament.
5. Appuyez sur Ctrl + M. Cela ouvrira une fenêtre contextuelle qui tabulera les mesures de surface, moyenne, min, max et longueur. Après avoir mesuré chaque filament, appuyez à nouveau sur Ctrl + M pour ajouter la mesure actuelle au tableau des mesures.
6. Lorsque tous les filaments ont été mesurés, copiez et collez les mesures de longueur dans un fichier d’analyse de données.
7. Effectuer une analyse statistique pour évaluer la distribution des longueurs de filament dans la souche de référence et la souche mutante.

9. Analyse tridimensionnelle manuelle

1. Pour obtenir une mesure plus précise de la morphogenèse qui évite la surestimation des formes de levure et peut permettre la discrimination entre pseudohyphes et hyphes, faites défiler manuellement la pile z de haut en bas tout en évaluant la morphologie de chaque organisme en trois dimensions.
2. Vous pouvez également créer une image tridimensionnelle de chaque pile Z et analyser la forme de chaque organisme tout en faisant pivoter l’image.

10. Analyse automatisée

1. À l’aide du logiciel d’imagerie, automatisez le dénombrement des organismes et leur morphologie en deux ou trois dimensions.
   NOTE: Certains algorithmes pour la discrimination des types morphologiques peuvent introduire un biais. Ainsi, les stratégies d’automatisation doivent être soigneusement validées par rapport à la conception expérimentale. Une analyse d’image automatisée bien conçue et validée peut augmenter le débit de l’étape d’analyse.

Representative Results

Les résultats présentés ici sont basés sur des rapports publiés antérieurement ^9,10. Le but de cette analyse est d’évaluer quantitativement la capacité des souches mutantes de C. albicans à subir une morphogenèse au cours d’infections actives. Les paramètres typiques qui distinguent les pseudohyphes des hyphes peuvent être difficiles à évaluer chez les organismes poussant en trois dimensions dans un environnement complexe in vivo. Cela est particulièrement vrai lorsque l’on examine les sections transversales bidimensionnelles créées par l’imagerie confocale. Par conséquent, cette analyse préalable est axée sur l’identification des organismes qui se développent sous forme de filamenteux par rapport à la levure. Pour les études de suivi utilisant une analyse plus approfondie, y compris les reconstructions tridimensionnelles, cette méthode pourrait être adaptée pour discriminer les levures, les hyphes et les pseudohyphes.

L’expression d’une protéine fluorescente dans une souche de référence ou mutante de C. albicans permet une détection directe de la morphologie de la souche in vivo (Figure 3 et Figure 4). En général, l’analyse quantitative par microscopie optique est mieux effectuée lorsque peu ou pas de pixels de l’image sont saturés. Pour ce protocole, cependant, une saturation de l’image simplifie souvent l’analyse. La localisation des protéines fluorescentes n’est pas uniforme dans toute la cellule et est souvent plus élevée dans la levure mère que dans les filaments. Heureusement, pour l’étude de la morphogenèse, la distribution spatiale du signal, plutôt que son intensité, définit le résultat. Par conséquent, l’obtention d’images dans lesquelles de nombreux pixels sont saturés améliore la capacité de quantifier la morphogenèse dans ce test.

Pour illustrer l’importance de l’évaluation de la morphogenèse in vivo, des résultats représentatifs sont présentés pour la souche de référence (SN250) et deux mutants : l’un dépourvu du facteur de transcription Efg1 et l’autre dépourvus d’adénylyl cyclase Cyr1. In vitro, aucune de ces souches ne se développe sous forme de filaments^20,21. Lorsqu’elle est cultivée in vitro en milieu RPMI complété par 10% de sérum, la souche de référence forme rapidement des filaments, contrairement aux souches efg1ΔΔ et cyr1ΔΔ (Figure 3 et Figure 4). Dans ces conditions, le mutant efg1ΔΔ présente une croissance quelque peu polarisée, les cellules filles étant légèrement allongées par rapport aux cellules mères. Cela souligne l’importance d’utiliser une définition claire de la filamentation. Une telle définition est par défaut arbitraire, mais elle est nécessaire pour une évaluation cohérente du phénotype. Pour ces études, un modèle filamenteux de croissance est défini comme un organisme avec la plus longue dimension d’une cellule fille plus de deux fois celle de la cellule mère. En utilisant cette définition, les cellules EFG1ΔΔ allongées ne sont pas filamenteuses.

Conformément à son phénotype in vitro, l’efg1 ΔΔ présente un défaut de filamentation important in vivo : environ 9 % des cellules efg1ΔΔ se sont développées sous forme de filaments in vivo (Figure 3). En revanche, 53% des cellules mutantes cyr1ΔΔ se sont développées sous forme de filaments in vivo (Figure 4). Bien que le nombre de cellules mutantes cyr1 ΔΔ subissant une filamentation in vivo soit significativement inférieur à la souche de référence, la capacité du mutant cyr1ΔΔ à former des filaments in vivo représente un changement substantiel par rapport à son absence totale de morphogenèse in vitro. Visuellement, les filaments formés par le mutant cyr1ΔΔ semblaient plus courts que la souche de référence. Pour évaluer cela quantitativement, la longueur du trajet de la courbe des cellules filamenteuses a été mesurée à l’aide d’une projection bidimensionnelle des images in vivo (Figure 4E). La longueur médiane des filaments cyr1ΔΔ était 29 % plus courte que celle des filaments de la souche de référence.

Figure 1 : Anesthésie et inoculation. (A) Induction de l’anesthésie à l’aide d’une chambre d’induction. (B) L’anesthésie est maintenue à l’aide d’un cône nasal, ce qui permet à la souris d’être repositionnée au besoin. (C) La crème dépilatoire est appliquée à l’aide d’un applicateur à embout de coton. Un gel lubrifiant pour les yeux a été appliqué pour protéger les yeux pendant l’anesthésie. (D) Épilation efficace de l’oreille droite. Comparer à l’oreille gauche non traitée. (E) Injection intradermique de C. albicans dans l’oreille de la souris. L’oreille est maintenue en place à l’aide de l’extrémité d’un tube conique enveloppé de ruban adhésif double face (ruban de mode). (F) Gros plan de l’injection intradermique. Une bulle pâle se forme dans la peau, signe d’un placement intradermique réussi. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Préparation pour l’imagerie. (A) Étage de microscope préparé pour l’imagerie. Le cône nasal d’anesthésie est fixé en place. Un capuchon est collé sur la scène recouvrant l’ouverture de l’objectif. D’autres morceaux de ruban adhésif sont disponibles. L’étage chauffé est préchauffé à 37 °C (non représenté). (B) Mise en place de la souris anesthésiée dans le cône nasal d’anesthésie. (C) La souris est légèrement tournée de sorte que le côté de l’oreille inoculée soit orienté vers la lentille inférieure du couvercle. L’oreille est ensuite aplatie contre le couvercle inférieur et fixée en place en plaçant une deuxième lamelle de couverture sur le dessus de l’oreille. (D) La lamelle supérieure est collée à la scène pour maintenir l’oreille en place par rapport à l’étage du microscope. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : Morphologie in vitro et in vivo de la souche mutante efg1ΔΔ. (A) Image grand champ de souches mutantes WT et efg1ΔΔ après induction in vitro de filamentation par des cellules en croissance dans RPMI + sérum à 10 % à 37 °C pendant 4 h. Les barres d’échelle représentent 10 μm. Le contraste de l’image a été ajusté à l’aide d’un logiciel de retouche photo pour faciliter la visualisation. (B) Pourcentage de filamentation in vitro observé chez les souches mutantes WT et efg1ΔΔ. Und = indétectable (aucun filament n’a été détecté). La hauteur de la barre représente le pourcentage médian de cellules filamenteuses provenant de trois expériences indépendantes dans lesquelles au moins 100 cellules ont été quantifiées. Les barres d’erreur indiquent l’écart-type (résultats comparés par test t de Student, p < 0,001). (C) Micrographie confocale de WT (vert) et du mutant efg1ΔΔ (rouge) poussant in vivo 24 heures après l’inoculation. Les flèches indiquent des exemples de cellules mutantes efg1ΔΔ qui répondent à notre définition de « filamenteux ». La barre d’échelle représente 50 μm. (D) Pourcentage de filamentation in vivo observé dans les souches mutantes WT et efg1ΔΔ. La hauteur de la barre représente le pourcentage médian de cellules filamenteuses provenant de deux expériences indépendantes. Les barres d’erreur indiquent l’écart-type (résultats comparés par le test t de Student, p < 0,001). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4 : Morphologie in vitro et in vivo de la souche mutante cyr1 ΔΔ. (A) Image grand champ de la souche mutante cyr1ΔΔ après induction in vitro de filamentation par des cellules en croissance dans RPMI + sérum à 10 % à 37 °C pendant 4 h. La barre d’échelle représente 10 μm. Le contraste de l’image a été ajusté à l’aide d’un logiciel de retouche photo pour faciliter la visualisation. (B) Pourcentage de filamentation in vitro observé chez les souches mutantes WT et cyr1ΔΔ. Und = indétectable (aucun filament n’a été détecté). La hauteur de la barre représente le pourcentage médian de cellules filamenteuses provenant de trois expériences indépendantes dans lesquelles au moins 100 cellules ont été quantifiées. Les barres d’erreur indiquent l’écart-type (résultats comparés par test t de Student, p < 0,001). (C) Micrographie confocale de WT (vert) et du mutant cyr1ΔΔ (rouge) poussant in vivo 24 heures après l’inoculation. La barre d’échelle représente 50 μm. (D) Pourcentage de filamentation in vivo observé dans les souches mutantes WT et cyr1ΔΔ. La hauteur de la barre représente le pourcentage médian de cellules filamenteuses provenant de deux expériences indépendantes. Les barres d’erreur indiquent l’écart-type (résultats comparés par test t de Student, p < 0,001). (E) Distribution de la longueur du filament in vivo, mesurée par la longueur du trajet de la courbe dans une projection bidimensionnelle de la pile Z. Chaque point représente la longueur d’un filament. Les cellules se développant sous forme de levure n’ont pas été incluses dans cette analyse. La barre indique la longueur médiane du filament. La distribution des longueurs est significativement différente lorsqu’elle est analysée à l’aide d’un test U de Mann-Whitney (p < 0,001). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Discussion

Ce modèle utilise la microscopie confocale pour obtenir des images des organismes de C. albicans lorsqu’ils se développent dans le tissu d’un hôte mammifère, ce qui nous permet d’évaluer les phénotypes de morphogenèse au cours d’une infection active. Le processus de morphogenèse est au cœur de la pathogenèse de C. albicans et a été largement étudié à l’aide d’une variété d’essais in vitro ^2,3,4. Cependant, aucun essai in vitro ne peut modéliser complètement l’environnement biochimique et structurel complexe de l’hôte.

Le protocole décrit ici est axé sur l’utilisation de ce système d’imagerie in vivo pour cribler une série / bibliothèque de mutants de C. albicans afin d’identifier les gènes impliqués dans la morphogenèse au cours de l’infection. L’utilisation de souches de C. albicans exprimant différentes protéines fluorescentes permet de quantifier la morphogenèse in vivo des souches mutantes de C. albicans par rapport à celle d’une souche de référence. La comparaison de la morphogenèse chez le mutant à la souche de référence dans la même zone d’infection garantit que les organismes sont exposés à des environnements identiques. Cela permet de mesurer quantitativement le pourcentage de cellules subissant une filamentation, ainsi que l’étendue de la filamentation. La normalisation des mesures de la ou des souches mutantes à celles de la souche de référence permet de mieux comparer les performances d’un mutant à un autre.

Les résultats représentatifs présentés ici démontrent le potentiel d’un écart important entre les phénotypes in vitro et in vivo . La souche mutante de C. albicans efg1ΔΔ est souvent utilisée comme témoin négatif pour les essais de morphogenèse car elle ne parvient pas à filamenter dans presque toutes les conditions in vitro ²⁰. Bien que les résultats in vivo aient été très similaires aux résultats in vitro , même cette souche gravement entravée a parfois formé des filaments dans l’environnement du tissu hôte (Figure 3). Cela souligne la force de l’environnement hôte dans le déclenchement de la morphogenèse.

En revanche, la souche mutante cyr1ΔΔ présente une discordance substantielle entre la croissance in vitro et in vivo; Bien qu’aucune des cellules mutantes ne subisse de filamentation in vitro, environ la moitié des cellules se développent sous forme de filaments in vivo (Figure 4)^10,21. Fait intéressant, ces filaments étaient significativement plus courts que ceux formés par la souche de référence, ce qui suggère que CYR1 contribue soit au taux de croissance du filament, soit à la capacité de maintenir un phénotype filamenteux. Pour faciliter l’analyse de la longueur du filament, la longueur du trajet de courbe des filaments a été mesurée à l’aide d’une projection bidimensionnelle des images. Dans les projections bidimensionnelles de filaments se développant en trois dimensions, tout filament croissant sur un axe qui n’est pas parallèle au plan xy se projettera comme plus court que sa longueur réelle. Comme ce raccourcissement se produit également pour la déformation de référence, l’évaluation de la distribution des longueurs de filament dans une projection bidimensionnelle permet toujours une comparaison quantitative entre les souches de référence et mutantes. L’analyse de la longueur du filament en deux dimensions plutôt qu’en trois dimensions nécessite une analyse d’image moins intensive; Ainsi, il peut être effectué relativement rapidement sur un ordinateur de bureau typique. L’utilisation de cette analyse plus simple permet d’inclure la distribution de la longueur du filament dans le cadre d’un protocole de dépistage, ce qui donne une compréhension plus nuancée de la capacité de chaque mutant à subir une morphogenèse sans causer de retards substantiels dans le débit.

Les études représentatives présentées ici ont été réalisées sur des souris DBA2/N, qui présentent un défaut dans leur système du complément entraînant un échec du recrutement des neutrophiles sur le site de l’infection à C. albicans ²². Le but de ces études était d’étudier les mécanismes de régulation de la filamentation de C. albicans dans le tissu hôte. Par conséquent, des souris DBA2/N ont été utilisées pour éviter de confondre les résultats en raison de la sensibilité ou de la résistance d’une souche individuelle aux neutrophiles. Comme la réponse anti-C. albicans des neutrophiles peut avoir un impact sur la filamentation²³, le recrutement des neutrophiles sur le site d’infection pourrait avoir un impact sur les résultats d’un test de morphogenèse. Si une souche est capable de filamenter in vivo mais est fortement inhibée par la filamentation lorsque des neutrophiles sont présents, la filamentation serait détectée chez les souris DBA2/N, mais il serait peu probable qu’elle soit observée lors de l’utilisation de souris ayant une chimiotaxie neutrophile intacte. Ainsi, la souche de la souris utilisée comme hôte est un facteur important lors de l’utilisation de ce protocole.

Il est peu probable que l’observation selon laquelle la souche mutante efg1ΔΔ ne parvient pas à filamenter in vivo soit liée aux réponses des neutrophiles de l’hôte, car cette souche ne parvient pas non plus à filamenter in vitro. La filamentation observée in vivo avec la souche cyr1ΔΔ est discordante avec son échec de filamentation in vitro. Les données du modèle de l’infection à C. albicans chez le poisson zèbre indiquent que les neutrophiles réagissant sont importants dans la prévention de la morphogenèse²⁴. Par conséquent, il est peu probable que l’utilisation de souris DBA2/N, qui n’ont pas de réponses neutrophiles, explique l’augmentation de la filamentation du cyr1ΔΔ in vivo par rapport à in vitro. Néanmoins, l’environnement in vivo a clairement un impact sur la morphogenèse de la souche cyr1ΔΔ ; par conséquent, une étude plus approfondie de cette souche peut fournir des informations importantes sur la régulation de la morphogenèse de C. albicans au cours d’infections actives. Le protocole décrit ici est conçu comme un test de dépistage pour identifier des souches telles que la souche cyr1ΔΔ à utiliser dans de futures études.

L’utilisation d’un système d’anesthésie gazeuse à faible débit est très utile pour ce protocole (Figure 1A,B). Au cours du développement initial de ce protocole, les souris ont été anesthésiées à l’aide d’un cocktail anesthésique injectable de kétamine mélangé à de la xylazine. Bien qu’il ait été possible d’effectuer une imagerie limitée avec cette méthode anesthésique, la durée de l’anesthésie était imprévisible, nécessitant la fin rapide des séances d’imagerie pour éviter que la souris ne se remette de l’anesthésie pendant l’imagerie. Les systèmes anesthésiques inhalés traditionnels sont encombrants et nécessitent des débits élevés de gaz anesthésiques, ce qui nécessite souvent leur utilisation dans une hotte. Ainsi, les systèmes anesthésiques inhalés traditionnels seraient très difficiles à utiliser avec les contraintes d’espace d’un microscope confocal sans exposer par inadvertance les chercheurs aux agents anesthésiques. L’utilisation d’un système anesthésique inhalé à faible débit permet une anesthésie constante de l’animal tout en maintenant un environnement sécuritaire pour l’investigateur. Le nez à faible débit permet un positionnement facile de l’animal pour l’inoculation et la microscopie. Le tube d’administration de petit calibre et de faible volume permet l’utilisation de tubes relativement longs, ce qui permet de placer l’appareil d’anesthésie à une distance suffisante pour ne pas interférer avec la microscopie.

La chlorophylle présente dans le chow typique de la souris conduit à une autofluorescence tissulaire significative²⁵. Cela crée un bruit important dans les images, ce qui rend difficile l’obtention d’images de haute qualité et de haute résolution spatiale. Lorsque les animaux ont été nourris avec du chow exempt de chlorophylle pendant 7 jours avant l’imagerie, le bruit de fond de l’autofluorescence a été considérablement diminué dans les tissus, mais la chlorophylle déposée dans les poils a continué à être problématique. L’épilation des pennes à l’aide d’une crème dépilatoire chimique en vente libre est efficace pour minimiser l’autofluorescence des cheveux (Figure 1C,D). Ainsi, la combinaison de chow sans chlorophylle et d’épilation adéquate a considérablement réduit l’autofluorescence et amélioré considérablement la qualité de l’image. Parce que les poils sont retirés de l’oreille avant l’imagerie, la couleur des poils de l’animal n’a pas d’impact sur ce système. Ce protocole a été utilisé avec succès pour étudier les infections à C. albicans chez les souris BALB/c (blanche), C57BL/6 (noire) et DBA2/N (brune). Le protocole peut également être utilisé avec des souris knockout C57BL/6 déficientes en divers gènes de l’hôte; Cela permettra d’étudier à l’avenir l’impact du système immunitaire de l’hôte mammifère sur la filamentation. Une caractéristique de ce modèle non abordée dans ce protocole est que, parce que ce système d’imagerie est non invasif, le même animal peut être imagé à plusieurs reprises sur plusieurs jours, ce qui permet de suivre la progression de l’infection individuelle au fil du temps. Cette caractéristique jouera probablement un rôle clé dans les futures études sur l’interaction hôte-pathogène.

En résumé, ce protocole permet d’obtenir des images à haute résolution spatiale de C. albicans poussant dans le tissu d’un mammifère hôte vivant, ce qui permet une évaluation précise de la morphogenèse des souches mutantes ^8,9,10. Les résultats présentés ici démontrent comment ce protocole peut être utilisé pour cribler une bibliothèque de mutants de C. albicans. Parmi les mutants de C. albicans testés à ce jour, une grande partie des mutants présentant des défauts connus de morphogenèse in vitro subissent facilement une filamentation in vivo ^9,10. Cela souligne l’importance d’inclure un système in vivo comme celui-ci dans des expériences conçues pour élucider les mécanismes de la pathogenèse de C. albicans.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
#1.5 coverslips	Thermo-Fisher	20811	large enough to cover the universal stage opening
0.1 mL Insulin syringes	EXELint	26018	Can use syringes that are 5/16"–1/2" long and 29–32 G
3.7% formaldehyde in dPBS	Sigma-Aldrich	SHBJ5734
70% Ethanol/30% water	Decon Laboratories	A05061001A
Alcohol prep pads	Covidien	5110	Alternative: gauze pads soaked in 70% isopropyl alcohol
C.albicans reference strain and experimental strains	SN250	FGSC Online Catalog	The specific C. albicans strain varies with experiment and the investigators goals. We have used strains derived from SC5314 as well as other clinical isolates.
Chlorophyl free mouse chow	Envigo	2920x
Computer	Dell	Optiplex 7050	Computer that can run imaging software for acquisition and for analysis of images. A variety of imaging software is available and varies with the specific microscope and user system.
Cotton tip applicator	Pro Advantage	76200
DBA2/N (6-12 week old mice)			BALB/c and C57/BL6 mice can also be used.  The latter allow for the use of widely available knockout mouse models as well as mouse models in which individual cell types, such as phagocytes, are identified by their expression of fluorescent proteins.
Double sided tape designed to hold fabric to skin (fashion tape)	local pharmacy or grocery store		Double sided adhesive tape designed for keeping clothing in place over human skin.  This is typically available over the counter in pharmacies and variety stores.  It is important to use this type of tape as it is designed for gentle adherence to skin.  Examples:  https://www.amazon.com/Womens-Fashion-Clothing-Transparent-Suitable/dp/B08S3TWR3H/ref=sr_1_40?crid=2UWFL8FMFAKGM&keywords =fashion+tape&qid=1649174406&sprefix= fashion+tape%2Caps%2C70&sr=8-40 https://www.amazon.com/Fearless-Tape-Sensitive-Clothing-Transparent/dp/B07QY8V5XT/ref=sr_1_26?crid=2UWFL8FMFAKGM&keywords =fashion+tape&qid=1649174320&sprefix= fashion+tape%2Caps%2C70&sr=8-26 https://www.amazon.com/Hollywood-Fashion-Secrets-Tape-Floral/dp/B009RX77MK/ref=sr_1_29?crid=2UWFL8FMFAKGM&keywords =fashion+tape&qid=1649174406&sprefix= fashion+tape%2Caps%2C70&sr=8-29
Dulbecco's phosphate buffered saline	Gibco / Thermo-Fisher	14190-144	Must be sterile; open a new container for every experiment
Fetal bovine serum	Gibco / Thermo-Fisher	26140-079
Gauze pad	Pro Advantage	P157112
Gel eye lurbicant	local pharmacy or grocery store
ImageJ or FIJI analysis software	NIH	ImageJ (FIJI)
Isoflurane	Akorn	J119005
Leica DMi8 (SP8 platform) with Leica 11506375 objective lens	Leica	DMi8 (SP8)	The objective lens  (Leica 11506375) used here  is a 25x water immersion lens to allow us to have a high NA (0.95) while approximating the refractive index of the ear tissue. The microscope (Leica DMi8 (SP8 platform) has 488 nm and 638 nm diode laser lines and is equipped with filter-free  spectral detection with computer controlled adjustable bandwidth for detection of emission light. The stage must have enough clearance to allow the objective to reach the bottom coverslip without hitting the stage.
Low-flow anesthesia system or traditional anesthesia vaporizer	Kent Scientific International	SomnoSuite
Nair hair remover lotion	local pharmacy or grocery store		Over the counter depilatory cream
Nourseothricin	Jena Bioscience	AB-101L
pENO1-NEON-NATR pENO1-iRFP-NATR plasmids			Fluorescent protein expression transformation constructs  generously given to us by Dr. Robert Wheeler (Seman, et al., 2018, Infection and Immunity; Bergeron, et al., 2017, Infection and Immunity)
Pressure sensitive laboratory tape	Tape & Label Graphic Systems Inc	1007910
RPMI1640 cell culture medium	Gibco / Thermo-Fisher	11875-093
Thimble, plastic 15 mL conical tube, or Falcon 5 mL round bottom polystyrene tubes	Falcon	352196	To safely hold the animals ear during injectinos