Uso dell'imaging in vivo per lo screening dei fenotipi di morfogenesi in ceppi mutanti di Candida albicans durante l'infezione attiva in un ospite di mammifero

Summary

Questo manoscritto descrive un metodo per lo screening di librerie mutanti di Candida albicans di dimensioni moderate per fenotipi di morfogenesi durante l'infezione attiva in un ospite di mammifero utilizzando la microscopia confocale non invasiva.

Abstract

La Candida albicans è un importante agente patogeno umano. La sua capacità di passare da una forma morfologica all'altra è fondamentale per la sua patogenesi; Questi cambiamenti morfologici sono regolati da una complessa rete di segnalazione controllata in risposta a stimoli ambientali. Questi componenti regolatori sono stati altamente studiati, ma quasi tutti gli studi utilizzano una varietà di stimoli in vitro per innescare la filamento. Per determinare come la morfogenesi è regolata durante il processo di patogenesi, abbiamo sviluppato un sistema di microscopia in vivo per ottenere immagini ad alta risoluzione spaziale di organismi sottoposti a formazione di ife all'interno dell'ospite mammifero. Il protocollo qui presentato descrive l'uso di questo sistema per lo screening di piccole collezioni di ceppi mutanti di C. albicans, permettendoci di identificare i regolatori chiave della morfogenesi mentre si verifica nel sito di infezione. Vengono presentati risultati rappresentativi, dimostrando che alcuni regolatori della morfogenesi, come il regolatore trascrizionale Efg1, hanno fenotipi coerenti in vitro e in vivo, mentre altri regolatori, come l'adenilciclasi (Cyr1), hanno fenotipi significativamente diversi in vivo rispetto a quelli in vitro.

Introduction

La Candida albicans è un comune agente patogeno fungino umano, che causa malattie mucocutanee, malattie disseminate e infezioni tissutali localizzate¹. Una caratteristica chiave della fisiologia di C. albicans è la sua complessa crescita polimorfica, che è legata al suo ruolo sia come commensale che come patogeno 2,3,4. In condizioni di ricche sostanze nutritive in vitro a 30 °C, cresce tipicamente come lievito ovoidale in erba. Una varietà di fattori scatenanti ambientali, tra cui la privazione di nutrienti, i cambiamenti di pH, la crescita a 37 ° C, l'esposizione al siero e la crescita quando incorporati nell'agar, provocano la transizione verso un modello di crescita polarizzato, con conseguente formazione di vere ife e / o pseudoife⁵. L'inizio della crescita polarizzata e la conseguente crescita di organismi filamentosi è indicato come morfogenesi.

A causa dell'importanza della morfogenesi nella virulenza dell'organismo, la regolazione della formazione delle ife è stata ampiamente studiata ^6,7. Esiste una complessa rete di vie di segnalazione e regolazione trascrizionale che innesca la morfogenesi. Nonostante la relazione della morfogenesi di C. albicans con la patogenesi, la maggior parte degli studi che studiano la morfogenesi hanno utilizzato stimoli in vitro per innescare la formazione di ifele. Sta diventando sempre più chiaro che i vari modelli in vitro di filamento non sono identici in termini di percorsi regolatori individuali stimolati. Inoltre, nessuna condizione di crescita in vitro corrisponde strettamente al complesso ambiente dell'ospite. Data l'importanza di C. albicans come patogeno umano, l'obiettivo di questo protocollo è quello di studiare la sua morfogenesi durante l'infezione attiva in un ospite di mammifero utilizzando un sistema con throughput moderato, consentendo così a un investigatore di esaminare le librerie mutanti di C. albicans.

Per facilitare queste indagini, è stato sviluppato un sistema di imaging in vivo che ci permette di ottenere immagini ad alta risoluzione spaziale delle cellule di C. albicans durante l'infezione del padiglione auricolare di un topo anestetizzato utilizzando un microscopio confocale invertito 8,9,10. Poiché la pelle del padiglione auricolare è piuttosto sottile, queste immagini possono essere ottenute senza la necessità di dissezione tissutale. Pertanto, i dati quantitativi sul fenotipo possono essere misurati nel sito di infezioni attive all'interno del tessuto ospite. Il protocollo qui descritto prevede la trasformazione di un ceppo di riferimento e di uno o più ceppi mutanti con diverse cassette di espressione proteica fluorescente^11,12. I ceppi fluorescenti che esprimono proteine vengono quindi miscelati e co-iniettati per via intradermica. Dopo che l'infezione è stata stabilita, l'imaging confocale viene utilizzato per quantificare sia la frequenza della filamento che la lunghezza dei filamenti formati. I dati ottenuti dai ceppi mutanti sono normalizzati a quelli ottenuti dal ceppo di riferimento, che è presente nella stessa regione tissutale, fornendo così un controllo interno. Questo sistema ci ha permesso di selezionare con successo diverse serie di ceppi mutanti di C. albicans, molti dei quali presentano difetti di morfogenesi in vitro ^9,10. Molti di questi ceppi filano facilmente in vivo, evidenziando l'importanza dei modelli in vivo per lo studio della morfogenesi.

Protocol

Gli studi in questo protocollo sono stati approvati dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali (IACUC) dell'Università dell'Iowa. Fare riferimento alle linee guida CDC per le attrezzature e le procedure per lavorare con organismi BSL2¹³.

1. Preparazione dei ceppi di Candida albicans

1. Identificare un ceppo di riferimento appropriato da utilizzare come controllo positivo. Assicurarsi che questo ceppo corrisponda strettamente ai ceppi sperimentali in termini di lignaggio e manipolazioni genetiche.
   NOTA: Per gli esperimenti rappresentativi qui presentati, i mutanti sono stati creati dai ceppi descritti in Homann, et ^al.14, che sono stati costruiti da SN152. Questi mutanti sono Arg^-. Pertanto, il ceppo di riferimento selezionato era SN250, anch'esso creato da SN152 ed è anche Arg^-. I fattori di stress nutrizionale sono fondamentali nella regolazione della crescita polarizzata nel lievito Saccharomyces cerevisiae¹⁵; sono stati anche implicati nella filamento in C. albicans e altri funghi^16,17,18. Pertanto, il ceppo di riferimento deve essere abbinato per gli auxotrofi con i ceppi sperimentali ogniqualvolta possibile per evitare potenziali effetti confondenti da stress nutrizionale.
2. Scegli costrutti di espressione proteica fluorescente. Quando si esegue lo screening di una varietà di ceppi sperimentali, creare un ceppo di riferimento che esprima una proteina fluorescente e utilizzare altre proteine fluorescenti per marcare i ceppi mutanti.
   NOTA: I dati rappresentativi qui presentati utilizzano NEON per il ceppo di riferimento e iRFP per i ceppi mutanti. Qualsiasi proteina fluorescente può essere utilizzata se è altamente espressa, relativamente luminosa e in grado di essere eccitata / rilevata dal microscopio utilizzato. Esperimenti di controllo che confrontano ceppi di riferimento che esprimono diverse proteine fluorescenti non hanno dimostrato alcun impatto dell'espressione delle proteine fluorescenti sulla morfogenesi.
3. Trasforma i ceppi con costrutti di espressione proteica fluorescente.
   NOTA: Molte istituzioni richiedono l'uso di precauzioni di livello 2 di sicurezza biologica per lavorare con C. albicans. Tutto il lavoro deve seguire le norme di sicurezza locali. Indipendentemente dalle normative locali, i ricercatori che lavorano con C. albicans devono essere addestrati alla manipolazione sicura dell'organismo.
   1. Trasformare i ceppi di riferimento e sperimentali utilizzando protocolli standard di acetato di litio¹⁹.
      NOTA: Gli esperimenti qui descritti utilizzano i plasmidi pENO1-NEON-NAT R e pENO1-iRFP-NAT^R, generosamente forniti dal Dr. Robert Wheeler^11,12. I plasmidi sono stati linearizzati usando NotI⁹.
   2. Selezionare i trasformanti in base alla crescita su nourseotricina o altro mezzo di selezione pertinente.
   3. Identificare i trasformanti di successo. Scegli una piccola dose di cellule da ogni colonia usando uno stuzzicadenti e poi mescolale in una goccia d'acqua da 2,5 μL su un vetrino da microscopio. Applicare un coprivetrino ed esaminare con ingrandimento 10x-40x. Esaminare con un sistema di imaging confocale (utilizzato per il resto del protocollo) o qualsiasi microscopio a fluorescenza a campo largo standard. I trasformanti appropriati avranno un segnale luminoso con lunghezze d'onda di eccitazione ed emissione appropriate.
      NOTA: Per i risultati rappresentativi, i ceppi espressi NEON sono stati visualizzati utilizzando un microscopio a fluorescenza verticale con un filtro passa-lungo impostato con un filtro di eccitazione passa banda 472/30 nm, un filtro di emissione passa banda 520/35 nm e uno splitter a fascio dicroico a bordo singolo da 495 nm. Poiché iRFP non è visibile ad occhio, le tensioni espresse da iRFP sono state visualizzate utilizzando il sistema di microscopia confocale utilizzato per l'imaging in vivo , utilizzando un laser a 638 nm per l'eccitazione e rilevando la luce di emissione da 655-755 nm.
      1. In alternativa, valutare la fluorescenza macroscopica delle colonie utilizzando la stereomicroscopia a fluorescenza, i sistemi di eccitazione della fluorescenza portatili o i sistemi di rilevamento della fluorescenza tipicamente utilizzati per gel e macchie occidentali.
      2. Crea scorte congelatrici di trasformanti selezionati.
4. Inoculare i terreni solidi YPD (estratto di lievito peptone destrosio) con un riferimento fluorescente che esprime proteine e ceppi sperimentali da scorte congelatrici 3 giorni prima dell'iniezione, utilizzando uno stuzzicadenti per trasferire un tampone di organismi dal congelatore al terreno solido YPD. Incubare a 30 °C per 2 giorni.
5. Per ogni ceppo, inoculare un matraccio contenente 25 mL di YPD con cellule di C. albicans prelevate da diverse colonie 1 giorno prima dell'iniezione. Fallo usando uno stuzzicadenti per trasferire un tampone di organismi da una colonia nell'YPD; Ripeti più volte per ottenere cellule da diverse colonie. Incubare per una notte a 30 °C in un incubatore orbitale a 175 giri/min.
   NOTA: È importante utilizzare più colonie come fonte per l'inoculo perché C. albicans ha un'alta frequenza di alterazioni genetiche spontanee. L'uso di più colonie quando si avvia la coltura dell'inoculo riduce al minimo la possibilità che tutti gli organismi nell'inoculo derivino da un genitore con significative alterazioni spontanee.
6. Il giorno dell'iniezione:
   1. Centrifugare 1 mL di coltura per 2 min a 500 x g.
   2. Lavare la coltura tre volte con 1 mL di soluzione salina sterile tamponata con fosfato di Dulbecco (dPBS). Dopo il lavaggio finale, risospendere il pellet in 1 mL di dPBS sterile.
   3. Diluire un campione della coltura lavata a 1:100 e contare utilizzando un emocitometro.
   4. Regolare la densità della coltura lavata a 1 x 10⁸ organismi per ml utilizzando dPBS.
   5. Per ogni serie di ceppi da iniettare, creare l'inoculo mescolando volumi uguali del ceppo di riferimento e dei ceppi sperimentali. Questo mantiene la densità dell'inoculo a 1 x 10⁸ organismi per ml.
      NOTA: Il numero di ceppi che possono essere valutati per orecchio è limitato dalla capacità del sistema di microscopia utilizzato di discriminare chiaramente il segnale di ciascuna proteina fluorescente.
   6. Una volta preparato l'inoculo, procedere direttamente alle iniezioni di animali. Non conservare l'inoculo prima dell'uso.

2. Preparazione degli animali

1. Ottenere l'approvazione del comitato istituzionale locale per la cura e l'uso degli animali o dell'organo di governo locale competente.
2. Ottieni topi di 6-12 settimane da un fornitore o da un programma di allevamento. Topi domestici nella struttura in cui vivranno durante l'esperimento per almeno 1 settimana prima dell'inoculazione.
   NOTA: Per i risultati rappresentativi, sono stati utilizzati topi DBA2/N femmina di 6 settimane.
3. Nutrire gli animali senza chow senza clorofilla per almeno 7 giorni prima dell'inoculazione.

3. Depilazione e inoculazione

1. Indurre un piano chirurgico di anestesia (Figura 1).
   ATTENZIONE: Gli agenti anestetici inalati sono materiali pericolosi e possono causare irritazione agli occhi o alla pelle, nonché tossicità del sistema nervoso. Devono essere seguite tutte le politiche e le procedure istituzionali e le pratiche generali di sicurezza del laboratorio per l'uso di anestetici inalati. Solo gli individui addestrati all'uso di anestetici per via inalatoria possono eseguire questi passaggi. Le pratiche standard includono l'uso di guanti, un camice da laboratorio, la protezione degli occhi, l'uso di un sistema di spazzino per anestesia e un'attenta tenuta dei registri secondo le linee guida istituzionali.
   1. Posizionare un topo in una camera di induzione per anestesia preriscaldata. Tenere l'animale in un ambiente caldo durante l'anestesia generale. Realizza questo utilizzando cuscinetti riscaldanti progettati per questo scopo e uno stadio di microscopio riscaldato. Non utilizzare una piastra riscaldante da banco in quanto può surriscaldarsi e causare ustioni.
   2. Fornire isoflurano al 2% -3% alla camera di induzione fino a quando il topo non ha perso il riflesso raddrizzante e la respirazione è lenta e costante. Eliminare la camera di induzione dell'anestesia e trasferire l'animale in un cono nasale senza rebreather che fornisca l'1% -2% di isoflurano.
   3. Convalidare il piano dell'anestesia utilizzando il riflesso del pizzico della punta o altri meccanismi di verifica. Durante l'esperimento, monitorare il modello respiratorio e il piano anestetico dell'animale e regolare la concentrazione di anestetico secondo necessità.
   4. Applicare lubrificante per gli occhi per prevenire l'essiccazione corneale.
2. Depilazione (Figura 1C,D)
   1. Applicare una crema depilatoria da banco liberamente sulla superficie interna ed esterna di entrambe le orecchie utilizzando un batuffolo di cotone.
   2. Dopo 2-3 minuti (o secondo le indicazioni del produttore), pulire delicatamente l'orecchio con una garza asciutta per rimuovere tutta la crema e i capelli. Pulire altre due volte con tamponi di garza saturi di acqua sterile per rimuovere completamente i residui di crema depilatoria. La mancata rimozione di tutta la crema depilatoria provocherà irritazione / infiammazione della pelle.
3. Iniezione (Figura 1E, F)
   1. Pulire la superficie dell'orecchio da iniettare con una garza satura di etanolo al 70% e lasciare asciugare all'aria.
   2. Mescolare bene l'inoculo invertendo più volte o vortice.
   3. Aspirare 20-30 μL di inoculo in una siringa da insulina. Tenendo l'ago rivolto verso l'alto, picchiettare delicatamente la siringa per assicurarsi che l'aria nella canna sia nella parte superiore. Espellere con cautela l'aria e l'inoculo in eccesso nel tubo dell'inoculo o in un tubo di scarico in modo che lo stantuffo sia al segno di 10 μL.
   4. Indossando un ditale su un dito o un pollice della mano non dominante, stabilizzare l'orecchio avvolgendolo attraverso il ditale. In alternativa, applicare il nastro biadesivo da banco (nastro di moda) su un piccolo tubo di plastica conico o rotondo e drappeggiare l'orecchio sul nastro. Fare attenzione a non rimuovere il cono del naso dell'anestesia mentre lo fai. Può essere utile fissare il naso al piano di lavoro.
      NOTA: Il lato interno o esterno dell'orecchio può essere iniettato in base al comfort fisico dello sperimentatore. Per la microscopia, assicurarsi di posizionare il mouse in modo che il lato dell'orecchio iniettato sia rivolto verso la lente dell'obiettivo.
   5. Mantenendo l'ago della siringa quasi completamente parallelo alla pelle ed evitando vene grandi, inserire la punta dell'ago nello strato più esterno della pelle fino a coprire la smussatura.
   6. Iniettare lentamente l'inoculo per via intradermica. Una buona iniezione intradermica solleverà una piccola bolla nella pelle. Tenere l'ago in posizione per 15-20 secondi prima di rimuoverlo dall'orecchio per ridurre al minimo le perdite.
      1. Se il lato inferiore dell'orecchio dell'animale diventa umido, l'ago era troppo profondo e passava interamente attraverso l'orecchio. In tal caso, ripetere l'iniezione in un'area diversa dell'orecchio.
   7. Ripeti il processo usando l'altro orecchio dell'animale. Questo può essere fatto con gli stessi ceppi di C. albicans per una replica o con un diverso insieme di ceppi di C. albicans.
   8. Se non si esegue immediatamente l'imaging, posizionare l'animale in una camera di recupero riscaldata. Osservare l'animale fino a quando non si è ripreso dall'anestesia e poi riportarlo nella sua gabbia abitativa.
   9. Seguendo i protocolli istituzionali, contrassegnare chiaramente la gabbia con etichette di rischio biologico e indicare che gli animali nella gabbia sono infetti da Candida albicans.
   10. Completare tutti i registri richiesti relativi all'anestesia animale e qualsiasi altra pratica istituzionale richiesta.
   11. Ospitare l'animale in condizioni di struttura per animali utilizzando le precauzioni di sicurezza biologica animale di livello 2.

4. Quantificare la morfogenesi in vitro per il confronto con i risultati in vivo

1. Utilizzando le stesse colture lavate utilizzate per preparare l'inoculo, creare una diluizione 1:50 di organismi in RPMI1640 + siero bovino fetale inattivato termicamente al 10% e incubare a 37 °C con burattatura per 4 ore. In alternativa, possono essere utilizzati altri mezzi che stimolano la morfogenesi in vitro .
2. Centrifugare il campione per 5 minuti a 500 x g e risospendere in 0,5 mL di dPBS.
3. Diluire il campione in un rapporto di 1:10, posizionare 2,5 μL del campione diluito su un vetrino da microscopio e coprirlo con un vetrino di copertura.
4. Esaminare il campione utilizzando un microscopio a fluorescenza. Contare almeno 100 cellule, registrando il numero di lieviti e cellule filamentose per ogni ceppo. Nei risultati rappresentativi qui presentati, una cellula filamentosa è definita come qualsiasi cellula con una lunghezza superiore al doppio della lunghezza della cellula madre.
   NOTA: La quantificazione della morfogenesi in vitro può essere effettuata lo stesso giorno dell'inoculazione degli animali. È possibile iniziare il saggio di morfogenesi in vitro durante la preparazione dell'inoculo per l'iniezione ed eseguire l'inoculazione degli animali durante il periodo di incubazione di 4 ore. Se tutte le procedure animali sono completate prima della fine del periodo di incubazione di 4 ore, procedere direttamente all'esame delle cellule stimolate in vitro . In alternativa, le cellule possono essere risospese in formaldeide al 3,7% in dPBS (nella fase 4.2) e conservate a 4 °C per diversi giorni. Gli organismi fissi possono quindi essere quantificati come il tempo lo consente. L'inoculazione degli animali non deve essere ritardata per il test di quantificazione in vitro .

5. Preparazione per l'imaging in vivo

1. Preparare il microscopio (Figura 2A).
   1. Accendere tutte le apparecchiature di microscopia e avviare il software di imaging.
      1. Se disponibili, caricare eventuali impostazioni di imaging predeterminate.
      2. Attivare i laser e i rilevatori necessari per rilevare le proteine fluorescenti utilizzate.
   2. Accendere lo stadio del microscopio riscaldato e lasciarlo riscaldare a 37 °C.
      NOTA: È possibile utilizzare un microscopio con una camera ambientale completamente chiusa piuttosto che un palco riscaldato.
   3. Impostare un punto di riferimento dell'asse z con il piano di messa a fuoco sulla superficie superiore del vetrino.  Questo può essere fatto fissando un copriletto in posizione sopra l'apertura del palco e mettendo una goccia d'acqua sul vetrino di copertura.  Utilizzare un obiettivo "a secco" con ingrandimento inferiore (10x) per mettere a fuoco il bordo della goccia d'acqua, quindi impostare il punto di riferimento dell'asse z.  Usa un pezzo di spugna per assorbire l'acqua dal coprislip prima di rimuoverlo dal palco.
   4. Ruotare l'obiettivo a distanza di lavoro molto lunga in posizione e posizionare una goccia di fluido di immersione sull'obiettivo. Abbassare la lente per evitare possibili danni quando si posiziona il vetrino.
   5. Posiziona una copertina #1.5 sopra l'apertura del palco e fissala in posizione. Assicurarsi che il nastro copra completamente tutti i bordi del vetrino per evitare che il fluido penetri al microscopio sotto il vetrino. Portate l'obiettivo al punto di riferimento dell'asse z in modo che il fluido di immersione sia a contatto sia con l'obiettivo che con il vetrino.
   6. Preparare più pezzi di nastro adesivo sensibile alla pressione in modo che siano pronti all'uso quando si posizionano il naso e il mouse.
2. Indurre l'anestesia generale nel mouse per essere ripreso come sopra (punto 3.1).
3. Posizionare il mouse (Figura 2B-D).
   1. Fissare un cono naso per anestesia sullo stadio del microscopio con il cono nasale posizionato in modo che copra completamente il naso dell'animale quando l'animale è in posizione per l'imaging. Questo può essere realizzato più facilmente con due investigatori. Chiedi al primo investigatore di posizionare il naso del topo anestetizzato nel naso e spostare il topo in posizione per l'imaging continuando a tenere il naso sopra il naso dell'animale. Chiedi all'altro investigatore di fissare il naso e il tubo in posizione in modo che si sieda stabilmente sopra il naso del topo. Una volta che il naso è stato registrato in posizione, lasciarlo lì per il resto della sessione di imaging.
   2. Dopo aver stabilito il posto migliore per posizionare il nosecone, notare la sua posizione. Per le successive sessioni di imaging, il naso può essere fissato allo stadio prima di portare un animale al microscopio.
   3. Posizionare una goccia di acqua sterile sul coprivetrino sopra l'obiettivo.
   4. Posizionare il mouse sul palco del microscopio. Assicurarsi che l'orecchio sia sopra la goccia d'acqua e piatto contro il coprifoglio.
   5. Utilizzare un secondo coprislip (superiore) per appiattire l'orecchio.
      1. Posizionare il bordo della copertina parallelamente al corpo del mouse, con il bordo che tocca il mouse nel punto in cui l'orecchio incontra la testa.
      2. Abbassare il bordo libero del coprivetrino allo stadio del microscopio con un movimento della cerniera. Quando il coprislip arriva contro lo stadio del microscopio, appiattirà l'orecchio. Fare attenzione a non creare pieghe o creste nell'orecchio.
      3. Fissare saldamente il coprislip superiore in modo che mantenga la pressione sufficiente a mantenere l'orecchio piatto. Fare attenzione a non catturare i peli o i baffi del topo nel nastro.
   6. A meno che non venga utilizzato un microscopio con una camera ambientale, coprire liberamente il corpo del topo con un drappo sterile per mantenere un ambiente normotermico.
4. Identificare un campo di interesse.
   1. Assicuratevi che l'obiettivo si trovi nel punto di riferimento dell'asse z.
   2. Utilizzando la luce bianca / imaging a campo ampio, regolare il piano di messa a fuoco nel tessuto dell'orecchio. Una buona strategia è quella di concentrarsi sui vasi sanguigni: se si possono vedere i globuli rossi muoversi nei vasi sanguigni, il piano di messa a fuoco è all'interno del tessuto.
   3. Se il microscopio è dotato di capacità di fluorescenza ad ampio campo, utilizzarlo per identificare un campo di interesse. In caso contrario, utilizzare l'imaging confocale. In generale, l'uso della microscopia a campo largo per identificare le aree di interesse è più veloce e richiede meno irradiazione del tessuto auricolare.
      1. Utilizzando un cubo filtrante per la rilevazione della proteina fluorescente espressa nel ceppo di riferimento, identificare un campo visivo che ha un segnale fluorescente dal ceppo di riferimento. Tieni presente che la luce fuori fuoco probabilmente impedirà la capacità di concentrarsi sui singoli organismi. L'obiettivo di questo passaggio è identificare un'area di interesse per l'imaging confocale.
      2. Passare a un cubo filtrante che rilevi la proteina fluorescente espressa dai ceppi sperimentali e ne verifichi la presenza nel campo visivo selezionato.

6. Imaging

1. Determinare le impostazioni.
   1. Mentre il software di imaging è in modalità confocale live, esaminare il campo di interesse mentre il piano focale viene spostato attraverso l'asse z. Scegli un piano dell'asse z con un segnale forte da tutte le proteine fluorescenti utilizzate.
   2. Regolare la potenza del laser e/o la velocità di imaging per ottenere un segnale abbastanza forte in modo tale che la morfologia possa essere determinata per tutte le celle nel campo visivo. Per evitare danni ai tessuti, utilizzare la potenza laser più bassa possibile.
      NOTA: Come per tutte le immagini, esiste un equilibrio tra potenza del laser, velocità di acquisizione e risoluzione. Identificare le impostazioni che identificano chiaramente la morfologia dell'organismo bilanciando velocità e potenza del laser per ridurre al minimo l'irradiazione del tessuto auricolare. Poiché l'imaging avviene attraverso il derma esterno, è necessaria una potenza laser più elevata per l'eccitazione rispetto a quella tipicamente necessaria per l'imaging confocale di campioni tradizionali montati su vetrini. Fortunatamente, il livello di risoluzione spaziale richiesto per l'analisi della morfologia non è estremo. Pertanto, ottenere immagini con un segnale sufficiente per determinare la morfologia dell'organismo senza causare danni ai tessuti è facilmente raggiungibile.
   3. Una volta stabiliti questi parametri, utilizzarli durante la sessione di imaging come punto di partenza per le sessioni di imaging successive. È quindi utile salvare le impostazioni di imaging.
      NOTA: Le singole aree di infezione possono essere meno profonde o più profonde all'interno del tessuto. Le aree più profonde possono richiedere un aumento della potenza del laser. Poiché questo test si basa sulla distribuzione spaziale del segnale piuttosto che sulla sua intensità, è accettabile modificare le impostazioni dell'immagine tra i campi in base alle esigenze.
2. Ottenere le immagini.
   1. Scegli un campo visivo che abbia una chiara formazione di filamenti nel ceppo di riferimento e in cui la maggior parte degli organismi sia distribuita abbastanza da poter determinare la loro morfologia.
   2. Impostate i piani superiore e inferiore di messa a fuoco per uno stack z. Non è necessario coprire l'intera profondità dell'area infetta, ma tenere presente che gli organismi nella parte superiore o inferiore del volume ripreso sono in genere esclusi dall'analisi.
   3. Acquisisci immagini z-stack, pseudocolora ogni canale per distinguere ogni ceppo e sovrapponi i canali. Salvare le immagini.
   4. Ripetere l'operazione per gli altri campi visivi. La morfogenesi può variare da luogo a luogo; Pertanto, acquisire e analizzare almeno tre campi da ciascun orecchio è importante.

7. Analisi bidimensionale manuale: frequenza della filamento

1. Utilizzare il software di imaging per eseguire una proiezione massima dello z-stack in un'immagine bidimensionale. Le istruzioni fornite qui sono per FIJI/Image J.
   1. Aprire immagini al microscopio utilizzando il software ImageJ.
   2. Se necessario, applicare uno pseudo-colore a ciascun canale per consentire una semplice identificazione di ciascun ceppo di C. albicans. Per questo, fai clic su Immagine > Tabella di ricerca > Colore LUT e seleziona lo pseudo-colore scelto.
   3. Convertire il file stack in un'immagine bidimensionale di proiezione di massima intensità:
      1. Selezionare il file z-stack. Clicca su Immagine > pile > proiezione Z.
      2. Selezionate il piano superiore e inferiore e selezionate il tipo di proiezione Intensità massima.
2. Contare ogni organismo visto nelle immagini di proiezione massima per tipo di ceppo (distinto dal colore del canale) e morfologia.
   1. Gli organismi che si sovrappongono significativamente o le aree con densità di organismi molto elevata saranno difficili da contare con precisione. Escludeteli dal conteggio, ma fate attenzione a non introdurre pregiudizi contro le forme filamentose, che hanno maggiori probabilità di sovrapporsi.
   2. Le forme filamentose che si proiettano direttamente dentro o fuori dallo z-stack appariranno come piccoli oggetti rotondi in una proiezione massima. Allo stesso modo, gli organismi che sono tagliati fuori dal bordo dell'immagine possono sembrare lievito perché il filamento è fuori dal campo visivo. Pertanto, l'analisi bidimensionale sovrastima sempre la percentuale di forme di lievito. Poiché ciò si verificherà allo stesso modo con i ceppi di riferimento e sperimentali, confrontare sempre i risultati sperimentali con quelli di un ceppo di riferimento.
3. Eseguire confronti statistici dei risultati come dettato dal disegno sperimentale.

8. Analisi bidimensionale manuale: lunghezza del filamento

1. Per C. albicans, la formazione di filamenti aberranti può verificarsi perché: a) meno cellule di lievito "madri" subiscono morfogenesi, b) i filamenti crescono a un ritmo più lento, o c) la crescita filamentosa è iniziata ma non mantenuta. Per valutare queste possibilità, quantificare la lunghezza del percorso della curva di ciascun filamento nell'immagine di proiezione massima come surrogato della vera lunghezza tridimensionale (discussa di seguito).
   1. Quando una gemma si sta sviluppando su una cellula madre, non è possibile dire se diventerà un filamento o un lievito. Per garantire che solo le cellule filamentose siano incluse in questa analisi, misurare solo gli organismi in cui la cellula figlia è almeno il doppio della lunghezza della cellula madre.
2. Aprire l'immagine di proiezione massima creata nel passaggio 7.
3. Nel set di strumenti ImageJ, fare clic con il pulsante destro del mouse sullo strumento Linea diritta/segmentata e scegliere l'opzione Linea segmentata. L'opzione della linea segmentata consente all'utente di misurare la lunghezza del filamento lungo un percorso curvo, una necessità data la plasticità dei filamenti di C. albicans.
4. Misurare la lunghezza del filamento dal collo del germoglio all'estremità crescente del filamento. Fare clic con il pulsante sinistro del mouse sul collo del bocciolo; Il puntatore cambierà in un piccolo quadrato. Traccia il filamento lungo la sua lunghezza, facendo clic sul centro del filamento ogni volta che c'è una curva, una svolta o un cambiamento dell'asse lungo del filamento. Fare doppio clic sulla punta crescente del filamento.
5. Premere Ctrl + M. Si aprirà una finestra pop-up che tabula le misure Area, Media, Min, Max e Lunghezza. Dopo aver misurato ciascun filamento, premere nuovamente CTRL + M per aggiungere la misurazione corrente alla tabella delle misurazioni.
6. Quando tutti i filamenti sono stati misurati, copiare e incollare le misurazioni della lunghezza in un file di analisi dei dati.
7. Eseguire analisi statistiche per valutare la distribuzione delle lunghezze del filamento nel ceppo di riferimento e nel ceppo mutante.

9. Analisi tridimensionale manuale

1. Per ottenere una misurazione più precisa della morfogenesi che eviti la sovrastima delle forme di lievito e possa consentire la discriminazione tra pseudoife e ife, scorrere manualmente su e giù attraverso lo z-stack mentre si valuta la morfologia di ciascun organismo in tre dimensioni.
2. In alternativa, crea un'immagine tridimensionale di ogni z-stack e analizza la forma di ciascun organismo mentre ruota l'immagine.

10. Analisi automatizzata

1. Utilizzando il software di imaging, automatizza l'enumerazione degli organismi e la loro morfologia in due o tre dimensioni.
   NOTA: alcuni algoritmi per la discriminazione dei tipi morfologici possono introdurre distorsioni. Pertanto, le strategie di automazione devono essere attentamente convalidate in relazione al design sperimentale. Un'analisi automatizzata delle immagini ben progettata e convalidata può aumentare la produttività della fase di analisi.

Representative Results

I risultati qui presentati si basano^{sui rapporti 9,10} pubblicati in precedenza. L'obiettivo di questa analisi è valutare quantitativamente la capacità dei ceppi mutanti di C. albicans di subire morfogenesi durante le infezioni attive. I parametri tipici che distinguono le pseudoife dalle ife possono essere difficili da valutare in organismi che crescono in tre dimensioni in un ambiente complesso in vivo. Ciò è particolarmente vero quando si osservano le sezioni trasversali bidimensionali create dall'imaging confocale. Pertanto, questa analisi di screening si concentra sull'identificazione degli organismi che crescono come filamentosi rispetto al lievito. Per gli studi di follow-up che utilizzano un'analisi più approfondita, comprese le ricostruzioni tridimensionali, questo metodo potrebbe essere adattato per discriminare lieviti, ife e pseudoife.

L'espressione di una proteina fluorescente in un ceppo di riferimento o mutante di C. albicans consente di rilevare direttamente la morfologia del ceppo in vivo (Figura 3 e Figura 4). In generale, l'analisi quantitativa al microscopio ottico viene eseguita al meglio quando pochi o nessuno dei pixel nell'immagine è saturo. Per questo protocollo, tuttavia, una saturazione dell'immagine spesso semplifica l'analisi. La localizzazione delle proteine fluorescenti non è uniforme in tutta la cellula ed è spesso più alta nel lievito madre che nei filamenti. Fortunatamente, per lo studio della morfogenesi, la distribuzione spaziale del segnale, piuttosto che la sua intensità, definisce il risultato. Pertanto, ottenere immagini in cui molti pixel sono saturi migliora la capacità di quantificare la morfogenesi in questo test.

Per illustrare l'importanza di valutare la morfogenesi in vivo, vengono presentati risultati rappresentativi per il ceppo di riferimento (SN250) e due mutanti: uno privo del fattore di trascrizione Efg1 e l'altro privo di adenilil ciclasi Cyr1. In vitro, nessuno di questi ceppi cresce come filamenti^20,21. Quando viene coltivato in vitro in mezzo RPMI integrato con siero al 10%, il ceppo di riferimento forma rapidamente filamenti, mentre i ceppi efg1ΔΔ e cyr1ΔΔ non lo fanno (Figura 3 e Figura 4). In queste condizioni, il mutante efg1ΔΔ mostra una crescita piuttosto polarizzata, con le cellule figlie leggermente allungate rispetto alle cellule madri. Ciò sottolinea l'importanza di utilizzare una chiara definizione di filamento. Qualsiasi definizione di questo tipo è per impostazione predefinita arbitraria, ma è necessaria per una valutazione coerente del fenotipo. Per questi studi, un modello filamentoso di crescita è definito come un organismo con la dimensione più lunga di una cellula figlia più del doppio di quella della cellula madre. Usando questa definizione, le cellule ΔΔ efg1allungate non sono filamentose.

Coerentemente con il suo fenotipo in vitro, efg1 ΔΔ mostra un significativo difetto di filamentazione in vivo: circa il 9% delle cellule efg1ΔΔ è cresciuto come filamenti in vivo (Figura 3). Al contrario, il 53% delle cellule mutanti ΔΔ cyr1è cresciuto come filamenti in vivo (Figura 4). Sebbene il numero di cellule mutanti ΔΔ cyr1 sottoposte a filamentazione in vivo fosse significativamente inferiore rispetto al ceppo di riferimento, la capacità del mutante ΔΔ cyr1di formare filamenti in vivo rappresenta un cambiamento sostanziale rispetto alla sua completa mancanza di morfogenesi in vitro. Visivamente, i filamenti formati dal mutante cyr1ΔΔ sembravano essere più corti del ceppo di riferimento. Per valutare questo quantitativamente, la lunghezza del percorso della curva delle celle filamentose è stata misurata utilizzando una proiezione bidimensionale delle immagini in vivo (Figura 4E). La lunghezza mediana dei filamenti di ΔΔ cyr1era inferiore del 29% rispetto ai filamenti del ceppo di riferimento.

Figura 1: Anestesia e inoculazione . (A) Induzione dell'anestesia utilizzando una camera di induzione. (B) L'anestesia viene mantenuta utilizzando un cono nasale, che consente di riposizionare il mouse secondo necessità. (C) La crema depilatoria viene applicata utilizzando un applicatore con punta di cotone. Il gel lubrificante per gli occhi è stato applicato per proteggere gli occhi durante l'anestesia. (D) Depilazione efficace dell'orecchio destro. Confronta con l'orecchio sinistro non trattato. (E) Iniezione intradermica di C. albicans nell'orecchio del topo. L'orecchio viene tenuto in posizione usando la punta di un tubo conico avvolto con nastro biadesivo (nastro di moda). (F) Primo piano dell'iniezione intradermica. Nella pelle si forma una bolla pallida, che è un segno di un posizionamento intradermico di successo. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 2: Preparazione per l'imaging. (A) Fase del microscopio preparata per l'imaging. Il cono del naso dell'anestesia è fissato in posizione. Una copertina è fissata al palco che copre l'apertura della lente. Sono disponibili ulteriori pezzi di nastro. Lo stadio riscaldato è preriscaldato a 37 °C (non mostrato). (B) Posizionamento del topo anestetizzato nel cono del naso dell'anestesia. (C) Il mouse viene ruotato leggermente in modo che il lato dell'orecchio che è stato inoculato sia rivolto verso il coperchio inferiore/lente dell'obiettivo. L'orecchio viene quindi appiattito contro il coprislip inferiore e fissato in posizione posizionando un secondo coprislip sulla parte superiore dell'orecchio. (D) Il coprislip superiore è fissato al palco per fissare l'orecchio in posizione rispetto al palco del microscopio. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 3: Morfologia in vitro e in vivo del ceppo mutante efg1ΔΔ . (A) Immagine a campo largo di ceppi mutanti WT ed efg1ΔΔ dopo induzione in vitro della filamentazione mediante cellule in crescita in RPMI + 10% di siero a 37 °C per 4 ore. Le barre della scala rappresentano 10 μm. Il contrasto dell'immagine è stato regolato utilizzando un software di fotoritocco per facilitare la visualizzazione. (B) Percentuale di filamentazione in vitro osservata nei ceppi mutanti WT ed efg1ΔΔ. Und = non rilevabile (non sono stati rilevati filamenti). L'altezza della barra rappresenta la percentuale mediana di cellule filamentose da tre esperimenti indipendenti in cui sono state quantificate almeno 100 cellule. Le barre di errore indicano la deviazione standard (risultati confrontati dal test t dello studente, p < 0,001). (C) Micrografia confocale di WT (verde) e del mutante efg1ΔΔ (rosso) che cresce in vivo 24 ore dopo l'inoculazione. Le frecce indicano esempi di cellule mutanti efg1ΔΔ che soddisfano la nostra definizione di "filamentose". La barra della scala rappresenta 50 μm. (D) Percentuale di filamentazione in vivo osservata nei ceppi mutanti WT ed efg1ΔΔ. L'altezza della barra rappresenta la percentuale mediana di cellule filamentose da due esperimenti indipendenti. Le barre di errore indicano la deviazione standard (risultati confrontati dal test t dello studente, p < 0,001). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 4: Morfologia in vitro e in vivo del ceppo mutante cyr1 ΔΔ. (A) Immagine a campo ampio del ceppo mutante cyr1ΔΔ dopo induzione in vitro della filamentazione mediante cellule in crescita in RPMI + 10% siero a 37 °C per 4 ore. La barra della scala rappresenta 10 μm. Il contrasto dell'immagine è stato regolato utilizzando un software di fotoritocco per facilitare la visualizzazione. (B) Percentuale di filamento in vitro osservata nei ceppi mutanti WT e cyr1ΔΔ. Und = non rilevabile (non sono stati rilevati filamenti). L'altezza della barra rappresenta la percentuale mediana di cellule filamentose da tre esperimenti indipendenti in cui sono state quantificate almeno 100 cellule. Le barre di errore indicano la deviazione standard (risultati confrontati con il test t dello studente, p < 0,001). (C) Micrografia confocale di WT (verde) e del mutante cyr1ΔΔ (rosso) che cresce in vivo 24 ore dopo l'inoculazione. La barra della scala rappresenta 50 μm. (D) Percentuale di filamentazione in vivo osservata nei ceppi mutanti WT e cyr1ΔΔ. L'altezza della barra rappresenta la percentuale mediana di cellule filamentose da due esperimenti indipendenti. Le barre di errore indicano la deviazione standard (risultati confrontati dal test t dello studente, p < 0,001). (E) Distribuzione della lunghezza del filamento in vivo, misurata dalla lunghezza del percorso della curva in una proiezione bidimensionale dello z-stack. Ogni punto rappresenta la lunghezza di un filamento. Le cellule che crescono come lievito non sono state incluse in questa analisi. La barra indica la lunghezza mediana del filamento. La distribuzione delle lunghezze è significativamente diversa quando analizzata utilizzando un test U di Mann-Whitney (p < 0,001). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Discussion

Questo modello utilizza la microscopia confocale per ottenere immagini degli organismi di C. albicans mentre crescono all'interno del tessuto di un ospite di mammifero, permettendoci così di valutare i fenotipi della morfogenesi durante l'infezione attiva. Il processo di morfogenesi è centrale per la patogenesi di C. albicans ed è stato ampiamente studiato utilizzando una varietà di saggi in vitro 2,3,4. Tuttavia, nessun test in vitro può modellare completamente il complesso ambiente biochimico e strutturale dell'ospite.

Il protocollo qui descritto è focalizzato sull'uso di questo sistema di imaging in vivo per lo screening di una serie / libreria di mutanti di C. albicans per identificare i geni coinvolti nella morfogenesi durante l'infezione. L'uso di ceppi di C. albicans che esprimono diverse proteine fluorescenti ci permette di quantificare in vivo la morfogenesi dei ceppi mutanti di C. albicans rispetto a quella di un ceppo di riferimento. Il confronto della morfogenesi nel mutante con il ceppo di riferimento all'interno della stessa area di infezione assicura che gli organismi siano esposti ad ambienti identici. Ciò consente la misurazione quantitativa della percentuale di cellule sottoposte a filamentazione, nonché l'entità della filamento. La normalizzazione delle misurazioni dei ceppi mutanti con quelle del ceppo di riferimento ci consente di confrontare meglio le prestazioni di un mutante con un altro.

I risultati rappresentativi qui presentati dimostrano il potenziale per una discrepanza significativa tra fenotipi in vitro e in vivo . Il ceppo mutante di C. albicans efg1ΔΔ è spesso usato come controllo negativo per i saggi di morfogenesi in quanto non riesce a filarsi in quasi tutte le condizioni in vitro ²⁰. Sebbene i risultati in vivo fossero molto simili ai risultati in vitro , anche questo ceppo gravemente ostacolato ha occasionalmente formato filamenti nell'ambiente del tessuto ospite (Figura 3). Questo sottolinea la forza dell'ambiente ospite nell'innescare la morfogenesi.

Al contrario, il ceppo mutante cyr1ΔΔ dimostra una sostanziale discordanza tra crescita in vitro e in vivo; sebbene nessuna delle cellule mutanti subisca filamentazione in vitro, circa la metà delle cellule cresce come filamenti in vivo (Figura 4)^10,21. È interessante notare che questi filamenti erano significativamente più corti di quelli formati dal ceppo di riferimento, suggerendo che CYR1 contribuisce al tasso di crescita del filamento o alla capacità di mantenere un fenotipo filamentoso. Per facilitare l'analisi della lunghezza del filamento, la lunghezza del percorso della curva dei filamenti è stata misurata utilizzando una proiezione bidimensionale delle immagini. Nelle proiezioni bidimensionali di filamenti che crescono in tre dimensioni, qualsiasi filamento che cresce su un asse che non è parallelo al piano xy proietterà più corto della sua lunghezza reale. Poiché questo scorcio si verifica anche per il ceppo di riferimento, la valutazione della distribuzione delle lunghezze dei filamenti in una proiezione bidimensionale consente ancora un confronto quantitativo tra i ceppi di riferimento e mutanti. L'analisi della lunghezza del filamento in due anziché tre dimensioni richiede un'analisi dell'immagine meno intensiva; Pertanto, può essere eseguito in tempi relativamente brevi su un tipico computer desktop. L'utilizzo di questa analisi più semplice consente di includere la distribuzione della lunghezza del filamento come parte di un protocollo di screening, fornendo una comprensione più sfumata della capacità di ciascun mutante di subire morfogenesi senza causare ritardi sostanziali nel throughput.

Gli studi rappresentativi qui presentati sono stati eseguiti utilizzando topi DBA2/N, che hanno un difetto nel loro sistema del complemento che causa un mancato reclutamento di neutrofili nel sito dell'infezione da C. albicans ²². L'obiettivo di questi studi era quello di studiare i meccanismi di regolazione della filamentazione di C. albicans all'interno del tessuto ospite. Pertanto i topi DBA2/N sono stati utilizzati per evitare di confondere i risultati a causa della suscettibilità o della resistenza di un singolo ceppo ai neutrofili. Poiché la risposta dei neutrofili anti-C. albicans può influire sulla filamento²³, il reclutamento dei neutrofili nel sito di infezione potrebbe influire sui risultati di un test di morfogenesi. Se un ceppo è in grado di filamentare in vivo ma è fortemente inibito dalla filamento quando sono presenti neutrofili, la filamentazione verrebbe rilevata nei topi DBA2/N, ma sarebbe improbabile che venga osservata quando si usano topi con chemiotassi neutrofila intatta. Pertanto, lo sforzo del mouse utilizzato come host è un fattore importante quando si utilizza questo protocollo.

È improbabile che l'osservazione che il ceppo mutante efg1ΔΔ non riesca a filamentarsi in vivo sia correlata alle risposte dei neutrofili dell'ospite, perché anche questo ceppo non riesce a filarsi in vitro. La filamentazione osservata in vivo con il ceppo cyr1ΔΔ è discordante con la sua mancata filamento in vitro. I dati del modello zebrafish dell'infezione da C. albicans indicano che i neutrofili che rispondono sono importanti nella prevenzione della morfogenesi²⁴. Pertanto, è improbabile che l'uso di topi DBA2/N, privi di risposte neutrofile, spieghi l'aumento della filamentazione del ΔΔ cyr1in vivo rispetto a quello in vitro. Tuttavia, l'ambiente in vivo sta chiaramente influenzando la morfogenesi del ceppo cyr1ΔΔ; pertanto, ulteriori indagini su questo ceppo possono fornire importanti informazioni sulla regolazione della morfogenesi di C. albicans durante le infezioni attive. Il protocollo qui descritto è progettato come un test di screening per identificare ceppi come il ceppo cyr1ΔΔ da utilizzare in studi futuri.

L'uso di un sistema di anestesia a gas a basso flusso è molto utile per questo protocollo (Figura 1A, B). Durante lo sviluppo iniziale di questo protocollo, i topi sono stati anestetizzati usando un cocktail anestetico iniettabile di ketamina mescolato con xilazina. Mentre era possibile eseguire immagini limitate con quel metodo anestetico, la durata dell'anestesia era imprevedibile, richiedendo che le sessioni di imaging fossero terminate rapidamente per evitare che il topo si riprendesse dall'anestesia durante l'imaging. I sistemi anestetici tradizionali per via inalatoria sono ingombranti e richiedono alti tassi di flusso di gas anestetici, spesso richiedendo di essere utilizzati all'interno di una cappa aspirante. Pertanto, i tradizionali sistemi anestetici inalati sarebbero molto difficili da usare con i vincoli di spazio di un microscopio confocale senza esporre inavvertitamente i ricercatori agli agenti anestetici. L'uso di un sistema anestetico inalato a basso flusso consente un'anestesia coerente dell'animale mantenendo un ambiente sicuro per lo sperimentatore. Il naso a basso flusso consente un facile posizionamento dell'animale sia per l'inoculazione che per la microscopia. Il tubo di erogazione di piccolo calibro e a basso volume consente l'uso di tubi relativamente lunghi, che consentono di posizionare la macchina per anestesia a una distanza sufficiente per non interferire con la microscopia.

La clorofilla presente nel tipico topo porta ad una significativa autofluorescenza tissutale²⁵. Ciò crea un rumore sostanziale nelle immagini, rendendo difficile ottenere immagini di alta qualità e ad alta risoluzione spaziale. Quando gli animali sono stati nutriti con chow privo di clorofilla per 7 giorni prima dell'imaging, il background da autofluorescenza era sostanzialmente diminuito nei tessuti, ma la clorofilla depositata nei capelli continuava ad essere problematica. La rimozione dei peli sui padiglioni auricolari utilizzando una crema depilatoria chimica da banco è efficace nel ridurre al minimo l'autofluorescenza nei capelli (Figura 1C, D). Pertanto, la combinazione di chow privo di clorofilla e un'adeguata depilazione ha ridotto sostanzialmente l'autofluorescenza e migliorato notevolmente la qualità dell'immagine. Poiché i peli vengono rimossi dall'orecchio prima dell'imaging, il colore dei capelli dell'animale non influisce su questo sistema. Questo protocollo è stato utilizzato con successo per studiare le infezioni da C. albicans in topi BALB / c (bianco), C57BL / 6 (nero) e DBA2 / N (marrone). Il protocollo può essere utilizzato anche con topi knockout C57BL/6 carenti di vari geni dell'ospite; Ciò consentirà future indagini su come il sistema immunitario dell'ospite dei mammiferi influisce sulla filamento. Una caratteristica di questo modello non discussa in questo protocollo è che, poiché questo sistema di imaging non è invasivo, lo stesso animale può essere ripreso ripetutamente per diversi giorni, consentendo di seguire l'andamento della singola infezione nel tempo. Questa caratteristica giocherà probabilmente un ruolo chiave negli studi futuri sull'interazione ospite-patogeno.

In sintesi, questo protocollo si traduce in immagini ad alta risoluzione spaziale di C. albicans che crescono nel tessuto di un ospite di mammifero vivo, consentendo una valutazione accurata della morfogenesi nei ceppi mutanti 8,9,10. I risultati presentati qui dimostrano come questo protocollo possa essere utilizzato per lo screening di una libreria di mutanti di C. albicans. Dei mutanti di C. albicans testati fino ad oggi, una gran parte dei mutanti con difetti noti nella morfogenesi in vitro si sottopongono prontamente alla filamentazione in vivo ^9,10. Ciò evidenzia l'importanza di includere un sistema in vivo come questo negli esperimenti progettati per chiarire i meccanismi della patogenesi di C. albicans.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
#1.5 coverslips	Thermo-Fisher	20811	large enough to cover the universal stage opening
0.1 mL Insulin syringes	EXELint	26018	Can use syringes that are 5/16"–1/2" long and 29–32 G
3.7% formaldehyde in dPBS	Sigma-Aldrich	SHBJ5734
70% Ethanol/30% water	Decon Laboratories	A05061001A
Alcohol prep pads	Covidien	5110	Alternative: gauze pads soaked in 70% isopropyl alcohol
C.albicans reference strain and experimental strains	SN250	FGSC Online Catalog	The specific C. albicans strain varies with experiment and the investigators goals. We have used strains derived from SC5314 as well as other clinical isolates.
Chlorophyl free mouse chow	Envigo	2920x
Computer	Dell	Optiplex 7050	Computer that can run imaging software for acquisition and for analysis of images. A variety of imaging software is available and varies with the specific microscope and user system.
Cotton tip applicator	Pro Advantage	76200
DBA2/N (6-12 week old mice)			BALB/c and C57/BL6 mice can also be used.  The latter allow for the use of widely available knockout mouse models as well as mouse models in which individual cell types, such as phagocytes, are identified by their expression of fluorescent proteins.
Double sided tape designed to hold fabric to skin (fashion tape)	local pharmacy or grocery store		Double sided adhesive tape designed for keeping clothing in place over human skin.  This is typically available over the counter in pharmacies and variety stores.  It is important to use this type of tape as it is designed for gentle adherence to skin.  Examples:  https://www.amazon.com/Womens-Fashion-Clothing-Transparent-Suitable/dp/B08S3TWR3H/ref=sr_1_40?crid=2UWFL8FMFAKGM&keywords =fashion+tape&qid=1649174406&sprefix= fashion+tape%2Caps%2C70&sr=8-40 https://www.amazon.com/Fearless-Tape-Sensitive-Clothing-Transparent/dp/B07QY8V5XT/ref=sr_1_26?crid=2UWFL8FMFAKGM&keywords =fashion+tape&qid=1649174320&sprefix= fashion+tape%2Caps%2C70&sr=8-26 https://www.amazon.com/Hollywood-Fashion-Secrets-Tape-Floral/dp/B009RX77MK/ref=sr_1_29?crid=2UWFL8FMFAKGM&keywords =fashion+tape&qid=1649174406&sprefix= fashion+tape%2Caps%2C70&sr=8-29
Dulbecco's phosphate buffered saline	Gibco / Thermo-Fisher	14190-144	Must be sterile; open a new container for every experiment
Fetal bovine serum	Gibco / Thermo-Fisher	26140-079
Gauze pad	Pro Advantage	P157112
Gel eye lurbicant	local pharmacy or grocery store
ImageJ or FIJI analysis software	NIH	ImageJ (FIJI)
Isoflurane	Akorn	J119005
Leica DMi8 (SP8 platform) with Leica 11506375 objective lens	Leica	DMi8 (SP8)	The objective lens  (Leica 11506375) used here  is a 25x water immersion lens to allow us to have a high NA (0.95) while approximating the refractive index of the ear tissue. The microscope (Leica DMi8 (SP8 platform) has 488 nm and 638 nm diode laser lines and is equipped with filter-free  spectral detection with computer controlled adjustable bandwidth for detection of emission light. The stage must have enough clearance to allow the objective to reach the bottom coverslip without hitting the stage.
Low-flow anesthesia system or traditional anesthesia vaporizer	Kent Scientific International	SomnoSuite
Nair hair remover lotion	local pharmacy or grocery store		Over the counter depilatory cream
Nourseothricin	Jena Bioscience	AB-101L
pENO1-NEON-NATR pENO1-iRFP-NATR plasmids			Fluorescent protein expression transformation constructs  generously given to us by Dr. Robert Wheeler (Seman, et al., 2018, Infection and Immunity; Bergeron, et al., 2017, Infection and Immunity)
Pressure sensitive laboratory tape	Tape & Label Graphic Systems Inc	1007910
RPMI1640 cell culture medium	Gibco / Thermo-Fisher	11875-093
Thimble, plastic 15 mL conical tube, or Falcon 5 mL round bottom polystyrene tubes	Falcon	352196	To safely hold the animals ear during injectinos