Dette manuskriptet beskriver en metode for screening av moderat størrelse Candida albicans mutantbiblioteker for morfogenesefenotyper under aktiv infeksjon hos en pattedyrvert ved bruk av ikke-invasiv konfokal mikroskopi.
Candida albicans er et viktig humant patogen. Dens evne til å bytte mellom morfologiske former er sentral for patogenesen; Disse morfologiske endringene reguleres av et komplekst signalnettverk kontrollert som respons på miljøstimuli. Disse regulatoriske komponentene har blitt sterkt studert, men nesten alle studier bruker en rekke in vitro stimuli for å utløse filamentasjon. For å bestemme hvordan morfogenese reguleres under patogeneseprosessen, utviklet vi et in vivo mikroskopisystem for å oppnå bilder med høy romlig oppløsning av organismer som gjennomgår hyphaldannelse i pattedyrverten. Protokollen som presenteres her beskriver bruken av dette systemet for å skjerme små samlinger av C. albicans mutantstammer, slik at vi kan identifisere viktige regulatorer av morfogenese som det skjer på infeksjonsstedet. Representative resultater presenteres, og viser at noen regulatorer av morfogenese, som transkripsjonsregulatoren Efg1, har konsistente fenotyper in vitro og in vivo, mens andre regulatorer, som adenylsyklase (Cyr1), har signifikant forskjellige fenotyper in vivo sammenlignet med in vitro.
Candida albicans er et vanlig humant sopppatogen, som forårsaker mukokutan sykdom, disseminert sykdom og lokaliserte vevsinfeksjoner1. Et sentralt trekk ved C. albicans fysiologi er dens komplekse polymorfe vekst, som er knyttet til dens rolle som både en commensal og et patogen 2,3,4. Under rike næringsforhold in vitro ved 30 ° C vokser det vanligvis som en ovoid spirende gjær. En rekke miljøutløsere, inkludert næringsdeprivasjon, pH-endringer, vekst ved 37 ° C, eksponering for serum og vekst når de er innebygd i agar, resulterer i overgangen til et polarisert vekstmønster, noe som resulterer i dannelse av ekte hyfer og / eller pseudohyphae5. Initiering av polarisert vekst og den resulterende veksten av filamentøse organismer refereres til som morfogenese.
På grunn av betydningen av morfogenese i organismens virulens, har reguleringen av hyphaldannelse blitt grundig studert 6,7. Det er et komplekst nettverk av signalveier og transkripsjonsregulering som utløser morfogenese. Til tross for forholdet mellom C. albicans morfogenese og patogenese, har de fleste studier som undersøker morfogenese brukt in vitro stimuli for å utløse hyphaldannelse. Det blir stadig tydeligere at de ulike in vitro-modellene for filamentasjon ikke er identiske når det gjelder de individuelle reguleringsveiene som stimuleres. Videre samsvarer ingen in vitro vekstforhold tett med vertens komplekse miljø. Gitt betydningen av C. albicans som et humant patogen, er målet med denne protokollen å undersøke dens morfogenese under aktiv infeksjon i en pattedyrvert ved hjelp av et system med moderat gjennomstrømning, slik at en etterforsker kan skjerme C. albicans mutantbiblioteker.
For å lette disse undersøkelsene ble det utviklet et in vivo bildebehandlingssystem som lar oss oppnå bilder med høy romlig oppløsning av C. albicans-celler under infeksjon av pinna av en bedøvet mus ved hjelp av et omvendt konfokalt mikroskop 8,9,10. Fordi huden på pinna er ganske tynn, kan disse bildene oppnås uten behov for vevsdisseksjon. Dermed kan kvantitative fenotypedata måles på stedet for aktive infeksjoner i vertsvevet. Protokollen beskrevet her innebærer transformasjon av en referansestamme og en eller flere mutantstammer med forskjellige fluorescerende proteinuttrykkskassetter11,12. De fluorescerende proteinuttrykkende stammene blandes deretter og injiseres samtidig intradermalt. Etter at infeksjonen er etablert, brukes konfokal avbildning til å kvantifisere både frekvensen av filamentasjon og lengden på de dannede filamentene. Dataene oppnådd fra mutantstammene normaliseres til det som er oppnådd fra referansestammen, som er tilstede i samme vevsområde, og gir dermed en intern kontroll. Dette systemet har gjort det mulig for oss å skjerme flere serier av C. albicans mutantstammer, hvorav mange har morfogenesedefekter in vitro 9,10. Mange av disse stammene filament lett in vivo, og fremhever viktigheten av in vivo-modeller for undersøkelse av morfogenese.
Denne modellen benytter konfokal mikroskopi for å få bilder av C. albicans organismer når de vokser i vevet til en pattedyrvert, slik at vi kan evaluere morfogenesefenotyper under aktiv infeksjon. Prosessen med morfogenese er sentral for C. albicans patogenese og har blitt mye studert ved hjelp av en rekke in vitro analyser 2,3,4. Imidlertid kan ingen in vitro-analyse fullt ut modellere det komplekse biokjemiske og strukturelle miljøet til verten.
Protokollen beskrevet her er fokusert på bruk av dette in vivo bildebehandlingssystemet for å skjerme en serie / bibliotek av C. albicans mutanter for å identifisere gener involvert i morfogenese under infeksjon. Bruken av C. albicans-stammer som uttrykker forskjellige fluorescerende proteiner gjør at vi kan kvantifisere in vivo morfogenese av C. albicans mutantstammer sammenlignet med en referansestamme. Sammenligning av morfogenese i mutanten med referansestammen innenfor samme infeksjonsområde sikrer at organismene blir utsatt for identiske miljøer. Dette muliggjør kvantitativ måling av prosentandelen celler som gjennomgår filamentasjon, samt omfanget av filamentasjon. Normalisering av målingene av mutantstammen (e) til referansestammen (e) gjør at vi bedre kan sammenligne ytelsen til en mutant til en annen.
De representative resultatene som presenteres her viser potensialet for et signifikant avvik mellom in vitro og in vivo fenotyper. C. albicans efg1ΔΔ mutantstamme brukes ofte som en negativ kontroll for morfogeneseanalyser, da den ikke klarer å filament i nesten alle in vitro-forhold 20. Selv om in vivo-resultatene var svært lik in vitro-resultatene , dannet selv denne sterkt hemmede stammen av og til filamenter i vertsvevsmiljøet (figur 3). Dette understreker vertsmiljøets styrke i å utløse morfogenese.
I kontrast demonstrerer cyr1ΔΔ mutantstammen en betydelig uenighet mellom in vitro og in vivo vekst; Selv om ingen av mutantcellene gjennomgår filamentasjon in vitro, vokser omtrent halvparten av cellene som filamenter in vivo (figur 4)10,21. Interessant nok var disse filamentene signifikant kortere enn de som ble dannet av referansestammen, noe som tyder på at CYR1 bidrar til enten filamentveksten eller evnen til å opprettholde en filamentøs fenotype. For å lette analysen av filamentlengden ble kurvebanelengden til filamentene målt ved hjelp av en todimensjonal projeksjon av bildene. I todimensjonale projeksjoner av filamenter som vokser i tre dimensjoner, vil ethvert filament som vokser på en akse som ikke er parallell med xy-planet, projisere som kortere enn den sanne lengden. Siden denne forkortingen også forekommer for referansestammen, tillater evaluering av fordelingen av filamentlengder i en todimensjonal projeksjon fortsatt en kvantitativ sammenligning mellom referanse- og mutantstammene. Analyse av filamentlengde i to snarere enn tre dimensjoner krever mindre intensiv bildeanalyse; Dermed kan den utføres relativt raskt på en typisk stasjonær datamaskin. Ved å bruke denne enklere analysen kan man inkludere filamentlengdefordeling som en del av en screeningprotokoll, noe som gir en mer nyansert forståelse av hver mutants evne til å gjennomgå morfogenese uten å forårsake betydelige forsinkelser i gjennomstrømningen.
De representative studiene som presenteres her ble utført ved bruk av DBA2 / N-mus, som har en defekt i komplementsystemet som forårsaker manglende rekruttering av nøytrofiler til stedet for C. albicans-infeksjon 22. Målet med disse studiene var å undersøke mekanismer for regulering av C. albicans filamentasjon i vertsvevet. Derfor ble DBA2 / N-mus brukt for å unngå å forstyrre resultatene på grunn av en individuell stammes følsomhet eller motstand mot nøytrofiler. Siden nøytrofil anti-C. albicans respons kan påvirke filamentasjon23, kan nøytrofil rekruttering til infeksjonsstedet påvirke resultatene av en morfogeneseanalyse. Hvis en stamme er i stand til å filamentering in vivo , men er sterkt hemmet fra filamentasjon når nøytrofiler er tilstede, vil filamentasjon bli detektert i DBA2 / N-mus, men det er usannsynlig å bli sett ved bruk av mus med intakt nøytrofil kjemotaksis. Dermed er belastningen av musen som brukes som vert en viktig faktor når du bruker denne protokollen.
Observasjonen om at efg1ΔΔ-mutantstammen ikke klarer å filament in vivo , er usannsynlig å være relatert til vertsnøytrofile responser, fordi denne stammen heller ikke klarer å filament in vitro. Filamentasjonen observert in vivo med cyr1ΔΔ-stammen er uoverensstemmende med dens manglende filamentasjon in vitro. Data fra sebrafiskmodellen for C. albicans-infeksjon indikerer at responderende nøytrofiler er viktige for å forebygge morfogenese24. Det er derfor lite sannsynlig at bruk av DBA2/N-mus, som mangler nøytrofil respons, vil forklare økningen i filamentasjon av cyr1ΔΔ in vivo sammenlignet med in vitro. Likevel påvirker in vivo-miljøet tydelig morfogenesen til cyr1ΔΔ-stammen; Dermed kan videre undersøkelser av denne stammen gi viktig informasjon om reguleringen av C. albicans morfogenese under aktive infeksjoner. Protokollen beskrevet her er utformet som en screeninganalyse for å identifisere stammer som cyr1ΔΔ-stammen som skal brukes i fremtidige studier.
Bruken av et lavstrømnings gassbedøvelsessystem er svært nyttig for denne protokollen (figur 1A, B). Under den første utviklingen av denne protokollen ble mus bedøvet ved hjelp av en injiserbar bedøvelsescocktail av ketamin blandet med xylazin. Mens det var mulig å utføre begrenset bildebehandling med den bedøvelsesmetoden, var anestesiens varighet uforutsigbar, noe som krevde at bildebehandlingsøkter ble avsluttet raskt for å unngå at musen gjenoppretter fra anestesi under avbildning. Tradisjonelle inhalerte bedøvelsessystemer er store og krever høye strømningshastigheter av bedøvelsesgasser, noe som ofte krever at de brukes i en avtrekksvifte. Dermed ville tradisjonelle inhalerte bedøvelsessystemer være svært vanskelig å bruke med plassbegrensningene til et konfokalt mikroskop uten utilsiktet å utsette etterforskerne for bedøvelsesmidlene. Bruken av et lav-flow inhalert bedøvelsessystem tillater konsekvent anestesi av dyret samtidig som det opprettholder et trygt miljø for etterforskeren. Nosecone med lav strømning tillater enkel posisjonering av dyret for både inokulering og mikroskopi. Den lille kaliber, lavvolum leveringsslangen tillater bruk av relativt lange rør, noe som gjør at anestesimaskinen kan plasseres i tilstrekkelig avstand for ikke å forstyrre mikroskopi.
Klorofyllet som er tilstede i typisk mus chow fører til betydelig vevsautofluorescens25. Dette skaper betydelig støy i bildene, noe som gjør det vanskelig å få tak i bilder av høy kvalitet med høy romlig oppløsning. Når dyr ble matet klorofyllfri chow i 7 dager før avbildning, ble bakgrunnen fra autofluorescens betydelig redusert i vev, men klorofyll avsatt i håret fortsatte å være problematisk. Fjerning av håret på pinnae ved hjelp av en over-the-counter kjemisk hårfjerningskrem er effektiv for å minimere autofluorescens i håret (figur 1C, D). Dermed reduserte kombinasjonen av klorofyllfri chow og tilstrekkelig hårfjerning betydelig autofluorescens og forbedret bildekvaliteten dramatisk. Fordi håret fjernes fra øret før avbildning, påvirker ikke fargen på dyrets hår dette systemet. Denne protokollen har blitt brukt med hell for å studere C. albicans infeksjoner i BALB / c (hvit), C57BL / 6 (svart) og DBA2 / N (brun) mus. Protokollen kan også brukes med C57BL/6 knockoutmus som mangler ulike vertsgener; Dette vil tillate fremtidige undersøkelser av hvordan pattedyrets vertsimmunsystem påvirker filamentasjon. Et trekk ved denne modellen som ikke er diskutert i denne protokollen, er at fordi dette bildebehandlingssystemet er ikke-invasivt, kan det samme dyret avbildes gjentatte ganger over flere dager, slik at man kan følge utviklingen av individuell infeksjon over tid. Denne funksjonen vil trolig spille en nøkkelrolle i fremtidige studier på vert-patogen-interaksjonen.
Oppsummert resulterer denne protokollen i bilder med høy romlig oppløsning av C. albicans som vokser i vevet til en levende pattedyrvert, noe som muliggjør nøyaktig evaluering av morfogenese i mutantstammer 8,9,10. Resultatene som presenteres her viser hvordan denne protokollen kan brukes til å skjerme et bibliotek med C. albicans mutanter. Av C. albicans mutanter testet til dags dato, gjennomgår en stor del av mutanter med kjente defekter i morfogenese in vitro lett filamentasjon in vivo 9,10. Dette fremhever viktigheten av å inkludere et in vivo-system som dette i eksperimenter designet for å belyse mekanismene til C. albicans patogenese.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av NIH-stipend 1R01AI33409 og Institutt for pediatri, Carver College of Medicine, University of Iowa.
#1.5 coverslips | Thermo-Fisher | 20811 | large enough to cover the universal stage opening |
0.1 mL Insulin syringes | EXELint | 26018 | Can use syringes that are 5/16"–1/2" long and 29–32 G |
3.7% formaldehyde in dPBS | Sigma-Aldrich | SHBJ5734 | |
70% Ethanol/30% water | Decon Laboratories | A05061001A | |
Alcohol prep pads | Covidien | 5110 | Alternative: gauze pads soaked in 70% isopropyl alcohol |
C.albicans reference strain and experimental strains | SN250 | FGSC Online Catalog | The specific C. albicans strain varies with experiment and the investigators goals. We have used strains derived from SC5314 as well as other clinical isolates. |
Chlorophyl free mouse chow | Envigo | 2920x | |
Computer | Dell | Optiplex 7050 | Computer that can run imaging software for acquisition and for analysis of images. A variety of imaging software is available and varies with the specific microscope and user system. |
Cotton tip applicator | Pro Advantage | 76200 | |
DBA2/N (6-12 week old mice) | BALB/c and C57/BL6 mice can also be used. The latter allow for the use of widely available knockout mouse models as well as mouse models in which individual cell types, such as phagocytes, are identified by their expression of fluorescent proteins. | ||
Double sided tape designed to hold fabric to skin (fashion tape) | local pharmacy or grocery store | Double sided adhesive tape designed for keeping clothing in place over human skin. This is typically available over the counter in pharmacies and variety stores. It is important to use this type of tape as it is designed for gentle adherence to skin. Examples: https://www.amazon.com/Womens-Fashion-Clothing-Transparent-Suitable/dp/B08S3TWR3H/ref=sr_1_40?crid=2UWFL8FMFAKGM&keywords =fashion+tape&qid=1649174406&sprefix= fashion+tape%2Caps%2C70&sr=8-40 https://www.amazon.com/Fearless-Tape-Sensitive-Clothing-Transparent/dp/B07QY8V5XT/ref=sr_1_26?crid=2UWFL8FMFAKGM&keywords =fashion+tape&qid=1649174320&sprefix= fashion+tape%2Caps%2C70&sr=8-26 https://www.amazon.com/Hollywood-Fashion-Secrets-Tape-Floral/dp/B009RX77MK/ref=sr_1_29?crid=2UWFL8FMFAKGM&keywords =fashion+tape&qid=1649174406&sprefix= fashion+tape%2Caps%2C70&sr=8-29 |
|
Dulbecco's phosphate buffered saline | Gibco / Thermo-Fisher | 14190-144 | Must be sterile; open a new container for every experiment |
Fetal bovine serum | Gibco / Thermo-Fisher | 26140-079 | |
Gauze pad | Pro Advantage | P157112 | |
Gel eye lurbicant | local pharmacy or grocery store | ||
ImageJ or FIJI analysis software | NIH | ImageJ (FIJI) | |
Isoflurane | Akorn | J119005 | |
Leica DMi8 (SP8 platform) with Leica 11506375 objective lens | Leica | DMi8 (SP8) | The objective lens (Leica 11506375) used here is a 25x water immersion lens to allow us to have a high NA (0.95) while approximating the refractive index of the ear tissue. The microscope (Leica DMi8 (SP8 platform) has 488 nm and 638 nm diode laser lines and is equipped with filter-free spectral detection with computer controlled adjustable bandwidth for detection of emission light. The stage must have enough clearance to allow the objective to reach the bottom coverslip without hitting the stage. |
Low-flow anesthesia system or traditional anesthesia vaporizer | Kent Scientific International | SomnoSuite | |
Nair hair remover lotion | local pharmacy or grocery store | Over the counter depilatory cream | |
Nourseothricin | Jena Bioscience | AB-101L | |
pENO1-NEON-NATR pENO1-iRFP-NATR plasmids | Fluorescent protein expression transformation constructs generously given to us by Dr. Robert Wheeler (Seman, et al., 2018, Infection and Immunity; Bergeron, et al., 2017, Infection and Immunity) | ||
Pressure sensitive laboratory tape | Tape & Label Graphic Systems Inc | 1007910 | |
RPMI1640 cell culture medium | Gibco / Thermo-Fisher | 11875-093 | |
Thimble, plastic 15 mL conical tube, or Falcon 5 mL round bottom polystyrene tubes | Falcon | 352196 | To safely hold the animals ear during injectinos |