Detta manuskript beskriver en metod för screening av måttligt stora Candida albicans mutantbibliotek för morfogenesfenotyper under aktiv infektion hos en däggdjursvärd med hjälp av icke-invasiv konfokalmikroskopi.
Candida albicans är en viktig mänsklig patogen. Dess förmåga att växla mellan morfologiska former är central för dess patogenes; Dessa morfologiska förändringar regleras av ett komplext signalnätverk som styrs som svar på miljöstimuli. Dessa regulatoriska komponenter har studerats mycket, men nästan alla studier använder en mängd olika in vitro-stimuli för att utlösa filamentation. För att bestämma hur morfogenesen regleras under patogenesprocessen utvecklade vi ett in vivo-mikroskopisystem för att få bilder med hög rumslig upplösning av organismer som genomgår hyphalbildning inom däggdjursvärden. Protokollet som presenteras här beskriver användningen av detta system för att screena små samlingar av C. albicans mutantstammar, så att vi kan identifiera viktiga regulatorer för morfogenes som det inträffar på infektionsstället. Representativa resultat presenteras, vilket visar att vissa regulatorer för morfogenes, såsom transkriptionsregulatorn Efg1, har konsekventa fenotyper in vitro och in vivo, medan andra regulatorer, såsom adenylcyklas (Cyr1), har signifikant olika fenotyper in vivo jämfört med in vitro.
Candida albicans är en vanlig mänsklig svamppatogen som orsakar mukokutan sjukdom, spridd sjukdom och lokaliserade vävnadsinfektioner1. Ett viktigt inslag i C. albicans fysiologi är dess komplexa polymorfa tillväxt, som är kopplad till dess roll som både en kommensal och en patogen 2,3,4. Under rika näringsförhållanden in vitro vid 30 ° C växer den vanligtvis som en äggformad spirande jäst. En mängd olika miljöutlösare, inklusive näringsbrist, pH-förändringar, tillväxt vid 37 ° C, exponering för serum och tillväxt när de är inbäddade i agar, resulterar i övergången till ett polariserat tillväxtmönster, vilket resulterar i bildandet av sanna hyfer och / eller pseudohyfer5. Initieringen av polariserad tillväxt och den resulterande tillväxten av trådformiga organismer kallas morfogenes.
På grund av betydelsen av morfogenes i organismens virulens har regleringen av hyphalbildning studerats omfattande 6,7. Det finns ett komplext nätverk av signalvägar och transkriptionell reglering som utlöser morfogenes. Trots förhållandet mellan C. albicans morfogenes och patogenes, de flesta studier som undersöker morfogenes har använt in vitro-stimuli för att utlösa hyphalbildning. Det blir allt tydligare att de olika in vitro-modellerna av filamentation inte är identiska när det gäller de individuella regleringsvägar som stimuleras. Dessutom motsvarar inga in vitro-tillväxtförhållanden tätt med värdens komplexa miljö. Med tanke på betydelsen av C. albicans som en mänsklig patogen är målet med detta protokoll att undersöka dess morfogenes under aktiv infektion hos en däggdjursvärd med hjälp av ett system med måttlig genomströmning, vilket gör det möjligt för en utredare att screena C. albicans mutantbibliotek.
För att underlätta dessa undersökningar utvecklades ett in vivo-avbildningssystem som gör det möjligt för oss att få bilder med hög rumslig upplösning av C. albicans-celler under infektion av pinna hos en bedövad mus med hjälp av ett inverterat konfokalmikroskop 8,9,10. Eftersom pinnaens hud är ganska tunn kan dessa bilder erhållas utan behov av vävnadsdissektion. Således kan kvantitativa fenotypdata mätas på platsen för aktiva infektioner i värdvävnaden. Protokollet som beskrivs här innefattar omvandling av en referensstam och en eller flera mutanta stammar med olika fluorescerande proteinuttryckskassetter11,12. De fluorescerande proteinuttryckande stammarna blandas sedan och injiceras intradermalt. Efter att infektionen har etablerats används konfokal avbildning för att kvantifiera både filamentationsfrekvensen och längden på de bildade filamenten. De data som erhålls från mutantstammarna normaliseras till de som erhålls från referensstammen, som finns i samma vävnadsregion, vilket ger en intern kontroll. Detta system har gjort det möjligt för oss att framgångsrikt screena flera serier av C. albicans mutanta stammar, varav många har morfogenesdefekter in vitro 9,10. Många av dessa stammar filament lätt in vivo, vilket belyser vikten av in vivo-modeller för undersökning av morfogenes.
Denna modell använder konfokalmikroskopi för att få bilder av C. albicans organismer när de växer i vävnaden hos en däggdjursvärd, vilket gör att vi kan utvärdera morfogenesfenotyper under aktiv infektion. Processen för morfogenes är central för C. albicans patogenes och har studerats i stor utsträckning med hjälp av en mängd olika in vitro-analyser 2,3,4. Ingen in vitro-analys kan dock helt modellera värdens komplexa biokemiska och strukturella miljö.
Protokollet som beskrivs här är inriktat på användningen av detta in vivo-bildsystem för att screena en serie / bibliotek av C. albicans-mutanter för att identifiera generna som är involverade i morfogenes under infektion. Användningen av C. albicans-stammar som uttrycker olika fluorescerande proteiner gör det möjligt för oss att kvantifiera in vivo-morfogenesen av C. albicans mutanta stammar jämfört med en referensstam. Genom att jämföra morfogenesen hos mutanten med referensstammen inom samma infektionsområde säkerställs att organismerna utsätts för identiska miljöer. Detta möjliggör kvantitativ mätning av andelen celler som genomgår filamentation, liksom omfattningen av filamentation. Normalisering av mätningarna av mutantstammarna till referensstammens mätningar gör det möjligt för oss att bättre jämföra prestanda hos en mutant med en annan.
De representativa resultat som presenteras här visar potentialen för en signifikant skillnad mellan in vitro – och in vivo-fenotyper . C. albicans efg1ΔΔ-mutantstam används ofta som en negativ kontroll för morfogenesanalyser eftersom den inte filament under nästan alla in vitro-förhållanden 20. Även om in vivo-resultaten var mycket lika in vitro-resultaten , bildade även denna allvarligt hämmade stam ibland filament i värdvävnadsmiljön (figur 3). Detta betonar värdmiljöns styrka när det gäller att utlösa morfogenes.
Däremot uppvisar cyr1ΔΔ-mutantstammen en betydande diskrepans mellan in vitro– och in vivo-tillväxt; Även om ingen av mutantcellerna genomgår filamentation in vitro, växer ungefär hälften av cellerna som filament in vivo (figur 4)10,21. Intressant nog var dessa filament signifikant kortare än de som bildades av referensstammen, vilket tyder på att CYR1 bidrar till antingen filamenttillväxten eller förmågan att upprätthålla en trådformig fenotyp. För att underlätta analysen av filamentlängden mättes filamentens kurvvägslängd med hjälp av en tvådimensionell projektion av bilderna. I tvådimensionella projektioner av filament som växer i tre dimensioner kommer alla filament som växer på en axel som inte är parallell med xy-planet att projicera som kortare än dess verkliga längd. Eftersom denna förskjutning också sker för referensstammen, möjliggör utvärdering av filamentlängdernas fördelning i en tvådimensionell projektion fortfarande en kvantitativ jämförelse mellan referens- och mutantstammarna. Analys av filamentlängd i två snarare än tre dimensioner kräver mindre intensiv bildanalys; Således kan den utföras relativt snabbt på en typisk stationär dator. Genom att använda denna enklare analys kan filamentlängdsfördelning inkluderas som en del av ett screeningprotokoll, vilket ger en mer nyanserad förståelse av varje mutants förmåga att genomgå morfogenes utan att orsaka betydande förseningar i genomströmningen.
De representativa studier som presenteras här utfördes med DBA2/N-möss, som har en defekt i sitt komplementsystem som orsakar ett misslyckande med att rekrytera neutrofiler till platsen för C. albicans-infektion 22. Målet med dessa studier var att undersöka mekanismer för reglering av C. albicans filamentation i värdvävnaden. Därför användes DBA2/N-möss för att undvika att förvirra resultaten på grund av en enskild stams mottaglighet eller resistens mot neutrofiler. Eftersom det neutrofila anti-C. albicans-svaret kan påverka filamentation23, kan neutrofilrekrytering till infektionsstället påverka resultaten av en morfogenesanalys. Om en stam kan glödtrådas in vivo men starkt hämmas från filamentation när neutrofiler är närvarande, skulle filamentation detekteras hos DBA2/N-möss men det är osannolikt att den ses vid användning av möss med intakt neutrofil kemotaxi. Således är musens belastning som används som värd en viktig faktor när du använder detta protokoll.
Observationen att efg1ΔΔ-mutantstammen inte filament in vivo är osannolikt att vara relaterad till värdens neutrofila svar, eftersom denna stam inte heller filament in vitro. Den filamentation som observerats in vivo med cyr1ΔΔ-stammen är disharmonisk med dess underlåtenhet att filamentera in vitro. Data från zebrafiskmodellen av C. albicans-infektion indikerar att svarande neutrofiler är viktiga för att förebygga morfogenes24. Därför är det osannolikt att användningen av DBA2/N-möss, som saknar neutrofila svar, kommer att förklara ökningen av filamentationen av cyr1ΔΔ in vivo jämfört med in vitro. Icke desto mindre påverkar in vivo-miljön tydligt morfogenesen hos cyr1ΔΔ-stammen. Således kan ytterligare undersökning av denna stam ge viktig information om regleringen av C. albicans morfogenes under aktiva infektioner. Protokollet som beskrivs här är utformat som en screeninganalys för att identifiera stammar som cyr1ΔΔ-stammen som ska användas i framtida studier.
Användningen av ett gasanestesisystem med lågt flöde är till stor hjälp för detta protokoll (figur 1A, B). Under den första utvecklingen av detta protokoll bedövades möss med hjälp av en injicerbar bedövningscocktail av ketamin blandad med xylazin. Även om det var möjligt att utföra begränsad avbildning med den bedövningsmetoden, var anestesiens varaktighet oförutsägbar, vilket krävde att avbildningssessioner avslutades snabbt för att undvika att musen återhämtade sig från anestesi under avbildning. Traditionella inhalerade anestesisystem är skrymmande och kräver höga flödeshastigheter av anestesigaser, vilket ofta kräver att de används i en dragskåp. Således skulle traditionella inhalerade anestesisystem vara mycket svåra att använda med utrymmesbegränsningarna i ett konfokalmikroskop utan att oavsiktligt utsätta utredarna för bedövningsmedlen. Användningen av ett lågflödesinandat bedövningssystem möjliggör konsekvent anestesi hos djuret samtidigt som en säker miljö för utredaren upprätthålls. Den lågflödesnoskonen möjliggör enkel positionering av djuret för både ympning och mikroskopi. Den lilla kalibern leveransslangen med låg volym möjliggör användning av relativt långa rör, vilket gör att anestesimaskinen kan placeras på tillräckligt avstånd för att inte störa mikroskopi.
Klorofyllet som finns i typisk muschow leder till signifikant vävnadsautofluorescens25. Detta skapar betydande brus i bilderna, vilket gör det svårt att få högkvalitativa, högrumsliga upplösningsbilder. När djur matades klorofyllfri chow i 7 dagar före avbildning minskade bakgrunden från autofluorescens avsevärt i vävnad, men klorofyll avsatt i håret fortsatte att vara problematiskt. Att ta bort håret på pinnae med en receptfri kemisk hårborttagningskräm är effektivt för att minimera autofluorescens i håret (figur 1C,D). Således minskade kombinationen av klorofyllfri chow och adekvat hårborttagning avsevärt autofluorescens och förbättrade bildkvaliteten dramatiskt. Eftersom håret tas bort från örat före avbildning påverkar färgen på djurets hår inte detta system. Detta protokoll har använts framgångsrikt för att studera C. albicans infektioner i BALB/c (vit), C57BL/6 (svart) och DBA2/N (brun) möss. Protokollet kan också användas med C57BL/6 knockoutmöss som har brist på olika värdgener; Detta kommer att möjliggöra framtida undersökningar av hur däggdjursvärdets immunsystem påverkar filamentation. En egenskap hos denna modell som inte diskuteras i detta protokoll är att eftersom detta bildsystem är icke-invasivt kan samma djur avbildas upprepade gånger under flera dagar, vilket gör det möjligt att följa utvecklingen av individuell infektion över tiden. Denna funktion kommer sannolikt att spela en nyckelroll i framtida studier om värd-patogeninteraktionen.
Sammanfattningsvis resulterar detta protokoll i högupplösta bilder av C. albicans som växer i vävnaden hos en levande däggdjursvärd, vilket möjliggör noggrann utvärdering av morfogenes i mutanta stammar 8,9,10. Resultaten som presenteras här visar hur detta protokoll kan användas för att screena ett bibliotek med C. albicans-mutanter. Av de C. albicans-mutanter som hittills testats genomgår en stor del av mutanterna med kända defekter i morfogenes in vitro lätt filamentation in vivo 9,10. Detta belyser vikten av att inkludera ett in vivo-system som detta i experiment som är utformade för att belysa mekanismerna för C. albicans patogenes.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av NIH-bidrag 1R01AI33409 och Institutionen för pediatrik, Carver College of Medicine, University of Iowa.
#1.5 coverslips | Thermo-Fisher | 20811 | large enough to cover the universal stage opening |
0.1 mL Insulin syringes | EXELint | 26018 | Can use syringes that are 5/16"–1/2" long and 29–32 G |
3.7% formaldehyde in dPBS | Sigma-Aldrich | SHBJ5734 | |
70% Ethanol/30% water | Decon Laboratories | A05061001A | |
Alcohol prep pads | Covidien | 5110 | Alternative: gauze pads soaked in 70% isopropyl alcohol |
C.albicans reference strain and experimental strains | SN250 | FGSC Online Catalog | The specific C. albicans strain varies with experiment and the investigators goals. We have used strains derived from SC5314 as well as other clinical isolates. |
Chlorophyl free mouse chow | Envigo | 2920x | |
Computer | Dell | Optiplex 7050 | Computer that can run imaging software for acquisition and for analysis of images. A variety of imaging software is available and varies with the specific microscope and user system. |
Cotton tip applicator | Pro Advantage | 76200 | |
DBA2/N (6-12 week old mice) | BALB/c and C57/BL6 mice can also be used. The latter allow for the use of widely available knockout mouse models as well as mouse models in which individual cell types, such as phagocytes, are identified by their expression of fluorescent proteins. | ||
Double sided tape designed to hold fabric to skin (fashion tape) | local pharmacy or grocery store | Double sided adhesive tape designed for keeping clothing in place over human skin. This is typically available over the counter in pharmacies and variety stores. It is important to use this type of tape as it is designed for gentle adherence to skin. Examples: https://www.amazon.com/Womens-Fashion-Clothing-Transparent-Suitable/dp/B08S3TWR3H/ref=sr_1_40?crid=2UWFL8FMFAKGM&keywords =fashion+tape&qid=1649174406&sprefix= fashion+tape%2Caps%2C70&sr=8-40 https://www.amazon.com/Fearless-Tape-Sensitive-Clothing-Transparent/dp/B07QY8V5XT/ref=sr_1_26?crid=2UWFL8FMFAKGM&keywords =fashion+tape&qid=1649174320&sprefix= fashion+tape%2Caps%2C70&sr=8-26 https://www.amazon.com/Hollywood-Fashion-Secrets-Tape-Floral/dp/B009RX77MK/ref=sr_1_29?crid=2UWFL8FMFAKGM&keywords =fashion+tape&qid=1649174406&sprefix= fashion+tape%2Caps%2C70&sr=8-29 |
|
Dulbecco's phosphate buffered saline | Gibco / Thermo-Fisher | 14190-144 | Must be sterile; open a new container for every experiment |
Fetal bovine serum | Gibco / Thermo-Fisher | 26140-079 | |
Gauze pad | Pro Advantage | P157112 | |
Gel eye lurbicant | local pharmacy or grocery store | ||
ImageJ or FIJI analysis software | NIH | ImageJ (FIJI) | |
Isoflurane | Akorn | J119005 | |
Leica DMi8 (SP8 platform) with Leica 11506375 objective lens | Leica | DMi8 (SP8) | The objective lens (Leica 11506375) used here is a 25x water immersion lens to allow us to have a high NA (0.95) while approximating the refractive index of the ear tissue. The microscope (Leica DMi8 (SP8 platform) has 488 nm and 638 nm diode laser lines and is equipped with filter-free spectral detection with computer controlled adjustable bandwidth for detection of emission light. The stage must have enough clearance to allow the objective to reach the bottom coverslip without hitting the stage. |
Low-flow anesthesia system or traditional anesthesia vaporizer | Kent Scientific International | SomnoSuite | |
Nair hair remover lotion | local pharmacy or grocery store | Over the counter depilatory cream | |
Nourseothricin | Jena Bioscience | AB-101L | |
pENO1-NEON-NATR pENO1-iRFP-NATR plasmids | Fluorescent protein expression transformation constructs generously given to us by Dr. Robert Wheeler (Seman, et al., 2018, Infection and Immunity; Bergeron, et al., 2017, Infection and Immunity) | ||
Pressure sensitive laboratory tape | Tape & Label Graphic Systems Inc | 1007910 | |
RPMI1640 cell culture medium | Gibco / Thermo-Fisher | 11875-093 | |
Thimble, plastic 15 mL conical tube, or Falcon 5 mL round bottom polystyrene tubes | Falcon | 352196 | To safely hold the animals ear during injectinos |