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माइक्रो-कम्प्यूटेड टोमोग्राफी का उपयोग करके हड्डी फ्रैक्चर उपचार का आकलन

Published: December 9, 2022 doi: 10.3791/64262
Automatic Translation
*1,2, *1,2, 1,2,3, 1,2, 1,2,4
1Center for Orthopaedic Research and Translational Science (CORTS), The Pennsylvania State University College of Medicine, 2Department of Orthopaedics and Rehabilitation, The Pennsylvania State University College of Medicine, 3Department of Pharmacology, The Pennsylvania State University College of Medicine, 4Department of Biochemistry and Molecular Biology, The Pennsylvania State University College of Medicine
* These authors contributed equally

Summary

माइक्रो-कंप्यूटेड टोमोग्राफी (μCT) एक गैर-विनाशकारी इमेजिंग उपकरण है जो प्रीक्लिनिकल अध्ययनों में हड्डी की संरचना का आकलन करने में सहायक है, हालांकि हड्डी के उपचार कैलस का विश्लेषण करने के लिए μCT प्रक्रियाओं पर आम सहमति की कमी है। यह अध्ययन एक चरण-दर-चरण μCT प्रोटोकॉल प्रदान करता है जो फ्रैक्चर उपचार की निगरानी की अनुमति देता है।

Abstract

माइक्रो-कंप्यूटेड टोमोग्राफी (μCT) ट्रांसलेशनल विज्ञान जांच में फ्रैक्चर उपचार के दौरान हड्डी और नवगठित हड्डी के त्रि-आयामी (3 डी) आकृति विज्ञान को चिह्नित करने के लिए सबसे आम इमेजिंग साधन है। कृन्तकों में लंबी हड्डी के फ्रैक्चर उपचार के अध्ययन में आमतौर पर द्वितीयक उपचार और खनिज युक्त कैलस का गठन शामिल होता है। गठित कैलस का आकार और नवगठित हड्डी का घनत्व टाइमपॉइंट और उपचार के बीच काफी भिन्न हो सकता है। जबकि बरकरार कॉर्टिकल और ट्रेब्युलर हड्डी के मापदंडों को निर्धारित करने के लिए मानक पद्धतियों का व्यापक रूप से उपयोग किया जाता है और व्यावसायिक रूप से उपलब्ध सॉफ्टवेयर में एम्बेडेड किया जाता है, उपचार कैलस का विश्लेषण करने के लिए प्रक्रियाओं पर आम सहमति की कमी है। इस काम का उद्देश्य एक मानकीकृत प्रोटोकॉल का वर्णन करना है जो हीलिंग कैलस में हड्डी की मात्रा अंश और कैलस खनिज घनत्व की मात्रा निर्धारित करता है। प्रोटोकॉल विभिन्न मापदंडों का वर्णन करता है जिन्हें इमेजिंग और विश्लेषण के दौरान माना जाना चाहिए, जिसमें इमेजिंग के दौरान नमूना संरेखण, रुचि की मात्रा का आकार और कैलस को परिभाषित करने के लिए कंटूर किए गए स्लाइस की संख्या शामिल है।

Introduction

माइक्रो-कम्प्यूटेड टोमोग्राफी (μCT) इमेजिंग का व्यापक रूप से प्रीक्लिनिकल हड्डी अनुसंधान में उपयोग किया गया है, जो हड्डियों के माइक्रोस्ट्रक्चर 1,2,3,4,5 का मूल्यांकन करने के लिए गैर-आक्रामक, उच्च-रिज़ॉल्यूशन छवियां प्रदान करता है। μCT में बड़ी संख्या में एक्स-रे छवियां शामिल होती हैं, जो एक घूर्णन नमूने से या घूर्णन एक्स-रे स्रोत और डिटेक्टर का उपयोग करके प्राप्त की जाती हैं। एल्गोरिदम का उपयोग छवि स्लाइस के ढेर के रूप में 3 डी वॉल्यूमेट्रिक डेटा के पुनर्निर्माण के लिए किया जाता है। नैदानिक सीटी मानव हड्डियों की 3 डी इमेजिंग के लिए स्वर्ण मानक है, और μCT प्रयोगात्मक जानवरों 1,2,3,4,6,7 में हड्डी चिकित्सा दक्षता का मूल्यांकन करने के लिए आमतौर पर इस्तेमाल की जाने वाली तकनीक है। खनिज युक्त हड्डी में एक्स-रे के लिए उत्कृष्ट विपरीत होता है, जबकि नरम ऊतकों में अपेक्षाकृत खराब विपरीत होता है जब तक कि कंट्रास्ट एजेंट का उपयोग नहीं किया जाता है। फ्रैक्चर चिकित्सा के मूल्यांकन में, μCT छवियां उत्पन्न करता है जो खनिज कैलस की 3 डी संरचना और घनत्व के बारे में विस्तृत जानकारी प्रदान करता है। विवो μCT स्कैनिंग में फ्रैक्चर चिकित्सा के अनुदैर्ध्य, समय-पाठ्यक्रम मूल्यांकन के लिए भी इस्तेमाल किया जा सकता है।

μCT का उपयोग करके बरकरार कॉर्टिकल और ट्रैब्युलर हड्डी का परिमाणीकरण आम तौर पर अच्छी तरह से स्थापित और मानकीकृतहै। यद्यपि प्रीक्लिनिकल अध्ययन फ्रैक्चर उपचार 9,10,11 का विश्लेषण करने के लिए विभिन्न प्रकार के परिमाणीकरण पद्धतियों का उपयोग करते हैं, लेकिन कैलस परिमाणीकरण के लिए μCT छवि विश्लेषण का एक विस्तृत प्रोटोकॉल अभी तक प्रकाशित नहीं किया गया है। इसलिए, इस अध्ययन का उद्देश्य μCT इमेजिंग और हड्डी चिकित्सा कैलस के विश्लेषण के लिए एक विस्तृत चरण-दर-चरण प्रोटोकॉल प्रदान करना है।

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Protocol

निम्नलिखित प्रोटोकॉल को इच्छामृत्यु वाले चूहों से काटे गए लंबे हड्डी के उपचार कैलस को चिह्नित करने के लिए विकसित किया गया था। हालांकि, अधिकांश चरणों को चूहों पर लागू किया जा सकता है और फ्रैक्चर हड्डियों की विवो स्कैनिंग में भी उपयोग किया जा सकता है। प्रोटोकॉल एक विशेष μCT सिस्टम और विशिष्ट छवि प्रसंस्करण, विश्लेषण और विज़ुअलाइज़ेशन सॉफ़्टवेयर ( सामग्री की तालिका देखें) का वर्णन करता है, फिर भी कार्यप्रणाली आम तौर पर अन्य स्कैनर और सॉफ़्टवेयर पर लागू होती है। प्रोटोकॉल को पेंसिल्वेनिया स्टेट यूनिवर्सिटी कॉलेज ऑफ मेडिसिन की संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था। इस अध्ययन में इस्तेमाल किए गए चूहे 16 सप्ताह के, पुरुष सी 57बीएल / 6 जे चूहे (औसत वजन 31.45 ± 3.2 ग्राम) थे।

1. ऊतक कटाई और संरक्षण

नोट: एक उपयुक्त मुराइन फ्रैक्चर मॉडल का उपयोग करें। इस अध्ययन के लिए,12,13 में वर्णित मानक प्रोटोकॉल के अनुसार मध्य-डायफिशियल ओपन टिबियल फ्रैक्चर मॉडल का उपयोग किया गया था।

  1. फ्रैक्चर मॉडल प्रयोग के अंत में, केटामाइन या ज़ाइलेज़िन (क्रमशः 500 मिलीग्राम / किग्रा या 50 मिलीग्राम / किग्रा) के इंट्रापरिटोनियल इंजेक्शन को प्रशासित करके माउस को इच्छामृत्यु करें।
  2. कैंची का उपयोग करके, फ्रैक्चर साइट को परेशान किए बिना मध्य-फीमर से टिबिओटालर जोड़ तक टूटी हुई हड्डी की कटाई करें। हड्डी के आसपास की मांसपेशियों को हटा दें, केवल नरम ऊतक को छोड़ दें जो बाद के प्रसंस्करण चरणों के दौरान फ्रैक्चर साइट का समर्थन करने के लिए हड्डी के सीधे संपर्क में है। माइक्रो-मच्छर स्ट्रेट हेमोस्टैटिक फोर्सप्स का उपयोग करके इंट्रामेडुलरी पिन को हटा दें।
  3. नमूनों को फॉर्मेलिन में 4 डिग्री सेल्सियस या -20 डिग्री सेल्सियस पर खारा में संरक्षित करें। संरक्षण वाहन की पसंद μCT के डाउनस्ट्रीम में इच्छित अनुप्रयोगों पर निर्भर करती है। इस अध्ययन में, नमूने -20 डिग्री सेल्सियस पर खारे में संरक्षित किए गए थे।

2. μCT स्कैनिंग

  1. नमूना तैयार करना
    1. कई नमूनों की एक साथ स्कैनिंग के लिए, छह नमूनों को एक कस्टम विकसित, 3 डी-मुद्रित स्कैनिंग फिक्स्चर (चित्रा 1 ए, बी) या इसी तरह में रखें। एक साथ स्कैनिंग समय और लागत को कम करती है। इस अध्ययन में उपयोग किए जाने वाले अनुकूलित फिक्स्चर में लंबी हड्डी के नमूने रखने के लिए छह स्लॉट और हाइड्रॉक्सीपैटाइट (एचए) प्रेत के लिए एक केंद्र छेद होता है (चित्रा 1 ए, बी; सामग्री की तालिका)।
      नोट: एचए फैंटम चरण 4.2 (नीचे देखें) में एक मानक के रूप में काम करेगा ताकि μCT इकाइयों (आमतौर पर हौंसफील्ड) को एचए घनत्व (mgHA / ccm) में परिवर्तित किया जा सके।
    2. तैयार फिक्स्चर को एक सिरिंज या शंक्वाकार ट्यूब में रखें जो दृश्य क्षेत्र (एफओवी) के व्यास के समान है; चित्रा 1 सी)। इस अध्ययन में, 21.5 मिमी क्षेत्र के दृश्य से मेल खाने के लिए 20 मिमी सिरिंज का उपयोग किया गया था।
    3. स्कैनिंग प्रक्रिया के दौरान नमूनों को सूखने से रोकने के लिए, सिरिंज या कैननिकल ट्यूब को चरण 1.3 में उपयोग किए गए संरक्षक के साथ भरें (इस अध्ययन में खारा का उपयोग किया गया था)।
  2. स्कैनिंग
    1. स्कैनिंग से पहले, पुष्टि करें कि μCT मशीन निम्नानुसार कैलिब्रेट की गई है: μCT FOV के केंद्र में एक एचए फैंटम रखें, प्रेत को स्कैन करें, और एचए के घनत्व को मापें। सुनिश्चित करें कि मापा घनत्व निर्माता द्वारा प्रदान किए गए घनत्व के अनुरूप है।
    2. नमूना फिक्स्चर सेंटरलाइन को μCT FOV की अनुमानित केंद्र रेखा के साथ संरेखित करें। यह सुनिश्चित करता है कि नमूने एफओवी के भीतर हैं, और उनके लंबे अक्षों में परिणामी छवियों की अक्षीय दिशा के साथ लगभग मेल खाता है।
      नोट: यह मानकीकृत अभिविन्यास बाद में विश्लेषण प्रक्रिया को वैरिएबिलिटी के लिए कम प्रवण बनाने में मदद कर सकता है जैसे कि ब्याज की मात्रा के भीतर माना जाने वाला ऊतक की मात्रा।
    3. μCT सिस्टम (सामग्री की तालिका) के स्कैनिंग पैरामीटर सेट करें। इस अध्ययन में उपयोग किए जाने वाले पैरामीटर 10.5 μm (आइसोट्रोपिक वोक्सेल आकार), 55 kVP (ऊर्जा / तीव्रता), 145 μA (वर्तमान), और 300 ms (एकीकरण समय) हैं। माउस ट्रेबेक्यूले (20-60 μm)8 की अनुमानित मोटाई के आधार पर Voxel आकार निर्धारित करें। यह सुनिश्चित करने के लिए कि यह सभी कैलस नमूनों की पूरी मात्रा को कवर करता है, अलग-अलग दृश्यों में स्कैन का नेत्रहीन निरीक्षण करें।

Figure 1
चित्रा 1: अनुकूलित स्कैनिंग फिक्स्चर की संरचना। (ए) स्कैनिंग फिक्स्चर (ऊपर) की छवियां, छह नमूना स्लॉट और एचए फैंटम (नीचे) दिखाती हैं। (बी) समर्पित स्लॉट में रखे गए लंबी हड्डी के नमूने (ऊपर) और एचए फैंटम (नीचे) को दिखाने वाली छवियां। (सी) 20 मिमी सिरिंज में रखी स्कैनिंग फिक्स्चर दिखाने वाली छवियां। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

3. छवि विभाजन

नोट: कच्ची छवियों को स्वचालित रूप से छवि अनुक्रम डेटा में पुनर्निर्मित किया जाता है।

  1. छवि रूपांतरण: एक छवि प्रसंस्करण सॉफ्टवेयर का उपयोग करके पुनर्निर्मित छवि अनुक्रम डेटा को DICOM छवि अनुक्रमों में परिवर्तित करें (सामग्री की तालिका देखें)। छवि प्रसंस्करण, विश्लेषण और विज़ुअलाइज़ेशन (चित्रा 2 ए) के लिए सॉफ़्टवेयर में DICOM छवि अनुक्रम आयात करें (सामग्री की तालिका देखें)।
  2. छवि फसल: एक समय में एक नमूना, प्रत्येक छवि स्टैक को क्रॉप करें और सुनिश्चित करें कि पूरे नमूने को क्रॉप्ड वॉल्यूम (चित्रा 2 बी) में शामिल किया गया है। फसली छवि को निम्नानुसार सहेजें: स्क्रीन के ऊपरी बाईं ओर फ़ाइल टैब पर क्लिक करें, प्रोजेक्ट सहेजें का चयन करें, और फिर स्क्रीन पर दिखाई देने वाले विकल्पों में से प्रोजेक्ट आकार छोटा करें का चयन करें। फ़ाइल वाणिज्यिक सॉफ़्टवेयर स्वरूप में सहेजी जाएगी.
  3. छवि डीनोइज़िंग: शोर के स्तर को कम करने और धुंधले से बचने के लिए फ़िल्टरिंग विधि का उपयोग करें।
    1. फ़ाइल टैब क्लिक करें और ओपन डेटा का उपयोग करके संसाधित की जाने वाली छवि चुनें। खोली गई छवि स्क्रीन के ऊपरी बाएं कोने में प्रोजेक्ट व्यू विंडो में दिखाई देगी।
    2. छवि संसाधन का चयन करने के लिए राइट क्लिक करें और फिर सैंडबॉक्स फ़िल्टर करें। बनाएँ क्लिक करें.
    3. गुण विंडो में (स्क्रीन के बाएं निचले कोने में) निम्न निष्पादित करें: पूर्वावलोकन प्रकार के रूप में डेटा चुनें; फ़िल्टर के बगल में स्थित ड्रॉप-डाउन मेनू से फ़िल्टर प्रकार का चयन करें; व्याख्या के लिए 3 डी चुनें; कर्नेल प्रकार के बगल में ड्रॉप-डाउन मेनू से वियोज्य का चयन करें; प्रत्येक के बगल में उपलब्ध खाली बॉक्स में मानक विचलन और कर्नेल आकार कारक के लिए उपयोग किए जाने वाले मानों को भरें; आउटपुट के बगल में ड्रॉप-डाउन मेनू से इनपुट के समान चुनें; लागू करें क्लिक करें.
      नोट: फ़िल्टर प्रकार की पसंद (उपलब्ध विकल्प द्विपक्षीय, बॉक्स, गॉसियन, माध्य, पुनरावर्ती घातांकीय, चित्रित, अनिसोट्रोपिक प्रसार, गैर-स्थानीय साधन, अनशार्प मास्किंग और एफएफटी फ़िल्टर हैं) और पैरामीटर शोर स्तर और स्कैन की गई छवियों के वोक्सेल आकार पर निर्भर करता है। गॉसियन फ़िल्टर के लिए, 3 x 3 x 3 और 5 x 5 x 5 कर्नेल आकार कारक के लिए आमतौर पर उपयोग किए जाने वाले मान हैं, और 0.5-2.0 आमतौर पर मानक विचलन8 के लिए उपयोग किया जाता है। इस अध्ययन में, एक गॉसियन फ़िल्टर लागू किया गया था, और क्रमशः कर्नेल आकार कारक और मानक विचलन के लिए 5 x 5 x 5 और 0.8 का उपयोग किया गया था।
  4. छवि पुनर्संरेखण
    नोट: यह एक वैकल्पिक कदम है। जब स्कैनिंग प्रक्रिया के दौरान इमेजिंग सिस्टम के समन्वय अक्षों के सापेक्ष लंबी हड्डी के नमूनों का गलत संरेखण होता है, तो गलत संरेखण को ठीक करने के लिए एक डिजिटल संरेखण विधि लागू की जा सकती है (चित्रा 2 सी)।
    1. निम्नानुसार नमूने की एक 3 डी रेंडर की गई छवि बनाएं। प्रोजेक्ट दृश्य विंडो में, फ़िल्टर की गई, क्रॉप की गई छवि (चरण 3.3 में बनाई गई) का चयन करें. ड्रॉप-डाउन मेनू से प्रदर्शन और फिर वॉल्यूम रेंडरिंग का चयन करने के लिए राइट क्लिक करें, फिर बनाएँ क्लिक करें. विज़ुअल रूप से 3 डी प्रस्तुत छवि को धनु और ललाट विमानों में जांचें।
    2. अनुदैर्ध्य अक्ष में एक अच्छा संरेखण प्राप्त करने के लिए रेंडर किए गए वॉल्यूम को मैन्युअल रूप से घुमाएं। घुमाई गई छवियों पर परिवर्तन निम्नानुसार लागू करें: गुण विंडो में, ट्रांसफ़ॉर्म संपादक पर क्लिक करें, फिर संपादक-मैनिपुलेटर को बदलने के लिए जाएं और ड्रॉप-डाउन मेनू से ट्रांसफार्मर का चयन करें। अब नमूने को घुमाया और पुन: संरेखित किया जा सकता है। एक बार रीअलाइनमेंट प्रक्रिया पूरी हो जाने के बाद, छवि को लॉक करने के लिए फिर से ट्रांसफॉर्म एडिटर पर क्लिक करें।
    3. नए अनुप्रस्थ (अक्षीय) विमान छवि स्लाइस बनाने के लिए फ़िल्टर की गई छवि (चरण 3.3 में बनाई गई) को निम्नानुसार पुन: नमूना करें: प्रोजेक्ट दृश्य विंडो में, चरण 3.4.2 से छवि का चयन करें। ज्यामिति ट्रांसफ़ॉर्म का चयन करने के लिए राइट क्लिक करें और फिर ड्रॉप-डाउन मेनू से रूपांतरित छवि का पुन: नमूना लें और बनाएँ क्लिक करें. गुण विंडो में, डेटा पर जाएँ और निम्न निष्पादित करें: प्रक्षेप के लिए, ड्रॉप-डाउन मेनू से मानक का चयन करें; मोड के लिए, विस्तारित चुनें; संरक्षित करने के लिए, वोक्सेल आकार चुनें; पैडिंग मान के लिए, उपलब्ध रिक्त बॉक्स में शून्य दर्ज करें. फिर लागू करें क्लिक करें.
  5. ब्याज की मात्रा को परिभाषित करना (VOI)
    1. अनुप्रस्थ छवि स्लाइस के माध्यम से जाएं और फ्रैक्चर कैलस के केंद्र तल की पहचान करें। कैलस के समीपस्थ और बाहर के सिरों के आधार पर वीओआई को परिभाषित करें। ऐसे मामलों में जब कैलस सिरों को परिभाषित करना मुश्किल होता है, तो कैलस सेंटर प्लेन (चित्रा 2 डी) से एक मानकीकृत दूरी के आधार पर वीओआई को परिभाषित करें।
      नोट: हड्डी रीमॉडेलिंग से पहले होने वाले उपचार चरणों के दौरान, खनिज युक्त कैलस के किनारों को परिभाषित करना आसान है क्योंकि नवगठित बुनी हुई हड्डी की त्रिकोणीय संरचना मूल हड्डी की कॉर्टिकल संरचना से अलग है। हालांकि, जब रीमॉडेलिंग चरण शुरू होता है, तो नवगठित हड्डी धीरे-धीरे कॉर्टिकल संरचना प्राप्त करती है; इस प्रकार, कैलस के किनारों को परिभाषित करना तेजी से चुनौतीपूर्ण हो जाता है।

Figure 2
चित्र 2: छवि विभाजन। (A) एक स्कैन के भीतर छह नमूने दिखाने वाली छवि. (B) अलग-अलग नमूनों को अलग करने के लिए छवि फसल. (सी) एक गलत संरेखित अनुदैर्ध्य अक्ष (पीली बिंदीदार रेखा) को सही करने के लिए डिजिटल संरेखण। (डी) वीओआई और कैलस सेंटर प्लेन की परिभाषा। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

4. छवि विश्लेषण

  1. कैलस और कॉर्टिकल हड्डी का विभाजन
    1. ऑटो ट्रेस और ट्रेस किनारों के विकल्पों (चित्रा 3 ए) के साथ विभाजन लासो टूल का उपयोग करके कैलस की बाहरी सीमा को अर्ध-स्वचालित रूप से कंटूर करें:
      1. रूपांतरित छवियों (चरण 3.4.3) के पुनर्संयोजन के बाद, स्क्रीन के शीर्ष से दूसरी टैब पंक्ति में विभाजन टैब पर क्लिक करें। विभाजन संपादक विंडो में, छवि के बगल में ड्रॉप-डाउन मेनू से एक रूपांतरित छवि (चरण 3.4.3 में बनाई गई) का चयन करें।
      2. सामग्री विंडो में, डबल क्लिक करें जोड़ें; ऐसा करने से, सामग्री 3 और सामग्री 4 नामक दो टैब दिखाई देंगे। सामग्री 3 का नाम बदलकर कैलस और सामग्री 4 को कॉर्टिकल हड्डी में बदलने के लिए राइट क्लिक करें।
      3. चयन विंडो में, लासो आइकन पर क्लिक करें; दिखाई देने वाले विकल्पों में से, 2 डी मोड के लिए फ्रीहैंड, 3 डी मोड के लिए इनसाइड और विकल्पों के लिए ऑटो ट्रेस और ट्रेस किनारों दोनों का चयन करें। रुचि के क्षेत्रों को चिह्नित करने के लिए लासो का उपयोग करें।
    2. वीओआई (चित्रा 3 बी) में नमूना किए गए स्लाइस के साथ इस कंटूरिंग चरण को दोहराएं। कंटूर्ड स्लाइस को अलग रखा जा सकता है (उदाहरण के लिए, 20 स्लाइस से अलग किया जाता है)।
      नोट: जटिल कैलस संरचनाओं वाले क्षेत्रों में, उपयोगकर्ता अधिक टुकड़ों को पकड़ने के लिए कंटूर्ड स्लाइस के बीच की दूरी को कम करने पर विचार कर सकता है (चित्रा 3 ए, बी)।
    3. एक पूर्ण कैलस लेबल (चित्रा 3 सी, डी) बनाने के लिए कंटूर्ड कैलस की रूपरेखा में इंटरपोल, निम्नानुसार: सामग्री विंडो में, कैलस फ़ाइल चुनें (चरण 4.1.1.2 में बनाया गया), स्क्रीन के शीर्ष पर चयन टैब पर क्लिक करें, और ड्रॉप-डाउन मेनू से इंटरपोल का चयन करें। चयन विंडो में, प्लस चिह्न पर क्लिक करें।
    4. चरण 4.1.1.2 में बनाई गई कॉर्टिकल बोन फ़ाइल खोलें। मज्जा गुहा सहित कॉर्टिकल हड्डी को विभाजित करें, जैसा कि चरण 4.1.1 और 4.1.2 में कैलस के लिए उल्लिखित है। (चित्रा 4 ए, बी)। चरण 4.1.3 (चित्रा 4 सी, डी) में कैलस के लिए उल्लिखित कॉर्टिकल हड्डी लेबल बनाने के लिए कंटूर्ड पेरीओस्टोल कॉर्टेक्स को इंटरपोल करें।
    5. कैलस के कंटूर्ड वॉल्यूम और औसत ग्रे मान की गणना निम्नानुसार करें: स्क्रीन की शीर्ष पंक्ति पर विभाजन टैब पर क्लिक करें और ड्रॉप-डाउन मेनू से सामग्री सांख्यिकी का चयन करें। यह एक तालिका उत्पन्न करेगा जिसमें सभी परिकलित मान शामिल हैं। कॉर्टिकल हड्डी और कैलस (कॉर्टिकल हड्डी को घटाने के बाद) के मूल्य अलग-अलग प्रदान किए जाते हैं। एक बार तालिका जनरेट हो जाने के बाद, डेटा सहेजने के लिए कार्यस्थान में निर्यात करें क्लिक करें.
  2. ग्रे-स्केल इकाइयों का अस्थि खनिज घनत्व में रूपांतरण
    1. पूरी छवि से 4.5 मिमी एचए फैंटम (चित्रा 2बी) की 3 डी छवि क्रॉप करें और विभाजन पर क्लिक करें। एचए फैंटम के राल में पांच छोटे एचए सिलेंडर होते हैं (चित्रा 1 ए)। एचए सिलेंडर के लिए जिसमें उच्चतम घनत्व है, दृश्य निरीक्षण द्वारा पहले और अंतिम स्लाइस को परिभाषित करें।
    2. ब्रश टूल (चित्रा 5 ए) का उपयोग करके पहले और अंतिम स्लाइस पर दो सर्कल खींचें (किनारों से बचें): सामग्री विंडो में, चार बार जोड़ें पर क्लिक करें। सामग्री 3, सामग्री 4, सामग्री 5, और सामग्री 6 का नाम बदलकर क्रमशः फैंटम 1, फैंटम 2, फैंटम 3 और फैंटम 4 करने के लिए राइट क्लिक करें। फैंटम 1 का चयन करें, चयन विंडो में ब्रश आइकन पर क्लिक करें और प्रेत के आकार के आधार पर ब्रश आकार (परिपत्र अनुरेखण) को समायोजित करने के लिए स्लाइडर का उपयोग करें (सर्कल का आकार प्रेत की तुलना में छोटा होना चाहिए)।
    3. प्रत्येक एचए सिलेंडर (चित्रा 5 बी) के लिए वॉल्यूम बनाने के लिए दो मंडलों के बीच प्रक्षेप लागू करें: सामग्री विंडो में, फैंटम 1 का चयन करें, स्क्रीन की शीर्ष पंक्ति पर चयन टैब पर क्लिक करें, और ड्रॉप-डाउन मेनू से इंटरपोल का चयन करें। चयन विंडो में, प्लस चिह्न क्लिक करें.
    4. शेष एचए सिलेंडरों में से तीन के साथ विभाजन प्रक्रिया को दोहराएं, जो दूसरे उच्चतम एचए घनत्व से शुरू होता है और दूसरे सबसे कम एचए घनत्व (चित्रा 5 बी) के साथ समाप्त होता है। सबसे कम एचए घनत्व वाले सिलेंडर को बाहर रखा जा सकता है क्योंकि इसे अक्सर सेगमेंट करना मुश्किल होता है।
    5. चार विश्लेषण किए गए एचए सिलेंडरों के औसत ग्रे मूल्यों की गणना करने के लिए उत्पन्न 3 डी लेबल का उपयोग करें। स्प्रेडशीट ( सामग्री की तालिका देखें) या इसी तरह का उपयोग करके, प्रेत निर्माता द्वारा प्रदान किए गए औसत ग्रे मूल्यों और संबंधित अस्थि खनिज घनत्व (बीएमडी) मूल्यों को प्लॉट करें। रैखिक प्रतिगमन का उपयोग करके बीएमडी और ग्रे मानों के बीच सहसंबंध समीकरण उत्पन्न करें।
  3. खनिज युक्त कैलस का विभाजन और बीएमडी की गणना
    1. चरण 4.2.5 में उत्पन्न सहसंबंध समीकरण और चुनी हुई सीमा के आधार पर जो खनिज और अखनिजीकृत कैलस को अलग करता है, संबंधित ग्रे मान सीमा निर्धारित करें। तदनुसार, सीमा से अधिक ग्रे मूल्यों वाले कैलस क्षेत्र को खनिज युक्त कैलस के रूप में लेबल करें और बाकी को अखनिजीकृत के रूप में लेबल करें (चित्रा 6 ए, बी)। इस अध्ययन में, 250 mgHA / ccm का उपयोग खनिज युक्त कैलस14,15 के लिए दहलीज के रूप में किया गया था।
    2. कुल कैलस और खनिज युक्त कैलस वॉल्यूम की गणना करें। इन मूल्यों के आधार पर, हड्डी की मात्रा अंश की गणना करें (खनिज युक्त कैलस मात्रा कुल कैलस वॉल्यूम = बीवी / टीवी के लिए सामान्यीकृत है)। 4.2.5 में उत्पन्न सहसंबंध समीकरण का उपयोग करके कैलस के बीएमडी की गणना करने के लिए कुल कैलस के लिए मापा गया औसत ग्रे मान का उपयोग करें।
      नोट: अध्ययन के लक्ष्य और विश्लेषण के लिए उपयोग किए जाने वाले सॉफ़्टवेयर के आधार पर, एसएमआई (संरचना मॉडल सूचकांक), त्रिकोणीय मोटाई और अनिसोट्रॉपी की डिग्री जैसे अन्य मापदंडों की गणना की जा सकती है।

Figure 3
चित्र 3: कैलस बाहरी सीमा का विभाजन। (ए) कैलस (लाल रेखा) की बाहरी सीमा का एक समोच्च। (बी) वीओआई (लाल स्लाइस) में नमूना किए गए स्लाइस पर आकृति। (सी) प्रक्षेप (लाल मात्रा) द्वारा बनाया गया एक 3 डी कैलस लेबल। (डी) सी (कॉर्टिकल हड्डी सहित) में दिखाए गए कैलस लेबल का एक क्रॉस-सेक्शन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्र 4: कॉर्टिकल हड्डी का विभाजन । (ए) कॉर्टेक्स (हरी रेखा) की पेरीओस्टोल सतह की एक समोच्च। (बी) वीओआई (हरे स्लाइस) में नमूना किए गए स्लाइस पर आकृति। (सी) कॉर्टिकल हड्डी का एक 3 डी लेबल (जिसमें मज्जा गुहा होता है; हरा) और कैलस (लाल) पेरीओस्टोल कॉर्टेक्स और कैलस के इंटरपोलेटेड लेबल से बनाया जाता है। (डी) कैलस (लाल) और कॉर्टिकल हड्डी का एक क्रॉस-सेक्शन (जिसमें इंट्रामेडुलरी गुहा होता है; हरा)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्र 5: ग्रे-स्केल इकाइयों का बीएमडी में रूपांतरण । (ए) पहले और अंतिम स्लाइस (लाल घेरे) पर एचए सिलेंडर की आकृति। (बी) 3 डी इंटरपोलेटेड एचए सिलेंडर (बाएं) और क्रॉस-सेक्शन (दाएं)। ब्राउन: उच्चतम एचए घनत्व; नीला: दूसरा उच्चतम एचए घनत्व; बैंगनी: तीसरा उच्चतम एचए घनत्व; हरा: चौथा उच्चतम एचए घनत्व। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 6
चित्र 6: खनिज युक्त कैलस का विभाजन। (A) खनिज युक्त कैलस (≥250 mgHA/ccm) को नीले रंग में दिखाया गया है, बाकी कैलस (<250 mgHA/ccm) को लाल रंग में दिखाया गया है, और मूल हड्डी के अनुरूप स्थान को हरे रंग में दिखाया गया है। (बी) प्रत्येक पृथक लेबल का एक 3 डी दृश्य। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Representative Results

फ्रैक्चर उपचार के दौरान हड्डी के गठन की निगरानी करने के लिए, वयस्क, पुरुष सी 75बीएल / 6 जे चूहों में एक मध्य-डायफिशियल ओपन टिबियल फ्रैक्चर को प्रेरित किया गया था। फ्रैक्चर को एक इंट्रामेडुलरी नाखून का उपयोग करके स्थिर किया गया था, जो माध्यमिक उपचार13 का एक स्थापित मॉडल था। कैलस ऊतकों को 14, 21 और 28 पोस्ट-फ्रैक्चर12 दिनों में काटा गया था। ये टाइमपॉइंट उपचार के विभिन्न चरणों का प्रतिनिधित्व करते हैं। द्वितीयक हड्डी के उपचार के दौरान एंडोकॉन्ड्रल हड्डी का गठन फाइब्रो-कार्टिलाजिनस (नरम) कैलस के प्रारंभिक गठन के माध्यम से आगे बढ़ता है, जो फ्रैक्चर गैप पर माइक्रोमोशन को कम करने के लिए बाद के चरणों में खनिज बनाता है, जिससे फ्रैक्चर लाइन13 में नई रक्त वाहिकाओं के गठन की अनुमति मिलती है। इस अध्ययन में उपयोग किए जाने वाले मुराइन फ्रैक्चर मॉडल में 14 वें दिन पोस्ट-फ्रैक्चर खनिज युक्त नरम कैलस के चरण का प्रतिनिधित्व करता है। जैसा कि उपचार दिन 14 से दिन 21 तक आगे बढ़ता है, खनिज युक्त नरम कैलस को पूरी तरह से नवगठित बुनी हुई हड्डी द्वारा प्रतिस्थापित किया जाता है, जिसके परिणामस्वरूप फ्रैक्चर गैप13 का बोनी ब्रिजिंग होता है। 21 और 28 दिनों के बीच, कैलस कॉर्टिकल हड्डी12 की विशिष्ट संरचना को फिर से स्थापित करने के लिए पुनरुत्थान और रीमॉडेलिंग से गुजरता है।

ऊपर वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग करके तीन टाइमपॉइंट्स पर μCT छवियों का अधिग्रहण और विश्लेषण किया गया था। प्रत्येक समय बिंदु पर कम से कम 10 नमूनों का विश्लेषण किया गया था। प्रत्येक नमूने के लिए, हड्डी की मात्रा अंश और बीएमडी की गणना की गई थी। हड्डी की मात्रा अंश की गणना कुल कैलस वॉल्यूम (टीवी) से खनिज युक्त कैलस (बीवी) की मात्रा को विभाजित करके की गई थी। परिणामों ने 14 वें दिन खनिज युक्त कैलस के पर्याप्त गठन का प्रदर्शन किया (चित्रा 7 ए, बी) और हड्डी के अंश की मात्रा और बीएमडी में वृद्धिशील वृद्धि क्योंकि उपचार 14 दिन से दिन 21 और 28 (चित्रा 7 ए, बी) तक आगे बढ़ा, जो फ्रैक्चर गैप के बोनी ब्रिजिंग के अनुरूप था। जैसा कि अपेक्षित था, कैलस ने 21 और 28 दिनों के बीच पुनरुत्थान / रीमॉडेलिंग किया, जैसा कि कुल कैलस वॉल्यूम में गिरावट से पता चलता है (चित्रा 7 ए, बी)। कैलस की कॉर्टिकल ब्रिजिंग किसी भी पूर्ववर्ती समय बिंदु (चित्रा 7 ए) की तुलना में 28 वें दिन अधिक स्पष्ट थी। इन परिणामों से संकेत मिलता है कि प्रदान किया गया μCT प्रोटोकॉल हड्डी के उपचार के विभिन्न चरणों के दौरान हड्डी के गठन और कैलस संरचना की निगरानी की अनुमति देता है।

Figure 7
चित्र 7: संकेतित पोस्ट-फ्रैक्चर टाइमपॉइंट्स पर μCT. (A) 2D (बाएं पैनल) और 3D (दाएं पैनल) द्वारा उत्पन्न हीलिंग कैलस की छवियों का उपयोग करके हड्डी के उपचार की निगरानी। (बी) बीएमडी, हड्डी की मात्रा अंश (बीवी / टीवी), और ए में दिखाए गए चित्रों से गणना की गई कुल कैलस मात्रा। परिणाम देर से मरम्मत और रीमॉडेलिंग चरणों के माध्यम से उपचार प्रगति दिखाते हैं। N = 10-12 लाइन प्लॉट पर बिंदु एक-तरफ़ा एनोवा का उपयोग करके औसत ± एसईएम (*) पी < 0.05 का प्रतिनिधित्व करते हैं, जिसके बाद टुकी का पोस्ट-हॉक परीक्षण होता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

इस अध्ययन का उद्देश्य 3 डी खनिज युक्त कैलस संरचना के सटीक परिमाणीकरण के लक्ष्य के साथ μCT विश्लेषण के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन करना है, जो अक्सर हड्डी और फ्रैक्चर उपचार अध्ययनों में मौलिक होता है। प्रोटोकॉल एक सामान्य-उद्देश्य अत्याधुनिक 3 डी छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर प्लेटफॉर्म का उपयोग करता है जो छवि विज़ुअलाइज़ेशन, विभाजन / लेबलिंग और सरल से जटिल तक के माप की सुविधा प्रदान करता है।

प्रोटोकॉल में सबसे अधिक समय लेने वाला कार्य कैलस का अर्ध-स्वचालित विभाजन है, जिसमें कॉर्टिकल हड्डी और मज्जा नहर का बहिष्करण है। इस क्षेत्र को पिछलेकई अध्ययनों 9,16,17,18 में भी बाहर रखा गया है। कुछ अध्ययनों ने अपने विश्लेषण19,21 में देशी कॉर्टिकल हड्डी और नहर क्षेत्रों को शामिल किया है, जबकि अन्य अध्ययनों में दृष्टिकोण स्पष्ट नहीं था। देशी कॉर्टिकल्स को शामिल करने से खंडित कॉर्टिकल्स के छोटे क्षेत्रों को कंटूर करने में कठिनाई और संभावित व्यक्तिपरकता से बचा जा सकता है, लेकिन कैलस खनिजीकरण उपायों को बढ़ा ता है।

प्रोटोकॉल कुल कैलस मात्रा, खनिज मात्रा, हड्डी की मात्रा अंश और हड्डी खनिज घनत्व सहित आउटपुट उपायों को प्राप्त करने पर केंद्रित है। इन मापदंडों की आसानी से व्याख्या की जाती है और आमतौर पर साहित्य में रिपोर्ट की जाती है। खनिज युक्त मात्रा और हड्डी की मात्रा अंश खनिज बनाम अखनिजीकृत को अलग करने के लिए चयनित सीमा पर निर्भर हैं, जबकि अस्थि खनिज घनत्व नहीं है। ऊतक खनिज घनत्व की गणना खनिज खनिज घनत्व के आधार पर केवल खनिज के रूप में लेबल किए गए ऊतक के आधार पर की जा सकती है, बजाय खनिज और अखनिजीकृत कैलस दोनों के आधार पर। ऊतक खनिज घनत्व को मरोड़ की ताकत और कठोरता के साथ जुड़ा हुआ बताया गया है9; हालांकि, ये उपाय हड्डी खनिज घनत्व की तुलना में आंशिक मात्रा प्रभाव और इमेजिंग रिज़ॉल्यूशन से प्रभावित होने की अधिक संभावना है।

जांचकर्ताओं ने मात्रात्मक 3 डी कॉर्टिकल ब्रिजिंग और कैलस ताकत और कठोरता के बीच अच्छे सहसंबंध की सूचना दी है (2 डी रेडियोग्राफी पर मूल्यांकन किए गए कॉर्टिकल ब्रिजिंग का आमतौर पर मानव रोगियों में नैदानिक रूप से मूल्यांकन किया जाता है)। साहित्य में रिपोर्ट किए गए अतिरिक्त 3 डी कैलस गुणों में जड़ता10,15,19 के क्षण शामिल हैं, जो कैलस के ज्यामितीय वितरण को चिह्नित करते हैं (यानी, ऊतक कैसे फैला हुआ है)। जड़ता का ध्रुवीय क्षण सैद्धांतिक रूप से मरोड़ प्रतिरोध से संबंधित है और जड़ता का झुकने वाला क्षण झुकने वाले प्रतिरोध से संबंधित है। यद्यपि इन गुणों की गणना इस अध्ययन में वर्णित खंडित कैलस डेटा के आधार पर की जा सकती है, मापा बायोमेकेनिकल गुणों के साथ उनका सहसंबंध असंगत 9,19,21 बताया गया है। पहले रिपोर्ट किए गए अन्य कैलस गुणों में कनेक्टिविटी घनत्व, त्रिकोणीय मोटाई और संरचना मॉडल इंडेक्स11,17,,2 2 शामिल हैं। इन मापदंडों का उपयोग अक्सर त्रिकोणीय हड्डी को चिह्नित करने के लिए किया जाता है और μCT स्कैनर सॉफ्टवेयर द्वारा आसानी से गणना की जाती है; हालांकि, फ्रैक्चर उपचार गुणवत्ता के लिए उनका संबंध उतना स्पष्ट नहीं है। इस प्रोटोकॉल में उपयोग किया जाने वाला सॉफ्टवेयर एक सामान्य-उद्देश्य कार्यक्रम है, हड्डी के लिए विशिष्ट नहीं है। इस प्रकार, यदि कुछ हड्डी मापदंडों जैसे कि ट्रैब्युलर मोटाई की गणना इस प्रोटोकॉल के बाहर की जाती है, तो खंडित डेटा को आगे के विश्लेषण के लिए अन्य कार्यक्रमों में निर्यात किया जा सकता है (उदाहरण के लिए, वाटसन एट अल 23 में)।

यह प्रोटोकॉल अन्य विधियों की तुलना में एक ही सॉफ्टवेयर वातावरण से जटिल कैलस संरचना लक्षण वर्णन और गुणवत्ता नियंत्रण के लिए विस्तृत वर्कफ़्लो प्रदान करता है जिसमें विश्लेषणके लिए कई कार्यक्रमों की आवश्यकता होती है। इसलिए, समय की बचत इस प्रोटोकॉल का एक संभावित लाभ है। सॉफ्टवेयर विभिन्न प्रकार के लचीले, परिष्कृत 3 डी विज़ुअलाइज़ेशन विधियों को सक्षम करता है जो सटीक विश्लेषण सुनिश्चित करने में मदद करते हैं और सभी परिणामों के समानांतर सारणीकरण की भी अनुमति देते हैं।

μCT विश्लेषण प्रोटोकॉल चूहों के साथ-साथ चूहों में विभिन्न फ्रैक्चर मॉडल के लिए अनुकूलित किया जा सकता है; अन्य अनुप्रयोगों के लिए, परिणाम भिन्नता को कम करने के लिए कुछ महत्वपूर्ण चरणों के अनुकूलन की सिफारिश की जाती है। विशेष रूप से, परिणामों की प्रजनन क्षमता पर वीओआई के आकार को बदलने या वीओआई के भीतर कंटूर्ड स्लाइस की संख्या को बदलने के प्रभाव की जांच पर विचार किया जाना चाहिए। इसके अलावा, चरण 3.4 में वर्णित डिजिटल रीअलाइनमेंट का उपयोग करने की सिफारिश की जाती है, लेकिन यदि विश्लेषण के लिए विभिन्न सॉफ़्टवेयर का उपयोग किया जाता है, तो डिजिटल रीअलाइनमेंट के साथ और बिना उत्पन्न डेटा की तुलना करके इस चरण की आवश्यकता का आकलन करना आवश्यक हो सकता है।

इस प्रोटोकॉल में, कॉर्टिकल हड्डी और मज्जा से कैलस की पहचान और पृथक्करण के लिए एक अर्ध-स्वचालित विभाजन दृष्टिकोण का उपयोग किया गया था। कॉम्मिनट्ड फ्रैक्चर जैसे मामलों में, जहां कैलस की संरचना बेहद जटिल होती है, कैलस और कॉर्टेक्स की पेरीओस्टोल सतह को कंटूर करना चुनौतीपूर्ण हो जाता है। इन मामलों में यह सलाह दी जाती है कि व्यक्तिपरकता का आकलन करने और उसे सीमित करने का प्रयास करने के लिए कई प्रयोगकर्ताओं के साथ कंटूरिंग करें।

इस प्रोटोकॉल के साथ सीमाएँ मौजूद हैं. प्रोटोकॉल को DICOM छवियों के रूपांतरण और निर्यात की आवश्यकता होती है ताकि छवियों को बाद में अतिरिक्त सॉफ़्टवेयर में विश्लेषण किया जा सके; इस कदम में कुछ अतिरिक्त समय लगता है और छवि के भीतर अंशांकन प्रेत के उपयोग की आवश्यकता हो सकती है। चूंकि स्वचालित विभाजन तकनीकें विकसित होती रहती हैं, जिनमें मशीन लर्निंग पर आधारित तकनीकें भी शामिल हैं, इसलिए इन नई तकनीकों के साथ प्रोटोकॉल के मैनुअल कंटूरिंग भागों को बदलना फायदेमंद हो सकता है। कुल मिलाकर, कृन्तकों में अस्थि चिकित्सा कैलस के विश्लेषण के लिए यहां वर्णित विस्तृत प्रोटोकॉल विशेष रूप से पर्याप्त μCT विश्लेषण अनुभव के बिना प्रयोगशालाओं को लाभ पहुंचा सकता है और पूरे क्षेत्र में अधिक सुसंगत और मानकीकृत दृष्टिकोण स्थापित करने में मदद कर सकता है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

इस काम को राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (एनआईएच) आर01 द्वारा आर.ए.ई और आर.01 DK121327 AR071968 एफ.के.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10% neutral buffered formalin  Fisher chemical SF100-20 Used for bone tissue fixation
Avizo Thermo Scientific Image processing and analysis software
Hydroxyapatite phantom  Micro-CT HA D4.5, QRM QRM-70128
Image Processing Language Scanco Used to convert raw images to DICOM images
Micro-Mosquito Straight Hemostatic Forceps Medline Used to remove the intramedullary pin 
Microsoft Excel Microsoft Spreadsheet software
Scanco mCT system (vivaCT 40) Scanco Used for µCT imaging 

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References

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माइक्रो-कम्प्यूटेड टोमोग्राफी का उपयोग करके हड्डी फ्रैक्चर उपचार का आकलन
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Wee, H., Khajuria, D. K., Kamal, F., Lewis, G. S., Elbarbary, R. A. Assessment of Bone Fracture Healing Using Micro-Computed Tomography. J. Vis. Exp. (190), e64262, doi:10.3791/64262 (2022).

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