Summary
Mikrocomputertomografi (μCT) er et ikke-destruktivt bildebehandlingsverktøy som er medvirkende til å vurdere beinstruktur i prekliniske studier, men det mangler konsensus om μCT-prosedyrer for å analysere benhelingskallus. Denne studien gir en trinnvis μCT-protokoll som gjør det mulig å overvåke bruddheling.
Abstract
Mikrocomputertomografi (μCT) er den vanligste bildemodaliteten for å karakterisere den tredimensjonale (3D) morfologien til bein og nydannet bein under bruddheling i translasjonsvitenskapelige undersøkelser. Studier av lang benbruddheling hos gnagere involverer vanligvis sekundær helbredelse og dannelse av en mineralisert callus. Formen på callus dannet og tettheten av det nydannede beinet kan variere vesentlig mellom tidspunkter og behandlinger. Mens standardmetoder for kvantifisering av parametere for intakt kortikal og trabekulært ben er mye brukt og innebygd i kommersielt tilgjengelig programvare, mangler det konsensus om prosedyrer for å analysere helbredelseskallus. Hensikten med dette arbeidet er å beskrive en standardisert protokoll som kvantifiserer beinvolumfraksjon og kallus mineraltetthet i helbredende callus. Protokollen beskriver forskjellige parametere som bør vurderes under avbildning og analyse, inkludert prøvejustering under avbildning, størrelsen på volumet av interesse og antall skiver som er konturert for å definere callus.
Introduction
Mikrocomputertomografi (μCT) avbildning har blitt mye brukt i preklinisk beinforskning, og gir ikke-invasive, høyoppløselige bilder for å evaluere mikrostrukturen av bein 1,2,3,4,5. μCT involverer et stort antall røntgenbilder, oppnådd fra en roterende prøve eller ved bruk av en roterende røntgenkilde og detektor. Algoritmer brukes til å rekonstruere 3D-volumetriske data i form av en stabel med bildeskiver. Klinisk CT er gullstandarden for 3D-avbildning av menneskelige bein, og μCT er en vanlig teknikk for å evaluere beinhelingseffektivitet hos forsøksdyr 1,2,3,4,6,7. Mineralisert bein har utmerket kontrast til røntgen, mens bløtvev har relativt dårlig kontrast med mindre et kontrastmiddel brukes. I vurderingen av bruddheling genererer μCT bilder som gir detaljert informasjon om 3D-strukturen og tettheten til den mineraliserte kallusen. In vivo μCT-skanning kan også brukes til langsgående, tidsløpsvurdering av bruddheling.
Kvantifiseringen av intakt kortikal og trabekulært ben ved bruk av μCT er generelt veletablert og standardisert8. Selv om prekliniske studier bruker en rekke kvantifiseringsmetoder for å analysere bruddheling 9,10,11, er en detaljert protokoll for μCT-bildeanalyse for kalluskvantifisering ikke publisert ennå. Derfor er målet med denne studien å gi en detaljert trinnvis protokoll for μCT-avbildning og analyse av benheling callus.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Følgende protokoll ble utviklet for å karakterisere langbeinsheling callus høstet fra euthaniserte mus. Imidlertid kan de fleste trinnene brukes på rotter og brukes også til in vivo-skanning av benbrudd. Protokollen beskriver et bestemt μCT-system og spesifikk bildebehandlings-, analyse- og visualiseringsprogramvare (se materialfortegnelse), men metodikken er generelt anvendelig for andre skannere og programvare. Protokollen ble godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee ved Pennsylvania State University College of Medicine. Mus brukt i denne studien var 16 uker gamle, mannlige C57BL/6J mus (gjennomsnittlig vekt 31,45 ± 3,2 g).
1. Vevshøsting og konservering
MERK: Bruk en egnet modell for murinbrudd. For denne studien ble mid-diaphyseal åpen tibial frakturmodell brukt i henhold til standardprotokollen beskrevet i12,13.
- På slutten av bruddmodelleksperimentet, avlive musen ved å administrere en intraperitoneal injeksjon av ketamin eller xylazin (henholdsvis 500 mg / kg eller 50 mg / kg).
- Bruk en saks til å høste det brukne beinet fra midten av lårbenet til tibiotalærleddet uten å forstyrre bruddstedet. Fjern musklene rundt beinet, slik at bare bløtvevet som er i direkte kontakt med beinet for å støtte bruddstedet under de påfølgende behandlingstrinnene. Fjern den intramedullære tappen ved hjelp av mikromygg rette hemostatiske tang.
- Prøvene skal oppbevares i formalin ved 4 °C eller i saltvann ved -20 °C. Valg av bevaringskjøretøy avhenger av de tiltenkte bruksområdene nedstrøms til μCT. I denne studien ble prøvene bevart i saltvann ved -20 °C.
2. μCT-skanning
- Prøve forberedelse
- For samtidig skanning av flere prøver, plasser opptil seks prøver i en spesialutviklet, 3D-trykt skannearmatur (figur 1 A, B) eller lignende. Samtidig skanning reduserer skannetiden og -kostnadene. Den tilpassede armaturen som ble brukt i denne studien inneholder seks spor for å holde de lange beinprøvene og et senterhull for et hydroksyapatitt (HA) fantomet (figur 1A, B; Materialfortegnelse).
MERK: HA-fantomet vil fungere som standard i trinn 4.2 (se nedenfor) for å konvertere μCT-enheter (vanligvis Hounsfield) til HA-tetthet (mgHA/ccm). - Plasser den forberedte armaturen i en sprøyte eller et konisk rør som ligner diameteren på synsfeltet (FOV; Figur 1C). I denne studien ble en 20 mm sprøyte brukt for å matche synsfeltet på 21,5 mm.
- For å forhindre at prøvene tørker ut under skanneprosessen, fyll sprøyten eller kanonerøret med konserveringsmiddelet som ble brukt i trinn 1.3 (saltvann ble brukt i denne studien).
- For samtidig skanning av flere prøver, plasser opptil seks prøver i en spesialutviklet, 3D-trykt skannearmatur (figur 1 A, B) eller lignende. Samtidig skanning reduserer skannetiden og -kostnadene. Den tilpassede armaturen som ble brukt i denne studien inneholder seks spor for å holde de lange beinprøvene og et senterhull for et hydroksyapatitt (HA) fantomet (figur 1A, B; Materialfortegnelse).
- Skanning
- Før skanning, bekreft at μCT-maskinen er kalibrert som følger: plasser et HA-fantomet på midtlinjen til μCT FOV, skann fantomet og mål tettheten til HA. Sørg for at den målte tettheten er i samsvar med tettheten fra produsenten.
- Juster prøvearmaturens midtlinje med den omtrentlige midtlinjen til μCT FOV. Dette sikrer at prøvene er innenfor FOV, og deres lange akser har orientering omtrent sammenfallende med den aksiale retningen til de resulterende bildene.
MERK: Denne standardiserte orienteringen kan senere bidra til å gjøre analyseprosedyren mindre utsatt for variasjoner, for eksempel i mengden vev som vurderes innenfor volumet av interesse. - Angi skanneparametrene til μCT-systemet (materialfortegnelse). Parametrene som brukes i denne studien er 10,5 μm (isotrop voxelstørrelse), 55 kVp (energi/intensitet), 145 μA (strøm) og 300 ms (integrasjonstid). Bestem voxelstørrelsen basert på den omtrentlige tykkelsen på musens trabeculae (20-60 μm)8. Inspiser skanningen visuelt i forskjellige visninger for å sikre at den dekker hele volumet av alle kallusprøver.
Figur 1: Strukturen til den tilpassede skannearmaturen. (A) Bilder av skannearmaturen (øverst), som viser de seks prøvesporene, og HA-fantomet (nederst). (B) Bilder som viser langbeinsprøven (øverst) og HA-fantomet (nederst) plassert i de dedikerte sporene. (C) Bilder som viser skannearmaturen plassert i en 20 mm sprøyte. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
3. Bildesegmentering
MERK: Råbilder rekonstrueres automatisk til bildesekvensdata.
- Bildekonvertering: konverter de rekonstruerte bildesekvensdataene til DICOM-bildesekvenser ved hjelp av et bildebehandlingsprogram (se Materialfortegnelse). Importer DICOM-bildesekvenser til programvaren (se Materialfortegnelse) for bildebehandling, analyse og visualisering (figur 2A).
- Beskjæring av bilde: én prøve om gangen, beskjær hver bildestakk og sørg for at hele prøven er inkludert i det beskårne volumet (figur 2B). Lagre det beskårne bildet på følgende måte: Klikk på Fil-fanen øverst til venstre på skjermen, velg Lagre prosjekt, og velg deretter Minimer prosjektstørrelse fra alternativene som vises på skjermen. Filen vil bli lagret i det kommersielle programvareformatet.
- Støyfjerning av bilder: Bruk en filtreringsmetode for å redusere støynivået og unngå uskarphet som følger.
- Klikk på Fil-fanen , og velg bildet som skal behandles ved hjelp av Åpne data. Det åpne bildet vises i prosjektvisningsvinduet øverst til venstre på skjermen.
- Høyreklikk for å velge Bildebehandling og deretter Filtrer sandkasse. Klikk på Opprett.
- Utfør følgende i vinduet Egenskaper (nederst til venstre på skjermen): velg Data som forhåndsvisningstype; velg filtertype fra rullegardinmenyen ved siden av Filter; velge 3D for tolkning; velg Separable fra rullegardinmenyen ved siden av kjernetype; fyll ut verdiene som skal brukes for standardavvik og kjernestørrelsesfaktor i den tilgjengelige tomme boksen ved siden av hver; velg Samme som input fra rullegardinmenyen ved siden av Output; Klikk på Bruk.
MERK: Valg av filtertype (tilgjengelige alternativer er bilateral, boks, gaussisk, median, rekursiv eksponentiell, avgrensning, anisotrop diffusjon, ikke-lokale midler, uskarp maskering og FFT-filter) og parametere avhenger av støynivået og voxelstørrelsen på skannede bilder. For det gaussiske filteret er 3 x 3 x 3 og 5 x 5 x 5 vanlige verdier for kjernestørrelsesfaktoren, og 0,5-2,0 brukes vanligvis for standardavvik8. I denne studien ble et Gauss-filter påført, og 5 x 5 x 5 og 0,8 ble brukt for henholdsvis kjernestørrelsesfaktor og standardavvik.
- Justering av bilde
MERK: Dette er et valgfritt trinn. Når feiljustering av lange beinprøver i forhold til koordinataksene til bildesystemet oppstår under skanneprosessen, kan en digital justeringsmetode brukes for å korrigere feiljusteringen (figur 2C).- Opprett et 3D-gjengitt bilde av eksemplet på følgende måte. I prosjektvisningsvinduet velger du det filtrerte, beskårne bildet (opprettet i trinn 3.3). Høyreklikk for å velge Vise og deretter Volumgjengivelse fra rullegardinmenyen, og klikk deretter Opprett. Sjekk visuelt det 3D-gjengitte bildet i sagittal- og frontalplanene.
- Roter det gjengitte volumet manuelt for å få en god justering i lengdeaksen. Bruk transformasjon på de roterte bildene som følger: I egenskapsvinduet klikker du på Transform Editor, går deretter til transform editor-manipulator og velger Transformer fra rullegardinmenyen. Nå kan prøven roteres og justeres. Når justeringsprosessen er ferdig, klikker du på Transformer redigering igjen for å låse bildet.
- Oppdater det filtrerte bildet (opprettet i trinn 3.3) for å opprette nye bildestykker i tverrplanet (aksial) som følger: I prosjektvisningsvinduet velger du bildet fra trinn 3.4.2. Høyreklikk for å velge Geometri Transform og deretter Oppdater transformert bilde fra rullegardinmenyen og klikk Opprett. I egenskapsvinduet går du til Data og utfører følgende: for interpolering, velg Standard fra rullegardinmenyen; for modus, velg Utvidet; for bevaring, velg Voxel Size; For utfyllingsverdi skriver du inn null i den tilgjengelige tomme boksen. Klikk deretter på Bruk.
- Definere volumet av interesse (VOI)
- Gå gjennom de tverrgående bildeskivene og identifiser midtplanet til bruddkallusen. Definer VOI basert på de proksimale og distale endene av callus. I tilfeller der callus-endene er vanskelige å definere, definer VOI basert på en standardisert avstand fra callus center-planet (figur 2D).
MERK: Under helbredelsesfaser som går foran beinremodellering, er det enkelt å definere kantene på den mineraliserte callus fordi den trabekulære strukturen til det nydannede vevde beinet er forskjellig fra den kortikale strukturen til det opprinnelige beinet. Men når ombyggingsfasen følger, oppnår det nydannede beinet den kortikale strukturen gradvis; Dermed blir det stadig mer utfordrende å definere kantene på callus.
- Gå gjennom de tverrgående bildeskivene og identifiser midtplanet til bruddkallusen. Definer VOI basert på de proksimale og distale endene av callus. I tilfeller der callus-endene er vanskelige å definere, definer VOI basert på en standardisert avstand fra callus center-planet (figur 2D).
Figur 2: Bildesegmentering . (A) Et bilde som viser seks prøver i løpet av en skanning. (B) Bildebeskjæring for å isolere individuelle prøver. (C) Digital justering for å korrigere en feiljustert lengdeakse (gul stiplet linje). (D) Definisjon av VOI- og callus-senterplanet. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
4. Bildeanalyse
- Segmentering av callus og kortikal bein
- Kontur halvautomatisk den ytre grensen for kallus ved hjelp av segmenteringslassoverktøyet med alternativene for automatisk sporing og sporingskanter (figur 3A) som følger:
- Etter remontering av transformerte bilder (trinn 3.4.3), klikker du på Segmentering-fanen i den andre faneraden fra toppen av skjermen. I vinduet for segmenteringsredigering velger du et transformert bilde (opprettet i trinn 3.4.3) fra rullegardinmenyen ved siden av bildet.
- I vinduet MATERIALER dobbeltklikker du Legg til; Ved å gjøre dette vises to faner kalt Material3 og Material4. Høyreklikk for å endre navn på materiale3 til callus og material4 til kortikal bein.
- I UTVALG-vinduet klikker du på lassoikonet; fra alternativene som vises, velg Frihånd for 2D-modus, Inne for 3D-modus, og både Autosporing og Spor kanter for alternativer. Bruk lassoen til å markere interesseområdene.
- Gjenta dette profileringstrinnet med stykker som det er tatt prøver av over VOI (figur 3B). De profilerte skivene kan skilles fra hverandre (f.eks. atskilt med 20 skiver).
MERK: I områder med komplekse kallusstrukturer kan brukeren vurdere å redusere avstanden mellom profilerte stykker for å fange flere fragmenter (figur 3A, B). - Interpoler over de profilerte kalluskonturene for å lage en komplett kallusetikett (figur 3C, D) som følger: I MATERIALS-vinduet velger du Callus-filen (opprettet i trinn 4.1.1.2.), klikker på Valg-fanen øverst på skjermen, og velger Interpoler fra rullegardinmenyen. I UTVALG-vinduet klikker du på plusstegnet.
- Åpne kortikalt bein-filen som ble opprettet i trinn 4.1.1.2. Segmenter det kortikale beinet, inkludert medulærhulen, som beskrevet for kallus i trinn 4.1.1 og 4.1.2. (Figur 4A,B). Interpoler den profilerte periosteale cortex for å lage en kortikal benetikett som beskrevet for callus i trinn 4.1.3 (figur 4C, D).
- Beregn profilert volum og gjennomsnittlig grå verdi av callus som følger: Klikk på kategorien Segmentering på øverste rad på skjermen og velg Materialstatistikk fra rullegardinmenyen. Dette vil generere en tabell som inneholder alle de beregnede verdiene. Verdiene av kortikalt bein og callus (etter subtrahering av kortikalbenet) er gitt separat. Når tabellen er generert, klikker du Eksporter til arbeidsområde for å lagre dataene.
- Kontur halvautomatisk den ytre grensen for kallus ved hjelp av segmenteringslassoverktøyet med alternativene for automatisk sporing og sporingskanter (figur 3A) som følger:
- Konvertering av gråskalaenheter til beinmineraltetthet
- Beskjær 3D-bildet av 4,5 mm HA-fantomet (figur 2B) fra hele bildet, og klikk på Segmentering. Harpiksen til HA-fantomet inneholder fem små HA-sylindere (figur 1A). For HA-sylinderen som har høyest tetthet, definer den første og den siste skiven ved visuell inspeksjon.
- Tegn to sirkler ved første og siste skive (unngå kanter) ved hjelp av penselverktøyet (figur 5A) på følgende måte: I vinduet MATERIALER klikker du på Legg til fire ganger. Høyreklikk for å endre navn på materiale3, materiale4, materiale5 og materiale6 til henholdsvis phantom1, phantom2, phantom3 og phantom4. Velg Røntgentegning1, klikk penselikonet i MARKERING-vinduet, og bruk glidebryteren til å justere penselstørrelsen (sirkelsporing) basert på størrelsen på fantomet (størrelsen på sirkelen bør være mindre enn fantomets).
- Bruk interpolering mellom de to sirklene for å lage et volum for hver HA-sylinder (figur 5B) som følger: I vinduet MATERIALER velger du Røntgen1, klikker på kategorien Utvalg på øverste rad på skjermen, og velger Interpoler fra rullegardinmenyen. I UTVALG-vinduet klikker du på plusstegnet.
- Gjenta segmenteringsprosessen med tre av de gjenværende HA-sylindrene, start fra den nest høyeste HA-tettheten og avslutt med den nest laveste HA-tettheten (figur 5B). Sylinderen med lavest HA-tetthet kan utelukkes fordi den ofte er vanskelig å segmentere.
- Bruk de genererte 3D-etikettene til å beregne gjennomsnittlige gråverdier for de fire analyserte HA-sylindrene. Bruk et regneark (se Materialfortegnelse) eller lignende til å plotte de gjennomsnittlige gråverdiene og de tilsvarende verdiene for beinmineraltetthet (BMD) fra fantomprodusenten. Generer en korrelasjonsligning mellom BMD og de grå verdiene ved hjelp av lineær regresjon.
- Segmentering av mineralisert callus og beregning av BMD
- Basert på korrelasjonsligningen generert i trinn 4.2.5 og den valgte terskelen som skiller mineralisert og umineralisert callus, bestemmer du den tilsvarende gråverditerskelen. Merk derfor kallusområdet med gråverdier større enn terskelen som mineralisert kallus og merk resten som umineralisert (figur 6A, B). I denne studien ble 250 mgHA / ccm brukt som terskel for mineralisert callus14,15.
- Beregn de totale callus og mineraliserte callusvolumene. Basert på disse verdiene, beregne benvolumfraksjonen (mineralisert kallusvolum normalisert til totalt kallusvolum = BV / TV). Bruk den målte gjennomsnittlige gråverdien for total callus for å beregne BMD for callus ved hjelp av korrelasjonsligningen generert i 4.2.5.
MERK: Basert på målet med studien og programvaren som brukes til analyse, kan andre parametere som SMI (strukturmodellindeks), trabekulær tykkelse og grad av anisotropi beregnes.
Figur 3: Segmentering av callus yttergrense. (A) En kontur av den ytre grensen til callus (rød linje). (B) Konturer ved skiver samplet over VOI (røde skiver). (C) En 3D callus-etikett opprettet ved interpolering (rødt volum). (D) Et tverrsnitt av kallusetiketten vist i C (inkludert kortikalt bein). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4 Segmentering av kortikalbenet. (A) En kontur av cortexens periosteale overflate (grønn linje). (B) Konturer ved skiver samplet over VOI (grønne skiver). (C) En 3D-etikett av kortikale bein (som inneholder medullærhulen; grønn) og callus (rød) opprettet fra interpolerte etiketter av periosteal cortex og callus. (D) Et tverrsnitt av callus (rød) og kortikalt ben (som inneholder det intramedullære hulrom; grønt). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Omregning av gråskalaenheter til BMD. (A) Konturer av HA-sylinderen ved første og siste skive (røde sirkler). (B) 3D-interpolerte HA-sylindere (venstre) og tverrsnitt (høyre). Brun: høyeste HA-tetthet; blå: nest høyeste HA-tetthet; fiolett: tredje høyeste HA-tetthet; grønn: fjerde høyeste HA-tetthet. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6: Segmentering av mineralisert callus. (A) Den mineraliserte callus (≥250 mgHA / ccm) er vist i blått, resten av callus (<250 mgHA / ccm) er vist i rødt, og mellomrommet som tilsvarer det opprinnelige beinet er vist i grønt. (B) En 3D-visning av hver isolerte etikett. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For å overvåke bendannelse under bruddtilheling ble det indusert et åpent tibialbrudd midt i diafysen hos voksne, mannlige C75BL/6J-mus. Bruddet ble stabilisert ved hjelp av en intramedullær negl, en etablert modell for sekundær helbredelse13. Callusvev ble høstet på dagene 14, 21 og 28 etter brudd12. Disse tidspunktene representerer ulike faser av helbredelse. Endokondral beindannelse under sekundær beinheling fortsetter via innledende dannelse av en fibrobrusk (myk) callus, som mineraliserer i senere stadier for å redusere mikrobevegelse ved bruddgapet, slik at dannelsen av nye blodkar over bruddlinjen13. Dag 14 etter fraktur i murinfrakturmodellen brukt i denne studien representerer stadiet av mineralisert myk callus. Når helbredelsen fortsetter fra dag 14 til dag 21, blir den mineraliserte myke callus helt erstattet av nydannet vevd bein, noe som resulterer i benaktig brobygging av bruddgapet13. Mellom dag 21 og 28 gjennomgår callus resorpsjon og ombygging for å gjenopprette den karakteristiske strukturen til kortikal bein12.
μCT-bilder ble samlet inn og analysert ved tre tidspunkter ved hjelp av protokollen beskrevet ovenfor. Minimum 10 prøver ble analysert på hvert tidspunkt. For hver prøve ble benvolumfraksjon og BMD beregnet. Benvolumfraksjonen ble beregnet ved å dele volumet av mineralisert callus (BV) med det totale kallusvolumet (TV). Resultatene viste betydelig dannelse av mineralisert kallus ved dag 14 (figur 7A,B) og inkrementelle økninger i benfraksjonsvolum og BMD etter hvert som tilhelingen fortsatte fra dag 14 til dag 21 og 28 (figur 7A,B), forenlig med benete brobygging av bruddgapet. Som forventet gjennomgikk callus resorpsjon/ombygging mellom dag 21 og 28, noe som fremgår av en nedgang i totalt kallusvolum (figur 7A,B). Kortikal brobygging av callus var tydeligere på dag 28 enn noe foregående tidspunkt (figur 7A). Disse resultatene indikerer at den medfølgende μCT-protokollen tillater overvåking av beindannelse og kallusstruktur i forskjellige faser av beinheling.
Figur 7: Overvåking av bentilheling ved bruk av μCT. (A) 2D (sagittal, venstre panel) og 3D (høyre panel) bilder av healing callus generert av μCT ved de angitte tidspunktene etter fraktur. (B) BMD, benvolumfraksjon (BV / TV) og totalt kallusvolum beregnet fra bilder vist i A. Resultatene viser helbredelsesprogresjon gjennom de sene reparasjons- og ombyggingsfasene. N = 10-12. Prikkene på linjeplottet representerer gjennomsnittlig ± SEM. (*) p < 0,05 ved bruk av enveis ANOVA etterfulgt av Tukeys post-hoc-test. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Formålet med denne studien er å beskrive en detaljert protokoll for μCT-analyse med mål om nøyaktig kvantifisering av 3D-mineralisert kallusstruktur, som ofte er grunnleggende i bein- og bruddhelingsstudier. Protokollen benytter en generell state-of-the-art 3D-bildeanalyseprogramvareplattform som letter bildevisualisering, segmentering / merking og målinger som spenner fra enkle til komplekse.
Den mest tidkrevende oppgaven i protokollen er semi-automatisert segmentering av callus, med utelukkelse av kortikalt bein og medulærkanal. Denne regionen har også blitt ekskludert i mange tidligere studier 9,16,17,18. Noen studier har inkludert de opprinnelige kortikale bein- og kanalregionene i sine analyser19,21, mens i andre studier var tilnærmingen ikke klar. Inkludert de innfødte cortices unngår vanskeligheten og potensiell subjektivitet i konturering av forsmådde regioner av brukket cortices, men oppblåser callus mineraliseringstiltak.
Protokollen fokuserer på å oppnå utgangsmål, inkludert totalt kallusvolum, mineralisert volum, beinvolumfraksjon og beinmineraltetthet. Disse parametrene tolkes lett og rapporteres ofte i litteraturen. Mineralisert volum og benvolumfraksjon er avhengig av den valgte terskelen for å differensiere mineralisert versus umineralisert, mens benmineraltetthet ikke er det. Vevsmineraltetthet kan også beregnes basert på bare vevet merket som mineralisert, i stedet for beinmineraltetthet basert på både mineralisert og umineralisert callus. Vevsmineraltetthet er rapportert å være assosiert med vridningsstyrke og stivhet9. Imidlertid er disse målene mer sannsynlig påvirket av partielle volumeffekter og bildeoppløsning enn benmineraltetthet.
Etterforskere har rapportert god korrelasjon mellom kvantifisert 3D-kortikal brobygging og kallusstyrke og stivhet (kortikal brobygging vurdert på 2D-røntgenbilder vurderes vanligvis klinisk hos mennesker)20. Ytterligere 3D-kallusegenskaper rapportert i litteraturen inkluderer treghetsmomenter10,15,19, som karakteriserer den geometriske fordelingen av callus (dvs. hvor spredt vevet er). Polar treghetsmoment relaterer seg teoretisk til vridningsmotstand og treghetsmoment relaterer seg til bøyemotstand. Selv om disse egenskapene kunne beregnes basert på segmenterte callusdata beskrevet i denne studien, har deres korrelasjon med målte biomekaniske egenskaper blitt rapportert å være inkonsekvent 9,19,2 1. Andre tidligere rapporterte callusegenskaper inkluderer tilkoblingstetthet, trabekulær tykkelse og strukturmodellindeks11,17,,2 2. Disse parametrene brukes ofte til å karakterisere trabekulært bein og beregnes lett av μCT-skannerprogramvare; Imidlertid er deres forhold til bruddhelingskvalitet ikke like klart. Programvaren som brukes i denne protokollen er et generelt program, ikke spesifikt for bein. Således, hvis visse beinparametere som trabekulær tykkelse beregnes utenfor denne protokollen, kan segmenterte data eksporteres til andre programmer for videre analyse (f.eks. som i Watson et al.23).
Denne protokollen gir detaljerte arbeidsflyter for kompleks kallusstrukturkarakterisering og kvalitetskontroll fra et enkelt programvaremiljø sammenlignet med andre metoder der flere programmer kreves for analyse2: 4. Derfor er tidsbesparelse en potensiell fordel med denne protokollen. Programvaren muliggjør en rekke fleksible, sofistikerte 3D-visualiseringsmetoder som bidrar til å sikre nøyaktig analyse og også tillate parallell tabulering av alle resultater.
μCT-analyseprotokollen kan tilpasses forskjellige bruddmodeller hos mus så vel som rotter; For andre applikasjoner anbefales optimalisering av noen av de kritiske trinnene for å sikre minimering av resultatvariasjon. Spesielt bør det vurderes å undersøke virkningen av å endre størrelsen på VOI eller antall profilerte skiver i VOI på reproduserbarheten av resultatene. Det anbefales også å bruke digital justering som beskrevet i trinn 3.4, men hvis annen programvare brukes til analyse, kan det være nødvendig å vurdere nødvendigheten av dette trinnet, ved å sammenligne data generert med og uten digital omstilling.
I denne protokollen ble en semi-automatisert segmenteringsmetode brukt for identifisering og separasjon av callus fra kortikale bein og marg. I tilfeller som komminuterte brudd, hvor strukturen av callus er ekstremt kompleks, blir konturering av callus og periosteal overflate av cortex utfordrende. Det anbefales i disse tilfellene å utføre konturering med flere eksperimenter for å vurdere og forsøke å begrense subjektiviteten.
Det finnes begrensninger med denne protokollen. Protokollen krever konvertering og eksport av DICOM-bilder slik at bilder deretter kan analyseres i tilleggsprogramvare; Dette trinnet tar litt ekstra tid og kan kreve bruk av et kalibreringsfantom i bildet. Etter hvert som automatiserte segmenteringsteknikker fortsetter å utvikle seg, inkludert de som er basert på maskinlæring, kan det være fordelaktig å erstatte de manuelle konturdelene av protokollen med disse nye teknikkene. Samlet sett kan den detaljerte protokollen beskrevet her for analyse av beinheling callus hos gnagere spesielt være til nytte for laboratorier uten betydelig μCT-analyseerfaring og kan bidra til å etablere en mer konsistent og standardisert tilnærming over hele feltet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter å opplyse.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health (NIH) R01 DK121327 til R.A.E og R01 AR071968 til F.K.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% neutral buffered formalin | Fisher chemical | SF100-20 | Used for bone tissue fixation |
| Avizo | Thermo Scientific | Image processing and analysis software | |
| Hydroxyapatite phantom | Micro-CT HA D4.5, QRM | QRM-70128 | |
| Image Processing Language | Scanco | Used to convert raw images to DICOM images | |
| Micro-Mosquito Straight Hemostatic Forceps | Medline | Used to remove the intramedullary pin | |
| Microsoft Excel | Microsoft | Spreadsheet software | |
| Scanco mCT system (vivaCT 40) | Scanco | Used for µCT imaging |
References
- Rüegsegger, P., Koller, B., Müller, R. A microtomographic system for the nondestructive evaluation of bone architecture. Calcified Tissue International. 58 (1), 24-29 (1996).
- Müller, R., et al. Morphometric analysis of human bone biopsies: a quantitative structural comparison of histological sections and micro-computed tomography. Bone. 23 (1), 59-66 (1998).
- Waarsing, J. H., et al. Detecting and tracking local changes in the tibiae of individual rats: a novel method to analyse longitudinal in vivo micro-CT data. Bone. 34 (1), 163-169 (2004).
- Boyd, S. K., Davison, P., Müller, R., Gasser, J. A. Monitoring individual morphological changes over time in ovariectomized rats by in vivo micro-computed tomography. Bone. 39 (4), 854-862 (2006).
- Christiansen, B. A. Effect of micro-computed tomography voxel size and segmentation method on trabecular bone microstructure measures in mice. Bone Reports. 5, 136-140 (2016).
- Holdsworth, D. W., Thornton, M. M. Micro-CT in small animal and specimen imaging. Trends in Biotechnology. 20 (8), 34-39 (2002).
- Schambach, S. J., Bag, S., Schilling, L., Groden, C., Brockmann, M. A. Application of micro-CT in small animal imaging. Methods. 50 (1), 2-13 (2010).
- Bouxsein, M. L., et al. Guidelines for assessment of bone microstructure in rodents using micro-computed tomography. Journal of Bone and Mineral Research. 25 (7), 1468-1486 (2010).
- Morgan, E. F., et al. Micro-computed tomography assessment of fracture healing: Relationships among callus structure, composition, and mechanical function. Bone. 44 (2), 335-344 (2009).
- O'Neill, K. R., et al. Micro-computed tomography assessment of the progression of fracture healing in mice. Bone. 50 (6), 1357-1367 (2012).
- Bissinger, O., et al. Fully automated segmentation of callus by micro-CT compared to biomechanics. Journal of Orthopaedic Surgery and Research. 12 (1), 108 (2017).
- Brown, M. L., et al. Delayed fracture healing and increased callus adiposity in a C57BL/6J murine model of obesity-associated type 2 diabetes mellitus. PLOS One. 9 (6), 99656 (2014).
- Khajuria, D. K., et al. Aberrant structure of fibrillar collagen and elevated levels of advanced glycation end products typify delayed fracture healing in the diet-induced obesity mouse model. Bone. 137, 115436 (2020).
- Sigurdsen, U., Reikeras, O., Hoiseth, A., Utvag, S. E. Correlations between strength and quantitative computed tomography measurement of callus mineralization in experimental tibial fractures. Clinical Biomechanics. 26 (1), 95-100 (2011).
- Duvall, C. L., Taylor, W. R., Weiss, D., Wojtowicz, A. M., Guldberg, R. E. Impaired angiogenesis, early callus formation, and late stage remodeling in fracture healing of osteopontin-deficient mice. Journal of Bone and Mineral Research. 22 (2), 286-297 (2007).
- Gerstenfeld, L. C., et al. Comparison of effects of the bisphosphonate alendronate versus the RANKL inhibitor denosumab on murine fracture healing. Journal of Bone and Mineral Research. 24 (2), 196-208 (2009).
- Alentado, V. J., et al. Validation of the modified radiographic union score for tibia fractures (mRUST) in murine femoral fractures. Frontiers in Endocrinology. 13, 911058 (2022).
- Yu, K. E., et al. Enhancement of impaired MRSA-infected fracture healing by combinatorial antibiotics and modulation of sustained inflammation. Journal of Bone and Mineral Research. 37 (1), 1352-1365 (2022).
- Nyman, J. S., et al. Quantitative measures of femoral fracture repair in rats derived by micro-computed tomography. Journal of Biomechanics. 42 (7), 891-897 (2009).
- Fiset, S., et al. Experimental validation of the radiographic union score for tibial fractures (RUST) using micro-computed tomography scanning and biomechanical testing in an in-vivo rat model. The Journal of Bone and Joint Surgery. 100 (21), 1871-1878 (2018).
- Shefelbine, S. J., et al. Prediction of fracture callus mechanical properties using micro-CT images and voxel-based finite element analysis. Bone. 36 (3), 480-488 (2005).
- Liu, Y., et al. Glucocorticoid-induced delayed fracture healing and impaired bone biomechanical properties in mice. Clinical Interventions in Aging. 13, 1465-1474 (2018).
- Watson, P. J., Fitton, L. C., Meloro, C., Fagan, M. J., Gröning, F. Mechanical adaptation of trabecular bone morphology in the mammalian mandible. Scientific Reports. 8 (1), 7277 (2018).
- Nie, C., Wang, Z., Liu, X. The effect of depression on fracture healing and osteoblast differentiation in rats. Neuropsychiatric Disease and Treatment. 14, 1705-1713 (2018).
