Summary
显微计算机断层扫描（μCT）是一种无损成像工具，有助于评估临床前研究中的骨结构，但对用于分析骨愈合愈伤组织的μCT程序缺乏共识。本研究提供了一种循序渐进的μCT方案，可以监测骨折愈合。
Abstract
显微计算机断层扫描 （μCT） 是转化科学研究中表征骨折愈合过程中骨骼和新形成骨骼三维 （3D） 形态的最常见成像方式。啮齿动物长骨折愈合的研究通常涉及二次愈合和矿化愈伤组织的形成。形成的愈伤组织的形状和新形成的骨的密度可能在时间点和治疗之间有很大差异。虽然量化完整皮质和小梁骨参数的标准方法被广泛使用并嵌入到市售软件中，但对分析愈合愈伤组织的程序缺乏共识。这项工作的目的是描述一种标准化方案，该方案定量愈合愈伤组织中的骨体积分数和愈伤组织矿物质密度。该协议描述了成像和分析过程中应考虑的不同参数，包括成像过程中的样品对齐、目标体积的大小以及轮廓化以定义愈伤组织的切片数量。
Introduction
显微计算机断层扫描（μCT）成像已广泛用于临床前骨骼研究，提供无创、高分辨率的图像来评估骨骼的微观结构1,2,3,4,5。μCT涉及大量X射线图像，这些图像来自旋转样品或使用旋转的X射线源和检测器获得。算法用于以图像切片堆栈的形式重建 3D 体积数据。临床CT是人体骨骼3D成像的金标准，μCT是评估实验动物骨愈合效率的常用技术1,2,3,4,6,7。矿化骨与X射线具有极好的对比度，而软组织的对比度相对较差，除非使用造影剂。在骨折愈合评估中，μCT生成的图像提供有关矿化愈伤组织3D结构和密度的详细信息。体内μCT扫描也可用于骨折愈合的纵向、时程评估。
使用μCT对完整皮质和小梁骨的定量通常是成熟和标准化的8。尽管临床前研究使用各种定量方法来分析骨折愈合9,10,11，但用于愈伤组织定量的μCT图像分析的详细方案尚未发表。因此，本研究的目的是为骨愈合愈伤组织的μCT成像和分析提供详细的分步方案。
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Protocol
开发以下协议以表征从安乐死小鼠收获的长骨愈合愈伤组织。然而，大多数步骤可以应用于大鼠，也可用于骨折骨的 体内 扫描。该协议描述了特定的μCT系统和特定的图像处理、分析和可视化软件（参见 材料表），但该方法通常适用于其他扫描仪和软件。该协议已获得宾夕法尼亚州立大学医学院机构动物护理和使用委员会的批准。本研究中使用的小鼠是16周龄的雄性C57BL / 6J小鼠（平均体重31.45±3.2g）。
1. 组织采集和保存
注意：使用合适的鼠骨折模型。在这项研究中，根据12,13中描述的标准方案使用骨干中开放性胫骨骨折模型。
- 在骨折模型实验结束时，通过腹膜内注射氯胺酮或甲苯噻嗪（分别为500mg / kg或50mg / kg）对小鼠实施安乐死。
- 使用剪刀，在不干扰骨折部位的情况下，将骨折的骨从股骨中部收集到胫距关节。在随后的处理步骤中，去除骨骼周围的肌肉，仅留下与骨骼直接接触的软组织，以支持骨折部位。使用微蚊直止血钳取出髓内针。
- 将样品保存在4°C的福尔马林或-20°C的盐水中。 保存载体的选择取决于μCT下游的预期应用。在这项研究中，样品保存在-20°C的盐水中。
2. 微CT扫描
- 样品制备
- 要同时扫描多个样品，请将多达六个样品放入定制开发的3D打印扫描夹具（图1 A，B）或类似夹具中。同时扫描可减少扫描时间和成本。本研究中使用的定制夹具包含六个用于固定长骨样品的插槽和一个用于羟基磷灰石 （HA） 模型的中心孔（图 1A，B;目录）。
注意：HA模型将作为步骤4.2（见下文）中的标准，将μCT单位（通常是Hounsfield）转换为HA密度（mgHA / ccm）。 - 将准备好的夹具放在与视野直径相似的注射器或锥形管中（FOV; 图 1C）。在这项研究中，使用20毫米注射器来匹配21.5毫米的视野。
- 为防止样品在扫描过程中变干，请用步骤1.3中使用的防腐剂填充注射器或规范管（本研究使用盐水）。
- 要同时扫描多个样品，请将多达六个样品放入定制开发的3D打印扫描夹具（图1 A，B）或类似夹具中。同时扫描可减少扫描时间和成本。本研究中使用的定制夹具包含六个用于固定长骨样品的插槽和一个用于羟基磷灰石 （HA） 模型的中心孔（图 1A，B;目录）。
- 扫描
- 在扫描之前，确认μCT机器已按如下方式校准：将HA模型放置在μCT FOV的中心线，扫描模型并测量HA的密度。确保测量的密度与制造商提供的密度一致。
- 将样品夹具中心线与μCT FOV的近似中心线对齐。这确保了样品在FOV内，并且它们的长轴的方向与结果图像的轴向方向大致一致。
注意：这种标准化的方向以后可以帮助使分析过程不易发生变化，例如在感兴趣的体积内考虑的组织数量。 - 设置μCT系统的扫描参数（材料表）。本研究中使用的参数为 10.5 μm（各向同性体素大小）、55 kVp（能量/强度）、145 μA（电流）和 300 ms（积分时间）。根据小鼠小梁的近似厚度（20-60μm）确定体素大小8。在不同视图中目视检查扫描，以确保它覆盖所有愈伤组织样本的整个体积。
图1：定制扫描夹具的结构。 （A） 扫描夹具（顶部）的图像，显示六个样品插槽和 HA 模型（底部）。（B） 显示放置在专用插槽中的长骨样本（顶部）和 HA 模型（底部）的图像。（C） 显示放置在20毫米注射器中的扫描夹具的图像。 请点击此处查看此图的大图。
3. 图像分割
注意：原始图像会自动重建为图像序列数据。
- 图像转换：使用图像处理软件将重建的图像序列数据转换为DICOM图像序列（见 材料表）。将DICOM图像序列导入软件（参见 材料表）以进行图像处理、分析和可视化（图2A）。
- 图像裁剪：一次一个样本，裁剪每个图像堆栈，并确保整个样本包含在裁剪的体积中（图2B）。按如下方式保存裁剪后的图像：单击屏幕左上角的“ 文件 ”选项卡，选择“ 保存项目”，然后从屏幕上显示的选项中选择 “最小化项目大小 ”。该文件将被保存在商业软件格式。
- 图像去噪：使用过滤方法降低噪点水平并避免模糊，如下所示。
- 单击 文件 选项卡，然后选择要使用 开放数据处理的图像。打开的图像将显示在屏幕左上角的项目视图窗口中。
- 右键单击以选择 图像处理 ，然后选择 过滤沙盒。单击 创建。
- 在“属性”窗口（位于屏幕的左下角）中执行以下操作：选择“ 数据 ”作为预览类型;从过滤器旁边的下拉菜单中选择过滤器类型;选择 3D 进行解释;从内核类型旁边的下拉菜单中选择 可分离 ;在每个值旁边的可用空框中填写要用于标准偏差和内核大小因子的值;从输出旁边的下拉菜单中选择 与输入相同 ;单击 应用。
注意：滤波器类型的选择（可用选项包括双边、箱形、高斯、中位数、递归指数、描绘、各向异性扩散、非局部均值、非锐化掩蔽和 FFT 滤波器）和参数取决于扫描图像的噪声水平和体素大小。对于高斯滤波器，3 x 3 x 3 和 5 x 5 x 5 是内核大小因子的常用值，0.5-2.0 通常用于标准偏差8。本研究采用高斯滤波，核尺寸因子和标准差分别使用5 x 5 x 5和0.8。
- 图像重新对齐
注意：这是一个可选步骤。当长骨样品在扫描过程中相对于成像系统的坐标轴发生错位时，可以应用数字对准方法来纠正错位（图2C）。- 创建示例的 3D 渲染图像，如下所示。在项目视图窗口中，选择经过筛选的裁剪图像（在步骤 3.3 中创建）。右键单击以选择 显示 然后 体积渲染 从下拉菜单中，然后单击 创建.目视检查矢状面和额平面中的 3D 渲染图像。
- 手动旋转渲染体积以在纵轴上获得良好的对齐方式。按如下方式对旋转的图像应用变换：在属性窗口中，单击变换编辑器，然后转到 变换编辑器操纵器并从下拉菜单中选择 变形器 。现在，样品可以旋转和重新对齐。重新对齐过程完成后，再次单击 变换编辑器 以锁定图像。
- 对过滤后的图像（在步骤 3.3 中创建）重新采样以创建新的横向（轴向）平面图像切片，如下所示：在项目视图窗口中，选择步骤 3.4.2 中的图像。右键单击以选择 几何 变换，然后从下拉菜单中选择 重新采样变换后的图像 ，然后单击 创建。在属性窗口中，转到 数据 并执行以下操作：对于插值，请从下拉菜单中选择 标准 ;对于模式，选择 扩展;对于保留，选择 体素大小;对于填充值，在可用空白框中输入零。然后单击 应用。
- 定义感兴趣的数量 （VOI）
- 浏览横向图像切片并确定骨折愈伤组织的中心平面。根据愈伤组织的近端和远端定义 VOI。在愈伤组织末端难以定义的情况下，根据远离愈伤组织中心平面的标准化距离定义VOI（图2D）。
注意：在骨重塑之前的愈合阶段，定义矿化愈伤组织的边缘很容易，因为新形成的编织骨的小梁结构与原始骨的皮质结构不同。然而，当随后的重塑阶段时，新形成的骨骼逐渐获得皮质结构;因此，定义愈伤组织边缘变得越来越具有挑战性。
- 浏览横向图像切片并确定骨折愈伤组织的中心平面。根据愈伤组织的近端和远端定义 VOI。在愈伤组织末端难以定义的情况下，根据远离愈伤组织中心平面的标准化距离定义VOI（图2D）。
图 2：图像分割 。 （A） 一次扫描中显示六个样本的图像。 （B） 图像裁剪以隔离单个样本。（C） 数字对齐以校正未对齐的纵轴（黄色虚线）。（D）VOI和愈伤组织中心平面的定义。 请点击此处查看此图的大图。
4. 图像分析
- 骨痂和皮质骨的分割
- 使用带有自动描线和迹线边缘选项的分割套索工具（图 3A）半自动勾勒愈伤组织的外边界，如下所示：
- 重新组合转换后的图像（步骤 3.4.3），单击屏幕顶部第二个选项卡行中的“ 分割 ”选项卡。在分割编辑器窗口中，从图像旁边的下拉菜单中选择转换后的图像（在步骤 3.4.3 中创建）。
- 在“材料”窗口中，双击“ 添加”;这样，将显示名为“材料3”和“材料4”的两个选项卡。右键单击将材料 3 重命名为愈伤组织，将材料 4 重命名为皮质骨。
- 在选择窗口中，单击套索图标;从出现的选项中，为 2D 模式选择“ 徒手” ，为 3D 模式选择“ 内部 ”，为选项选择“ 自动描 摹”和 “描摹边 ”。使用套索标记感兴趣的区域。
- 对整个VOI采样的切片重复此轮廓步骤（图3B）。轮廓切片可以间隔开（例如，由 20 个切片隔开）。
注意：在愈伤组织结构复杂的区域中，用户可以考虑减小轮廓切片之间的间距以捕获更多片段（图3A，B）。 - 在轮廓愈伤组织轮廓上插值以创建完整的愈伤组织标签（图 3C，D），如下所示：在“材料”窗口中，选择愈伤组织文件（在步骤 4.1.1.2 中创建），单击屏幕顶部的“选择”选项卡，然后从下拉菜单中选择插值。在“选择”窗口中，单击加号。
- 打开在步骤 4.1.1.2 中创建的皮质骨文件。分割皮质骨，包括髓腔，如步骤 4.1.1 和 4.1.2 中针对愈伤组织概述的那样。（图4A，B）。插入轮廓的骨膜皮层以创建皮质骨标签，如步骤4.1.3中为愈伤组织概述的那样（图4C，D）。
- 按如下方式计算愈伤组织的轮廓体积和平均灰度值：单击屏幕顶行的 细分 选项卡，然后从下拉菜单中选择 材料统计 。这将生成一个包含所有计算值的表。皮质骨和愈伤组织（减去皮质骨后）的值单独提供。生成表后，单击 导出到工作区 以保存数据。
- 使用带有自动描线和迹线边缘选项的分割套索工具（图 3A）半自动勾勒愈伤组织的外边界，如下所示：
- 灰度单位转换为骨密度
- 从整个图像中裁剪 4.5 mm HA 模型（图 2B）的 3D 图像，然后单击 分割。HA模型的树脂包含五个小HA圆柱体（图1A）。对于密度最高的 HA 圆柱体，通过目视检查定义第一个和最后一个切片。
- 使用画笔工具（图 5A）在第一个和最后一个切片（避开边缘）绘制两个圆，如下所示：在“材料”窗口中，单击 “添加 ”四次。右键单击可将材料 3、材料 4、材料 5 和材料 6 分别重命名为虚拟 1、虚拟 2、虚拟 3 和虚拟 4。选择 Phantom1，单击“选择”窗口中的画笔图标，然后使用滑块根据模型的大小调整画笔大小（圆形描摹）的大小（圆圈的大小应小于虚拟的大小）。
- 在两个圆之间应用插值以为每个 HA 圆柱体创建一个体积（图 5B），如下所示：在材料窗口中，选择 Phantom1，单击屏幕顶行上的 选择 选项卡，然后从下拉菜单中选择插值。在“选择”窗口中，单击 加号。
- 对剩余的三个 HA 圆柱体重复分段过程，从第二高的 HA 密度开始，到第二低的 HA 密度结束（图 5B）。可以排除HA密度最低的圆柱体，因为它通常难以分段。
- 使用生成的 3D 标签计算四个分析的 HA 圆柱体的平均灰度值。使用电子表格（参见 材料表）或类似工具，绘制模型制造商提供的平均灰度值和相应的骨矿物质密度 （BMD） 值。使用线性回归生成 BMD 和灰度值之间的相关方程。
- 矿化愈伤组织的分割和BMD的计算
- 根据步骤4.2.5中生成的相关方程和所选的区分矿化和非矿化愈伤组织阈值，确定相应的灰度值阈值。因此，将灰度值大于阈值的愈伤组织区域标记为矿化愈伤组织，并将其余区域标记为未矿化（图6A，B）。在这项研究中，250 mgHA/ccm用作矿化愈伤组织14,15的阈值。
- 计算总愈伤组织和矿化愈伤组织体积。根据这些值，计算骨体积分数（矿化愈伤组织体积归一化为总愈伤组织体积 = BV/TV）。使用总愈伤组织测量的平均灰度值，使用4.2.5中生成的相关方程计算愈伤组织的BMD。
注意：根据研究目标和用于分析的软件，可以计算其他参数，例如SMI（结构模型指数），小梁厚度和各向异性程度。
图 3：愈伤组织外部边界的分割。 （A） 愈伤组织外边界的轮廓（红线）。（B）在VOI上采样的切片（红色切片）的轮廓。（C） 通过插值（红色体积）创建的 3D 愈伤组织标签。（D）C所示愈伤组织标签的横截面（包括皮质骨）。请点击此处查看此图的大图。
图4：皮质骨的分割。 （A）皮层骨膜表面的轮廓（绿线）。（B）在VOI上采样的切片等高线（绿色切片）。（C）皮质骨（包含髓腔;绿色）和愈伤组织（红色）的3D标签，由骨膜皮层和愈伤组织的插值标签创建。（D）愈伤组织（红色）和皮质骨（包含髓内腔;绿色）的横截面。 请点击此处查看此图的大图。
图 5：灰度单位到 BMD 的转换。 （A） 第一个和最后一个切片处的 HA 圆柱体轮廓（红色圆圈）。（B） 3D 插补 HA 圆柱体（左）和横截面（右）。棕色：最高 HA 密度;蓝色：第二高的HA密度;紫色：第三高的HA密度;绿色：第四高的 HA 密度。 请点击此处查看此图的大图。
图6：矿化愈伤组织的分割 。 （A）矿化愈伤组织（≥250 mgHA / ccm）显示为蓝色，其余的愈伤组织（<250 mgHA / ccm）显示为红色，与原始骨骼相对应的空间显示为绿色。（B） 每个独立标签的 3D 视图。 请点击此处查看此图的大图。
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Representative Results
为了监测骨折愈合过程中的骨形成，在成年雄性C75BL / 6J小鼠中诱导了骨干开放性胫骨骨折。使用髓内钉稳定骨折，这是一种既定的二次愈合模型13。在骨折后第14、21和28天收获愈伤组织12。这些时间点代表了愈合的不同阶段。继发性骨愈合期间的软骨内骨形成通过纤维软骨（软）愈伤组织的初始形成 进行 ，愈伤组织在后期矿化以减少骨折间隙处的微运动，从而允许在骨折线上形成新血管13。本研究中使用的鼠骨折模型中骨折后第14天代表矿化软愈伤组织阶段。随着愈合从第 14 天进行到第 21 天，矿化的软骨痂被新形成的编织骨完全取代，导致骨折间隙13 的骨桥接。在第 21 天和第 28 天之间，愈伤组织经历吸收和重塑以重建皮质骨的特征结构12。
使用上述协议在三个时间点采集和分析μCT图像。每个时间点至少分析10个样品。对于每个样本，计算骨体积分数和BMD。通过将矿化愈伤组织（BV）的体积除以总愈伤组织体积（TV）来计算骨体积分数。结果显示，随着愈合从第14天到第21天和第28天（图7A，B），矿化愈伤组织形成大量（图7A，B），骨分数体积和BMD逐渐增加，与骨折间隙的骨桥接一致。正如预期的那样，愈伤组织在第21天和第28天之间经历了再吸收/重塑，这可以从骨伤组织总体积的下降中得到证明（图7A，B）。愈伤组织的皮质桥接在第28天比之前的任何时间点都更明显（图7A）。这些结果表明，提供的μCT方案允许在骨愈合的不同阶段监测骨形成和愈伤组织结构。
图 7：使用 μCT 监测骨愈合。 （A） μCT 在指定的骨折后时间点生成的愈合愈伤组织的 2D（矢状面，左图）和 3D（右图）图像。（B）骨密度，骨体积分数（BV / TV）和根据A所示图像计算的总愈伤组织体积.结果显示愈合进展通过后期修复和重塑阶段。N = 10-12。线图上的点表示平均± SEM. （*） p < 0.05，使用单因素方差分析，然后是 Tukey 的事后检验。请点击此处查看此图的大图。
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Discussion
本研究的目的是描述μCT分析的详细方案，目的是准确量化3D矿化愈伤组织结构，这通常是骨和骨折愈合研究的基础。该协议利用通用的最先进的3D图像分析软件平台，该平台有助于图像可视化，分割/标记以及从简单到复杂的测量。
该方案中最耗时的任务是半自动分割愈伤组织，排除皮质骨和髓管。在以前的许多研究中，该区域也被排除在外9,16,17,18。一些研究在其分析中包括了天然皮质骨和管区域19,21，而在其他研究中，方法尚不清楚。包括天然皮质避免了在轮廓化断裂皮质的粉碎区域时遇到的困难和潜在的主观性，但会膨胀愈伤组织矿化措施。
该协议侧重于获得输出测量值，包括总愈伤组织体积、矿化体积、骨体积分数和骨矿物质密度。这些参数很容易解释，并且通常在文献中报道。矿化体积和骨体积分数取决于区分矿化和非矿化的首选阈值，而骨矿物质密度则不然。组织矿物质密度也可以仅基于标记为矿化的组织来计算，而不是基于矿化和非矿化愈伤组织的骨矿物质密度。据报道，组织矿物密度与扭转强度和刚度有关9;然而，与骨密度相比，这些措施更可能受到部分体积效应和成像分辨率的影响。
研究人员报告说，量化的3D皮质桥与愈伤组织强度和硬度之间存在良好的相关性（在2DX光片上评估的皮质桥通常在人类患者中进行临床评估）20。文献中报道的其他3D愈伤组织特性包括惯性矩10,15,19，其表征愈伤组织的几何分布（即组织的展开程度）。极惯性矩理论上与抗扭力矩有关，弯曲惯量与抗弯矩有关。尽管可以根据本研究中描述的分段愈伤组织数据计算这些特性，但据报道，它们与测量的生物力学特性的相关性不一致 9,19,2 1.先前报告的其他愈伤组织特性包括连通性密度、小梁厚度和结构模型指数11,17，，2 2。这些参数通常用于表征骨小梁，并且可通过μCT扫描仪软件轻松计算;然而，它们与骨折愈合质量的关系尚不清楚。本协议中使用的软件是通用程序，而不是特定于骨骼。因此，如果在本协议之外计算某些骨参数（例如小梁厚度），则可以将分割数据导出到其他程序进行进一步分析（例如，如Watson等人2 3）。
与需要多个程序进行分析的其他方法相比，该协议为来自单个软件环境的复杂愈伤组织结构表征和质量控制提供了详细的工作流程24.因此，节省时间是该协议的潜在优势。该软件支持各种灵活、复杂的 3D 可视化方法，有助于确保准确分析，并允许对所有结果进行并行制表。
μCT分析方案可以适用于小鼠和大鼠的不同骨折模型;对于其他应用，建议优化一些关键步骤，以确保最大限度地减少结果变化。具体而言，应考虑改变VOI的大小或VOI中轮廓切片的数量对结果可重复性的影响。此外，建议使用步骤 3.4 中所述的数字重新对齐，但如果使用不同的软件进行分析，则可能需要通过比较使用和不使用数字重新对齐生成的数据来评估此步骤的必要性。
在该协议中，使用半自动分割方法从皮质骨和骨髓中识别和分离愈伤组织。在粉碎性骨折等情况下，愈伤组织的结构极其复杂，对愈伤组织和皮质的骨膜表面进行轮廓塑造变得具有挑战性。在这些情况下，建议与多个实验者一起进行轮廓绘制，以评估并尝试限制主观性。
此协议存在限制。该协议要求转换和导出DICOM图像，以便随后可以在其他软件中分析图像;此步骤需要一些额外的时间，并且可能需要在图像中使用校准模型。随着自动分割技术的不断发展，包括基于机器学习的技术，用这些新技术取代协议的手动轮廓部分可能是有利的。总体而言，此处描述的用于分析啮齿动物骨愈合愈伤组织的详细方案可能特别有利于没有大量μCT分析经验的实验室，并可能有助于在整个领域建立更一致和标准化的方法。
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Disclosures
作者没有利益冲突需要披露。
Acknowledgments
这项工作得到了美国国立卫生研究院（NIH）R01 DK121327 to R.A.E和R01 AR071968 to F.K.的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% neutral buffered formalin | Fisher chemical | SF100-20 | Used for bone tissue fixation |
| Avizo | Thermo Scientific | Image processing and analysis software | |
| Hydroxyapatite phantom | Micro-CT HA D4.5, QRM | QRM-70128 | |
| Image Processing Language | Scanco | Used to convert raw images to DICOM images | |
| Micro-Mosquito Straight Hemostatic Forceps | Medline | Used to remove the intramedullary pin | |
| Microsoft Excel | Microsoft | Spreadsheet software | |
| Scanco mCT system (vivaCT 40) | Scanco | Used for µCT imaging |
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