Summary
Mikrodatortomografi (μCT) är ett icke-destruktivt avbildningsverktyg som är avgörande för att bedöma benstrukturen i prekliniska studier, men det saknas konsensus om μCT-procedurer för att analysera benläkningsförhårdnader. Denna studie ger ett steg-för-steg μCT-protokoll som möjliggör övervakning av frakturläkning.
Abstract
Mikrodatortomografi (μCT) är den vanligaste avbildningsmodaliteten för att karakterisera den tredimensionella (3D) morfologin hos ben och nybildat ben under frakturläkning i translationella vetenskapliga undersökningar. Studier av läkning av långa benfrakturer hos gnagare involverar vanligtvis sekundär läkning och bildandet av en mineraliserad förhårdnad. Formen på den förhårdnad som bildas och tätheten hos det nybildade benet kan variera avsevärt mellan tidpunkter och behandlingar. Medan standardmetoder för att kvantifiera parametrar för intakt kortikalt och trabekulärt ben används i stor utsträckning och är inbäddade i kommersiellt tillgänglig programvara, finns det en brist på konsensus om procedurer för att analysera den läkande förhårdnaden. Syftet med detta arbete är att beskriva ett standardiserat protokoll som kvantifierar benvolymfraktion och förhårdnadsmineraltäthet i den läkande förhårdnaden. Protokollet beskriver olika parametrar som bör beaktas under avbildning och analys, inklusive provinriktning under avbildning, storleken på volymen av intresse och antalet skivor som kontureras för att definiera förhårdnaden.
Introduction
Mikrodatortomografi (μCT) har använts i stor utsträckning inom preklinisk benforskning, vilket ger icke-invasiva, högupplösta bilder för att utvärdera mikrostrukturen hos ben 1,2,3,4,5. μCT omfattar ett stort antal röntgenbilder, erhållna från ett roterande prov eller med hjälp av en roterande röntgenkälla och detektor. Algoritmer används för att rekonstruera volymetriska 3D-data i form av en stapel av bildsegment. Klinisk CT är guldstandarden för 3D-avbildning av mänskliga ben, och μCT är en vanlig teknik för att utvärdera benläkningseffektivitet hos försöksdjur 1,2,3,4,6,7. Mineraliserat ben har utmärkt kontrast till röntgen, medan mjukvävnader har relativt dålig kontrast om inte kontrastmedel används. Vid bedömning av frakturläkning genererar μCT bilder som ger detaljerad information om 3D-strukturen och densiteten hos den mineraliserade förhårdnaden. In vivo μCT-skanning kan också användas för longitudinell bedömning av frakturläkning över tid.
Kvantifieringen av intakt kortikalt och trabekulärt ben med hjälp av μCT är i allmänhet väletablerad och standardiserad8. Även om prekliniska studier använder en mängd olika kvantifieringsmetoder för att analysera frakturläkning 9,10,11, har ett detaljerat protokoll för μCT-bildanalys för kalluskvantifiering ännu inte publicerats. Därför är syftet med denna studie att tillhandahålla ett detaljerat steg-för-steg-protokoll för μCT-avbildning och analys av benläkningsförhårdnader.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Följande protokoll utvecklades för att karakterisera förhårdnader med långa ben som skördats från avlivade möss. De flesta av stegen kan dock tillämpas på råttor och även användas för in vivo-skanning av brutna ben. Protokollet beskriver ett visst μCT-system och specifik programvara för bildbehandling, analys och visualisering (se materialförteckning), men metoden är allmänt tillämplig på andra skannrar och programvara. Protokollet godkändes av Institutional Animal Care and Use Committee vid Pennsylvania State University College of Medicine. Möss som användes i denna studie var 16 veckor gamla, manliga C57BL/6J-möss (medelvikt 31,45 ± 3,2 g).
1. Skörd och konservering av vävnader
OBS: Använd en lämplig murin frakturmodell. För denna studie användes modellen med öppen tibialfraktur i mitten av diafysen enligt standardprotokollet som beskrivs i12,13.
- I slutet av frakturmodellexperimentet avlivas musen genom att administrera en intraperitoneal injektion av ketamin eller xylazin (500 mg/kg respektive 50 mg/kg).
- Använd en sax för att skörda det brutna benet från mitten av lårbenet till tibiotalarleden utan att störa frakturstället. Ta bort musklerna som omger benet och lämna endast den mjuka vävnaden som är i direkt kontakt med benet för att stödja frakturstället under de efterföljande bearbetningsstegen. Ta bort det intramedullära stiftet med en rak hemostatisk pincett för mikromyggor.
- Förvara proverna i formalin vid 4 °C eller i koksaltlösning vid -20 °C. Valet av konserveringsvehikel beror på de avsedda tillämpningarna nedströms μCT. I denna studie konserverades proverna i saltlösning vid -20 °C.
2. μCT-skanning
- Beredning av prover
- För samtidig skanning av flera prover, placera upp till sex prover i en specialutvecklad, 3D-printad skanningsfixtur (Figur 1 A, B) eller liknande. Samtidig skanning minskar skanningstiden och kostnaden. Den skräddarsydda fixturen som används i denna studie innehåller sex slitsar för att hålla de långa benproverna och ett mitthål för en hydroxiapatit (HA) fantom (Figur 1A,B; Materialförteckning).
HA-fantomen kommer att fungera som en standard i steg 4.2 (se nedan) för att konvertera μCT-enheter (vanligtvis Hounsfield) till HA-densitet (mgHA/ccm). - Placera den förberedda fixturen i en spruta eller ett koniskt rör som liknar diametern på synfältet (FOV; Figur 1C). I denna studie användes en 20 mm spruta för att matcha synfältet på 21,5 mm.
- För att förhindra att proverna torkar ut under skanningsprocessen, fyll sprutan eller det kanoniska röret med det konserveringsmedel som användes i steg 1.3 (koksaltlösning användes i denna studie).
- För samtidig skanning av flera prover, placera upp till sex prover i en specialutvecklad, 3D-printad skanningsfixtur (Figur 1 A, B) eller liknande. Samtidig skanning minskar skanningstiden och kostnaden. Den skräddarsydda fixturen som används i denna studie innehåller sex slitsar för att hålla de långa benproverna och ett mitthål för en hydroxiapatit (HA) fantom (Figur 1A,B; Materialförteckning).
- Skanning
- Före skanning, kontrollera att μCT-maskinen är kalibrerad enligt följande: placera en HA-fantom vid mittlinjen av μCT FOV, skanna fantomen och mät densiteten av HA. Se till att den uppmätta densiteten överensstämmer med den densitet som tillhandahålls av tillverkaren.
- Rikta in provfixturens mittlinje med den ungefärliga mittlinjen för μCT FOV. Detta säkerställer att proverna ligger inom synfältet och att deras långa axlar har en orientering som ungefär sammanfaller med den axiella riktningen för de resulterande bilderna.
OBS: Denna standardiserade orientering kan senare bidra till att göra analysproceduren mindre benägen för variationer, t.ex. i mängden vävnad som beaktas inom den aktuella volymen. - Ställ in skanningsparametrarna för μCT-systemet (Materialförteckning). Parametrarna som används i denna studie är 10,5 μm (isotrop voxelstorlek), 55 kVp (energi/intensitet), 145 μA (ström) och 300 ms (integrationstid). Bestäm voxelstorleken baserat på den ungefärliga tjockleken på mustrabeklerna (20-60 μm)8. Inspektera skanningen visuellt i olika vyer för att se till att den täcker hela volymen av alla kallusprover.
Figur 1: Struktur för den anpassade skanningsfixturen. (A) Bilder av skanningsfixturen (överst), som visar de sex provplatserna, och HA-fantomen (nederst). (B) Bilder som visar det långa benprovet (överst) och HA-fantomen (nederst) placerade i de avsedda platserna. (C) Bilder som visar skanningsfixturen placerad i en 20 mm spruta. Klicka här för att se en större version av denna figur.
3. Segmentering av bilder
OBS: Raw-bilder rekonstrueras automatiskt till bildsekvensdata.
- Bildkonvertering: konvertera rekonstruerade bildsekvensdata till DICOM-bildsekvenser med hjälp av ett bildbehandlingsprogram (se Materialförteckning). Importera DICOM-bildsekvenser till programvaran (se materialförteckning) för bildbehandling, analys och visualisering (figur 2A).
- Bildbeskärning: ett prov i taget, beskär varje bildstapel och se till att hela provet ingår i den beskurna volymen (Figur 2B). Spara den beskurna bilden på följande sätt: klicka på fliken Arkiv längst upp till vänster på skärmen, välj Spara projekt och välj sedan Minimera projektstorlek från alternativen som visas på skärmen. Filen sparas i det kommersiella programvaruformatet.
- Bildnedsättning: använd en filtreringsmetod för att minska brusnivån och för att undvika oskärpa enligt följande.
- Klicka på fliken Arkiv och välj den bild som ska bearbetas med hjälp av öppna data. Den öppnade bilden visas i projektvisningsfönstret i det övre vänstra hörnet av skärmen.
- Högerklicka för att välja Bildbehandling och sedan Filtersandlåda. Klicka på Skapa.
- Gör så här i fönstret Egenskaper (längst ned till vänster på skärmen): välj Data som förhandsgranskningstyp. välj filtertyp från rullgardinsmenyn bredvid Filter; välja 3D för tolkning; välj Separable från rullgardinsmenyn bredvid kerneltyp; Fyll i de värden som ska användas för standardavvikelse och kärnstorleksfaktor i den tillgängliga tomma rutan bredvid var och en. välj Samma som inmatning från rullgardinsmenyn bredvid utdata; klicka på Använd.
OBS: Valet av filtertyp (tillgängliga alternativ är bilateral, box, Gaussian, median, rekursiv exponentiell, avgränsad, anisotropisk diffusion, icke-lokala medel, oskarp maskering och FFT-filter) och parametrar beror på brusnivån och voxelstorleken på skannade bilder. För det gaussiska filtret är 3 x 3 x 3 och 5 x 5 x 5 vanliga värden för kernelstorleksfaktorn och 0,5–2,0 används ofta för standardavvikelsen8. I denna studie användes ett Gaussiskt filter och 5 x 5 x 5 och 0,8 för kärnstorleksfaktor respektive standardavvikelse.
- Justering av bild
OBS: Detta är ett valfritt steg. När felinriktning av långa benprover i förhållande till bildsystemets koordinataxlar inträffar under skanningsprocessen, kan en digital inriktningsmetod tillämpas för att korrigera felinriktningen (figur 2C).- Skapa en 3D-renderad bild av exemplet på följande sätt. I projektvyfönstret väljer du den filtrerade, beskurna bilden (som skapades i steg 3.3). Högerklicka för att välja Display och sedan Volume Rendering från rullgardinsmenyn och klicka sedan på Create. Kontrollera visuellt den 3D-renderade bilden i sagittal- och frontalplanen.
- Rotera den renderade volymen manuellt för att få en bra justering i den längsgående axeln. Tillämpa omformning på de roterade bilderna på följande sätt: i egenskapsfönstret klickar du på Transformeringsredigeraren, går sedan till Transform Editor-manipulator och väljer Transformer i listrutan. Nu kan provet roteras och justeras om. När justeringsprocessen är klar klickar du på Transformeringsredigeraren igen för att låsa bilden.
- Sampla om den filtrerade bilden (som skapades i steg 3.3) för att skapa nya tvärgående (axiella) bildsegment enligt följande: I fönstret Projektvy väljer du bilden från steg 3.4.2. Högerklicka för att välja Geometritransformering och sedan Sampla om transformerad bild från rullgardinsmenyn och klicka på Skapa. I egenskapsfönstret går du till Data och utför följande: för interpolering väljer du Standard i den nedrullningsbara menyn. för läge, välj Utökad; för konservering, välj Voxel Size; För Utfyllnadsvärde anger du noll i rutan Tillgänglig tom. Klicka sedan på Använd.
- Definiera volymen av intresse (VOI)
- Gå igenom de tvärgående bildskivorna och identifiera mittplanet för frakturförhårdnaden. Definiera VOI baserat på de proximala och distala ändarna av förhårdnaden. I de fall då förhårdnadsändarna är svåra att definiera, definiera VOI baserat på ett standardiserat avstånd från förhårdnadens mittplan (Figur 2D).
OBS: Under läkningsfaser som föregår benombyggnad är det lätt att definiera kanterna på den mineraliserade förhårdnaden eftersom den trabekulära strukturen hos det nybildade vävda benet skiljer sig från den kortikala strukturen hos det ursprungliga benet. Men när ombyggnadsfasen följer förvärvar det nybildade benet den kortikala strukturen gradvis; Därför blir det allt svårare att definiera kanterna på förhårdnaden.
- Gå igenom de tvärgående bildskivorna och identifiera mittplanet för frakturförhårdnaden. Definiera VOI baserat på de proximala och distala ändarna av förhårdnaden. I de fall då förhårdnadsändarna är svåra att definiera, definiera VOI baserat på ett standardiserat avstånd från förhårdnadens mittplan (Figur 2D).
Figur 2: Bildsegmentering . (A) En bild som visar sex prover inom en skanning. (B) Bildbeskärning för att isolera enskilda prover. (C) Digital justering för att korrigera en feljusterad längsgående axel (gul prickad linje). (D) Definition av VOI och förhårdnadens mittplan. Klicka här för att se en större version av denna figur.
4. Bildanalys
- Segmentering av förhårdnad och kortikalt ben
- Konturera den yttre gränsen för förhårdnaden halvautomatiskt med hjälp av segmenteringslassoverktyget med alternativ för automatisk spårning och spårkanter (figur 3A) enligt följande:
- När du har satt ihop de omformade bilderna igen (steg 3.4.3) klickar du på fliken Segmentering i den andra flikraden högst upp på skärmen. I segmenteringsredigerarens fönster väljer du en transformerad bild (skapad i steg 3.4.3) i listrutan bredvid bilden.
- I fönstret MATERIAL dubbelklickar du på Lägg till; Genom att göra det kommer två flikar med namnet Material3 och Material4 att visas. Högerklicka för att byta namn på material3 till callus och material4 till kortikalt ben.
- I SELECTION-fönstret klickar du på lassoikonen; från alternativen som visas väljer du Frihand för 2D-läget, Inuti för 3D-läget och både Automatisk kalkering och Spåra kanter för alternativ. Använd lassot för att markera de intressanta områdena.
- Upprepa detta kontureringssteg med skivor som samplas över VOI (Figur 3B). De konturerade skivorna kan placeras åtskilda från varandra (t.ex. separeras med 20 skivor).
OBS: I regioner med komplexa förhårdnadsstrukturer kan användaren överväga att minska avståndet mellan konturerade skivor för att fånga fler fragment (Figur 3A,B). - Interpolera över de konturerade förhårdnadskonturerna för att skapa en komplett förhårdnadsetikett (Figur 3C,D) enligt följande: i fönstret MATERIAL väljer du Callus-filen (skapad i steg 4.1.1.2.), klickar på fliken Selection högst upp på skärmen och väljer Interpolera från rullgardinsmenyn. I fönstret URVAL klickar du på plustecknet.
- Öppna Cortical Bone-filen som skapades i steg 4.1.1.2. Segmentera det kortikala benet, inklusive märghålan, enligt beskrivningen för förhårdnaden i steg 4.1.1 och 4.1.2. (Figur 4A,B). Interpolera den konturerade periosteala cortex för att skapa en kortikal benetikett enligt beskrivningen för förhårdnaden i steg 4.1.3 (Figur 4C,D).
- Beräkna den konturerade volymen och medelvärdet för förhårdnaden enligt följande: klicka på fliken Segmentering på den översta raden på skärmen och välj Materialstatistik från rullgardinsmenyn. Detta genererar en tabell som innehåller alla beräknade värden. Värdena för det kortikala benet och förhårdnaden (efter att ha subtraherat det kortikala benet) tillhandahålls separat. När tabellen har genererats klickar du på Exportera till arbetsyta för att spara data.
- Konturera den yttre gränsen för förhårdnaden halvautomatiskt med hjälp av segmenteringslassoverktyget med alternativ för automatisk spårning och spårkanter (figur 3A) enligt följande:
- Omvandling av gråskaleenheter till bentäthet
- Beskär 3D-bilden av 4,5 mm HA-fantomen (bild 2B) från hela bilden och klicka på Segmentering. Hartset i HA-fantomen innehåller fem små HA-cylindrar (figur 1A). För den HA-cylinder som har den högsta densiteten definierar du de första och sista sektorerna genom visuell inspektion.
- Rita två cirklar vid den första och den sista skivan (undvik kanter) med penselverktyget (Figur 5A) enligt följande: i fönstret MATERIAL klickar du på Lägg till fyra gånger. Högerklicka för att byta namn på material3, material4, material5 och material6 till phantom1, phantom2, phantom3 respektive phantom4. Välj Phantom1, klicka på penselikonen i fönstret MARKERING och använd skjutreglaget för att justera penselstorleken (cirkulär kalkering) baserat på fantomens storlek (storleken på cirkeln ska vara mindre än fantomens).
- Använd interpolering mellan de två cirklarna för att skapa en volym för varje HA-cylinder (figur 5B) enligt följande: i fönstret MATERIAL väljer du Phantom1, klickar på fliken Urval på den översta raden på skärmen och väljer Interpolera från rullgardinsmenyn. I fönstret URVAL klickar du på plustecknet.
- Upprepa segmenteringsprocessen med tre av de återstående cylindrarna för hög ha, med början från den näst högsta HA-densiteten och slutar med den näst lägsta HA-densiteten (figur 5B). Cylindern med lägst HA-densitet kan uteslutas eftersom den ofta är svår att segmentera.
- Använd de genererade 3D-etiketterna för att beräkna medelvärdena för grått för de fyra analyserade HA-cylindrarna. Med hjälp av ett kalkylblad (se materialförteckning) eller liknande kan du plotta de genomsnittliga gråvärdena och motsvarande värden för bentäthet (BMD) som tillhandahålls av fantomtillverkaren. Generera en korrelationsekvation mellan BMD och gråvärdena med hjälp av linjär regression.
- Segmentering av den mineraliserade förhårdnaden och beräkning av BMD
- Baserat på korrelationsekvationen som genererades i steg 4.2.5 och det valda tröskelvärdet som skiljer mineraliserad och omineraliserad kallus, bestäm motsvarande gråvärdeströskel. Märk därför förhårdnadsområdet med gråvärden som är större än tröskelvärdet som mineraliserad förhårdnad och märk resten som omineraliserad (Figur 6A,B). I denna studie användes 250 mgHA/ccm som tröskelvärde för mineraliserad kallus14,15.
- Beräkna de totala volymerna av förhårdnader och mineraliserade förhårdnader. Baserat på dessa värden, beräkna benvolymfraktionen (mineraliserad förhårdnadsvolym normaliserad till den totala förhårdnadsvolymen = BV/TV). Använd det uppmätta gråvärdet för den totala förhårdnaden för att beräkna förhårdnadernas BMD med hjälp av korrelationsekvationen som genererades i 4.2.5.
OBS: Baserat på målet med studien och den programvara som används för analysen kan andra parametrar som SMI (strukturmodellindex), trabekulär tjocklek och grad av anisotropi beräknas.
Figur 3: Segmentering av förhårdnadens yttre gräns. (A) En kontur av förhårdnadens yttre gräns (röd linje). (B) Konturer vid skivor samplade tvärs över VOI (röda skivor). (C) En 3D-etikett för förhårdnader som skapats genom interpolering (röd volym). (D) Ett tvärsnitt av förhårdnadsetiketten som visas i C (inklusive kortikalt ben). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Segmentering av det kortikala benet. (A) En kontur av cortexens periosteala yta (grön linje). (B) Konturer vid skivor samplade över VOI (gröna skivor). (C) En 3D-etikett av det kortikala benet (som innehåller märghålan; grön) och förhårdnaden (röd) skapad av interpolerade etiketter av periosteala cortex och callus. (D) Ett tvärsnitt av förhårdnad (röd) och kortikalt ben (innehållande den intramedullära kaviteten; grön). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5: Omvandling av gråskaleenheter till BMD. (A) Konturer av HA-cylindern vid de första och sista skivorna (röda cirklar). (B) 3D-interpolerade HA-cylindrar (vänster) och tvärsnitt (höger). Brun: högsta HA-densitet; blå: näst högsta HA-densitet; violett: tredje högsta HA-densitet; grön: fjärde högsta HA-densitet. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 6: Segmentering av den mineraliserade förhårdnaden. (A) Den mineraliserade förhårdnaden (≥250 mgHA/ccm) visas i blått, resten av förhårdnaden (<250 mgHA/ccm) visas i rött och utrymmet som motsvarar det ursprungliga benet visas i grönt. (B) En 3D-vy av varje enskild etikett. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
För att övervaka benbildningen under frakturläkning inducerades en öppen tibialfraktur i mitten av diafysen hos vuxna C75BL/6J-möss av hankön. Frakturen stabiliserades med hjälp av en intramedulär nagel, en etablerad modell för sekundär läkning13. Förhårdnadsvävnader skördades dag 14, 21 och 28 efter fraktur12. Dessa tidpunkter representerar olika faser av läkning. Endokondral benbildning under sekundär benläkning fortskrider via initial bildning av en fibro-broskig (mjuk) förhårdnad, som mineraliseras i senare stadier för att minska mikrorörelsen vid frakturgapet, vilket möjliggör bildandet av nya blodkärl över frakturlinjen13. Dag 14 efter fraktur i den murina frakturmodellen som används i denna studie representerar stadiet av mineraliserad mjuk förhårdnad. När läkningen fortskrider från dag 14 till dag 21 ersätts den mineraliserade mjuka förhårdnaden helt av nybildat vävt ben, vilket resulterar i benöverbryggning av frakturgapet13. Mellan dag 21 och 28 genomgår förhårdnaden resorption och ombyggnad för att återupprätta den karakteristiska strukturen hos kortikalt ben12.
μCT-bilder togs och analyserades vid tre tidpunkter med hjälp av det protokoll som beskrivs ovan. Minst 10 prover analyserades vid varje tidpunkt. För varje prov beräknades benvolymfraktion och BMD. Benvolymfraktionen beräknades genom att dividera volymen mineraliserad förhårdnad (BV) med den totala förhårdnadsvolymen (TV). Resultaten visade betydande bildning av mineraliserad förhårdnad vid dag 14 (Figur 7A,B) och inkrementella ökningar av benfraktionsvolym och BMD när läkningen fortsatte från dag 14 till dag 21 och 28 (Figur 7A,B), vilket överensstämde med benöverbryggning av frakturgapet. Som förväntat genomgick förhårdnaden resorption/ombyggnad mellan dag 21 och 28, vilket framgår av en minskning av den totala förhårdnadsvolymen (figur 7A,B). Kortikal överbryggning av förhårdnaden var tydligare vid dag 28 än vid någon tidigare tidpunkt (Figur 7A). Dessa resultat indikerar att det tillhandahållna μCT-protokollet möjliggör övervakning av benbildning och förhårdnadsstruktur under olika faser av benläkning.
Figur 7: Övervakning av benläkning med μCT . (A) 2D-bilder (sagittal, vänster panel) och 3D (höger panel) av den läkande förhårdnaden som genereras av μCT vid de angivna tidpunkterna efter frakturen. (B) BMD, benvolymfraktion (BV/TV) och total förhårdnadsvolym beräknad från bilder som visas i A. Resultaten visar läkningsprogression genom de sena reparations- och ombyggnadsfaserna. N = 10-12. Prickarna på linjediagrammet representerar genomsnittlig ± SEM. (*) p < 0,05 med envägs ANOVA följt av Tukeys post-hoc-test. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Syftet med denna studie är att beskriva ett detaljerat protokoll för μCT-analys med målet att noggrant kvantifiera den 3D-mineraliserade förhårdnadsstrukturen, vilket ofta är grundläggande i ben- och frakturläkningsstudier. Protokollet använder en toppmodern mjukvaruplattform för 3D-bildanalys som underlättar bildvisualisering, segmentering/märkning och mätningar som sträcker sig från enkla till komplexa.
Den mest tidskrävande uppgiften i protokollet är halvautomatisk segmentering av förhårdnaden, med uteslutning av det kortikala benet och märgkanalen. Denna region har också uteslutits i många tidigare studier 9,16,17,18. Vissa studier har inkluderat de inhemska kortikala ben- och kanalregionerna i sina analyser19,21, medan tillvägagångssättet i andra studier inte var tydligt. Genom att inkludera de inhemska hjärnbarkarna undviker man svårigheten och den potentiella subjektiviteten i konturering av finfördelade regioner i frakturerade kortiker, men blåser upp kallusmineraliseringsåtgärderna.
Protokollet fokuserar på att erhålla produktionsmått inklusive total callusvolym, mineraliserad volym, benvolymfraktion och benmineraltäthet. Dessa parametrar är lätta att tolka och rapporteras ofta i litteraturen. Mineraliserad volym och benvolymfraktion är beroende av det valda tröskelvärdet för att differentiera mineraliserad kontra omineraliserad, medan benmineraltäthet inte är det. Vävnadsmineraldensitet kan också beräknas baserat på endast den vävnad som är märkt som mineraliserad, istället för benmineraldensitet baserad på både mineraliserad och omineraliserad förhårdnad. Vävnadsmineraltäthet har rapporterats vara förknippad med vridhållfasthet och styvhet9; Det är dock mer sannolikt att dessa mått påverkas av partiella volymeffekter och bildupplösning än bentäthet.
Utredare har rapporterat god korrelation mellan kvantifierad 3D-kortikal överbryggning och förhårdnadsstyrka och styvhet (kortikal överbryggning bedömd på 2D-röntgenbilder bedöms vanligtvis kliniskt hos mänskliga patienter)20. Ytterligare 3D-förhårdnadsegenskaper som rapporterats i litteraturen inkluderar tröghetsmoment10,15,19, som karakteriserar den geometriska fördelningen av förhårdnaden (dvs. hur utspridd vävnaden är). Polärt tröghetsmoment relaterar teoretiskt till vridmotstånd och böjtröghetsmoment relaterar till böjmotstånd. Även om dessa egenskaper kunde beräknas baserat på de segmenterade förhårdnadsdata som beskrivs i denna studie, har deras korrelation med uppmätta biomekaniska egenskaper rapporterats vara inkonsekvent 9,19,2 1. Andra tidigare rapporterade förhårdnadsegenskaper inkluderar konnektivitetstäthet, trabekulär tjocklek och strukturmodellindex11,17,,2 2. Dessa parametrar används ofta för att karakterisera trabekulärt ben och kan enkelt beräknas med μCT-skannerprogramvara. Deras förhållande till frakturläkningskvalitet är dock inte lika tydligt. Programvaran som används i detta protokoll är ett allmänt program, inte specifikt för ben. Således, om vissa benparametrar, såsom trabekulär tjocklek, beräknas utanför detta protokoll, kan segmenterade data exporteras till andra program för vidare analys (t.ex. som i Watson et al.23).
Detta protokoll tillhandahåller detaljerade arbetsflöden för komplex karakterisering av kallusstrukturer och kvalitetskontroll från en enda programvarumiljö jämfört med andra metoder där flera program krävs för analys24. Därför är tidsbesparing en potentiell fördel med detta protokoll. Programvaran möjliggör en mängd flexibla, sofistikerade 3D-visualiseringsmetoder som hjälper till att säkerställa korrekt analys och även möjliggör parallell tabulering av alla resultat.
μCT-analysprotokollet kan anpassas till olika frakturmodeller hos möss såväl som råttor; För andra applikationer rekommenderas optimering av några av de kritiska stegen för att säkerställa minimering av resultatvariationer. Specifikt bör man undersöka effekten av att ändra storleken på VOI eller antalet konturerade skivor inom VOI på resultatens reproducerbarhet. Vi rekommenderar också att du använder digital justering enligt beskrivningen i steg 3.4, men om annan programvara används för analys kan det krävas en bedömning av behovet av detta steg genom att jämföra data som genererats med och utan digital justering.
I detta protokoll användes en halvautomatisk segmenteringsmetod för identifiering och separation av förhårdnaden från det kortikala benet och märgen. I fall som finfördelade frakturer, där strukturen på förhårdnaden är extremt komplex, blir konturering av förhårdnaden och den periosteala ytan av cortex utmanande. Det är tillrådligt att i dessa fall utföra kontureringen med flera experimentatorer för att bedöma och försöka begränsa subjektiviteten.
Det finns begränsningar med det här protokollet. Protokollet kräver konvertering och export av DICOM-bilder så att bilder sedan kan analyseras i ytterligare programvara. Det här steget tar lite extra tid och kan kräva användning av en kalibreringsfantom i bilden. I takt med att automatiserade segmenteringstekniker fortsätter att utvecklas, inklusive sådana som bygger på maskininlärning, kan det vara fördelaktigt att ersätta de manuella konturdelarna av protokollet med dessa nya tekniker. Sammantaget kan det detaljerade protokollet som beskrivs här för analys av benläkning hos gnagare särskilt gynna laboratorier utan betydande erfarenhet av μCT-analys och kan bidra till att etablera ett mer konsekvent och standardiserat tillvägagångssätt över hela fältet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga intressekonflikter att redovisa.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av National Institutes of Health (NIH) R01 DK121327 till R.A.E och R01 AR071968 till F.K.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% neutral buffered formalin | Fisher chemical | SF100-20 | Used for bone tissue fixation |
| Avizo | Thermo Scientific | Image processing and analysis software | |
| Hydroxyapatite phantom | Micro-CT HA D4.5, QRM | QRM-70128 | |
| Image Processing Language | Scanco | Used to convert raw images to DICOM images | |
| Micro-Mosquito Straight Hemostatic Forceps | Medline | Used to remove the intramedullary pin | |
| Microsoft Excel | Microsoft | Spreadsheet software | |
| Scanco mCT system (vivaCT 40) | Scanco | Used for µCT imaging |
References
- Rüegsegger, P., Koller, B., Müller, R. A microtomographic system for the nondestructive evaluation of bone architecture. Calcified Tissue International. 58 (1), 24-29 (1996).
- Müller, R., et al. Morphometric analysis of human bone biopsies: a quantitative structural comparison of histological sections and micro-computed tomography. Bone. 23 (1), 59-66 (1998).
- Waarsing, J. H., et al. Detecting and tracking local changes in the tibiae of individual rats: a novel method to analyse longitudinal in vivo micro-CT data. Bone. 34 (1), 163-169 (2004).
- Boyd, S. K., Davison, P., Müller, R., Gasser, J. A. Monitoring individual morphological changes over time in ovariectomized rats by in vivo micro-computed tomography. Bone. 39 (4), 854-862 (2006).
- Christiansen, B. A. Effect of micro-computed tomography voxel size and segmentation method on trabecular bone microstructure measures in mice. Bone Reports. 5, 136-140 (2016).
- Holdsworth, D. W., Thornton, M. M. Micro-CT in small animal and specimen imaging. Trends in Biotechnology. 20 (8), 34-39 (2002).
- Schambach, S. J., Bag, S., Schilling, L., Groden, C., Brockmann, M. A. Application of micro-CT in small animal imaging. Methods. 50 (1), 2-13 (2010).
- Bouxsein, M. L., et al. Guidelines for assessment of bone microstructure in rodents using micro-computed tomography. Journal of Bone and Mineral Research. 25 (7), 1468-1486 (2010).
- Morgan, E. F., et al. Micro-computed tomography assessment of fracture healing: Relationships among callus structure, composition, and mechanical function. Bone. 44 (2), 335-344 (2009).
- O'Neill, K. R., et al. Micro-computed tomography assessment of the progression of fracture healing in mice. Bone. 50 (6), 1357-1367 (2012).
- Bissinger, O., et al. Fully automated segmentation of callus by micro-CT compared to biomechanics. Journal of Orthopaedic Surgery and Research. 12 (1), 108 (2017).
- Brown, M. L., et al. Delayed fracture healing and increased callus adiposity in a C57BL/6J murine model of obesity-associated type 2 diabetes mellitus. PLOS One. 9 (6), 99656 (2014).
- Khajuria, D. K., et al. Aberrant structure of fibrillar collagen and elevated levels of advanced glycation end products typify delayed fracture healing in the diet-induced obesity mouse model. Bone. 137, 115436 (2020).
- Sigurdsen, U., Reikeras, O., Hoiseth, A., Utvag, S. E. Correlations between strength and quantitative computed tomography measurement of callus mineralization in experimental tibial fractures. Clinical Biomechanics. 26 (1), 95-100 (2011).
- Duvall, C. L., Taylor, W. R., Weiss, D., Wojtowicz, A. M., Guldberg, R. E. Impaired angiogenesis, early callus formation, and late stage remodeling in fracture healing of osteopontin-deficient mice. Journal of Bone and Mineral Research. 22 (2), 286-297 (2007).
- Gerstenfeld, L. C., et al. Comparison of effects of the bisphosphonate alendronate versus the RANKL inhibitor denosumab on murine fracture healing. Journal of Bone and Mineral Research. 24 (2), 196-208 (2009).
- Alentado, V. J., et al. Validation of the modified radiographic union score for tibia fractures (mRUST) in murine femoral fractures. Frontiers in Endocrinology. 13, 911058 (2022).
- Yu, K. E., et al. Enhancement of impaired MRSA-infected fracture healing by combinatorial antibiotics and modulation of sustained inflammation. Journal of Bone and Mineral Research. 37 (1), 1352-1365 (2022).
- Nyman, J. S., et al. Quantitative measures of femoral fracture repair in rats derived by micro-computed tomography. Journal of Biomechanics. 42 (7), 891-897 (2009).
- Fiset, S., et al. Experimental validation of the radiographic union score for tibial fractures (RUST) using micro-computed tomography scanning and biomechanical testing in an in-vivo rat model. The Journal of Bone and Joint Surgery. 100 (21), 1871-1878 (2018).
- Shefelbine, S. J., et al. Prediction of fracture callus mechanical properties using micro-CT images and voxel-based finite element analysis. Bone. 36 (3), 480-488 (2005).
- Liu, Y., et al. Glucocorticoid-induced delayed fracture healing and impaired bone biomechanical properties in mice. Clinical Interventions in Aging. 13, 1465-1474 (2018).
- Watson, P. J., Fitton, L. C., Meloro, C., Fagan, M. J., Gröning, F. Mechanical adaptation of trabecular bone morphology in the mammalian mandible. Scientific Reports. 8 (1), 7277 (2018).
- Nie, C., Wang, Z., Liu, X. The effect of depression on fracture healing and osteoblast differentiation in rats. Neuropsychiatric Disease and Treatment. 14, 1705-1713 (2018).
