Summary
يتم زرع الفئران والجرذان جراحيا باستخدام أجهزة الإرسال والاستقبال عن بعد ثم تعويدها على بيئة الاختبار والإجراء. يتم قياس التغيرات في درجة حرارة العضلات استجابة للمنبهات الدوائية أو السياقية في القفص المنزلي أو أثناء النشاط البدني الموصوف (أي المشي على جهاز المشي بسرعة ثابتة).
Abstract
يوفر التوليد الحراري للعضلات الهيكلية وسيلة محتملة لفهم التوازن الأيضي بشكل أفضل والآليات الكامنة وراء إنفاق الطاقة. من المثير للدهشة أن القليل من الأدلة المتاحة لربط الآليات العصبية والعضلية الخلوية والجزيئية لتوليد الحرارة مباشرة بالتغيرات القابلة للقياس في درجة حرارة العضلات. تصف هذه الورقة طريقة يتم من خلالها استخدام أجهزة الإرسال والاستقبال لدرجة الحرارة لاسترداد القياسات المباشرة لدرجة حرارة العضلات الهيكلية للفأر والفئران.
يتم زرع أجهزة الإرسال والاستقبال عن بعد جراحيا داخل عضلات الفئران والجرذان ، ويتم منح الحيوانات وقتا للتعافي. يجب بعد ذلك تعويد الفئران والجرذان بشكل متكرر على بيئة الاختبار والإجراء. يتم قياس التغيرات في درجة حرارة العضلات استجابة للمنبهات الدوائية أو السياقية في قفص المنزل. يمكن أيضا قياس درجة حرارة العضلات أثناء النشاط البدني الموصوف (أي المشي على جهاز المشي بسرعة ثابتة) لتحليل التغيرات في النشاط كمساهمين في التغيرات في درجة حرارة العضلات التي تسببها هذه المحفزات.
تم استخدام هذه الطريقة بنجاح لتوضيح الآليات الكامنة وراء التحكم الحراري للعضلات على مستوى الدماغ والجهاز العصبي الودي والعضلات الهيكلية. يتم تقديم عروض توضيحية لهذا النجاح باستخدام رائحة المفترس (PO ؛ رائحة النمس) كحافز سياقي وحقن الأوكسيتوسين (Oxt) كحافز دوائي ، حيث تحفز رائحة المفترس توليد الحرارة العضلية ، و Oxt يثبط درجة حرارة العضلات. وبالتالي ، تعرض مجموعات البيانات هذه فعالية هذه الطريقة في اكتشاف التغيرات السريعة في درجة حرارة العضلات.
Introduction
ضمن أبحاث التمثيل الغذائي ، يعد فحص توليد الحرارة للعضلات الهيكلية وسيلة جديدة واعدة لفحص توازن وزن الجسم. تدعم الأدبيات المنشورة فكرة أن الاستجابات الحرارية لأحد أكبر أجهزة الجسم - العضلات الهيكلية - توفر وسيلة لزيادة نفقات الطاقة والتأثيرات الأيضية الأخرى ، وبالتالي إعادة توازن الأنظمة بشكل فعال داخل أمراض مثل السمنة1،2،3. إذا كان من الممكن اعتبار العضلات عضوا حراريا ، فيجب أن تستخدم الدراسات منهجية عملية لدراسة التغيرات الحرارية داخل هذا العضو. الرغبة في فهم التأثير الماص للحرارة للعضلات الهيكلية وفائدة هذه المنهجية لدراسة توليد الحرارة للعضلات غير المرتعشة ليست خاصة بالدراسات الأيضية. أظهرت التخصصات بما في ذلك التطور4 وعلم وظائف الأعضاء المقارن5 والفيزيولوجيا البيئية6،7 اهتماما راسخا بفهم الطرق التي قد يساهم بها توليد الحرارة العضلي في ماص الحرارة وكيف تتكيف هذه الآلية مع البيئة. يوفر البروتوكول المقدم الأساليب الحاسمة اللازمة لمعالجة هذه الأسئلة.
يمكن استخدام الطريقة المقدمة في تقييم كل من تعديل المحفزات السياقية والدوائية لدرجة حرارة العضلات ، بما في ذلك التقنية الفريدة لتوفير رائحة المفترس (PO) لتغيير السياق لتكرار تهديد المفترس. أظهرت التقارير السابقة قدرة PO على إحداث زيادة كبيرة في توليد الحرارةالعضلي 8 بسرعة. علاوة على ذلك ، يمكن للمحفزات الدوائية أيضا تغيير درجة حرارة العضلات. وقد ثبت ذلك في سياق توليد الحرارة العضلي الناجم عن PO ، حيث أدى الحصار الدوائي للمستقبلات β الأدرينالية المحيطية ، باستخدام nadolol ، إلى تثبيط قدرة PO على تحفيز توليد الحرارة العضلي دون التأثير بشكل كبير على توليد الحرارة المقلص أثناء المشي على جهاز المشي8. كما تم استخدام الإدارة المركزية لمنبهات مستقبلات الميلانوكورتين في الفئران لتمييز آليات الدماغ التي تغير توليد الحرارة 9,10.
يتم توفير هنا تحقيقا أوليا في قدرة هرمون الأوكسيتوسين العصبي (Oxt) على تغيير توليد الحرارة العضلي في الفئران. على غرار تهديد المفترس ، تؤدي اللقاءات الاجتماعية مع شخص محدد من نفس الجنس إلى زيادة درجة حرارة الجسم ، وهي ظاهرة يشار إليها باسم ارتفاع الحرارة الاجتماعي11. نظرا لأهمية Oxt للسلوك الاجتماعي12 ، فقد تم التكهن بأن Oxt هو وسيط لارتفاع الحرارة الاجتماعي في الفئران. في الواقع ، يقلل مضاد مستقبلات الأوكسيتوسين من ارتفاع الحرارة الاجتماعي في الفئران11 ، وتظهر جراء الفئران التي تفتقر إلى Oxt عجزا في الجوانب السلوكية والفسيولوجية للتنظيم الحراري ، بما في ذلك توليد الحرارة13. بالنظر إلى أن Harshaw et al. (2021) لم يجد دليلا يدعم توليد الحرارة للأنسجة الدهنية البنية (BAT) المعتمدة على مستقبلات الأدرينالية β3 مع ارتفاع الحرارة الاجتماعي11 ، فقد افترض أن ارتفاع الحرارة الاجتماعي قد يكون مدفوعا بتحريض أوكست لتوليد الحرارة العضلي.
لقياس التوليد الحراري للعضلات الهيكلية ، يستخدم البروتوكول التالي زرع أجهزة الإرسال والاستقبال IPTT-300 المبرمجة مسبقا بجوار العضلات محل الاهتمام داخل الفأر أو الجرذ8،10،14،15. أجهزة الإرسال والاستقبال هذه عبارة عن رقائق دقيقة مغلفة بالزجاج تتم قراءتها باستخدام قارئات جهاز الإرسال والاستقبال المقابلة. استخدمت الأبحاث القليلة أو المعدومة هذه التقنية بهذه الصفة ، على الرغم من أن الدراسات أشارت إلى الحاجة إلى الخصوصية التي توفرها هذه الطريقة16,17. أظهرت التحقيقات السابقة موثوقية هذه الطريقة ومجموعة متنوعة من الطرق التي يمكن من خلالها استخدام أجهزة الإرسال والاستقبال في درجة الحرارة مقارنة بطرق اختبار درجة الحرارة الأخرى18 أو بالاقتران مع الطرق الجراحية (على سبيل المثال ، القنية19). ومع ذلك ، تعتمد الدراسات من هذا النوع على مواضع استراتيجية مختلفة لقياس درجة حرارة الجسم الكلية 20،21،22 أو أنسجة محددة مثل BAT23،24،25.
بدلا من قياس درجة الحرارة من هذه المواقع أو أثناء استخدام موازين حرارة الأذن أو المستقيم26 ، توفر الطريقة الموضحة هنا خصوصية للعضلة محل الاهتمام. تعد القدرة على استهداف موقع ما عن طريق زرع أجهزة إرسال واستقبال مباشرة مجاورة للعضلات محل الاهتمام أكثر فعالية لفحص توليد الحرارة العضلي على وجه التحديد. يوفر طريقا جديدا بالإضافة إلى تلك التي يوفرها قياس الحرارة بالأشعة تحت الحمراءالسطحية 27,28 أو قياسات درجة الحرارة الجلدية عبر المزدوجة الحرارية 29. علاوة على ذلك ، توفر البيانات المقدمة من خلال هذه الطريقة مجموعة من طرق البحث ، وتجنب الحاجة إلى معدات وبرامج كبيرة ومكلفة وعالية التقنية مثل التصوير الحراري بالأشعة تحت الحمراء30،31،32.
تم استخدام هذه الطريقة بنجاح لقياس درجة الحرارة في عضلات الفخذ والساق ، إما من جانب واحد أو ثنائي. كانت هذه الطريقة فعالة أيضا بالتزامن مع الجراحة التجسيمية14،15. ضمن ~ 7-10 سم من طرف جهاز الإرسال والاستقبال ، يتم استخدام قارئات جهاز الإرسال والاستقبال المحمولة (DAS-8027 / DAS-7007R) لمسح درجة الحرارة وقياسها وعرضها. كانت هذه المسافة حرجة وقيمة للتحقيقات السابقة8،9،10 لأنها تقلل من الضغوطات المحتملة والمتغيرات المتغيرة لدرجة الحرارة مثل التعامل مع الحيوانات أثناء إجراءات الاختبار. باستخدام أجهزة ضبط الوقت ، يمكن بعد ذلك تسجيل القياسات وجمعها على مدار فترة زمنية دون تفاعل مباشر مع الحيوانات.
لتقليل إزعاج الفئران أثناء الاختبار ، تصف هذه الطريقة تجميع واستخدام الناهضين المصنوع من أنابيب PVC لمنح المجرب إمكانية الوصول إلى قاع الأقفاص المنزلية أثناء الاختبار. باستخدام الناهضين جنبا إلى جنب مع القارئ الرقمي ، يمكن إجراء قياسات درجة حرارة طرف جهاز الإرسال والاستقبال دون أي تفاعل حيواني بعد وضع التحفيز. بأقل تكلفة ، يمكن استخدام هذه الطريقة جنبا إلى جنب مع المحفزات الدوائية والسياقية ، مما يجعلها في متناول الباحثين. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن استخدام هذه الطريقة مع عدد كبير من الموضوعات (~ 16 فأرا أو ~ 12 فأرا) في وقت واحد ، مما يوفر الوقت في زيادة الإنتاجية الإجمالية لأي مشروع بحثي.
تم تقديم آلية مصممة في هذه الطريقة لتقديم الروائح للفئران باستخدام كرات الشاي المصنوعة من الفولاذ المقاوم للصدأ ، والتي يشار إليها من الآن فصاعدا باسم "كرات الشاي". على الرغم من أن كرات الشاي هذه مثالية لاحتواء أي مادة ذات رائحة ، في هذه الدراسات ، يتم وضع المناشف التي كانت بمثابة فراش في قفص على مدى 2-3 أسابيع للقوارض ، وهي مفترس طبيعي للفئران والجرذان ، داخل كل كرة شاي علاجية. يتم تقطيع كل منشفة إلى مربعات 5 سم × 5 سم. يتكرر هذا الاقتباس أيضا مع مناشف تحكم متطابقة عديمة الرائحة. أدى تقديم هذه الروائح بدون حاجز (أي كرة الشاي) إلى قيام الفئران بتمزيق الألياف داخل أقفاصها ، مما زاد من النشاط البدني. لم يكن هذا السلوك بارزا في الفئران. توفر كرات الشاي غلافا جيد التهوية للمنشفة ، مما يتيح الوصول الكامل إلى الرائحة مع الحفاظ على الحماية طوال التجربة التجريبية. يمكن تعقيم كرات الشاي هذه وفقا لبروتوكولات استخدام الحيوانات ، وإعدادها وإدخالها مباشرة بعد الجراحة لبدء تعويد الحيوانات على الهيكل جنبا إلى جنب مع حافز التحكم. يمكن للفئران بعد ذلك العيش مع التخصيب الإضافي ، مما يقلل من بروز عرض التحفيز الحاد.
التعود على وجود كرة الشاي هو جانب واحد فقط من التعود الذي يعتبر حاسما لهذه الطريقة. يتكون بروتوكول التعود الموصوف أيضا من التعرض المتكرر لإجراء الاختبار لتطبيع بيئة الاختبار (أي الأفراد والنقل والحركة إلى موقع الاختبار والتعرض للتحفيز). يقلل هذا التعود الممتد من الاستجابات الدقيقة من الحيوانات ويركز القياسات على المتغيرات التابعة المرغوبة (على سبيل المثال ، المحفزات الدوائية أو السياقية). حدد التقييم السابق لهذا البروتوكول أربع تجارب كحد أدنى لعدد الاعتيادات اللازمة قبل اختبار درجة الحرارة داخل الأقفاص المنزلية في الفئران8. إذا تم فصل الاختبار بفترات طويلة (أكثر من 2-3 أسابيع) ، فيجب تعويد الحيوانات مرة أخرى. بالنسبة للتعود المتكرر ، يكفي ما لا يقل عن تجربة أو تجربتين. ومع ذلك ، إذا تم فصل اختبارات درجة الحرارة عن طريق نوبات زمنية أطول ، فقد يكون من الضروري تكرار المزيد من التجارب.
في الجهود المستمرة لتعويد الفئران والجرذان على إجراء الاختبار ، يجب تضمين فترة تأقلم قبل عرض التحفيز في كل تجربة تجريبية. يعد وقت التأقلم هذا أمرا بالغ الأهمية لإعادة توازن درجة الحرارة والنشاط بعد نقله إلى موقع الاختبار. تميل القوارض إلى زيادة حادة في درجات الحرارة بسبب النقل. يجب أن يتكون التأقلم من 1 ساعة على الأقل دون تفاعل من المجرب في يوم الاختبار قبل أي إضافة لعامل دوائي أو محفزات سياقية. هذا ضروري كل يوم من الاختبار.
في اختبارات درجة حرارة القفص المنزلي المحددة ، تتمتع الفئران بالنطاق الحر لقفصها المنزلي للتجول استجابة للتحفيز الذي تم اختباره. يمكن أن يتسبب ذلك في حدوث تحولات متغيرة في النشاط ، مما يؤثر على دقة قراءات درجة الحرارة ، وبالتالي تحليل التأثيرات الحرارية للمتغير المستقل (على سبيل المثال ، التحفيز الدوائي أو السياقي). تقديرا للتغيرات المحتملة في درجة الحرارة بسبب مستوى النشاط ، يتم تضمين بروتوكول أدناه يصف استخدام درجة الحرارة أثناء المشي على جهاز المشي. تصف الأدبيات المنشورة الاستخدام الناجح لهذا الإجراء في الفئران ، ويتم استخدامه حاليا مع الفئران8،10،14،15. يحافظ المشي على جهاز المشي على سرعة ثابتة للنشاط لموضوع الاختبار. في هذه الدراسة ، يتم استخدام أجهزة المشي بشكل صارم للتحكم في مستوى النشاط ، وبالتالي ، يتم ضبطها على أقل سرعة متاحة على جهاز المشي لتعزيز المشي للفئران وإعداد منخفض مماثل للفئران.
تم تحديد الإجراء التالي لقياس درجة حرارة gastrocnemius من جانب واحد في الفئران وعرض رائحة المفترس. يمكن استخدام التصميم جنبا إلى جنب مع العوامل الدوائية ويمكن نقله إلى الفئران ومجموعات العضلات الهيكلية الأخرى (أي عضلات الفخذ) في الفئران. بالنسبة للفئران ، يمكن وضع أجهزة الإرسال والاستقبال في gastrocnemius بشكل ثنائي وفي الأنسجة الدهنية البنية. نظرا لقيود الحجم والمسافة ، يمكن استخدام جهاز إرسال واستقبال واحد فقط لكل ماوس. يمكن إجراء تعديلات طفيفة (على سبيل المثال ، إزالة المحفزات السياقية) لتقييم الاستجابات الحرارية للعوامل الدوائية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
يمكن تطبيق هذه الطرق على كل من نماذج الفئران والفئران وتم تنفيذها بموافقة مؤسسية (جامعة ولاية كينت ، موافقة IACUC # 359 و # 340 CN 12-04). قبل تنفيذ البروتوكول ، يجب إيواء الحيوانات وفقا لدليل رعاية واستخدام المختبر.
1. إعداد قارئ جهاز الإرسال والاستقبال
ملاحظة: قبل الاستخدام ، يجب ضبط قارئ جهاز الإرسال والاستقبال ؛ تتضمن الخطوات التالية فقط تغييرات الإعداد اللازمة لهذه الدراسة. يرتبط هذا الجزء من البروتوكول مباشرة بأجهزة القراءة المحمولة DAS-8027-IUS. يجب أن تتبع نماذج القارئ الأخرى التعليمات المقدمة من الدليل لتحقيق نتائج البرمجة.
- اضبط صوت الصفارة على OFF.
- قم بتشغيل الجهاز بالضغط على زر SCAN وانتظر ظهور الإضاءة على شاشة OLED. اضغط مع الاستمرار على زر BACK/MENU للوصول إلى شاشة القائمة .
- باستخدام الزر NEXT / ENTER ، قم بالتمرير عبر الخيارات حتى الإعداد التشغيلي. هنا ، قم بتبديل الأسهم لأعلى أو لأسفل لتحويل YES وافتح القائمة الفرعية التشغيلية.
- باستخدام الزر NEXT / ENTER ، قم بالتمرير إلى AUDIO BEEP. نظرا لأن الإعداد الافتراضي هو ON ، قم بتبديل الأسهم لأعلى أو لأسفل وقم بتغيير الإعداد إلى OFF.
- اضغط على الزر NEXT/ENTER لحفظ تغيير الإعداد هذا.
- اضبط الاهتزاز عند القراءة إلى ON.
- اتبع الخطوة 1.1 إلى الخطوة 1.2 أو أكمل الخطوة التالية مباشرة بعد الخطوة 1.4.
- باستخدام الزر التالي / ENTER ، قم بالتمرير إلى الاهتزاز عند القراءة. نظرا لأن الإعداد الافتراضي هو OFF ، قم بتبديل السهمين لأعلى ولأسفل وقم بتغيير الإعداد إلى ON ليشعر ، عبر الاهتزاز ، عند اكتمال القراءة بغض النظر عن القدرة على عرض الشاشة.
2. برنامج أجهزة الإرسال والاستقبال
ملاحظة: يجب أولا برمجة كل جهاز مرسل مستجيب مزروع بتعريف (معرف الحيوان أو معرف جهاز الإرسال والاستقبال). يمكن استخدام هذه التسمية كتعريف ثانوي لموضوع الاختبار (على سبيل المثال ، أربعة أرقام لاختصار سلالة الفأر ، وموقع جهاز الإرسال والاستقبال ، وثلاثة إلى أربعة أرقام إضافية للإشارة إلى رقم الحيوان). يمكن إكمال البرمجة قبل أيام من الجراحة مع الحفاظ على تعقيم أجهزة الإرسال والاستقبال قبل الجراحة.
- أدخل رمز الهوية على جهاز الإرسال والاستقبال.
- قم بتطبيق ملف معزز على رأس القارئ - ملحق محدد للطراز DAS 8027-IUS ، مما يساعد في إجراء البرمجة.
- باستخدام يد قفاز ، ضع جهاز الإرسال والاستقبال (داخل القضيب) في ملف التعزيز.
- قم بتشغيل الجهاز بالضغط على زر SCAN وانتظر حتى تضيء شاشة OLED. اضغط مع الاستمرار على زر BACK/MENU للوصول إلى شاشة القائمة .
- باستخدام الزر NEXT/ENTER ، قم بالتمرير عبر الخيارات حتى كتابة معرف المرسل المستجيب. هنا ، قم بتبديل الأسهم لأعلى أو لأسفل لتحويل نعم.
- باستخدام الزر NEXT / ENTER ، قم بالتبديل إلى رمز معرف ENTER.
- استخدم مفتاحي السهمين لأعلى ولأسفل للتمرير عبر الأرقام والحروف. اضغط على NEXT/ENTER بعد كل تحديد حرف للانتقال إلى الحرف التالي.
- عند اكتمال رمز المعرف ، اضغط على SCAN لكتابة جهاز الإرسال والاستقبال.
- قم بإزالة جهاز الإرسال والاستقبال من ملف التعزيز وكرر حسب الضرورة. تأكد من أن جهاز الإرسال والاستقبال يقرأ التغيرات في درجات الحرارة عن طريق تسخين أجهزة الإرسال والاستقبال المغلقة بين أيدي القفاز والقياس باستخدام الماسح الضوئي لدرجة الحرارة.
ملاحظة: يمكن ضبط إعدادات الكتابة المتعددة التلقائية والعدد المتسلسل على تشغيل للسماح ببرمجة مرسل مستجيب متعددة أو متسلسلة أثناء الجلسة. يجب اختبار كل جهاز إرسال واستقبال أثناء البرمجة.
3. إعداد "كرات قفص المنزل"
- ضع منشفة 5 سم × 5 سم عديمة الرائحة / التحكم في كرة شاي.
- ضع كرات القفص المنزلي هذه في أقفاص منزلية جديدة بعد الجراحة لبدء تعويد الحيوان على الطريقة التي سيتم بها تقديم المحفزات السياقية أثناء الاختبار. استبدال هذه الكرات قفص المنزل كل 2 أسابيع.
4. الجراحة ورعاية ما بعد الجراحة
- وزن وتسجيل وزن الجسم قبل الجراحة. باستخدام غرفة الحث ، قم بتوفير التخدير (على سبيل المثال ، 2-5٪ إيزوفلوران) للحيوان.
- باستخدام كليبرز الكهربائية ، حلق تماما الطرف الخلفي. تطبيق تسكين الألم (على سبيل المثال، 5 ملغ/كغ من كيتوبروفين، s.c) وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية.
ملاحظة: قد تكون هناك حاجة إلى تسكين إضافي إذا تم الجمع بين هذا الإجراء وطرق جراحية أخرى. - نظف المنطقة بنسبة 70٪ كحول (أو مناديل كحول معقمة متوفرة تجاريا) وغسول بوفيدون اليود (أو مسحات بيتادين معقمة وملفوفة بشكل فردي متوفرة تجاريا) بالتناوب ثلاث مرات على الأقل ، وتنتهي ببوفيدون اليود.
- أعد الحيوان إلى غرفة الحث ، وقم بتخدير الحيوان إلى المستويات الجراحية. بعد ذلك ، قم بإعداد الماوس في قناع الوجه للتعرض المستمر للتخدير. تطبيق مرهم العيون نيومايسين على عيون الحيوان لمنع الجفاف أثناء التخدير.
ملاحظة: يجب ألا يبدأ الإجراء حتى لا يظهر الفأر أي دليل على استقبال الألم (على سبيل المثال ، منعكس القرنية ، استجابة قرصة الذيل ، منعكس قرصة إصبع القدم). - باستخدام مقص جراحي فقط ، قم بعمل قطع ضحل عبر الجلد على الطرف الخلفي الأيمن.
- بالتحرك بالتوازي مع gastrocnemius ، ضع الحافة الحادة لجهاز الإرسال والاستقبال المعقم المبرمج مسبقا وغير المغطى في الشق. تأكد من أن المكبس الأخضر متجها لأعلى ومرئي. استمر في دفع قضيب جهاز الإرسال والاستقبال في الشق حتى يصبح فتح قضيب جهاز الإرسال والاستقبال غير مرئي.
ملاحظة: لا تضغط عن طريق الخطأ على المكبس الأخضر الموجود على قضيب جهاز الإرسال والاستقبال أثناء الخطوة 4.6. سيؤدي التفريغ المبكر لجهاز الإرسال والاستقبال إلى وضع غير صحيح. - أدر القضيب 180 درجة ، مما أدى إلى توجيه المكبس الأخضر لأسفل نحو طرف الفأر ، ولم يعد مرئيا للمجريب. ادفع قضيب جهاز الإرسال والاستقبال إلى الموقع النهائي. بمجرد أن يكون في الموضع المثالي ، المجاور أو المحاط جزئيا بالساق ، ادفع المكبس الأخضر ، مما يسمح لضغط القضيب بتوجيه يد المحقق بعيدا عن الماوس.
- باستخدام ملقط ، امسك الجلد المفتوح معا وضع مشبك جرح بمشبك تلقائي معقم أو خياطة معقمة. إذا لزم الأمر ، استخدم الغرز القابلة للامتصاص قبل المشبك التلقائي المعقم لإغلاق طبقة اللفافة. باستخدام قارئ جهاز الإرسال والاستقبال ، تحقق من درجة حرارة عضلة الماوس.
- أخرج الفأر من التخدير وضعه في قفص منزلي نظيف يوضع فوق وسادة تدفئة متداولة بالماء مضبوطة على درجة منخفضة للتعافي. تأكد من أن القفص المنزلي يحتوي على كرة شاي بمنشفة عديمة الرائحة لبدء التعود.
ملاحظة: يجب أن يستيقظ الفأر من الجراحة في غضون 15 دقيقة. يمكن وضع الطعام في الجزء السفلي من القفص لسهولة الوصول إليه خلال أيام التعافي. - رعاية ما بعد الجراحة
- سجل أوزان الماوس ودرجات الحرارة يوميا باستخدام قارئ مرسل مستجيب لمدة 2 أيام على الأقل بعد الجراحة أو حتى تستعيد الفئران أو تستقر وزن الجسم.
- تطبيق تسكين غير مخدر (على سبيل المثال، 5 ملغ / كغ من كيتوبروفين، SC) مرة واحدة يوميا للفئران لمدة 2 أيام على الأقل بعد الجراحة، مع توفير جرعات إضافية حسب الحاجة.
ملاحظة: يجب أن تتعافى الفئران والجرذان تماما في غضون 5-8 أيام من الجراحة ويمكن أن تخضع لإجراءات التعود والاختبار.
5. إعداد الاختبار - قفص المنزل
- بناء الناهضين
ملاحظة: تعتمد الخطوة التالية على أقفاص الماوس التي تعلوها مرشح 194 مم × 181 مم × 398 مم. لتناسب أقفاص أكبر (على سبيل المثال ، قفص منزل الفئران) ، يجب تعديل العرض.- اقطع الأنبوب PVC بقاطع PVC المتصاعد إلى ثمانية أقسام وقم بتجميعه وفقا للشكل 1C. سيعطي هذا هيكلا مفتوحا منضدية يمكنه استيعاب أربعة أقفاص تقريبا. جعل العدد المطلوب من الناهضين.
- إعداد الغرفة
- قم بتعيين موقع لكل ناهض داخل غرفة الاختبار. افصل الناهضين الذين تم ضبطهم لتلقي محفزات سياقية مختلفة (أي الروائح) بحد أدنى 2 متر لتجنب المتغيرات المربكة.
ملاحظة: يجب أن يكون لكل فأر موقع اختبار مخصص داخل غرفة الاختبار وعلى الناهضين الماديين قدر الإمكان لتجنب تطوير الارتباطات بين المواقع المختلفة والمحفزات الحرارية. - باستخدام شرائط مغناطيسية ، قم بإرفاق صفائح أو أردية جراحية عبر الناهضين ، مما يخلق حاجزا بصريا بين الباحث وموضوعات الاختبار. اضبط هذا الحاجز لتقليل التغيرات في درجات الحرارة الناتجة عن نشاط الماوس عند عرض المجربين الذين يتحركون نحو القفص أو حول غرفة الاختبار.
- (اختياري) ضع المرايا على السطح أسفل الناهضين لتسهيل رؤية قاع القفص أثناء الاختبار.
ملاحظة: يمكن تعقيم الناهضين من خلال نظام غسيل الأقفاص. يجب غسل القماش أو الملاءات الجراحية قبل التعود والاختبار.
- قم بتعيين موقع لكل ناهض داخل غرفة الاختبار. افصل الناهضين الذين تم ضبطهم لتلقي محفزات سياقية مختلفة (أي الروائح) بحد أدنى 2 متر لتجنب المتغيرات المربكة.
- تحضير كرة الشاي
- تحضير كرات الشاي مع التحكم ومناشف PO (حوالي 5 سم × 5 سم). لتجنب التلوث المتبادل ، قم بإعداد كرات الشاي ذات الرائحة الكريهة أولا.
ملاحظة: يجب اختبار مناشف الرائحة المفترسة قبل الاستخدام. يجب أيضا احتواء هذه المناشف ، ويجب تعقيم المواد التي تتفاعل معها على الفور (أي غسل الأقفاص) ، مما يمنع تعرض الرائحة للحيوانات الأخرى.
- تحضير كرات الشاي مع التحكم ومناشف PO (حوالي 5 سم × 5 سم). لتجنب التلوث المتبادل ، قم بإعداد كرات الشاي ذات الرائحة الكريهة أولا.
6. اختبار درجة الحرارة - قفص المنزل
ملاحظة: يجب أن تعتاد الحيوانات على إجراء الاختبار بأكمله ، باستثناء المحفزات السياقية أو الدوائية التجريبية. يجب إكمال هذا بحد أدنى 4x قبل الاختبار.
- نقل الحيوانات إلى غرفة الاختبار المعدة. ضع الحيوانات في مكان محدد مسبقا على الناهض. يجب أن يكون هذا الموقع هو نفسه في جميع إجراءات التعود والاختبار.
- قم بإزالة "كرة القفص المنزلي" من قفص منزل الفأر وأعد تغطية الأقفاص بقطعة قماش أو ملاءة جراحية. اسمح للفئران بالتأقلم مع مساحة الاختبار لمدة 1-2 ساعة.
- بعد اكتمال التأقلم ، استخدم الماسحة الضوئية لقياس وتسجيل درجة حرارة خط الأساس لكل موضوع. تجنب التلاعب بأغطية القماش أثناء القياسات.
ملاحظة: يمكن تطبيق العوامل الدوائية هنا. يمكن إضافة وقت الانتظار بعد الحقن أو التطبيق حسب الحاجة قبل الاختبار. يوصى بتسجيل خط أساس ثانوي مباشرة قبل الاختبار بعد إضافة عامل دوائي لمراقبة الاستجابة للمنبهات الدوائية. إذا لم يتم اختبار استجابة الرائحة ، يمكن أن تبدأ قياسات درجة حرارة الفئران مباشرة بعد الحقن. يجب استخدام التوزيع العشوائي عند تقديم أي محفزات. - اكشف القفص وضع كرة الشاي (التحكم أو PO) على أرضية القفص المنزلي. استبدل غطاء القفص وغطاء القماش.
- ابدأ ساعة الإيقاف. قم بقياس درجات حرارة الأشخاص الخاضعين للاختبار بنفس ترتيب وضع كرة الشاي. تسجيل درجات الحرارة ووقت ساعة القياسات باتباع النقاط الزمنية المطلوبة.
- عند اكتمال التجربة ، قم بإزالة كرة العلاج. ضع الفئران التي تلقت PO في قفص منزلي جديد مع "كرة قفص المنزل" الأصلية. أعد "كرة القفص المنزلي" إلى قفص الفئران التي تلقت رائحة التحكم. نقل الفئران إلى موقع السكن.
ملاحظة: يمكن ترجمة الإجراء أعلاه إلى نماذج الفئران داخل أقفاص ذات حجم مناسب. قد تكون هناك حاجة إلى تعديلات على القياسات المقترحة في الشكل 1C للسماح بوصول أفضل إلى قاع القفص المنزلي.
الشكل 1: أجهزة الإرسال والاستقبال واختبار درجة حرارة القفص المنزلي. (أ) رسم تخطيطي لوضع جهاز الإرسال والاستقبال أحادي الجانب لاختبار درجة الحرارة في ساق الفأر. بمجرد برمجته ووضعه ، يمكن استخدام قارئ جهاز الإرسال والاستقبال (DAS-8027-IUS ، موضح) لقياس درجة الحرارة. (ب) على اليسار، صورة لكرة شاي مفتوحة من الفولاذ المقاوم للصدأ ومنشفة مقاس 5 سم × 5 سم. الحق ، كرة الشاي المغلقة ، وتستخدم لعقد التعود ورائحة المناشف في اختبار قفص المنزل. (ج) رسم تخطيطي للرافعات التي تم إنشاؤها باستخدام أنابيب PVC لاختبار القفص المنزلي. (د) سير عمل بروتوكول اختبار القفص المنزلي. (ه) صور المرفق لمنطقة اختبار الأقفاص المنزلية. إلى اليسار ، أربعة أقفاص فأر فوق الناهض. توجد شرائط مغناطيسية على الجدار المجاور ، ويوجد مغناطيس وقماش جراحي على الطاولة. الحق ، أقفاص الماوس المغطاة على الناهضين. تم إنشاء (أ) و(ج) و(د) باستخدام Biorender.com. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
7. اختبار درجة الحرارة - المشي على جهاز المشي
- قم بتعيين جهاز المشي لكل كموقع مخصص له لإجراءات التعود والاختبار.
- قم بإعداد المطاحن للاختبار ، مما يضمن أن أجهزة الصدمات تعمل.
ملاحظة: بالنسبة للمشي على جهاز المشي ، يجب ضبط أجهزة المشي بأقل وتيرة متاحة تعزز الحركة المستمرة ولكن لا تعمل لكل من التعود والاختبار. بالنسبة لجهاز المشي الأيضي المغلق المعياري 1012M-2 ، يكون هذا 5.2 م / دقيقة للفئران و 7 م / دقيقة للفئران. قد تحتاج هذه الوتيرة إلى تعديل بناء على السمنة في الموضوع. يجب ضبط الصدمات على معدل شدة وتكرار 5.0. - التعود
- انقل الفئران إلى غرفة الاختبار. السماح للفئران 1-2 ساعة للتأقلم مع نقل الغرفة في أقفاصهم المنزلية.
- بعد التأقلم ، قم بتوجيه الفئران إلى فتحة جهاز المشي المخصص لها وأغلق جهاز المشي. ابدأ تشغيل الحزام والصدمة وساعة الإيقاف.
- اسمح للفئران بالسير على أجهزة المشي لمدة 15 دقيقة ، باستخدام محفز الصدمة كدافع للحركة. أوقف الاختبار على الفور إذا ظل على صدمة نشطة لفترة طويلة.
- بعد الاختبار ، قم بإزالة الفئران وإعادتها إلى أقفاص المنزل.
- نظف المطاحن باستخدام المنظفات السائلة والماء.
- اختبار
- انقل الفئران إلى غرفة الاختبار. السماح للفئران 1-2 ساعة للتأقلم مع نقل الغرفة في أقفاص منزلهم.
- قم بقياس وتسجيل درجة حرارة خط الأساس قبل تحريك الماوس إلى جهاز المشي.
ملاحظة: بالنسبة للاختبارات التي تشمل العوامل الدوائية ، قم بتطبيقها أو حقنها هنا ، باتباع المخطط الموضح في الشكل 2 أ. يمكن إضافة وقت الانتظار بعد الحقن حسب الحاجة قبل وضع الفئران على جهاز المشي. يجب استخدام التوزيع العشوائي عند تقديم أي محفزات. - ضع مربعات 5 سم × 5 سم من التحكم أو مناشف PO داخل جهاز المشي الأقرب إلى مقدمة جهاز المشي. قم بلصق المناشف بسقف جهاز المشي أو تحتها لسهولة وضعها وإزالتها.
- توجيه الفئران إلى حلقة مفرغة المعينة. قم بتشغيل حزام المطحنة والصدمة.
- ابدأ تشغيل ساعة الإيقاف. أخذ قياسات مواضيع الاختبار بنفس الترتيب الذي تم به إعداد الفئران في أجهزة المشي. سجل درجات الحرارة ووقت الساعة للقياسات باتباع النقاط الزمنية المطلوبة.
ملاحظة: يمكن قياس درجة الحرارة بشكل موثوق من خارج جهاز المشي أثناء وجود الماوس داخل جهاز المشي المغلق أثناء نشاط المشي. بالنسبة للفئران ، قد يتطلب حجم جهاز المشي وقيود المسافة بين جهاز الإرسال والاستقبال أن يبقي المجرب الجزء الخلفي من جهاز المشي مفتوحا لإدخال القارئ داخل جهاز المشي ، أقرب إلى الموضوع. - عند اكتمال الاختبار ، قم بإيقاف تشغيل الصدمات وأجهزة المشي ؛ إعادة الفئران إلى أقفاصهم المنزلية. نقل الفئران إلى موقع السكن.
- نظف أجهزة المشي باستخدام المنظفات السائلة والماء ، مع إيلاء اهتمام خاص لإزالة أي PO متبقي.
- عند اكتمال التجارب ، قم بالقتل الرحيم للحيوانات (على سبيل المثال ، باستخدام استنشاق CO2 ) ، وتأكد بصريا من موقع جهاز الإرسال والاستقبال.
الشكل 2: اختبار درجة الحرارة التي يتم التحكم فيها بواسطة النشاط. (أ) سير عمل اختبار درجة الحرارة التي يتم التحكم فيها بالنشاط باستخدام عامل دوائي باستخدام المشي على جهاز المشي. (ب) صور المنشأة لأجهزة المشي. على اليسار، صورة لإعداد المعدات بالكامل. على اليمين ، صورة أقرب لأجهزة المشي الفردية والصدمات. (A) تم إنشاؤه باستخدام Biorender.com. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تم زرع أجهزة الإرسال والاستقبال من جانب واحد في الساق الأيمن لعشرة فئران من النوع البري (WT) عمرها 4-6 أشهر تم تربيتها من سلالة SF1-Cre (خلفيات Tg (Nr5a1-cre) 7Lowl / J ، Strain # 012462 ، C57BL / 6J و FVB ؛ أنثى N = 5 ؛ ذكر N = 5). بعد الشفاء ، اعتادت الفئران على إجراء اختبار درجة حرارة القفص المنزلي الذي لم يتضمن حافزا سياقيا (على سبيل المثال ، PO). تم تسجيل قياسات درجة الحرارة باستخدام عصا مرسل مستجيب داخل غرفة السكن الخاصة بهم وبعد النقل إلى موقع الاختبار. أعطيت الفئران 1-2 ساعة للتأقلم مع غرفة الاختبار والموقع. عند الانتهاء من التأقلم ، تم تسجيل قياسات خط الأساس والقياسات المتتالية لمدة 1 ساعة لكل ماوس. تم الانتهاء من هذا الإجراء أربع مرات.
بشكل عام ، لم يلاحظ أي اختلافات بين الجنسين. زادت درجات حرارة العضلات بشكل ملحوظ بعد نقل الفئران إلى غرفة الاختبار ، ثم انخفضت عن طريق قياس خط الأساس بعد قضاء 60 دقيقة في سياق الاختبار. لم يظهر التحليل المشترك بين الجنسين للتجربة 4 أي فرق كبير بين قياسات درجة الحرارة "قبل التحرك" و "خط الأساس" (اختبار t ثنائي الطرف ، اختبار t مزدوج ، p > 0.10) ، مما يدل على فعالية تأقلم 1 ساعة مع سياق الاختبار. علاوة على ذلك ، أظهرت المقارنة الإحصائية لدرجات الحرارة عند خط الأساس و 60 دقيقة انخفاضا معنويا في درجة الحرارة (ثنائي الطرف ، اختبار t المزدوج ، p < 0.01) ، مما يوفر دليلا على اعتياد الفئران على حركة الباحث أثناء القياس. ومع ذلك ، أظهرت الإناث (ولكن ليس الذكور) استجابات تدريجية حيث كانت درجة الحرارة المقاسة من 5 دقائق إلى 15 دقيقة أقل مع تجارب التعود المتتالية (الشكل 3). عند ملاحظة الآثار الحادة للتحرك أو ارتفاع درجة الحرارة بعد خط الأساس ، تميل الفئران إلى الاستجابة بشكل أقل للنقل إلى غرفة الاختبار خلال تجارب التعود المتتالية (الملف التكميلي 1 ، تحليل التجربة).
تم اختبار الفئران WT البالغة المعتادة الموصوفة أعلاه باستخدام Oxt ، وهو عامل دوائي. أعطيت الفئران حقن داخل الصفاق (أي ، 2 ملغم / كغم) من Oxt أو مركبة (محلول ملحي معقم) بترتيب عشوائي ، وتم قياس درجات حرارة العضلات قبل الحركة إلى غرفة الاختبار وبعد 5 و 10 و 15 و 30 و 45 و 60 و 90 و 120 و 150 و 180 دقيقة من الحقن. تلقى كل فأر كلا العلاجين. كشف تحليل التباين المتكرر (ANOVA) عن تأثيرات رئيسية كبيرة ل Oxt والوقت ، حيث انخفض Oxt درجة حرارة العضلات بالنسبة للمركبة. انخفض Oxt درجة حرارة العضلات بالنسبة إلى خط الأساس بسرعة تصل إلى 5 دقائق بعد الحقن ، مع انخفاض أقصى شوهد بعد 30 دقيقة من الحقن (الشكل 4). تم تطبيع درجات حرارة العضلات لمدة 60 دقيقة بعد حقن Oxt (ثنائي الذيل ، اختبار t مقترن ، p > 0.10).
تم تعويد ذكور الفئران Sprague-Dawley البالغة (N = 4 ، العمر ~ 6 أشهر) المزروعة ثنائيا مع أجهزة الإرسال والاستقبال في gastrocnemius ثم تم اختبارها في قفص منزلي مع محفز PO (رائحة النمس). تم تسجيل قياسات خط الأساس ، وتم تقديم كل فأر مع PO في شكل منشفة. ثم تمت إزالة الرائحة بعد 10 دقائق من التعرض. تم أخذ قياسات متتالية قبل وبعد إزالة التحفيز. تشير هذه البيانات الأولية (الشكل 5) إلى أن الفموي له تأثير مستمر على توليد الحرارة للعضلات الهيكلية بعد إزالة التحفيز.
قيمت البيانات المنشورة سابقا تنشيط تهديد المفترس لتوليد الحرارة العضلي الهيكلي في ذكور الفئران البالغة Sprague-Dawley (العمر ~ 6 أشهر)8. تم تقديم الفئران مع أجهزة الإرسال والاستقبال الساقية الثنائية المزروعة برائحة مفترسة (النمس). تم أخذ القياسات في إعداد قفص منزلي (N = 8 ، الشكل 6A). كشفت هذه البيانات عن زيادة قوية في درجة الحرارة مقارنة بالتحكم في الروائح. لتحليل الاستجابات الحرارية المكروهة أو المجهدة لرائحة النمس ، تم تقديم ذكور الفئران (N = 7 ، الشكل 6B) برائحة مكروهة (حمض الزبد) ، أو رائحة جديدة (2-ميثيل بنزوكسازول) ، أو رائحة الثعلب ، أو مقيدة لمدة 1 دقيقة قبل الاختبار (الإجهاد المعتدل). تم أخذ القياسات في قفص منزلي على مدى فترة 2 ساعة. أظهر تحليل هذه البيانات أن رائحة النمس تنتج وتحافظ على تغيير قوي في توليد الحرارة مقارنة بجميع الظروف الأخرى. توفر هذه البيانات معا دليلا على التأثير الأدنى والعابر لرائحة التحكم على توليد الحرارة للعضلات الهيكلية.
الشكل 3: تحليل درجة حرارة العضلات أثناء التعود لاختبار درجة حرارة القفص المنزلي. اعتادت الفئران المزروعة من جانب واحد مع أجهزة الإرسال والاستقبال في الساق الأيمن على إجراء الاختبار. تم قياس الفئران في غرفة سكن الحيوانات ، "قبل التحرك" ، في غرفة الاختبار ، "بعد التحرك" ، بعد التأقلم لمدة 1-2 ساعة ، "خط الأساس" ، ثم على التوالي أكثر من 1 ساعة. أجريت جميع المقارنات الإحصائية المبينة بين التجربة 1 والتجربة 4، * p < 0.05، ** p < 0.01 (t-test، N = 10)؛ † p < 0.05 ، †† p < 0.01 ، ‡ p < 0.001 تجربة التأثير الرئيسي (ANOVA ، N [التجارب] = 4). تعرض أشرطة الخطأ المعروضة الخطأ القياسي للمتوسط (SEM). الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 4: درجة حرارة العضلات أثناء التحفيز الدوائي للأوكسيتوسين في الفئران. أعطيت الفئران المعتادة، المزروعة من جانب واحد مع أجهزة الإرسال والاستقبال، 2 ملغم/كغم (i.p.) إما من الأوكسيتوسين أو السيارة (محلول ملحي معقم). لوحظت انخفاضات كبيرة في درجة حرارة العضلات في 5 دقائق بعد حقن الأوكسيتوسين وتطبيعها لمدة 60 دقيقة ، ** p < 0.01 ، *** p < 0.001 (اختبار t ثنائي الذيل ، N = 9). تعرض أشرطة الخطأ المعروضة الخطأ القياسي للمتوسط. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 5: توليد الحرارة برائحة المفترس في اختبار درجة حرارة قفص منزل الفئران. قياسات درجة الحرارة في الفئران مع أجهزة الإرسال والاستقبال المزروعة بشكل ثنائي في gastrocnemius بعد التعرض لرائحة المفترس (النمس) لمدة 10 دقائق. بعد التعرض لمدة 10 دقائق ، تمت إزالة المناشف التي تحتوي على التحفيز ، كما هو موضح بالسهم. حافظت الفئران على زيادة درجة الحرارة بعد 20 دقيقة من إزالة التحفيز. أكبر بكثير من درجة حرارة خط الأساس ، * p < 0.05 ، ** p < 0.01 ، *** p < 0.001 (اختبار t ، N = 4). تعرض أشرطة الخطأ المعروضة الخطأ القياسي للمتوسط. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 6: تؤدي رائحة النمس إلى ارتفاع سريع في درجة حرارة العضلات مقارنة بالسيطرة. (أ) ارتفعت درجة حرارة Gastrocnemius بشكل ملحوظ بعد رائحة المفترس (النمس) مقارنة بالتعرض للمراقبة في ذكور الفئران (اختبار t المزدوج ثنائي الذيل ، N = 8). (ب) لم تغير الروائح الجديدة أو المكروهة أو روائح الثعالب درجة حرارة العضلات بشكل كبير مقارنة بالمجموعة الضابطة. تغير درجة الحرارة الناجم عن الإجهاد المعتدل انخفض بسرعة بعد 5 دقائق. حافظت رائحة النمس على استجابة قوية ، مقارنة بالظروف الأخرى ، لكامل الاختبار (ANOVA ، N = 7). † p < 0.05 ، رائحة النمس > جميع الحالات الأخرى ؛ * P < 0.025 ، مقارنة النقاط بين رائحة النمس والإجهاد المعتدل مقابل رائحة التحكم. تم تعديل هذا الرقم بإذن من Gorrell et al.8. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الملف التكميلي 1: R تخفيض السعر لتحليل التعود الشكل 3 . يظهر ملف Markdown لتحليل التعود باستخدام رمز R أمثلة على طرق الترميز والطرق التي يمكن من خلالها فحص الجنس داخل البيانات. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يوفر بروتوكول اختبار درجة الحرارة هذا للحقل وسيلة لقياس توليد الحرارة للعضلات الهيكلية مباشرة. هذا أمر بالغ الأهمية حيث تتعمق الأبحاث في تحديد الآليات الكامنة وراء توليد الحرارة العضلي33. توفر الطريقة بروتوكولين فعالين من حيث التكلفة لقياس توليد الحرارة للعضلات الهيكلية في ظل الظروف السياقية والدوائية. يؤكد هذا البروتوكول على أهمية كل من التعود والتأقلم في هذه الإجراءات. يستخدم التعود لتقديم الاختبار الخاضع لإجراء الاختبار بشكل متكرر دون إدخال أي محفزات دوائية أو سياقية ؛ إنه عنصر حاسم في كل من اختبار درجة حرارة القفص المنزلي وجهاز المشي. هذا يعطي الوقت للحيوانات للتعرف على البيئة مع تقليل بروز السياق التجريبي. يمكن أن يؤدي حذف هذه الخطوة إلى ارتباطات متحيزة مع التحفيز التجريبي ، بالإضافة إلى استجابات حرارية مرتفعة للتحكم في المحفزات8. يجب أن تتعلم الحيوانات الإجراء لتقليل استجابات الإجهاد للحركة العامة والتلاعب المطلوب لاختبار الحيوانات بموجب هذه البروتوكولات. تقدم البيانات النموذجية التي تم جمعها دليلا على ضرورة التعود المتكرر (الشكل 3). في جهد مماثل ، يعد التأقلم في يوم الاختبار ضروريا لكل تجربة. التأقلم هو أداة استيعاب يومية ، مما يمنح الحيوانات وقتا للاسترخاء من ضغوط النقل إلى غرفة الاختبار. يمكن أن يؤدي تخطي التأقلم إلى قياسات غير دقيقة لدرجة حرارة خط الأساس ، والتفاعل مع أي تقييم لاحق.
هنا ، تم استخدام القياسات الحرارية للعضلات لإثبات التأثير المنخفض للحرارة ل Oxt داخل الصفاق على الفئران. كانت هذه النتيجة مفاجئة بالنظر إلى الأدلة التي تدعم دور Oxt المركزي في توليد الحرارة ، وعلى وجه التحديد ، في ارتفاع الحرارة الاجتماعي11,13. ومع ذلك ، فقد أظهر آخرون قدرة كل من Oxt و vasopressin على قمع درجة الحرارة الأساسية جنبا إلى جنب مع معدل ضربات القلب في الفئران ، وهي تأثيرات بوساطة مستقبل Avpr1a34. ولم يتم التوفيق بين هذه المفارقة الظاهرة. من الممكن أن تنبع قدرة Oxt على زيادة أو تقليل درجة الحرارة في سياقات مختلفة من العمل المركزي مقابل المحيطي ل Oxt أو من طول التعرض13،35،36،37. بغض النظر ، هنا ، نوضح أن درجة حرارة عضلات الفأر تظهر انخفاضا كبيرا في درجة الحرارة بسرعة بعد حقن Oxt المحيطي (الشكل 4) ، بما يتفق مع التغيرات في درجة حرارة الفئران الأساسية التي أبلغ عنها Hicks et al. (2014) 33.
وفقا لتوقعات المعهد الوطني للصحة (NIH) بأن الباحثين يأخذون في الاعتبار الجنس كمتغير بيولوجي ، يتم قياس توليد الحرارة العضلية في الذكور والإناث في كل من الفئران والجرذان. يمكن مقارنة بيانات توليد الحرارة من الذكور والإناث ، على الرغم من أن الدراسات السابقة والحالية فشلت في تحديد الاختلافات الجنسية القوية في توليد الحرارة السياقي والتباين عبر الدورة الشحمية في إناث الفئران8. أحد الاستثناءات هو الاختلاف الواضح بين الجنسين في درجة حرارة العضلات عند خط الأساس وبعد النقل إلى منطقة الاختبار ، خاصة قبل التعود8. قد ينبع هذا من الاختلافات في الحركة بعد النقل ، حيث أن إناث الفئران لديها استجابة حركية أعلى لبعض المحفزات المجهدة مقارنة بالذكور ، والتي يمكن فصلها عن مقاييس القلق الأساسية38. هذا يؤكد الحاجة إلى التعود المتكرر على السياق التجريبي ، في هذه الحالة ، لتجنب تحريف اختلاف الجنس في توليد الحرارة الذي قد يعزى إلى التحفيز التجريبي بدلا من الاختلافات الأساسية في استجابة الإجهاد.
الطريقة الأساسية لاختبار درجة الحرارة داخل أقفاص الحيوانات المنزلية لها بعض القيود ، أحدها هو التحكم في مستويات النشاط المتغيرة. قد يكون هذا أمرا بالغ الأهمية لأن زيادة النشاط يؤدي إلى زيادة درجة حرارة العضلات. لمعالجة هذا ، تم تحديد إجراء للمشي على الفئران والجرذان. يقلل التحكم في حركة الحيوان من احتمالية تأثير النشاط على درجة الحرارة ، مع مراعاة الاختلافات في توليد الحرارة المقلص. بينما يمكن إكمال المشي على جهاز المشي كاختبار منفرد ، يمكن استخدام هذه الطريقة جنبا إلى جنب مع تقييم درجة حرارة القفص المنزلي. يوفر التحليل المشترك مزيدا من الأدلة على التأكيدات على أن التغيرات في درجة حرارة العضلات الهيكلية تنبع من المحفزات الدوائية أو السياقية بدلا من التغيرات في النشاط الناتجة عن هذه المحفزات8،14،15. بالإضافة إلى ذلك ، هذه الطريقة محدودة من حيث أنها غازية بشكل معتدل ، والتي لا تلبي حاجة بعض الدراسات البحثية. ومع ذلك ، لا تتطلب هذه الطريقة سوى عملية جراحية واحدة ، مما يسمح للباحثين بتجنب التلاعب المستمر بالحيوانات أثناء الاختبار مع الحفاظ على خصوصية القياسات. علاوة على ذلك ، فإن الحجم المتاح حاليا لجهاز الإرسال والاستقبال IPTT-300 لا يسمح بوضع جهاز الإرسال والاستقبال مباشرة داخل ساق الماوس. يمكن إكمال ذلك داخل نماذج الفئران بسبب حجمها الأكبر. توفر هذه الطريقة آلية قياس مجاورة للعضلة محل الاهتمام ؛ ومع ذلك ، فإن الإصدارات المعاد تشكيلها أو الأصغر من أجهزة الإرسال والاستقبال القادرة على قياس درجة الحرارة ستكون رصيدا كبيرا للمجال والدراسات المستقبلية.
لقد منحنا الاستخدام الواسع للطريقة الموصوفة في برنامجنا البحثي الفرصة لإدارة التباين استجابة لزرع جهاز الإرسال والاستقبال وإجراءات الاختبار8،10،14،15. بعد زرع جهاز الإرسال والاستقبال ، يوصى بمراقبة درجات حرارة الحيوانات مباشرة بعد الجراحة وأثناء الشفاء. في حين أن هذا يعطي أولا نظرة ثاقبة لصحة الحيوان (على سبيل المثال ، درجة حرارة منخفضة بشكل غريب كعلامة على المرض أو الوفاة الوشيكة) ، فإنه يوفر أيضا دليلا على أن جهاز الإرسال والاستقبال لا يزال نشطا ومؤمنا في مكانه. قد يخدش الجرذ أو الفأر في موقع الشق ، مما قد يؤدي إلى سقوط جهاز الإرسال والاستقبال جزئيا أو كليا. امتثالا للإرشادات المؤسسية ، تعتبر هذه الجراحة بسيطة. لذلك ، في حالات وضع جهاز الإرسال والاستقبال من جانب واحد ، إذا فقد الماوس جهاز الإرسال والاستقبال الخاص به أو إذا لم يعد جهاز الإرسال والاستقبال الخاص بالماوس يعمل ، فيمكن تكرار الجراحة على طرف بديل. يوصى بوضع علامة (أي تحديد موضع جديد ، أو "R" للاستبدال) للإشارة إلى هذه الجراحة المتكررة التي لوحظت أثناء برمجة جهاز الإرسال والاستقبال كجزء من اسم تعريف الحيوان. علاوة على ذلك ، نظرا لأن الحيوانات لديها نطاق حر من قفصها ، فقد يواجه الباحثون صعوبة في العثور على الحيوان لأخذ القراءة. يقترح أن يستخدم الباحثون مرحلة التعود لممارسة القياسات وتقييم إعدادها. قد تشمل التعديلات زيادة عدد المجربين والماسحات الضوئية للمرسل المستجيب أو تقليل عدد الناهضين ، وبالتالي الحيوانات التي تم اختبارها في كل تجربة.
يوفر هذا البروتوكول تعليمات لقياس درجة الحرارة المباشرة للعضلات دون تحليل برامج إضافية ، مما يؤدي إلى وسيلة مجدية ومنخفضة التكلفة نسبيا للدراسات التي تستخدم فيها كاميرات الأشعة تحت الحمراء عادة. علاوة على ذلك ، يتيح هذا الإجراء جمع البيانات التي تسد الفجوة التي لاحظتها بعض الدراسات التي تسعى إلى ربط التغيرات الجينية أو البروتينية بتوليد الحرارة العضلي37. بشكل عام ، يتم تسهيل الاهتمام المتزايد بتوليد الحرارة العضلي وآلياته من خلال التقييم المباشر للحرارة المتولدة في العضلات المستهدفة. يعالج الإجراء الموصوف مباشرة هذا الفراغ المنهجي داخل المجال من خلال توفير آلية لدراسة العضلات الهيكلية لكل من الفئران والجرذان.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
يعلن المؤلفون أنه ليس لديهم تضارب في المصالح.
Acknowledgments
هذا العمل مدعوم من قبل R15 DK097644 و R15 DK108668. نشكر الدكتورة شيتانيا ك. جافيني والدكتورة ميغان ريتش على مساهماتهما السابقة والدكتور ستانلي دانيميلر لضمان امتثالنا لإرشادات الاستخدام المؤسسي للحيوانات. شكر خاص للدكتور تيم بارتنيس على تقديم البحوث الأساسية اللازمة لبناء هذه الطريقة والدراسات المرتبطة بها. تم إنشاء الأشكال 1A و C و D والشكل 2A باستخدام Biorender.com.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1012M-2 Modular Enclosed Metabolic Treadmill for Mice, 2 Lanes w/ Shock | Columbus Instruments | ||
| 1012R-2 Modular Enclosed Metabolic Treadmill for Rats, 2 Lanes w/ Shock | Columbus Instruments | ||
| 1-1/4 in. Ratcheting PVC Cutter | BrassCraft | ||
| 1 mL Syringes | Fisher Scientific | BD 309659 | |
| Betadine Swabs | Fisher Scientific | 19-898-945 | |
| Booster Coil | BioMedic Data Systems | Transponder Accessory | |
| Electric Clippers | Andis | 40 Ultraedge Clipper Blade | |
| Flexible Mirror Sheets | Amazon | Self Adhesive Non Glass Mirror Tiles | |
| Forceps | Fisher Scientific | 89259-940 | |
| Heating Pad | |||
| Induction Chamber (isoflurane) | Kent Scientific | VetFlo-0730 | 3.0 L Low Cost Chambers for Traditional Vaporizers |
| Ketoprophen | Med-Vet Intl. | RXKETO-50 | |
| Magnetic Strips | Amazon | ||
| Magnets | Amazon | DIYMAG Magnetic Hooks 40lbs | |
| Needles | Med-Vet Intl. | 26400 | |
| Neomycin/Polymixin/Bacitracin with Hydrocortisone Ophthalmic Ointment, 3.5 g | Med-Vet Intl. | RXNPB-HC | |
| Oasis Absorbable Suture | Med-Vet Intl. | MV-H821-V | |
| Predator (Ferret) Odor Towels | Marshall BioResources | ||
| PVC pipe | |||
| Reflex Wound Clip Remover | CellPoint Scientific | ||
| Reflex Wound Clip, 7 mm (mouse) | CellPoint Scientific | ||
| Reflex Wound Clip, 9 mm (rat) | CellPoint Scientific | ||
| Srerile Autoclip, 7 mm (mouse) | CellPoint Scientific | Wound Clip Applier (mouse) | |
| Stainless Strainers Interval Seasonings Tea Infuser | Amazon | ||
| Sterile Autoclip, 9 mm (rat) | CellPoint Scientific | Wound Clip Applier (rat) | |
| Sterile Saline | Med-Vet Intl. | RX0.9NACL-10 | |
| Surgical Scissors | Fisher Scientific | 08-951-5 | |
| Surgical Sheets | |||
| Towels (Control/Habituation) | Amazon | 100% Cotton Towels, white | |
| Transponders | BioMedic Data Systems | Model: IPTT-300 | |
| Transponders Reader | BioMedic Data Systems | Model: DAS-8027-IUS/ DAS-7007R | |
| Versaclean | Fisher Scientific | 18-200-700 | liquid detergent |
| Webcol Alcohol Preps | Covidien | 22-246-073 | |
| Wedge pieces for PVC pipe |
References
- Periasamy, M., Herrera, J. L., Reis, F. C. G. Skeletal muscle thermogenesis and its role in whole body energy metabolism. Diabetes Metabolism Journal. 41 (5), 327-336 (2017).
- Rowland, L. A., Bal, N. C., Periasamy, M. The role of skeletal-muscle-based thermogenic mechanisms in vertebrate endothermy. Biological Reviews of the Cambridge Philosophical Society. 90 (4), 1279-1297 (2015).
- Maurya, S. K., et al. Sarcolipin is a key determinant of the basal metabolic rate, and its overexpression enhances energy expenditure and resistance against diet-induced obesity. Journal of Biological Chemistry. 290 (17), 10840-10849 (2015).
- Grigg, G., et al. Whole-body endothermy: Ancient, homologous and widespread among the ancestors of mammals, birds and crocodylians. Biological Reviews of the Cambridge Philosophical Society. 97 (2), 766-801 (2022).
- Franck, J. P. C., Slight-Simcoe, E., Wegner, N. C. Endothermy in the smalleye opah (Lampris incognitus): A potential role for the uncoupling protein sarcolipin. Comparative Biochemistry and Physiology - Part A: Molecular & Integrative Physiology. 233, 48-52 (2019).
- Nowack, J., et al. Muscle nonshivering thermogenesis in a feral mammal. Scientific Reports. 9, 6378 (2019).
- Oliver, S. R., Anderson, K. J., Hunstiger, M. M., Andrews, M. T. Turning down the heat: Down-regulation of sarcolipin in a hibernating mammal. Neuroscience Letters. 696, 13-19 (2019).
- Gorrell, E., et al. Skeletal muscle thermogenesis induction by exposure to predator odor. The Journal of Experimental Biology. 223, Pt 8 (2020).
- Gavini, C. K., et al. Leanness and heightened nonresting energy expenditure: Role of skeletal muscle activity thermogenesis. The American Journal of Physiology - Endocrinology and Metabolism. 306 (6), 635-647 (2014).
- Almundarij, T. I., Gavini, C. K., Novak, C. M. Suppressed sympathetic outflow to skeletal muscle, muscle thermogenesis, and activity energy expenditure with calorie restriction. Physiological Reports. 5 (4), 13171 (2017).
- Harshaw, C., Lanzkowsky, J., Tran, A. D., Bradley, A. R., Jaime, M. Oxytocin and 'social hyperthermia': Interaction with beta3-adrenergic receptor-mediated thermogenesis and significance for the expression of social behavior in male and female mice. Hormones and Behavior. 131, 104981 (2021).
- Caldwell, H. K. Oxytocin and vasopressin: Powerful regulators of social behavior. The Neuroscientist. 23 (5), 517-528 (2017).
- Harshaw, C., Leffel, J. K., Alberts, J. R. Oxytocin and the warm outer glow: Thermoregulatory deficits cause huddling abnormalities in oxytocin-deficient mouse pups. Hormones and Behavior. 98, 145-158 (2018).
- Gavini, C. K., Britton, S. L., Koch, L. G., Novak, C. M. Inherently lean rats have enhanced activity and skeletal muscle response to central melanocortin receptors. Obesity. 26 (5), 885-894 (2018).
- Gavini, C. K., Jones, W. C., Novak, C. M. Ventromedial hypothalamic melanocortin receptor activation: regulation of activity energy expenditure and skeletal muscle thermogenesis. The Journal of Physiology. 594 (18), 5285-5301 (2016).
- Zaretsky, D. V., Romanovsky, A. A., Zaretskaia, M. V., Molkov, Y. I. Tissue oxidative metabolism can increase the difference between local temperature and arterial blood temperature by up to 1.3(o)C: Implications for brain, brown adipose tissue, and muscle physiology. Temperature. 5 (1), 22-35 (2018).
- Yoo, Y., et al. Exercise activates compensatory thermoregulatory reaction in rats: A modeling study. Journal of Applied Physiology. 119 (12), 1400-1410 (2015).
- Langer, F., Fietz, J. Ways to measure body temperature in the field. Journal of Thermal Biology. 42, 46-51 (2014).
- Pence, S., et al. Central apolipoprotein A-IV stimulates thermogenesis in brown adipose tissue. International Journal of Molecular Sciences. 22 (3), 1221 (2021).
- Li, D., et al. Homeostatic disturbance of thermoregulatory functions in rats with chronic fatigue. Journal of Neuroscience Research. 165, 45-50 (2021).
- Carlier, J., et al. Pharmacodynamic effects, pharmacokinetics, and metabolism of the synthetic cannabinoid AM-2201 in male rats. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 367 (3), 543-550 (2018).
- Pato, A. M., Romero, D. M., Sosa Holt, C. S., Nemirovsky, S. I., Wolansky, M. J. Use of subcutaneous transponders to monitor body temperature in laboratory rats. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 114, 107145 (2022).
- Almeida, D. L., et al. Lean in one way, in obesity another: Effects of moderate exercise in brown adipose tissue of early overfed male Wistar rats. International Journal of Obesity. 46 (1), 137-143 (2022).
- Brito, M. N., Brito, N. A., Baro, D. J., Song, C. K., Bartness, T. J. Differential activation of the sympathetic innervation of adipose tissues by melanocortin receptor stimulation. Endocrinology. 148 (11), 5339-5347 (2007).
- Vaughan, C. H., Shrestha, Y. B., Bartness, T. J. Characterization of a novel melanocortin receptor-containing node in the SNS outflow circuitry to brown adipose tissue involved in thermogenesis. Brain Research. 1411, 17-27 (2011).
- Kort, W. J., Hekking-Weijma, J. M., TenKate, M. T., Sorm, V., VanStrik, R. A microchip implant system as a method to determine body temperature of terminally ill rats and mice. Laboratory Animals. 32 (3), 260-269 (1998).
- Mei, J., et al. Body temperature measurement in mice during acute illness: Implantable temperature transponder versus surface infrared thermometry. Scientific Reports. 8, 3526 (2018).
- Warn, P. A., et al. Infrared body temperature measurement of mice as an early predictor of death in experimental fungal infections. Laboratory Animals. 37 (2), 126-131 (2003).
- Hargreaves, K., Dubner, R., Brown, F., Flores, C., Joris, J. A new and sensitive method for measuring thermal nociception in cutaneous hyperalgesia. Pain. 32 (1), 77-88 (1988).
- Fiebig, K., Jourdan, T., Kock, M. H., Merle, R., Thone-Reineke, C. Evaluation of infrared thermography for temperature measurement in adult male NMRI nude mice. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 57 (6), 715-724 (2018).
- Franco, N. H., Geros, A., Oliveira, L., Olsson, I. A. S., Aguiar, P. ThermoLabAnimal - A high-throughput analysis software for non-invasive thermal assessment of laboratory mice. Physiology & Behavior. 207, 113-121 (2019).
- Koganti, S. R., et al. Disruption of KATP channel expression in skeletal muscle by targeted oligonucleotide delivery promotes activity-linked thermogenesis. Molecular Therapy. 23 (4), 707-716 (2015).
- Bal, N. C., Periasamy, M. Uncoupling of sarcoendoplasmic reticulum calcium ATPase pump activity by sarcolipin as the basis for muscle non-shivering thermogenesis. Philosophical Transactions of the Royal Society B. 375 (1793), 20190135 (2020).
- Hicks, C., et al. Body temperature and cardiac changes induced by peripherally administered oxytocin, vasopressin and the non-peptide oxytocin receptor agonist WAY 267,464: a biotelemetry study in rats. British Journal of Pharmacology. 171 (11), 2868-2887 (2014).
- Kasahara, Y., et al. Oxytocin receptor in the hypothalamus is sufficient to rescue normal thermoregulatory function in male oxytocin receptor knockout mice. Endocrinology. 154 (11), 4305-4315 (2013).
- Kasahara, Y., et al. Role of the oxytocin receptor expressed in the rostral medullary raphe in thermoregulation during cold conditions. Frontiers in Endocrinology. 6, 180 (2015).
- Yuan, J., Zhang, R., Wu, R., Gu, Y., Lu, Y. The effects of oxytocin to rectify metabolic dysfunction in obese mice are associated with increased thermogenesis. Molecular and Cellular Endocrinology. 514, 110903 (2020).
- Scholl, J. L., Afzal, A., Fox, L. C., Watt, M. J., Forster, G. L. Sex differences in anxiety-like behaviors in rats. Physiology & Behavior. 211, 112670 (2019).
