Summary
עכברים וחולדות מושתלים בניתוח במשדרי טמפרטורה מרוחקים ולאחר מכן מורגלים לסביבת הבדיקה ולהליך. שינויים בטמפרטורת השרירים נמדדים בתגובה לגירויים פרמקולוגיים או קונטקסטואליים בכלוב הביתי או במהלך פעילות גופנית שנקבעה (כלומר, הליכה על הליכון במהירות קבועה).
Abstract
תרמוגנזה של שרירי השלד מספקת אפיק פוטנציאלי להבנה טובה יותר של הומאוסטזיס מטבולי והמנגנונים העומדים בבסיס הוצאת האנרגיה. באופן מפתיע, מעטות הראיות הקיימות כדי לקשר את המנגנונים העצביים, המיוצלולריים והמולקולריים של תרמוגנזה ישירות לשינויים הניתנים למדידה בטמפרטורת השרירים. מאמר זה מתאר שיטה שבה משדרי טמפרטורה משמשים לאחזור מדידות ישירות של טמפרטורת שרירי השלד של עכברים וחולדות.
משדרים מרוחקים מושתלים בניתוח בתוך שריר של עכברים וחולדות, ולבעלי החיים ניתן זמן להתאושש. לאחר מכן יש להרגיל שוב ושוב עכברים וחולדות לסביבת הבדיקה ולנוהל. שינויים בטמפרטורת השרירים נמדדים בתגובה לגירויים פרמקולוגיים או קונטקסטואליים בכלוב הביתי. ניתן למדוד את טמפרטורת השרירים גם במהלך פעילות גופנית שנקבעה (כלומר, הליכה על הליכון במהירות קבועה) כדי לקחת בחשבון את השינויים בפעילות כתורמים לשינויים בטמפרטורת השרירים המושרים על ידי גירויים אלה.
שיטה זו שימשה בהצלחה להבהרת מנגנונים העומדים בבסיס השליטה התרמוגנית בשרירים ברמת המוח, מערכת העצבים הסימפתטית ושרירי השלד. מסופקות הדגמות של הצלחה זו באמצעות ריח טורף (PO; ריח חמוס) כגירוי הקשרי וזריקות של אוקסיטוצין (Oxt) כגירוי פרמקולוגי, שבו ריח טורף משרה תרמוגנזה של שרירים, ו- Oxt מדכא את טמפרטורת השריר. לפיכך, מערכי נתונים אלה מציגים את היעילות של שיטה זו באיתור שינויים מהירים בטמפרטורת השרירים.
Introduction
במסגרת המחקר המטבולי, בחינת התרמוגנזה של שרירי השלד היא אפיק חדש ומבטיח לחקר הומאוסטזיס של משקל הגוף. הספרות שפורסמה תומכת ברעיון שהתגובות התרמוגניות של אחת ממערכות האיברים הגדולות בגוף – שרירי השלד – מספקות דרך להגדלת ההוצאה האנרגטית והשפעות מטבוליות אחרות, ובכך למעשה מאזנות מחדש מערכות בתוך מחלות כמו השמנת יתר 1,2,3. אם השריר יכול להיחשב איבר תרמוגני, המחקרים חייבים להשתמש במתודולוגיה מעשית כדי לחקור שינויים תרמוגניים בתוך איבר זה. הרצון להבין את ההשפעה האנדותרמית של שרירי השלד והתועלת של מתודולוגיה זו לחקר תרמוגנזה של שרירים שאינם רועדים אינם ספציפיים למחקרים מטבוליים. דיסציפלינות הכוללות אבולוציה4, פיזיולוגיה השוואתית5 ואקופיזיולוגיה 6,7 הראו עניין רב בהבנת הדרכים שבהן תרמוגנזה של שרירים עשויה לתרום לאנדותרמיה וכיצד מנגנון זה מסתגל לסביבה. הפרוטוקול המוצג מספק את השיטות הקריטיות הדרושות כדי להתמודד עם שאלות אלה.
השיטה המסופקת יכולה לשמש בהערכת אפנון גירויים הקשריים ופרמקולוגיים של טמפרטורת השרירים, כולל הטכניקה הייחודית של מתן ריח טורף (PO) כדי לשנות את ההקשר כדי לשכפל איום טורף. דיווחים קודמים הדגימו את היכולת של PO לגרום במהירות לעלייה ניכרת בתרמוגנזה של השרירים8. יתר על כן, גירויים פרמקולוגיים יכולים גם לשנות את טמפרטורת השרירים. זה הוכח בהקשר של תרמוגנזה שרירית המושרה על ידי PO, שבה חסימה פרמקולוגית של קולטני β-אדרנרגיים היקפיים, באמצעות nadolol, עיכבה את היכולת של PO לגרום לתרמוגנזה של שרירים מבלי להשפיע באופן משמעותי על תרמוגנזה מתכווצת במהלך הליכוןהליכה 8. מתן מרכזי של אגוניסטים לקולטני מלנוקורטין בחולדות שימש גם להבחנה במנגנונים מוחיים המשנים תרמוגנזה 9,10.
להלן חקירה ראשונית של יכולתו של הנוירוהורמון אוקסיטוצין (Oxt) לשנות את התרמוגנזה של השרירים בעכברים. בדומה לאיום על טורפים, מפגשים חברתיים עם אוכלוסייה חד-מינית מעלים את טמפרטורת הגוף, תופעה המכונה היפרתרמיה חברתית11. בהתחשב ברלוונטיות של Oxt להתנהגות חברתית12, הועלתה השערה כי Oxt הוא מתווך של היפרתרמיה חברתית בעכברים. ואכן, אנטגוניסט של קולטן אוקסיטוצין מפחית היפרתרמיה חברתית בעכברים11, וגורי עכברים ללא Oxt מראים ליקויים בהיבטים התנהגותיים ופיזיולוגיים של ויסות תרמי, כולל תרמוגנזה13. בהתחשב בכך ש- Harshaw et al. (2021) לא מצאו ראיות התומכות בתרמוגנזה של רקמת שומן חום תלוית קולטן אדרנרגי β3 (BAT) עם היפרתרמיה חברתית11, הועלתה ההנחה כי היפרתרמיה חברתית עשויה להיות מונעת על ידי אינדוקציה של Oxt של תרמוגנזה של שרירים.
כדי למדוד תרמוגנזה של שרירי השלד, הפרוטוקול הבא משתמש בהשתלת משדרי IPTT-300 מתוכנתים מראש הסמוכים לשריר העניין בתוך עכבר או חולדה 8,10,14,15. משדרים אלה הם שבבים עטופים בזכוכית הנקראים באמצעות קוראי משדרים מתאימים. מעט מאוד מחקרים השתמשו בטכנולוגיה זו בתפקיד זה, אם כי מחקרים הצביעו על צורך בספציפיות שמספקת שיטה זו16,17. מחקרים קודמים הראו את האמינות של שיטה זו ומגוון דרכים שבהן ניתן להשתמש במשדרי טמפרטורה בהשוואה לשיטות בדיקת טמפרטורהאחרות 18 או בשילוב עם שיטות כירורגיות (למשל, cannulation19). עם זאת, מחקרים מסוג זה מסתמכים על מיקומים אסטרטגיים שונים כדי למדוד את טמפרטורת הגוף הכוללת 20,21,22 או רקמות מוגדרות כגון BAT23,24,25.
במקום למדוד טמפרטורה ממקומות אלה או תוך שימוש במדחומים אוזניים או רקטליים26, השיטה המתוארת כאן מספקת ספציפיות לשריר העניין. היכולת למקד אתר על ידי השתלה ישירה של משדרים הסמוכים לשרירים המעניינים יעילה יותר לבדיקת תרמוגנזה של שרירים באופן ספציפי. הוא מספק שדרה חדשה בנוסף לאלה המסופקים על ידי תרמומטריה אינפרא אדום פני השטח 27,28 או מדידות טמפרטורה עורית באמצעות thermocouple 29. יתר על כן, הנתונים המסופקים בשיטה זו מציעים מגוון אפיקי מחקר, תוך הימנעות מהצורך בציוד ותוכנות היי-טק גדולות ויקרות כגון תרמוגרפיה אינפרא אדומה30,31,32.
שיטה זו שימשה בהצלחה למדידת הטמפרטורה בקוואדריפס ובגסטרוקנמיוס, באופן חד צדדי או דו-צדדי. שיטה זו הייתה יעילה גם בשילוב עם ניתוחים סטריאוטקסיים14,15. בטווח של ~7-10 ס"מ מאיבר המשדר, קוראי משדרים ניידים (DAS-8027/DAS-7007R) משמשים לסריקה, מדידה והצגה של הטמפרטורה. מרחק זה היה קריטי ובעל ערך למחקרים קודמים 8,9,10 מכיוון שהוא ממזער גורמי עקה פוטנציאליים ומשתנים משני טמפרטורה כגון טיפול בבעלי חיים במהלך הליכי הניסוי. באמצעות טיימרים, ניתן להקליט ולאסוף את המדידות לאורך פרק זמן ללא אינטראקציה ישירה עם בעלי החיים.
כדי למזער עוד יותר את ההפרעה של עכברים במהלך הבדיקה, שיטה זו מתארת את ההרכבה והשימוש של הגבהות העשויות מצנרת PVC כדי לתת לנסיין גישה לתחתית הכלובים הביתיים במהלך הבדיקה. באמצעות ההגבהות יחד עם הקורא הדיגיטלי, ניתן לבצע מדידות טמפרטורה של איבר המשדר ללא כל אינטראקציה עם בעלי חיים לאחר מיקום הגירוי. בעלות מינימלית, ניתן להשתמש בשיטה זו בשילוב עם גירויים פרמקולוגיים והקשריים, מה שהופך אותה לנגישה למדי לחוקרים. בנוסף, ניתן להשתמש בשיטה זו עם מספר ניכר של נבדקים (~ 16 עכברים או ~ 12 חולדות) בכל פעם, ולחסוך זמן בהגדלת התפוקה הכוללת עבור כל פרויקט מחקר.
בשיטה זו מוצג מנגנון מעוצב להצגת ריחות לעכברים באמצעות כדורי תה מפלדת אל-חלד, המכונים מעתה "כדורי תה". למרות שכדורי התה האלה אידיאליים להכלת כל חומר ריח, במחקרים אלה, מגבות ששימשו כמצעים בכלוב במשך 2-3 שבועות לחמוסים, טורף טבעי של עכברים וחולדות, ממוקמות בתוך כל כדור תה טיפולי. כל מגבת חתוכה לריבועים בגודל 5X5 ס"מ. ציטוט זה חוזר על עצמו גם עם מגבות בקרה זהות ללא ריח. הצגת ריחות אלה ללא מחסום (כלומר, כדור תה) הובילה לכך שעכברים גורסים את הסיבים בתוך הכלובים שלהם, מה שמגביר את הפעילות הגופנית. התנהגות זו לא הייתה בולטת כל כך בחולדות. כדורי תה מספקים מעטפת מאווררת למגבת, ומעניקים גישה מלאה לריח תוך שמירה על הגנה במשך כל הניסוי הניסיוני. כדורי תה אלה ניתנים לחיטוי בהתאם לפרוטוקולי השימוש בבעלי חיים, מוכנים ומוצגים ישירות לאחר הניתוח כדי להתחיל להרגיל את בעלי החיים למבנה יחד עם גירוי הבקרה. עכברים יכולים לחיות עם ההעשרה הנוספת, מה שמקטין את הבולטות של הצגת הגירוי החריף.
הרגלה לנוכחות כדור התה היא רק היבט אחד של הרגלה שהוא קריטי לשיטה זו. פרוטוקול ההרגלה המתואר מורכב גם מחשיפה חוזרת ונשנית להליך הבדיקה כדי לנרמל את סביבת הבדיקה (כלומר, כוח אדם, תחבורה ותנועה למקום הבדיקה, חשיפה לגירוי). הרגלה ממושכת זו ממזערת תגובות ניואנסיות של בעלי החיים וממקדת את המדידות במשתנים התלויים הרצויים (למשל, גירויים פרמקולוגיים או הקשריים). הערכה קודמת של פרוטוקול זה זיהתה ארבעה ניסויים כמספר ההרגלים המינימלי הדרוש לפני בדיקת טמפרטורה בכלובים ביתיים בחולדות8. אם הניסויים מופרדים על ידי תקופות ארוכות (יותר מ 2-3 שבועות), בעלי החיים חייבים להיות רגילים שוב. עבור הרגלים חוזרים ונשנים, מספיק מינימום של ניסוי אחד עד שניים. עם זאת, אם בדיקות הטמפרטורה מופרדות על ידי התקפי זמן ממושכים יותר, ייתכן שיהיה צורך לחזור על ניסויים נוספים.
במאמץ המתמשך להרגיל עכברים וחולדות להליך הבדיקה, יש לכלול תקופת התאקלמות לפני הצגת הגירוי בכל ניסוי ניסיוני. זמן התאקלמות זה הוא קריטי לאיזון מחדש של הטמפרטורה והפעילות לאחר המעבר למקום הבדיקה. מכרסמים נוטים להיות עליות טמפרטורה חדות עקב טרנסלוקציה. התאקלמות צריכה להיות מורכבת ממינימום של 1 שעות ללא אינטראקציה מהנסיין ביום הבדיקה לפני כל תוספת של סוכן פרמקולוגי או גירויים הקשריים. זה הכרחי בכל יום של בדיקה.
בבדיקות הטמפרטורה של הכלוב הביתי, לעכברים יש את הטווח החופשי של הכלוב הביתי שלהם לשוטט בתגובה לגירוי שנבדק. זה יכול לגרום לשינויים משתנים בפעילות, להשפיע על הדיוק של קריאות הטמפרטורה, ולכן, ניתוח ההשפעות התרמוגניות של המשתנה הבלתי תלוי (למשל, גירוי פרמקולוגי או הקשרי). מתוך הכרה בשינויים הפוטנציאליים בטמפרטורה עקב רמת הפעילות, נכלל להלן פרוטוקול המתאר את השימוש בטמפרטורה במהלך הליכה על הליכון. הספרות שפורסמה מתארת את השימוש המוצלח בהליך זה בחולדות, והוא משמש כיום עם עכברים 8,10,14,15. הליכה על הליכון שומרת על מהירות קבועה של פעילות עבור הנבדק. במחקר זה, הליכונים משמשים אך ורק לשליטה ברמת הפעילות, ולכן הם מוגדרים למהירות הנמוכה ביותר הזמינה על ההליכון כדי לקדם הליכה לעכברים והגדרה נמוכה דומה לחולדות.
ההליך הבא מתואר למדידת הטמפרטורה של גסטרוקנמיוס חד-צדדי בעכברים והצגת ריח טורף. העיצוב יכול לשמש בשילוב עם חומרים פרמקולוגיים והוא ניתן להעברה לחולדות ולקבוצות שרירי שלד אחרות (כלומר, quadriceps) בעכברים. עבור חולדות, משדרים יכולים להיות ממוקמים gastrocnemius דו צדדית ברקמת שומן חום. בשל מגבלות גודל ומרחק, ניתן להשתמש במשדר אחד בלבד לכל עכבר. ניתן לבצע שינויים קלים (למשל, הסרת גירויים הקשריים) כדי להעריך תגובות תרמוגניות לסוכנים פרמקולוגיים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ניתן ליישם שיטות אלה הן על מודלים של חולדות והן על עכברים והן בוצעו באישור מוסדי (אוניברסיטת קנט סטייט, אישור IACUC #359 ו- #340 CN 12-04). לפני יישום הפרוטוקול, יש לשכן בעלי חיים בהתאם למדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה.
1. הכנת קורא המשדרים
הערה: לפני השימוש, יש להגדיר את קורא המשדר; השלבים הבאים כוללים רק את שינויי ההגדרות הדרושים למחקר זה. חלק זה של הפרוטוקול משויך ישירות לקוראים הניידים DAS-8027-IUS; מודלים אחרים של הקוראים צריכים לעקוב אחר ההוראות המסופקות על-ידי המדריך כדי להשיג תוצאות תכנות.
- הגדר את צפצוף השמע למצב כבוי.
- הפעל את ההתקן על-ידי לחיצה על לחצן SCAN והמתן עד שהתאורה תופיע בתצוגת ה-OLED. לחץ והחזק את הלחצן BACK/MENU כדי להגיע למסך התפריט .
- באמצעות הלחצן NEXT/ENTER , גלול בין האפשרויות עד להגדרה תפעולית. כאן, החלף את החצים למעלה או למטה כדי להפוך את כן ולפתוח את תפריט המשנה התפעולי.
- באמצעות הבא /ENTER לחצן, גלול אל AUDIO BEEP. כאשר הגדרת ברירת המחדל היא מופעל, החלף את החצים למעלה או למטה ושנה את ההגדרה למצב כבוי.
- לחץ על הלחצן NEXT/ENTER כדי לשמור שינוי הגדרה זה.
- הגדר רטט בעת קריאה למצב מופעל.
- בצע את שלב 1.1 עד שלב 1.2 או השלם את השלב הבא מיד לאחר שלב 1.4.
- באמצעות הלחצן הבא/ENTER, גלול אל רטט עם הקריאה. מכיוון שהגדרת ברירת המחדל היא OFF, החלף את החצים למעלה ולמטה ושנה את ההגדרה ל- ON כדי להרגיש, באמצעות רטט, כאשר הקריאה הושלמה ללא קשר ליכולת להציג את המסך.
2. משדרי תוכנית
הערה: כל משדר מושתל צריך להיות מתוכנת תחילה עם זיהוי בעל חיים (מזהה בעל חיים או מזהה משדר). מינוח זה יכול לשמש כזיהוי משני עבור הנבדק (למשל, ארבע ספרות לקיצור זן עכבר, מיקום המשדר, ושלוש עד ארבע ספרות נוספות לציון מספר בעלי חיים). ניתן להשלים את התכנות ימים לפני הניתוח תוך שמירה על סטריליות המשדרים לפני הניתוח.
- הזן את קוד הזיהוי במשדר.
- החל סליל מאיץ על ראש הקורא - אביזר ספציפי עבור דגם DAS 8027-IUS, המסייע בהליך התכנות.
- בעזרת יד עם כפפות, הניחו את המשדר (בתוך המוליך) לתוך סליל המאיץ.
- הפעל את ההתקן על ידי לחיצה על כפתור הסריקה והמתן עד שצג ה-OLED יידלק. לחץ והחזק את הלחצן BACK/MENU כדי להגיע למסך התפריט .
- באמצעות הלחצן NEXT/ENTER, גלול בין האפשרויות עד ל- WRITE TRANSPONDER ID. כאן, החלף את החצים למעלה או למטה כדי להפוך את כן.
- באמצעות הלחצן הבא/ENTER , עבור למצב הזן קוד מזהה.
- השתמש במקשי החצים למעלה ולמטה כדי לגלול בין מספרים ואותיות. הקש NEXT/ENTER לאחר כל בחירת תו כדי לעבור לתו הבא.
- לאחר השלמת קוד הזיהוי, לחץ על SCAN כדי לכתוב את המשדר.
- הסר את המשדר מסליל המאיץ וחזור על הפעולה לפי הצורך. בדקו שהמשדר קורא את שינויי הטמפרטורה על ידי חימום המשדרים הסגורים בין ידיים עם כפפות ומדידה באמצעות סורק הטמפרטורה.
הערה: ניתן להגדיר את ההגדרות ' כתיבה אוטומטית מרובה ' ו'ספירה רציפה ' למצב 'פועל ' כדי לאפשר תיכנות של משדרים מרובים או רציפים במהלך הפעלה. כל משדר צריך להיבדק במהלך התכנות.
3. הכינו "כדורי כלוב ביתיים"
- הכניסו לכדור תה מגבת בגודל 5X5 ס"מ נטולת ריח/קונטרול.
- הניחו את כדורי הכלוב הביתי בכלובים ביתיים חדשים לאחר הניתוח כדי להתחיל להרגיל את בעל החיים לשיטה שבה יוצגו הגירויים ההקשריים במהלך הבדיקה. החלף את כדורי הכלוב הביתיים האלה כל שבועיים.
4. ניתוח וטיפול לאחר הניתוח
- לשקול ולתעד את משקל הגוף של הנבדקים לפני הניתוח. באמצעות תא אינדוקציה, לספק הרדמה (למשל, 2-5% isoflurane) לבעל החיים.
- באמצעות קוצץ חשמלי, לגלח לחלוטין את הגפה האחורית. מתן משככי כאבים (למשל, 5 מ"ג/ק"ג של קטופרופן, s.c.) בהתאם להנחיות המוסדיות.
הערה: ייתכן שיהיה צורך במשכך כאבים נוסף אם הליך זה משולב עם שיטות כירורגיות אחרות. - נקו את האזור עם 70% אלכוהול (או מגבון אלכוהול סטרילי זמין מסחרית) ושטיפת פובידון-יוד (או ספוגיות בטאדין סטריליות, עטופות בנפרד) הזמינות מסחרית לסירוגין לפחות שלוש פעמים, ומסתיימות בפובידון-יוד.
- החזירו את החיה לחדר האינדוקציה, והרדימו את החיה לרמות כירורגיות. לאחר מכן, הגדר את העכבר במסכת פנים להמשך חשיפה להרדמה. החל משחה אופתלמית neomycin על העיניים של החיה כדי למנוע יובש בזמן הרדמה.
הערה: ההליך לא אמור להתחיל עד שהעכבר לא מראה שום עדות לקליטת כאב (כלומר, רפלקס הקרנית, תגובת צביטה בזנב, רפלקס צביטה בבוהן). - באמצעות מספריים כירורגיים בלבד, לבצע חתך רדוד דרך העור על הגפה האחורית הימנית.
- בתנועה מקבילה לגסטרוקנמיוס, מניחים את הקצה החד של משדר סטרילי מתוכנת מראש ולא מתוכנת לתוך החתך. ודא שהבוכנה הירוקה פונה כלפי מעלה ונראית לעין. המשך לדחוף את המוליך המשדר לתוך החתך עד שפתח המוליך המשדר אינו נראה עוד.
הערה: אין ללחוץ בטעות על הבוכנה הירוקה במוליך המשדר במהלך שלב 4.6. פריקה מוקדמת של המשדר תוביל למיקום לא תקין. - סובב את המוליך ב-180°, וכתוצאה מכך הבוכנה הירוקה פונה כלפי מטה לכיוון איבר העכבר, ואינה נראית עוד לנסיין. דחפו את המוליך המשדר למיקום הסופי. ברגע שהוא נמצא במיקום אידיאלי, סמוך לגסטרוקנמיוס או סגור חלקית בו, יש לדחוף את הבוכנה הירוקה, מה שמאפשר ללחץ של המוליך להנחות את ידו של החוקר הרחק מהעכבר.
- בעזרת מלקחיים, החזיקו יחד את העור הפתוח והניחו קליפס פצע עם אוטוקליפס סטרילי או תפר סטרילי. במידת הצורך, יש להשתמש בתפרים נספגים לפני האוטוקליפס הסטרילי כדי לסגור את שכבת החיתולית. באמצעות קורא המשדר, בדוק את הטמפרטורה של שריר העכבר.
- הוציאו את העכבר מההרדמה והניחו אותו בכלוב ביתי נקי הממוקם על גבי כרית חימום במחזור מים, המיועדת להתאוששות נמוכה . ודאו כי הכלוב הביתי כולל כדור תה עם מגבת חסרת ריח כדי להתחיל בהרגלה.
הערה: העכבר אמור להתעורר מניתוח תוך 15 דקות. ניתן להניח מזון בתחתית הכלוב לגישה נוחה במהלך ימי ההחלמה. - טיפול לאחר הניתוח
- תעד את משקלי העכבר ואת הטמפרטורות מדי יום באמצעות קורא משדרים למשך יומיים לפחות לאחר הניתוח או עד שהעכברים יחזרו או ייצבו את משקל הגוף.
- מתן משככי כאבים שאינם נרקוטיים (למשל, 5 מ"ג/ק"ג של קטופרופן, s.c.) פעם ביום לעכברים למשך יומיים לפחות לאחר הניתוח, עם מינונים נוספים הניתנים לפי הצורך.
הערה: עכברים וחולדות צריכים להתאושש באופן מלא תוך 5-8 ימים מהניתוח ויכולים לעבור הליכי הרגלה ובדיקה.
5. הכנה לבדיקה - כלוב ביתי
- בניית מגדלים
הערה: השלב הבא מבוסס על כלובים בגודל 194 מ"מ x 181 מ"מ x 398 מ"מ עם מסנן עכבר. כדי להתאים לכלובים גדולים יותר (למשל, כלוב ביתי של חולדות), יהיה צורך להתאים את הרוחב.- חתכו את צינור ה-PVC בעזרת חותך PVC מחגר לשמונה חלקים והרכיבו אותו בהתאם לאיור 1C. זה ייתן מבנה שולחן פתוח שיכול להכיל כארבעה כלובים. בצע את המספר הרצוי של risers.
- סידור החדר
- הקצה מיקום לכל riser בתוך חדר הבדיקה. הפרד את ההגבהים המוגדרים לקבלת גירויים הקשריים שונים (כלומר, ריחות) במינימום של 2 מ 'כדי להימנע ממשתנים מבלבלים.
הערה: לכל עכבר צריך להיות מיקום בדיקה מוקצה בתוך חדר הבדיקה ועל הגבהים הפיזיים ככל שניתן כדי למנוע פיתוח קשרים בין מיקומים שונים וגירויים תרמוגניים. - באמצעות פסים מגנטיים, הצמידו יריעות כירורגיות או חלוקים לרוחב ההגבהות, ויצרו מחסום חזותי בין החוקר לבין הנבדקים. הגדר מחסום זה כדי למזער את שינויי הטמפרטורה הנובעים מפעילות העכבר בעת צפייה בנסיינים הנעים לכיוון הכלוב או סביב חדר הבדיקה.
- (אופציונלי) הניחו מראות על המשטח מתחת להגבהות כדי להקל על הצפייה בתחתית הכלוב במהלך הבדיקה.
הערה: ניתן לחטא את הגבהים באמצעות מערכת שטיפת כלובים. יש לכבס בד או יריעות כירורגיות לפני ההרגלה והבדיקה.
- הקצה מיקום לכל riser בתוך חדר הבדיקה. הפרד את ההגבהים המוגדרים לקבלת גירויים הקשריים שונים (כלומר, ריחות) במינימום של 2 מ 'כדי להימנע ממשתנים מבלבלים.
- הכנת כדור תה
- הכינו כדורי תה עם שליטה ומגבות PO (כ-5X5 ס"מ). כדי למנוע זיהום צולב, הכינו תחילה כדורי תה עם ריח בקרה.
הערה: מגבות בעלות ריח של טורף צריכות לעבור בדיקת פתוגנים לפני השימוש. יש להכיל גם מגבות אלה, וחומרים המקיימים איתן אינטראקציה יש לחטא מיד (כלומר, שטיפת כלוב), ובכך למנוע חשיפה של הריח לבעלי חיים אחרים.
- הכינו כדורי תה עם שליטה ומגבות PO (כ-5X5 ס"מ). כדי למנוע זיהום צולב, הכינו תחילה כדורי תה עם ריח בקרה.
6. בדיקת טמפרטורה - כלוב ביתי
הערה: בעלי חיים צריכים להיות רגילים לכל הליך הניסוי, למעט גירויים קונטקסטואליים ניסיוניים או פרמקולוגיים. יש להשלים זאת לפחות פי 4 לפני הבדיקה.
- העבירו את בעלי החיים לחדר הניסויים המוכן. מקם את החיות במיקום שהוקצה מראש על ההגבהה. מיקום זה צריך להיות זהה לאורך כל נהלי ההרגלה והבדיקה.
- הסר את "כדור הכלוב הביתי" מכלוב הבית של העכבר וכסה מחדש את הכלובים במטלית או בסדין כירורגי. אפשרו לעכברים להתאקלם לחלל הבדיקה למשך 1-2 שעות.
- לאחר השלמת ההתאקלמות, השתמש בסורק כדי למדוד ולתעד את טמפרטורת הבסיס של כל נבדק. הימנעו ממניפולציה של כיסויי הבד במהלך המדידות.
הערה: ניתן ליישם סוכנים פרמקולוגיים כאן. ניתן להוסיף זמן המתנה לאחר ההזרקה או היישום לפי הצורך לפני הבדיקה. מומלץ להקליט בסיס משני ישירות לפני הבדיקה לאחר הוספת סוכן פרמקולוגי כדי לפקח על התגובה לגירויים פרמקולוגיים. אם תגובת הריח אינה נבדקת, מדידות הטמפרטורה של העכברים יכולות להתחיל מיד לאחר ההזרקה. יש להשתמש באקראיות בעת מתן גירויים כלשהם. - חשפו את הכלוב והניחו את כדור התה (קונטרול או PO) על רצפת הכלוב הביתי. החלף את מכסה הכלוב ואת כיסוי הבד.
- התחילו את שעון העצר. מדוד את הטמפרטורות של הנבדקים באותו סדר של מיקום כדורי תה. תעד טמפרטורות וזמן שעון של מדידות בעקבות נקודות הזמן הרצויות.
- בסיום הניסוי, הסר את כדור הטיפול. הניחו את העכברים שקיבלו PO בכלוב ביתי חדש עם "כדור הכלוב הביתי" המקורי. החזירו את "כדור הכלוב הביתי" לכלוב של העכברים שקיבלו ריח שליטה. העבירו את העכברים למיקום הדיור.
הערה: ניתן לתרגם את ההליך הנ"ל למודלים של חולדות בתוך כלובים בגודל מתאים. ייתכן שיידרשו התאמות למדידות המוצעות באיור 1C כדי לאפשר גישה טובה יותר לתחתית הכלוב הביתי.
איור 1: משדרים ובדיקת טמפרטורה בכלוב ביתי . (A) דיאגרמה של מיקום משדר חד-צדדי לבדיקת טמפרטורה בגסטרוקנמיוס עכבר. לאחר התכנות והמיקום, ניתן להשתמש בקורא המשדר (DAS-8027-IUS, מוצג) למדידת טמפרטורה. (B) משמאל, תמונה של כדור תה מנירוסטה עם רשת פתוחה ומגבת בגודל 5X5 ס"מ. מימין, כדור תה סגור, המשמש להחזקת מגבות הרגלה וריח בבדיקת כלובים ביתיים. (C) סכמת הגבהות הבנויה עם צנרת PVC לבדיקת כלובים ביתיים. (D) זרימת עבודה של פרוטוקול בדיקת כלובים ביתיים. (E) תמונות מתקן של אזור בדיקת כלובים ביתיים. משמאל, ארבעה כלובי עכברים על גבי מתרומם. פסים מגנטיים ממוקמים על הקיר הסמוך, ומגנטים ומטלית כירורגית נמצאים על השולחן. ימין, כלובי עכברים מכוסים על מגבהים. (A), (C) ו-(D) נוצרו עם Biorender.com. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
7. בדיקת טמפרטורה - הליכון הליכה
- הקצו לכל בעל חיים הליכון כמיקום שהוקצה לו לצורך הרגלה והליכי בדיקה.
- הכינו את ההליכונים לבדיקה, וודאו כי הזעזועים מתפקדים.
הערה: עבור הליכה על הליכון, יש להגדיר את ההליכונים בקצב הנמוך ביותר הזמין המקדם תנועה רציפה אך לא לרוץ הן לצורך התרגלות והן לצורך בדיקה. עבור הליכון מטבולי מודולרי מוקף 1012M-2, מדובר ב-5.2 מ'/דקה לעכברים ו-7 מ'/דקה לחולדות. ייתכן שיהיה צורך להתאים את הקצב הזה על סמך השמנת היתר של הנושא. יש להגדיר את הזעזועים לעוצמה ושיעור חזרות של 5.0. - הרגלה
- העבירו את העכברים לחדר הבדיקה. אפשרו לעכברים 1-2 שעות להתאקלם להעברה בחדר בכלובים הביתיים שלהם.
- לאחר ההתאקלמות, הדריכו את העכברים לפתיחת ההליכון שהוקצה להם וסגרו את ההליכון. הפעל את החגורה, הזעזוע ושעון העצר.
- אפשרו לעכברים ללכת על ההליכונים במשך 15 דקות, תוך שימוש בגירוי הלם כמוטיבציה לתנועה. להפסיק את הבדיקה מיד אם בעל חיים נשאר על שוקר פעיל במשך תקופה ממושכת.
- לאחר הבדיקה מוציאים את העכברים ומחזירים אותם לכלובים הביתיים.
- נקו את ההליכונים באמצעות חומר ניקוי נוזלי ומים.
- בדיקות
- העבירו את העכברים לחדר הבדיקה. אפשרו לעכברים 1-2 שעות להתאקלם בחדר ההעברה בכלובים הביתיים שלהם.
- מדדו ותעדו את טמפרטורת הבסיס לפני הזזת העכבר להליכון.
הערה: עבור בדיקות כולל חומרים פרמקולוגיים, החל או הזרק אותם כאן, בהתאם לסכמת המוצגת באיור 2A. ניתן להוסיף זמן המתנה לאחר ההזרקה לפי הצורך לפני שהעכברים מונחים על ההליכון. יש להשתמש באקראיות בעת מתן גירויים כלשהם. - הניחו ריבועי בקרה בגודל 5X5 ס"מ או מגבות PO בתוך ההליכון הקרוב ביותר לקדמת ההליכון. הדביקו את המגבות לתקרת ההליכון או מתחתיה למיקום והסרה קלים.
- הדרך את העכברים אל ההליכון שהוקצה להם. הפעל את חגורת ההליכון ואת השוקר.
- הפעל את שעון העצר. יש למדוד את הנבדקים באותו סדר שבו הוצבו העכברים בהליכונים. רשום את הטמפרטורות וזמן השעון של המדידות לאחר נקודות הזמן הרצויות.
הערה: ניתן למדוד באופן מהימן את הטמפרטורה מחוץ להליכון בזמן שעכבר נמצא בתוך הליכון סגור במהלך פעילות הליכה. עבור חולדות, מגבלות גודל ההליכון ומרחק קורא המשדר עשויות לדרוש מהנסיין לשמור על גב ההליכון פתוח כדי להכניס את הקורא לתוך ההליכון, קרוב יותר לנבדק. - בסיום הבדיקה, כבו את הזעזועים וההליכונים; להחזיר את העכברים לכלובים הביתיים שלהם. העבירו את העכברים למיקום הדיור.
- נקו את ההליכונים באמצעות חומר ניקוי נוזלי ומים, תוך שימת לב ספציפית להסרת שאריות PO.
- לאחר השלמת הניסויים, הרדימו את בעלי החיים (למשל, באמצעות שאיפת CO2 ), ואשרו באופן חזותי את מיקום המשדר.
איור 2: בדיקת טמפרטורה מבוקרת פעילות. (A) זרימת עבודה של בדיקת טמפרטורה מבוקרת פעילות עם חומר פרמקולוגי באמצעות הליכון הליכה. (B) תמונות מתקן של הליכונים. משמאל, תמונה של הגדרת ציוד מלאה. מימין, תמונה קרובה יותר של הליכונים בודדים וזעזועים. (A) נוצר עם Biorender.com. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
משדרים הושתלו באופן חד-צדדי בגסטרוקנמיוס הימני של עשרה עכברים בני 4-6 חודשים, מסוג בר (WT) שגודלו מזן SF1-Cre (Tg(Nr5a1-cre)7Lowl/J, זן #012462, C57BL/6J ורקעי FVB; נקבה N = 5; זכר N = 5). לאחר ההתאוששות, העכברים הורגלו להליך בדיקת טמפרטורה בכלוב ביתי שלא כלל גירוי הקשרי (למשל, PO). מדידות טמפרטורה באמצעות שרביט משדר נרשמו בתוך חדר הדיור שלהם ולאחר העברה למקום הבדיקה. לעכברים ניתנו 1-2 שעות להתאקלם בחדר הבדיקה ובמיקום. בסיום ההתאקלמות נרשמו מדידות בסיסיות ורצופות במשך שעה אחת עבור כל עכבר. הליך זה הושלם ארבע פעמים.
בסך הכל, לא נצפו הבדלי מין. טמפרטורות השרירים עלו באופן משמעותי לאחר שהעכברים הועברו לחדר הבדיקה, ולאחר מכן ירדו על ידי המדידה הבסיסית לאחר 60 דקות שהושקעו בהקשר הבדיקה. ניתוח המין המשולב של ניסוי 4 לא הראה הבדל משמעותי בין מדידות טמפרטורה "לפני המעבר" לבין מדידות טמפרטורה "בסיסיות" (מבחן t דו-זנב, זוגי, p > 0.10), והראה את היעילות של התאקלמות של שעה אחת בהקשר הבדיקה. יתר על כן, השוואה סטטיסטית של הטמפרטורות בנקודת ההתחלה ו-60 דקות הראתה ירידה משמעותית בטמפרטורה (מבחן t דו-זנב, זוגי, p < 0.01), וסיפקה עדות לכך שהעכברים התרגלו לתנועת החוקר במהלך המדידה. עם זאת, נקבות (אך לא זכרים) הראו תגובות מצטברות שבהן הטמפרטורה שנמדדה בין 5 דקות ל-15 דקות הייתה נמוכה יותר בניסויי הרגלה רצופים (איור 3). כאשר מתבוננים בהשפעות החריפות של תנועה או עלייה בטמפרטורה לאחר נקודת ההתחלה, עכברים נוטים להגיב פחות להובלה לחדר הבדיקה במהלך ניסויי הרגלה רצופים (קובץ משלים 1, ניתוח ניסוי).
עכברי WT בוגרים שתוארו לעיל נבדקו עם Oxt, סוכן פרמקולוגי. עכברים קיבלו זריקות תוך-צפקיות (i.p., 2 מ"ג/ק"ג) של Oxt או של כלי רכב (מלוחים סטריליים) בסדר אקראי, וטמפרטורות השרירים נמדדו לפני התנועה לחדר הבדיקה ולאחר 5, 10, 15, 30, 45, 60, 90, 120, 150 ו-180 דקות של הזרקה. כל עכבר קיבל את שני הטיפולים. ניתוח מדידות חוזרות ונשנות של שונות (ANOVA) גילה השפעות עיקריות משמעותיות של Oxt וזמן, שבו Oxt הפחית את טמפרטורת השרירים ביחס לרכב. Oxt הוריד את טמפרטורת השרירים ביחס לנקודת ההתחלה במהירות של 5 דקות לאחר ההזרקה, כאשר ירידה מקסימלית נראתה 30 דקות לאחר ההזרקה (איור 4). טמפרטורות השרירים נורמלו ב-60 דקות לאחר הזרקת Oxt (בדיקת t דו-זנבית, זוגית, p > 0.10).
חולדות ספראג-דאולי זכרים בוגרים (N = 4, גיל ~ 6 חודשים) שהושתלו באופן דו-צדדי במשדרים בגסטרוקנמיוס הורגלו ולאחר מכן נבדקו בסביבה של כלוב ביתי עם גירוי PO (ריח חמוס). מדידות בסיסיות נרשמו, וכל חולדה הוצגה עם PO בצורה של מגבת. הריח הוסר לאחר 10 דקות של חשיפה; מדידות עוקבות נלקחו לפני ואחרי הסרת הגירוי. נתונים ראשוניים אלה (איור 5) מצביעים על כך של-PO יש השפעה מתמשכת על תרמוגנזה של שרירי השלד לאחר הסרת הגירוי.
נתונים שפורסמו בעבר העריכו את הפעלת איום הטורפים של תרמוגנזה בשרירי השלד אצל חולדות ספראג-דאולי זכרים בוגרים (גיל ~6 חודשים)8. חולדות עם משדרי גסטרוקנמיוס דו-צדדיים מושתלים הוצגו עם ריח טורף (חמוס). המדידות נעשו במסגרת כלוב ביתי (N = 8, איור 6A). נתונים אלה חשפו עלייה חזקה בטמפרטורה בהשוואה לריחות בקרה. כדי לנתח תגובות תרמוגניות מרתיעות או מלחיצות לריח חמוס, חולדות זכריות (N = 7, איור 6B) הוצגו עם ריח מרתיע (חומצה בוטירית), ריח חדש (2-מתיל-בנזוקסזול) או ריח שועל, או רוסנו למשך דקה אחת לפני הבדיקה (מתח מתון). המדידות נלקחו במסגרת כלוב ביתי במשך שעתיים. ניתוח של נתונים אלה הראה ריח חמוס לייצר ולשמור על שינוי חזק בתרמוגנזה בהשוואה לכל התנאים האחרים. יחד, נתונים אלה מספקים עדות להשפעה המינימלית והחולפת של ריח הבקרה על תרמוגנזה של שרירי השלד.
איור 3: ניתוח טמפרטורת השרירים במהלך הרגלה לבדיקת טמפרטורת כלוב ביתי. עכברים שהושתלו באופן חד צדדי במשדרים בגסטרוקנמיוס הימני הורגלו להליך הבדיקה. עכברים נמדדו בחדר המגורים של בעלי החיים, "לפני המעבר", בחדר הבדיקה, "After Move", לאחר התאקלמות במשך 1-2 שעות, "קו בסיס", ולאחר מכן ברציפות מעל שעה. כל ההשוואות הסטטיסטיות שהוצגו נעשו בין ניסוי 1 לניסוי 4, * p < 0.05, ** p < 0.01 (t-test, N = 10); † p < 0.05, †† p < 0.01, ‡ p < 0.001 ניסוי ההשפעה העיקרית (ANOVA, N [ניסויים] = 4). קווי השגיאה המוצגים מציגים את שגיאת התקן של הממוצע (SEM). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 4: טמפרטורת שריר במהלך גירוי פרמקולוגי של אוקסיטוצין בעכברים. עכברים רגילים, שהושתלו באופן חד צדדי במשדרים, קיבלו 2 מ"ג/ק"ג (כלומר) של אוקסיטוצין או כלי רכב (מלוחים סטריליים). ירידות משמעותיות בטמפרטורת השרירים נצפו 5 דקות לאחר הזרקת אוקסיטוצין ונורמלו על ידי 60 דקות, ** p < 0.01, *** p < 0.001 (מבחן t זוגי דו-זנב, N = 9). קווי השגיאה המוצגים מציגים את שגיאת התקן של הממוצע. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 5: תרמוגנזה של ריח טורף בבדיקת טמפרטורה של כלוב ביתי של חולדות. מדידות טמפרטורה בחולדות עם משדרים שהושתלו באופן דו-צדדי בגסטרוקנמיוס לאחר חשיפה לריח טורף (חמוס) במשך 10 דקות. לאחר חשיפה במשך 10 דקות, הוסרו מגבות המכילות את הגירוי, כפי שצוין על ידי החץ. החולדות שמרו על טמפרטורה מוגברת 20 דקות לאחר הסרת הגירוי. גדול משמעותית מטמפרטורת הבסיס, * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001 (t-test, N = 4). קווי השגיאה המוצגים מציגים את שגיאת התקן של הממוצע. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 6: ריח חמוס גורם לעלייה מהירה בטמפרטורת השרירים בהשוואה לבקרה. (A) טמפרטורת גסטרוקנמיוס עלתה באופן משמעותי לאחר ריח טורף (חמוס) בהשוואה לחשיפה לבקרה בחולדות זכריות (מבחן t זוגי דו-זנב, N = 8). (B) ריחות חדשים, מרתיעים או שועלים לא שינו באופן משמעותי את טמפרטורת השרירים בהשוואה לבקרה. שינוי הטמפרטורה הנגרם על ידי מתח מתון ירד במהירות לאחר 5 דקות. ריח החפרפרת שמר על תגובה חזקה, בהשוואה לתנאים אחרים, במשך כל הבדיקה (ANOVA, N = 7). † p < 0.05, ריח חמוס > כל התנאים האחרים; * p < 0.025, השוואה נקודתית בין ריח חמוס ללחץ בינוני לעומת ריח בקרה. נתון זה שונה באישורם של Gorrell et al.8. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
קובץ משלים 1: סימון R לניתוח הרגלים באיור 3 . קובץ Markdown לניתוח הרגלה עם קוד R מציג שיטות קידוד לדוגמה ודרכים שבהן ניתן לחקור מין בתוך נתונים. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
פרוטוקול בדיקת טמפרטורה זה מספק לשדה דרך למדוד ישירות את התרמוגנזה של שרירי השלד. זה קריטי מכיוון שהמחקר מתעמק בזיהוי המנגנונים העומדים בבסיס תרמוגנזה של שרירים33. השיטה מספקת שני פרוטוקולים חסכוניים למדידת תרמוגנזה של שרירי השלד בתנאים הקשריים ופרמקולוגיים. פרוטוקול זה מדגיש את חשיבות ההרגלה וההתאקלמות בהליכים אלה. הרגלה משמשת כדי להציג שוב ושוב את נושא הבדיקה להליך הבדיקה ללא הכנסת כל גירויים פרמקולוגיים או הקשריים; זהו מרכיב קריטי הן בכלוב הביתי והן בבדיקת הטמפרטורה של ההליכון. זה נותן זמן לבעלי החיים להכיר את הסביבה תוך הפחתת הבולטות של ההקשר הניסויי. השמטת צעד זה עלולה להוביל לאסוציאציות מוטות עם הגירוי הניסיוני, כמו גם לתגובות תרמוגניות מוגברות לשליטה בגירויים8. בעלי חיים חייבים ללמוד את הנוהל להפחתת תגובות הלחץ לתנועה הכללית ולמניפולציה הנדרשת לניסויים בבעלי חיים על פי פרוטוקולים אלה. הנתונים לדוגמה שנאספו מספקים עדות לצורך בהרגלה חוזרת ונשנית (איור 3). במאמץ דומה, התאקלמות ביום הבדיקה נחוצה לכל ניסוי. התאקלמות היא כלי הטמעה יומיומי, המעניק לבעלי החיים זמן להירגע מגורמי הלחץ של טרנסלוקציה לחדר הבדיקה. דילוג על התאקלמות יכול לתת מדידות טמפרטורה בסיסיות לא מדויקות, אינטראקציה עם כל הערכה מאוחרת יותר.
כאן, מדידות תרמוגניות של שרירים שימשו כדי להדגים את ההשפעה ההיפותרמית של Oxt intraperitoneal על עכברים. תוצאה זו הייתה מפתיעה בהתחשב בראיות התומכות בתפקידו של אוקסט המרכזי בתרמוגנזה, ובמיוחד בהיפרתרמיה חברתית11,13. אחרים, לעומת זאת, הדגימו את יכולתם של אוקסט וזופרסין לדכא את טמפרטורת הליבה יחד עם קצב הלב בחולדות, השפעות המתווכות על ידי הקולטן Avpr1a34. פרדוקס לכאורה זה לא התיישב. ייתכן שהיכולת של Oxt להעלות או להקטין את הטמפרטורה בהקשרים שונים עשויה לנבוע מפעולה מרכזית לעומת היקפית של Oxt או מאורך החשיפה 13,35,36,37. ללא קשר, כאן אנו מדגימים שטמפרטורת שריר העכבר מראה ירידה ניכרת בטמפרטורה במהירות לאחר הזרקת Oxt היקפית (איור 4), בהתאם לשינויים בטמפרטורת ליבת החולדה שדווחו על ידי Hicks et al. (2014)33.
בהתאם לציפייה של המכון הלאומי לבריאות (NIH) שהחוקרים יתחשבו במין כמשתנה ביולוגי, תרמוגנזה של שרירים נמדדת אצל זכרים ונקבות הן בעכברים והן בחולדות. ניתן להשוות בין נתוני תרמוגנזה של זכרים ונקבות, אם כי מחקרים קודמים ועכשוויים לא הצליחו לזהות הבדלי מין חזקים בתרמוגנזה הקשרית ובשונות על פני מחזור האסטרוס בחולדות נקבות8. יוצא דופן אחד הוא ההבדל המיני הניכר בטמפרטורת השרירים בנקודת ההתחלה ולאחר ההובלה לאזור הבדיקה, במיוחד לפני הרגל8. זה עשוי לנבוע מהבדלים בתנועה לאחר ההובלה, שכן לנקבות חולדות יש תגובה תנועתית גבוהה יותר לגירויים מלחיצים מסוימים בהשוואה לזכרים, הניתנים להפרדה ממדדי חרדה בסיסיים38. זה מדגיש את הצורך בהרגלה חוזרת להקשר הניסויי, במקרה זה, כדי למנוע מצג שווא של הבדל מין בתרמוגנזה שניתן לייחס לגירוי הניסויי ולא להבדלים בסיסיים בתגובת הלחץ.
לשיטה העיקרית של בדיקת טמפרטורה בכלובים ביתיים של בעלי חיים יש כמה מגבלות, אחת מהן היא שליטה על רמות פעילות משתנות. זה יכול להיות קריטי מכיוון שפעילות מוגברת מובילה לעלייה בטמפרטורת השרירים. כדי להתמודד עם זה, הוגדר נוהל להליכה על הליכון עכברים וחולדות. שליטה בתנועת החיה ממזערת את הפוטנציאל להשפעת פעילות על הטמפרטורה, תוך התחשבות בהבדלים בתרמוגנזה המתכווצת. בעוד שניתן להשלים הליכה על הליכון כמבחן סולו, ניתן להשתמש בשיטה זו בשילוב עם הערכת טמפרטורה בכלוב ביתי. הניתוח המשולב מספק ראיות נוספות לטענות ששינויים בטמפרטורת שרירי השלד נובעים מגירויים פרמקולוגיים או הקשריים ולא שנית משינויים בפעילות הנובעים מגירוייםאלה 8,14,15. בנוסף, שיטה זו מוגבלת בכך שהיא פולשנית במקצת, שאינה עונה על הצורך של מחקרים מסוימים. עם זאת, שיטה זו דורשת רק ניתוח אחד, המאפשר לחוקרים להימנע ממניפולציה מתמשכת של בעלי חיים במהלך הניסויים תוך שמירה על הספציפיות של המדידות. יתר על כן, הגודל הזמין כיום של משדר IPTT-300 אינו מאפשר למקם את המשדר ישירות בתוך הגסטרוקנמיוס של עכבר. ניתן להשלים זאת במודלים של חולדות בשל גודלן הגדול יותר. שיטה זו מספקת מנגנון מדידה הסמוך לשריר העניין; עם זאת, גרסאות משופצות או קטנות יותר של משדרים המסוגלים למדוד טמפרטורה יהיו נכס גדול לתחום ולמחקרים עתידיים.
השימוש הנרחב בשיטה המתוארת בתוכנית המחקר שלנו נתן לנו את ההזדמנות לנהל שונות בתגובה להשתלת משדרים והליכי בדיקה 8,10,14,15. לאחר השתלת המשדר, מומלץ לעקוב אחר הטמפרטורות של בעלי החיים מיד לאחר הניתוח ובמהלך ההתאוששות. אמנם זה נותן לראשונה תובנה לגבי בריאות החיה (למשל, טמפרטורה נמוכה באופן מוזר כסימן למחלה או למוות מתקרב), אבל זה גם מספק ראיות לכך שהמשדר עדיין פעיל ומאובטח במקום. חולדה או עכבר עלולים להתגרד במיקום החתך, מה שעלול לגרום לכך שהמשדר ייפול באופן חלקי או מלא. בהתאם להנחיות המוסדיות, ניתוח זה נחשב מינורי. לכן, במקרים של מיקום משדר חד צדדי, אם עכבר מאבד את המשדר שלו או אם המשדר של העכבר כבר לא מתפקד, ניתן לחזור על הניתוח על איבר חלופי. מומלץ לציין סימון (כלומר, זיהוי של מיקום חדש, או "R" להחלפה) כדי לציין את הניתוח החוזר הזה שצוין במהלך תכנות המשדר כחלק משם הזיהוי של בעל החיים. יתר על כן, מאחר שלבעלי חיים יש טווח חופשי של הכלוב שלהם, חוקרים עשויים להתקשות למצוא את החיה שתיקח את הקריאה. מוצע כי חוקרים ישתמשו בשלב ההרגלה כדי לתרגל מדידות ולהעריך את הגדרתן. השינויים עשויים לכלול הגדלת מספר הנסיינים וסורקי המשדרים או הקטנת מספר הנסים, ולכן גם בעלי החיים שנוסו בכל ניסוי.
פרוטוקול זה מספק הוראות למדידת טמפרטורה ישירה של שריר ללא ניתוח תוכנה נוסף, וכתוצאה מכך אפיק אפשרי וזול יחסית למחקרים שבהם בדרך כלל משתמשים במצלמות אינפרא אדום. יתר על כן, הליך זה מאפשר איסוף נתונים הסוגרים את הפער שנראה על ידי כמה מחקרים המבקשים לחבר שינויים גנטיים או חלבונים לתרמוגנזה של שרירים37. בסך הכל, התעניינות מוגברת בתרמוגנזה של השרירים ובמנגנונים שלה מתאפשרת על ידי הערכה ישירה של החום שנוצר בשריר המטרה. ההליך המתואר מטפל ישירות בחלל המתודולוגי הזה בתוך השדה על ידי מתן מנגנון לחקר שרירי השלד של עכברים וחולדות כאחד.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים מצהירים כי אין להם ניגודי עניינים.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכת על ידי R15 DK097644 ו- R15 DK108668. אנו מודים לד"ר צ'ייטניה ק' גאביני ולד"ר מייגן ריץ' על תרומות קודמות ולד"ר סטנלי דנמילר על שהבטחנו את עמידתנו בהנחיות המוסדיות לשימוש בבעלי חיים. תודה מיוחדת לד"ר טים ברטנס על מתן המחקר הבסיסי הדרוש לבניית שיטה זו והמחקרים הקשורים אליה. איורים 1A, C, D ואיור 2A נוצרו באמצעות Biorender.com.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1012M-2 Modular Enclosed Metabolic Treadmill for Mice, 2 Lanes w/ Shock | Columbus Instruments | ||
| 1012R-2 Modular Enclosed Metabolic Treadmill for Rats, 2 Lanes w/ Shock | Columbus Instruments | ||
| 1-1/4 in. Ratcheting PVC Cutter | BrassCraft | ||
| 1 mL Syringes | Fisher Scientific | BD 309659 | |
| Betadine Swabs | Fisher Scientific | 19-898-945 | |
| Booster Coil | BioMedic Data Systems | Transponder Accessory | |
| Electric Clippers | Andis | 40 Ultraedge Clipper Blade | |
| Flexible Mirror Sheets | Amazon | Self Adhesive Non Glass Mirror Tiles | |
| Forceps | Fisher Scientific | 89259-940 | |
| Heating Pad | |||
| Induction Chamber (isoflurane) | Kent Scientific | VetFlo-0730 | 3.0 L Low Cost Chambers for Traditional Vaporizers |
| Ketoprophen | Med-Vet Intl. | RXKETO-50 | |
| Magnetic Strips | Amazon | ||
| Magnets | Amazon | DIYMAG Magnetic Hooks 40lbs | |
| Needles | Med-Vet Intl. | 26400 | |
| Neomycin/Polymixin/Bacitracin with Hydrocortisone Ophthalmic Ointment, 3.5 g | Med-Vet Intl. | RXNPB-HC | |
| Oasis Absorbable Suture | Med-Vet Intl. | MV-H821-V | |
| Predator (Ferret) Odor Towels | Marshall BioResources | ||
| PVC pipe | |||
| Reflex Wound Clip Remover | CellPoint Scientific | ||
| Reflex Wound Clip, 7 mm (mouse) | CellPoint Scientific | ||
| Reflex Wound Clip, 9 mm (rat) | CellPoint Scientific | ||
| Srerile Autoclip, 7 mm (mouse) | CellPoint Scientific | Wound Clip Applier (mouse) | |
| Stainless Strainers Interval Seasonings Tea Infuser | Amazon | ||
| Sterile Autoclip, 9 mm (rat) | CellPoint Scientific | Wound Clip Applier (rat) | |
| Sterile Saline | Med-Vet Intl. | RX0.9NACL-10 | |
| Surgical Scissors | Fisher Scientific | 08-951-5 | |
| Surgical Sheets | |||
| Towels (Control/Habituation) | Amazon | 100% Cotton Towels, white | |
| Transponders | BioMedic Data Systems | Model: IPTT-300 | |
| Transponders Reader | BioMedic Data Systems | Model: DAS-8027-IUS/ DAS-7007R | |
| Versaclean | Fisher Scientific | 18-200-700 | liquid detergent |
| Webcol Alcohol Preps | Covidien | 22-246-073 | |
| Wedge pieces for PVC pipe |
References
- Periasamy, M., Herrera, J. L., Reis, F. C. G. Skeletal muscle thermogenesis and its role in whole body energy metabolism. Diabetes Metabolism Journal. 41 (5), 327-336 (2017).
- Rowland, L. A., Bal, N. C., Periasamy, M. The role of skeletal-muscle-based thermogenic mechanisms in vertebrate endothermy. Biological Reviews of the Cambridge Philosophical Society. 90 (4), 1279-1297 (2015).
- Maurya, S. K., et al. Sarcolipin is a key determinant of the basal metabolic rate, and its overexpression enhances energy expenditure and resistance against diet-induced obesity. Journal of Biological Chemistry. 290 (17), 10840-10849 (2015).
- Grigg, G., et al. Whole-body endothermy: Ancient, homologous and widespread among the ancestors of mammals, birds and crocodylians. Biological Reviews of the Cambridge Philosophical Society. 97 (2), 766-801 (2022).
- Franck, J. P. C., Slight-Simcoe, E., Wegner, N. C. Endothermy in the smalleye opah (Lampris incognitus): A potential role for the uncoupling protein sarcolipin. Comparative Biochemistry and Physiology - Part A: Molecular & Integrative Physiology. 233, 48-52 (2019).
- Nowack, J., et al. Muscle nonshivering thermogenesis in a feral mammal. Scientific Reports. 9, 6378 (2019).
- Oliver, S. R., Anderson, K. J., Hunstiger, M. M., Andrews, M. T. Turning down the heat: Down-regulation of sarcolipin in a hibernating mammal. Neuroscience Letters. 696, 13-19 (2019).
- Gorrell, E., et al. Skeletal muscle thermogenesis induction by exposure to predator odor. The Journal of Experimental Biology. 223, Pt 8 (2020).
- Gavini, C. K., et al. Leanness and heightened nonresting energy expenditure: Role of skeletal muscle activity thermogenesis. The American Journal of Physiology - Endocrinology and Metabolism. 306 (6), 635-647 (2014).
- Almundarij, T. I., Gavini, C. K., Novak, C. M. Suppressed sympathetic outflow to skeletal muscle, muscle thermogenesis, and activity energy expenditure with calorie restriction. Physiological Reports. 5 (4), 13171 (2017).
- Harshaw, C., Lanzkowsky, J., Tran, A. D., Bradley, A. R., Jaime, M. Oxytocin and 'social hyperthermia': Interaction with beta3-adrenergic receptor-mediated thermogenesis and significance for the expression of social behavior in male and female mice. Hormones and Behavior. 131, 104981 (2021).
- Caldwell, H. K. Oxytocin and vasopressin: Powerful regulators of social behavior. The Neuroscientist. 23 (5), 517-528 (2017).
- Harshaw, C., Leffel, J. K., Alberts, J. R. Oxytocin and the warm outer glow: Thermoregulatory deficits cause huddling abnormalities in oxytocin-deficient mouse pups. Hormones and Behavior. 98, 145-158 (2018).
- Gavini, C. K., Britton, S. L., Koch, L. G., Novak, C. M. Inherently lean rats have enhanced activity and skeletal muscle response to central melanocortin receptors. Obesity. 26 (5), 885-894 (2018).
- Gavini, C. K., Jones, W. C., Novak, C. M. Ventromedial hypothalamic melanocortin receptor activation: regulation of activity energy expenditure and skeletal muscle thermogenesis. The Journal of Physiology. 594 (18), 5285-5301 (2016).
- Zaretsky, D. V., Romanovsky, A. A., Zaretskaia, M. V., Molkov, Y. I. Tissue oxidative metabolism can increase the difference between local temperature and arterial blood temperature by up to 1.3(o)C: Implications for brain, brown adipose tissue, and muscle physiology. Temperature. 5 (1), 22-35 (2018).
- Yoo, Y., et al. Exercise activates compensatory thermoregulatory reaction in rats: A modeling study. Journal of Applied Physiology. 119 (12), 1400-1410 (2015).
- Langer, F., Fietz, J. Ways to measure body temperature in the field. Journal of Thermal Biology. 42, 46-51 (2014).
- Pence, S., et al. Central apolipoprotein A-IV stimulates thermogenesis in brown adipose tissue. International Journal of Molecular Sciences. 22 (3), 1221 (2021).
- Li, D., et al. Homeostatic disturbance of thermoregulatory functions in rats with chronic fatigue. Journal of Neuroscience Research. 165, 45-50 (2021).
- Carlier, J., et al. Pharmacodynamic effects, pharmacokinetics, and metabolism of the synthetic cannabinoid AM-2201 in male rats. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 367 (3), 543-550 (2018).
- Pato, A. M., Romero, D. M., Sosa Holt, C. S., Nemirovsky, S. I., Wolansky, M. J. Use of subcutaneous transponders to monitor body temperature in laboratory rats. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 114, 107145 (2022).
- Almeida, D. L., et al. Lean in one way, in obesity another: Effects of moderate exercise in brown adipose tissue of early overfed male Wistar rats. International Journal of Obesity. 46 (1), 137-143 (2022).
- Brito, M. N., Brito, N. A., Baro, D. J., Song, C. K., Bartness, T. J. Differential activation of the sympathetic innervation of adipose tissues by melanocortin receptor stimulation. Endocrinology. 148 (11), 5339-5347 (2007).
- Vaughan, C. H., Shrestha, Y. B., Bartness, T. J. Characterization of a novel melanocortin receptor-containing node in the SNS outflow circuitry to brown adipose tissue involved in thermogenesis. Brain Research. 1411, 17-27 (2011).
- Kort, W. J., Hekking-Weijma, J. M., TenKate, M. T., Sorm, V., VanStrik, R. A microchip implant system as a method to determine body temperature of terminally ill rats and mice. Laboratory Animals. 32 (3), 260-269 (1998).
- Mei, J., et al. Body temperature measurement in mice during acute illness: Implantable temperature transponder versus surface infrared thermometry. Scientific Reports. 8, 3526 (2018).
- Warn, P. A., et al. Infrared body temperature measurement of mice as an early predictor of death in experimental fungal infections. Laboratory Animals. 37 (2), 126-131 (2003).
- Hargreaves, K., Dubner, R., Brown, F., Flores, C., Joris, J. A new and sensitive method for measuring thermal nociception in cutaneous hyperalgesia. Pain. 32 (1), 77-88 (1988).
- Fiebig, K., Jourdan, T., Kock, M. H., Merle, R., Thone-Reineke, C. Evaluation of infrared thermography for temperature measurement in adult male NMRI nude mice. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 57 (6), 715-724 (2018).
- Franco, N. H., Geros, A., Oliveira, L., Olsson, I. A. S., Aguiar, P. ThermoLabAnimal - A high-throughput analysis software for non-invasive thermal assessment of laboratory mice. Physiology & Behavior. 207, 113-121 (2019).
- Koganti, S. R., et al. Disruption of KATP channel expression in skeletal muscle by targeted oligonucleotide delivery promotes activity-linked thermogenesis. Molecular Therapy. 23 (4), 707-716 (2015).
- Bal, N. C., Periasamy, M. Uncoupling of sarcoendoplasmic reticulum calcium ATPase pump activity by sarcolipin as the basis for muscle non-shivering thermogenesis. Philosophical Transactions of the Royal Society B. 375 (1793), 20190135 (2020).
- Hicks, C., et al. Body temperature and cardiac changes induced by peripherally administered oxytocin, vasopressin and the non-peptide oxytocin receptor agonist WAY 267,464: a biotelemetry study in rats. British Journal of Pharmacology. 171 (11), 2868-2887 (2014).
- Kasahara, Y., et al. Oxytocin receptor in the hypothalamus is sufficient to rescue normal thermoregulatory function in male oxytocin receptor knockout mice. Endocrinology. 154 (11), 4305-4315 (2013).
- Kasahara, Y., et al. Role of the oxytocin receptor expressed in the rostral medullary raphe in thermoregulation during cold conditions. Frontiers in Endocrinology. 6, 180 (2015).
- Yuan, J., Zhang, R., Wu, R., Gu, Y., Lu, Y. The effects of oxytocin to rectify metabolic dysfunction in obese mice are associated with increased thermogenesis. Molecular and Cellular Endocrinology. 514, 110903 (2020).
- Scholl, J. L., Afzal, A., Fox, L. C., Watt, M. J., Forster, G. L. Sex differences in anxiety-like behaviors in rats. Physiology & Behavior. 211, 112670 (2019).
