Summary
Här presenteras ett protokoll för att generera formalinfixerade, paraffininbäddade cellpelletskontroller för immunhistokemi.
Abstract
Positiva och negativa kontroller med känt uttryck av målproteiner är avgörande för utvecklingen av immunohistokemiska analyser (IHC). Medan vävnadskontroller är fördelaktiga för väl karakteriserade proteiner med definierade vävnads- och cellulära uttrycksmönster, är de mindre lämpliga för den initiala utvecklingen av IHC-analyser för nya, dåligt karakteriserade eller allestädes närvarande uttryckta proteiner. Alternativt, på grund av deras standardiserade natur, kan cellpellets, inklusive cancercellinjer med definierade protein- eller transkriptuttrycksnivåer (t.ex. högt, medium och lågt uttryck), transfekterade överuttryckande cellinjer eller cellinjer med gener som raderats genom cellteknikteknik som CRISPR, fungera som värdefulla kontroller, särskilt för den initiala antikroppskarakteriseringen och urvalet. För att dessa cellpellets ska kunna användas vid utvecklingen av IHC-analyser för formalinfixerade, paraffininbäddade vävnader måste de bearbetas och bäddas in på ett sätt som rekapitulerar de procedurer som används för vävnadsbehandling. Detta protokoll beskriver en process för att skapa och bearbeta formalinfixerade, paraffinbäddade cellpelletskontroller som kan användas för IHC-metodutveckling.
Introduction
Immunohistokemi (IHC) är en av de vanligaste analyserna inom undersökande och diagnostisk patologi. Beroende på sammanhang och analys används IHC för att hjälpa till med cancerdiagnos1,2, förutsäga behandlingssvar3,4, identifiera patogener5, karakterisera celltyper i sjuka vävnader6 och studera biologiska vägar och vävnadssvar 7,8. I alla situationer är grundprincipen för en IHC-analys att en antikropp binder specifikt till ett mål av intresse, oftast ett protein, och denna bindningshändelse visualiseras därefter i en vävnadssektion9. En av de största utmaningarna med någon IHC-analys är dock att säkerställa att antikropparna specifikt detekterar målet av intresse10. Antikroppsspecificitet är en utmaning i de flesta immunanalyser, men immunhistokemi erbjuder unika utmaningar genom att det inte finns några sekundära åtgärder, såsom molekylvikt, för att skilja mellan specifik och ospecifik märkning. Detta är särskilt besvärligt när man utvärderar dåligt karakteriserade eller allestädes närvarande uttryckta mål som saknar väldefinierade cellulära lokaliseringsmönster. Därför är robusta kontroller som kan hjälpa till att karakterisera bindningsspecificitet avgörande när man utvecklar en ny IHC-analys10.
För mål som är väldefinierade med karakteristiska cellulära uttrycksmönster används vävnadskontroller ofta i IHC-metodutveckling. Baserat på en mängd tidigare data kan man avgöra om antikroppen märker vävnaden, cellen och det subcellulära facket där det är känt att det uttrycks, och att det inte märker vävnadskomponenter där det inte borde vara närvarande11. Vävnadskontroller är dock av begränsad användning för dåligt karakteriserade, nya mål utan kända uttrycksmönster eller för proteiner som är allmänt uttryckta och saknar distinkta uttrycksmönster. I båda dessa scenarier gör avsaknaden av ett väldefinierat uttrycksmönster det omöjligt att skilja specifikt från icke-specifik märkning i vävnader. I dessa situationer erbjuder cellpellets en värdefull alternativ IHC-kontroll. Cellpelletskontroller kan inkludera: cancer eller andra cellinjer som har endogena eller inneboende / icke-inducerade uttrycksnivåer av proteinet av intresse, och vars proteinuttryck kan karakteriseras av western blotting, flödescytometriska analyser eller extrapoleras från transkriptionell profilering; konstruerade cellinjer som antingen överuttrycker proteinet av intresse eller har den kodande genen av intresse raderad; eller celler som har behandlats under särskilda förhållanden för att inducera proteinuttryck eller signalhändelser av intresse (t.ex. fosforylering)10,12. Väl karakteriserade proteinuttrycksnivåer i cellinjer möjliggör också utvärdering av känsligheten hos en analys genom att använda en panel av cellinjer med högt, medium, lågt och frånvarande proteinuttryck. Dessutom kan konstruerade cellpellets vara värdefulla artspecifika kontroller för veterinära arter, för vilka det kan finnas begränsad karakterisering eller tillgängliga vävnadskontroller13. Medan cellpellets har sina begränsningar, såsom det begränsade proteomet som finns i cellinjer som inte kommer att återspegla det olika proteomet i vävnader, fungerar de som lämpliga kontroller för att bekräfta att antikroppen kan detektera målet av intresse samt utesluta urskillningslös bindning av den primära antikroppen, sekundär antikropp eller andra regenter i analysen10.
De flesta vävnader i diagnostisk och undersökande patologi fixeras i neutralt buffrat formalin, dehydreras i en serie alkoholer, rensas i xylen och bearbetas och inbäddas i paraffinvax. Formalinfixering tvärbinder proteiner och fixering och varje ytterligare steg i vävnadsbehandling kan direkt påverka proteiner och antikroppars förmåga att detektera dem 9,14. Därför är det viktigt att alla kontroller som används i en IHC-analys genomgår samma fixering, vävnadsbehandling och inbäddningsprocedurer. Denna artikel beskriver de unika övervägandena för att bearbeta och bädda in odlade celler för att fungera som kontroller för att utveckla IHC-analyser i formalinfixerade paraffinbäddade vävnader, med metodiken främst inriktad på hantering och bearbetning av cellpelleten i ett histologilaboratorium.
Protocol
1. Beredning av cellpellets
- I fyra till åtta 150 mm2 eller åtta x T175-kolvar, växa celler i mediet och förhållanden som rekommenderas för cellinjen till 80% -90% sammanflöde. Till exempel växa 293T-celler i Dulbeccos Modified Eagle's Medium (DMEM) med 10% fosterbovint serum och 2 mM L-glutamin15.
OBS: Celler bör odlas med de villkor och medium som krävs för cellinjen av intresse16. Dessa förhållanden kan variera beroende på cellinjen, men nedströms pelleteringsmetoderna bör kunna anpassas för cellinjer oberoende av odlingsförhållandena. - När cellerna är nära sammanflödet (80% -90%), aspirera tillväxtmediet med en vakuumpipett och skölj cellerna i fosfatbuffrad saltlösning (PBS).
- Tillsätt 5 ml 5–10 mM EDTA till varje kolv och inkubera kolvarna vid 37 °C i 5–10 minuter. Tryck försiktigt på sidan av kolven för att lossa celler.
OBS: Använd inte trypsin eftersom detta kan klyva ytepitoper som skulle påverka vissa antigener negativt.- När cellerna har lossnat, tillsätt 5 ml tillväxtmedium som används för cellinjen (t.ex. DMEM för 293T-celler) till varje kolv och överför sedan cellerna till 50 ml koniska rör.
- Centrifugera de koniska rören vid 930 x g vid rumstemperatur i 5 minuter. Efter centrifugering, avlägsna mediet och EDTA genom vakuumpipettaspiration.
- Tvätta cellpelletsen i 10-20 ml 1x PBS och, om flera plattor eller kolvar används, slå samman cellerna från plattorna eller kolvarna (cirka sex T175-kolvar i experimentet som visas i figur 1) till ett enda 50 ml koniskt rör.
- Centrifugera röret vid 930 x g i 5 min. Aspirera PBS efter centrifugering med en vakuumpipett.
- Håll cellpelletsröret på våt is tills fixering.
OBS: Celler hålls kylda för att begränsa nedbrytbar enzymaktivitet och minimera autolys av celler och associerade proteinförändringar, inklusive förändringar i proteinlokalisering.
2. Fixering av cellpellet
- Utför fixering genom att tillsätta 30 ml 10% neutralt buffrat formalin till 3 ml cellpellet för att skapa ett 10: 1 (vol: vol) fixativ till cellförhållande.
- Vänd det tätt täckta 50 ml röret upprepade gånger tills cellerna är helt i suspension.
OBS: Bildning av en kondenserad cellpellets före fullständig fixering kan orsaka ojämn fixering, vilket resulterar i artefakter under senare färgnings- och immunmärkningsprocedurer. - Låt cellsuspensionen sätta sig över natten vid rumstemperatur.
- Invertera röret igen nästa dag för att återsuspendera cellerna, öka förhållandet mellan yta och volym för att förbättra fixeringen.
OBS: Vortexing av cellpelleten är inte nödvändigt eller rekommenderat eftersom det kan leda till cellskador.
3. Trimning och bearbetning av cellpellets
- Efter 24 timmars fixering centrifugerar du det koniska 50 ml vid 930 x g vid 5 °C i 10–15 minuter. Se till att rören är ordentligt täckta, fördelade lika och balanserade i centrifugen.
OBS: Fixeringstiderna kan modifieras för att återspegla de vävnadsfixeringstider som används av laboratoriet eller kraven för specifika experimentella förhållanden. - Efter centrifugering, se till att cellerna bildar en synlig pellet. Ta bort fixeringsmedlet genom dekantering och/eller försiktigt aspirerande med steril överföringspipett.
- Tillsätt smält (40–60 °C) hydroxietylagarosbaserad gel (se materialtabell) till cellpelleten i förhållandet 1:4 (vol:vol) gel till cellpellets.
- Använd en ren 5-tums, 2 mm spets Sterling-sond med ett öga sköljt med kranvatten, rör försiktigt den smälta gelén i den fasta cellpelleten, vilket skapar en jämn suspension av fasta celler i smält gel i botten av 50 ml koniskt rör (figur 1A).
- Placera det täckta 50 ml koniska röret med den smälta gelén blandad med fast cellpellet på våt is i 5-10 minuter för att stelna den gelerade cellpelleten.
- Använd en ren mikrospatel och ta försiktigt bort pelleten från det koniska röret genom att placera en spatel längs rörets sida och försiktigt utnyttja pelleten utan att genomborra den. Lägg pelleten på biopsipapper.
- Använd en ren mikrospatel och trimma cellpelleten i 4-5 mm tjocka skivor, så att varje skiva får plats i en 26 mm x 26 mm x 5 mm vävnadskasett (figur 1B).
- Placera enskilda gelpelletsskivor i mitten av en bit biopsipapper. Vik de två motsatta ändarna av biopsipapperet över pelleten och linda in den. Placera den inslagna pelleten i en 26 mm x 26 mm x 5 mm vävnadskassett. Stäng locket och krymp de utfällda sidorna av biopsifolien med vävnadskassettlocket (figur 1C).
- Placera den trimmade cellpelletskassetten i vävnadsprocessorns retort fylld med 10% neutralt buffrat formalin och kör på ett kort bearbetningsschema.
OBS: Det korta bearbetningsschemat består av 30 minuter i varje retort som börjar i 10% neutralt buffrat formalin, dehydreras genom en serie alltmer graderade alkoholer, rensas i tre förändringar av xylener och slutar med paraffininfiltration i två förändringar av 60 ° C smält infiltration / inbäddning av paraffin (56 ° C smältpunkt).
4. Inbäddning av cellpellets
- Placera de bearbetade kassetterna i förvaringsområdet för inbäddningscentret.
- Öppna vävnadskassettlocket och vik försiktigt ut biopsipapperet.
- Placera cellpelleten i en liten 15 mm x 15 mm engångsform med inbäddning, med skärsidan nedåt.
OBS: En liten inbäddningsform gör det möjligt för upp till tre cellpelletssektioner att passa på en ostoppad vävnadsglas för IHC-analyser. - Medan du försiktigt håller cellpelleten i botten av formen med pincett, tillsätt 62 ° C vävnadsinfiltration / inbäddning av paraffin i formen och täck cellpelleten.
- Flytta formen till ett kallt block för att börja stelna paraffinet. Justera cellpelletsen medan paraffinet stelnar för att fixera dem i lämplig position längst ner i formen.
- Ta bort locket från kassetten. Placera kassetten, nedifrån och ner, ovanpå inbäddningsformen och tillsätt ytterligare smält paraffin för att täcka kassetten.
- När paraffin fylls över vävnadskassetten, återför formen till det kalla blocket för att stelna17,18.
5. Sektionering av cellpellets
- Använd en roterande mikrotom inställd på en sektionstjocklek på 20 μm för att trimma cellpelletsblocket tills paraffinblockets hela yta och cellpelleten fångas upp i paraffinsektionsbandet. Detta kallas "vänd" mot blocket.
- Kyl och blötlägg de vända pelletsblocken på en isbadbricka i 5-15 minuter för att kyla och hydrera blocket innan du delar upp.
OBS: När blocket är hydratiserat kommer cellpelleten att vara genomskinlig i paraffinbandet. Om det är ogenomskinligt krävs mer blötläggning och artefakter kan finnas. - Sektionera paraffinbandet i cellpelletsblocket med en tjocklek av 4 μm eller annan önskad tjocklek i kontinuerligt skärläge med användning av ett roterande mikrotom.
- Placera paraffinbanden på ett vattenflytande bad som är inställt på 42 °C.
- Plocka upp paraffinsektionerna som framställts med hjälp av den roterande mikrotomen från flytbadet på positivt laddade objektglas.
- Placera den första sektionen högst upp på bilden inom täck- och färgningsgränsen och placera den andra under den och den tredje cellpelletssektionen under den (figur 1D).
- Efter sektionering, torka objektglasen vid rumstemperatur (ca 23 °C) i 24 timmar, följt av 60 °C i 30 minuter.
OBS: Efter bakning av objektglasen vid 60 °C kan cellpelletssektionerna användas med vilket standard IHC-protokoll som helst, inklusive protokoll som använder värmeinducerad och enzymbaserad antigenhämtning9.
Representative Results
Efter tillsats av den agarosbaserade gelén bör cellpelleten bilda en fast gelatinös massa som är mottaglig för hantering (figur 1B). När den väl är inbäddad kommer pelleten att ha en konsistens som liknar en fast vävnad och bör vara relativt lätt att rutinmässigt dela på en mikrotom. När cellpellets är inbäddade kan de användas i histologi och IHC-experiment på samma sätt som formalinfixerade, paraffininbäddade vävnader. Detta inbegriper användning av värmeinducerad epitop eller enzymatisk antigenhämtning med indirekta kromogena detektionsmetoder (t.ex. användning av en sekundär antikropp med pepparrotsperoxidas och diaminobenzidindetektion enligt figur 2 och figur 3) med hjälp av kommersiella IHC-plattformar9. Histologiskt bör cellerna spridas jämnt över hela sektionen med minimal cellklumpning, även om vidhäftande celler kan behålla sina cell-cellinteraktioner i pelleten. Denna dispersion möjliggör skillnad mellan enskilda celler, även om denna skillnad kommer att påverkas signifikant av cellstorlek och relativ densitet inom gelpelleten. Kärnan, cytoplasman och cellmembranet är mer distinkta och lättare att visualisera vid dispersion (figur 2). I figur 2 är tre cellinjer immunmärkta för TEAD-transkriptionsfaktorn. Immunmärkning visualiseras med den bruna diaminobenzidin (DAB) kromogenen. Cellinjerna har varierande uttrycksnivåer för TEAD-transkriptionsfaktorn, allt från inget uttryck (figur 2A) till svagt uttryck (figur 2B) till starkt uttryck (figur 2C). I detta exempel observeras märkning i kärnan, som man kan förvänta sig av en transkriptionsfaktor, och är frånvarande från cytoplasman och cellmembranet, som är synliga men saknar märkning (Figur 2). Cellpellets kan införlivas i cellpelletsmikroarrayer (figur 3) på standardglas på 23 mm x 75 mm x 1 mm. Att införliva cellpellets i en mikroarray möjliggör utvärdering av kontroller med varierande uttrycksnivåer i samma bild. I det här exemplet fungerar PEG10-bristfälliga embryonala stamceller från mus (vänster) som en negativ kontroll och 293T-celler som överuttrycker PEG10 (höger, brun immunmärkning) fungerar som en positiv kontroll i mikroarrayen (figur 3). Det finns ingen variation i vävnads- och inbäddningsförfarandena för cellpellets som kommer att ingå i mikroarrayer, och mikroarrayer kan genereras med metoder som liknar dem som används för vävnader19.
Figur 1: Cellpelletsbearbetning . (A) Cellerna pelleteras i 50 ml koniska rör och blandas med gelén. (B) När pellets har stelnat skivas de seriellt för att passa in i en 26 mm x 26 mm x 5 mm vävnadskassett. C) Cellpellets förpackas i biopsipapper innan de placeras i vävnadsprocessorn. (D) Upp till tre cellpellets kan serieuppsamlas på en enda 25 mm x 75 mm glashistologiglas. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Cellpellets med olika nivåer av protein eller transkriptuttryck kan användas för att utvärdera analysens dynamiska omfång. Cellpellets är immunmärkta för TEAD-transkriptionsfaktorn och uppvisar varierande nivåer av TEAD-uttryck. (A) DAUDI-celler saknar TEAD-uttryck och har ingen immunmärkning i cytoplasman eller kärnan. Blå fläck är hematoxylinmotfläck av kärnan. (B) 293T-celler visar svag kärnmärkning (brun diaminobenzidin (DAB) kromogen) av TEAD-transkriptionsfaktorn. (C) Detroit 562-celler uttrycker starkt TEAD, vilket framgår av den intensiva bruna märkningen i kärnan. Märkning i kärnan, men inte cytoplasman (benvit till grå region runt den bruna kärnan), visar lämplig märkning av immunohistokemianalysen. Observera att i alla tre cellinjerna dispergeras cellerna, vilket möjliggör visualisering av enskilda celler, inklusive deras kärn- och cytoplasmatiska morfologier. Skalstreck = 25 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Cellpelletsmikroarray skapad genom att använda flera cellpellets med varierande proteinuttrycksnivåer möjliggör samtidig bedömning av kontroller i en enda bild. PEG10-bristfälliga embryonala stamceller från mus (vänster) och 293T-celler som överuttrycker PEG10 (höger) är immunmärkta för PEG10. Medan stark märkning (brun DAB-kromogen) observeras i 293T-celler som uttrycker PEG10, är ingen märkning uppenbar i PEG10-bristfälliga celler. Blå representerar hematoxylin motstain. Skalstreck = 200 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Discussion
Detta protokoll beskriver en metod för att generera formalinfixerade, paraffininbäddade cellpellets som kan användas som kontroller för nedströms immunhistokemi och in situ hybridiseringsstudier. De histologimetoder som beskrivs i detta protokoll är tillämpliga på ett varierat spektrum av cancer- och primära cellinjer och anpassar främst rutinmässiga histologitekniker för att producera dessa pellets17,18. Vid bearbetning och inbäddning kan pelletsna användas på liknande sätt som vävnader. Detta inkluderar att använda dem med värmeinducerade och enzymatiska antigenhämtningsprotokoll för immunhistokemiska experiment. Ett syfte med de metoder som används i detta protokoll är att bevara cellernas morfologi och antigenicitet under hela processen. Därför används EDTA, som är relativt mild när det gäller förändringar i både morfologin och antigeniciteten, för att lossa cellerna. Detta betyder inte att andra tillvägagångssätt, såsom fysiska störningar, inte är livskraftiga; Varje tillvägagångssätt för att lossa celler bör dock säkerställa att cellerna inte skadas i processen. Det andra syftet med detta protokoll är att fixera och bearbeta cellerna på ett sätt som liknar vävnader, med samma fixerings-, fixativförhållande, bearbetningsschema (fixering, uttorkning, clearing och paraffininfiltration) och inbäddningstekniker, så att de kan fungera som jämförbara kontroller för nedströmsanalyser. Därför bör de fixerings- och bearbetningsmetoder som används för att generera cellpellets efterlikna de metoder som används för vävnader.
Protokollet som beskrivs i denna rapport är inte anpassat för att hantera celler med smittämnen, såsom celler infekterade med patogena bakterier eller virus, eftersom celler lossnar, samlas in och centrifugeras före fixering. Utredare kan överväga protokoll för att fixa cellerna före lossning, men detta skulle kräva ytterligare optimering för att samla cellerna utan att störa cellmorfologin. Dessutom kräver fixeringstider och hanteringsförhållanden för celler med smittämnen ytterligare överväganden baserade på smittämnet och tillhörande institutionella biosäkerhetsprotokoll.
Formalinfixerade, paraffininbäddade cellpellets är unikt fördelaktiga för att ha väldefinierade proteinuttrycksnivåer10. Medan cancer och endogena cellinjer erbjuder ett urval av celler med varierande nivåer av proteinuttryck, gör genteknikteknik det möjligt för forskare att modellera proteinuttrycket genom överuttryckande proteiner av intresse och användning av CRISPR-teknik för att skära ut eller infoga kodande gener av intresse20,21 . Nackdelen med överuttryckta proteiner i cellinjer är att de är dåliga mått på känsligheten hos en analys eftersom de kanske inte representerar endogena proteinnivåer22. Däremot kan både endogena cellinjer och cancercellinjer bättre representera endogena uttrycksnivåer, och CRISPR-medierad radering av den kodande genen i en kognatlinje kan fungera som en motsvarande negativ kontroll. Dessutom är endogena cellinjer eller cancercellinjer med varierande nivåer av proteinuttryck idealiska för titreringsexperiment för att välja slutliga antikroppsutspädningar och för att bäst förstå känsligheten hos en analys (figur 2). Beslutet kring vilka cellinjer som ska användas bör baseras på individuella experimentella behov och kommer ofta att använda en kombination av tillvägagångssätt.
Förutom att utvärdera om en antikropp kan detektera proteinet av intresse, kan en panel av cellinjer användas för att definiera en antikropps specificitet. Till exempel kan en panel av cellinjer som individuellt uttrycker en familj av närbesläktade proteiner användas för att testa om en antikropp är specifik för ett enskilt protein eller om den också detekterar andra närbesläktade proteiner. Mer detaljerade kontroller kan innebära att man använder cellinjer som uttrycker, antingen genom CRISPR-knock-in eller genom överuttryck, proteiner med punktmutationer som inte kan genomgå specifika signalhändelser som detekteras (t.ex. mutation på specifika fosforyleringsställen vid utvärdering av en fosfospecifik antikropp). Även om dessa är mer komplexa tillvägagångssätt kan de vara nödvändiga för att bekräfta att antikroppen endast använde etiketter under specifika omständigheter10.
Det är viktigt att notera att genetiska manipuleringar av cellinjer kanske inte genererar en homogen cellpopulation. Till exempel är transfektionseffektiviteten vid överuttryck av cellinjer vanligtvis inte 100% och vissa celler kanske inte överuttrycker proteinet av intresse. Inkludering av FLAG eller en relaterad tagg i transfektionen som kan detekteras med standardmetoder kan vara till hjälp för att bedöma transfektionseffektiviteten hos cellinjen23. Detta kan vara till hjälp både för att avgöra om transfektionen lyckades och utesluta brist på detektion på grund av proteinuttrycket, och för att fungera som referens för den förväntade andelen celler som bör uttrycka proteinet av intresse.
In situ hybridisering (ISH) kan också vara ett fördelaktigt verktyg för att karakterisera målgenuttrycket i cellpellets och informera IHC-metodutveckling10. Vid screening av antikroppar kan det vara informativt att veta när transkriptet, och därmed det potentiella proteinet, kan detekteras. Dessutom kan cellpellets ISH-screening vara till nytta för ISH-metodutveckling. Även om specificitet är mindre ofta ett problem för ISH-analyser, är det fortfarande viktigt att ha lämpliga kontroller och liknande överväganden för utveckling och användning av kontroller som kan tillämpas på ISH-studier.
Vävnadsmikroarrayer skapas genom att ta bort kärnor från givarblock och överföra dessa kärnor, ofta i ett rutmönster, till ett mottagarparaffinblock. I slutändan innehåller mottagarblocket ett spektrum av prover i ett enda block, vilket gör det möjligt för alla prover i blocket att gå igenom identiska IHC-procedurer och möjliggöra direkt jämförelse av flera prover på samma bild24,25. Eftersom cellpellets är relativt enhetliga populationer kan de representeras exakt av 1 mm kärnor, vilket gör dem till idealiska kandidater för inkludering i liknande arrays. Med hjälp av en cellpelletsuppsättning är det möjligt att inkludera cellpellets med varierande uttrycksnivåer, cellpellets som unikt uttrycker relaterade proteiner och cellpellets som uttrycker ortologer av proteinet av intresse från olika arter i en enda bild (figur 3). Detta gör att alla cellpellets kan utvärderas samtidigt under enhetliga förhållanden på ett snabbt sätt, samtidigt som användningen av reagenserminimeras 25.
För detta protokoll rekommenderas en minsta startcellpelletsvolym på 2 ml som samlats in från åtta T175-kolvar. Denna volym möjliggör produktion och arkivering av flera cellpelletsblock, så att cellpelletskontroller kan standardiseras över längre tidsperioder och flera cellpelletsmatriser kan skapas från en given pellets. Lägre cellpelletsvolymer kan användas vid hantering av primära patient-härledda cellinjer, långsamt växande cellinjer eller när förhållandena begränsar provets volym. Naturligtvis kommer lägre startvolymer att förstärka den negativa påverkan från eventuell cellförlust under fixering och beredning av pelleten och kommer att begränsa det material som är tillgängligt för nedströmsprocesser. Det är särskilt viktigt att vara försiktig när du tar bort fixativ efter centrifugering för att minimera eventuell tillhörande förlust. För lägre provvolymer kan ett 1,5 ml, täckt centrifugrör användas för att pelletera cellerna. Dessa rör kan korsas i längdriktningen med ett blad för bearbetning.
I likhet med vävnadsfixering är cellfixering inom denna pellet avgörande för nedströms IHC-bedömningar. För att uppnå fullständig fixering använder vi minst ett 10: 1 formalin till cellpelletsförhållande och inverterar det koniska röret för att hålla cellerna i suspension. Om cellerna inte är i suspension vid tidpunkten för fixeringen finns det risk för ofullständig eller otillräcklig fixering, vilket kommer att påverka nedströms immunmärkning. Ofta manifesteras detta som stark märkning i periferin och förlust av märkning i mitten av pelleten eller märkning av varierande intensitet i hela pelleten.
Detta protokoll använder Histogel, som huvudsakligen består av hydroxietylagaros, för att både binda cellpelleten och för att göra det möjligt för cellerna att fördelas jämnt över cellpelleten. Utan det blir cellerna komprimerade och förlorar sina cytomorfologiska detaljer. Dessa cytomorfologiska detaljer är ofta viktiga under antikroppsscreening, eftersom de ger ytterligare information om huruvida antikroppen är märkt i lämpligt subcellulärt fack (t.ex. kärnan, cytoplasman eller plasmamembranet). Däremot kan för mycket gel resultera i lägre celltätheter i pelleten, vilket leder till att cellerna distribueras brett och minskar cellantalet per sektion.
Detta protokoll kan rutinmässigt användas för att utveckla IHC-kontroller. Materialen som behövs för att skapa dessa pellets är vanliga i undersökande biologi- och histologilaboratorier, och metoderna är enkla och lätta att anpassa. Medan cellpellets har begränsningar som IHC-kontroller, fungerar de som bra verktyg för initial antikroppsscreening och kompletterar andra vävnadskontroller.
Disclosures
Alla författare är anställda av Genentech / Roche och är som sådana aktieägare i Roche.
Acknowledgments
Vi vill uppmärksamma samarbetet mellan våra kollegor i Genentechs forskningsorganisation, och särskilt patologikärnlaboratorierna (P-core) som bidragit till utvecklingen av dessa metoder genom åren.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% Neutral Buffered Formalin | VWR | 16004-128 | |
| 50 mL Conical Tube | Becton Dickinson Labware | #0747-1886 | |
| 70% Ethanol | Koptec | V1401 | |
| 95% Ethanol | Koptec | V1101 | |
| Biopsy Wraps | Surgipath Medical Industries, Inc | #01090 | |
| Costar Stripette serological pipette 10mL | Corning | CLS4101 | |
| Flex 100 | Epredia | 8101 | |
| Flex 95 | Epredia | 8201 | |
| Histogel | Thermo Scientific | #R904012 | |
| Leica Automated Rotary Microtome | Leica | RM2255 | |
| Micro Spatula, rounded and tapered ends | Tedd Pella | #13510 | |
| NanoZoomer 2.0 HT whole slide imager | Hamamatsu | ||
| Paraplast Tissue Infiltration/Embedding Paraffin | Surgipath | 39601006 | |
| Pipette Controller | CAPP | PA-100 | |
| Reagent Alcohol | Epredia | 9111 | |
| Sterling Probe 5” 2mm Tip with Eye | Roboz Surgical Instrument Co., Inc | #RS-9522 | |
| Superfrost Plus positively charged microscope slides | Thermo Scientific | 6776214 | |
| Tissue cassettes; PrintMate Slotted Cassette | Epredia | B851120WH | |
| TMA Tissue Grand Master | 3DHistech LTD | ||
| Xylenes | VWR | 89370-088 |
References
- Wennerberg, A. E., Nalesnik, M. A., Coleman, W. B. Hepatocyte paraffin 1: a monoclonal antibody that reacts with hepatocytes and can be used for differential diagnosis of hepatic tumors. American Journal of Pathology. 143 (4), 1050-1054 (1993).
- Chu, P. G., Ishizawa, S., Wu, E., Weiss, L. M. Hepatocyte antigen as a marker of hepatocellular carcinoma. American Journal of Surgical Pathology. 26 (8), 978-988 (2002).
- Cobleigh, M. A., et al. Multinational study of the efficacy and safety of humanized anti-HER2 monoclonal antibody in women who have HER2-overexpressing metastatic breast cancer that has progressed after chemotherapy for metastatic disease. Journal of Clinical Oncology. 17 (9), 2639-2648 (1999).
- Vogel, C. L., et al. Efficacy and safety of trastuzumab as a single agent in first-line treatment of HER2-overexpressing metastatic breast cancer. Journal of Clinical Oncology. 20 (3), 719-726 (2002).
- Webster, J. D., Miller, M. A., DuSold, D., Ramos-Vara, J. A. Effects of prolonged formalin fixation on the immunohistochemical detection of infectious agents in formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. Veterinary Pathology. 47 (3), 529-535 (2010).
- Havnar, C., et al. Characterization of tumor-immune microenvironment by high-throughput image analysis of CD8 immunohistochemistry combined with modified Masson's trichrome. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 69 (9), 611-615 (2021).
- Newton, K., et al. RIPK1 inhibits ZPB1-driven necroptosis during development. Nature. 540 (7631), 129-133 (2016).
- Webster, J. D., Solon, M., Haller, S., Newton, K. Detection of necroptosis by phospho-RIPK3 immunohistochemical labeling. Methods in Molecular Biology. 1857, 153-160 (2018).
- Ramos, J. A., Miller, M. A., et al. When antibodies and antigens get along: revisiting the technical aspects of immunohistochemistry-the red, brown, and blue technique. Veterinary Pathology. 51 (1), 42-87 (2014).
- Webster, J. D., Solon, M., Gibson-Corley, K. N. Validating immunohistochemistry assay specificity in investigative studies: consideration for a weight of evidence approach. Veterinary Pathology. 58 (5), 829-840 (2021).
- Ramos-Vara, J. A., et al. American association of veterinary laboratory diagnosticians subcommittee on standardization of immunohistochemistry suggested guidelines for immunohistochemical techniques in veterinary diagnostic laboratories. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation. 20 (4), 393-413 (2008).
- Dominguez, S., et al. Genetic inactivation of RIP1 kinase does not ameliorate disease in a mouse model of ALS. Cell Death and Differentiation. 28 (3), 915-931 (2021).
- Lean, F. Z. X., et al. Differential susceptibility of SARS-CoV-2 in animals: evidence of ACE2 host receptor distribution in companion animals, livestock and wildlife by immunohistochemical characterization. Transboundary and Emerging Disease. , 14232 (2021).
- Dunstan, R. W., Wharton, K. A., Quigley, C., Lowe, A. The use of immunohistochemistry for biomarker assessment-can it compete with other technologies. Toxicologic Pathology. 39 (6), 988-1002 (2011).
- Atcc.org. , Available from: http://www.atcc.org (2022).
- Thermo Fisher Scientific. Cell Culture Basics Handbook. , Gibco. (2020).
- Carson, F. Histotechnology: A Self-Instructional Text, 2nd Ed. , ASCP Press. Chicago, IL. (1997).
- Suvarna, S. K., Layton, C., Bancroft, J. D. Tissue Processing. Bancroft's Theory and Practice of Histological Techniques, 7th Ed. Spencer, L. T., Bancroft, J. D. , Churchill Livingstone-Elsevier. China. (2013).
- Dancau, A. M., Simon, R., Mirlacher, M., Sauter, G. Tissue Microarrays. Cancer Gene Profiling. , Humana Press. New York. 53-65 (2016).
- Jinek, M., et al. Programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
- Jinek, M., et al. RNA-programmed genome editing in human cells. eLife. 2, 00471 (2013).
- Hewitt, S. M., Baskin, D. G., Frevert, C. W., Stahl, W. L., Rosa-Molinar, E. Controls for immunohistochemistry: The Histochemical Society's standards of practice for validation of immunohistochemical assays. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 62 (10), 693-697 (2014).
- Ferrando, R., Newton, K., Chu, F., Webster, J., French, D. Immunohistochemical detection of FLAG-tagged endogenous proteins in knock-in mice. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 63 (4), 244-255 (2015).
- Kononen, J., et al. Tissue microarrays for high-throughput molecular profiling of tumor specimens. Nature Medicine. 4 (7), 844-847 (1998).
- Moch, H., Kononen, J., Kallioniemi, O. P., Sauter, G. Tissue microarrays: what will they bring to molecular and anatomic pathology. Advances in Anatomic Pathology. 8 (1), 14-20 (2001).
