Summary
Een zelfgeassembleerd peptide-poloxamine nanodeeltje (PP-sNp) wordt ontwikkeld met behulp van een microfluïdisch mengapparaat om in vitro getranscribeerd boodschapper-RNA in te kapselen en af te leveren. Het beschreven mRNA/PP-sNp kon in vitro efficiënt gekweekte cellen transfecteren.
Abstract
In vitro getranscribeerde messenger RNA (mRNA) vaccins hebben een enorm potentieel getoond in de strijd tegen de coronavirusziekte 2019 (COVID-19) pandemie. Efficiënte en veilige toedieningssystemen moeten worden opgenomen in de mRNA-vaccins vanwege de fragiele eigenschappen van mRNA. Een zelfgeassembleerd peptide-poloxamine nanodeeltje (PP-sNp) genafgiftesysteem is specifiek ontworpen voor de pulmonale afgifte van nucleïnezuren en vertoont veelbelovende mogelijkheden bij het bemiddelen van succesvolle mRNA-transfectie. Hier wordt een verbeterde methode voor het bereiden van PP-sNp beschreven om uit te werken hoe de PP-sNp Metridia luciferase (MetLuc) mRNA inkapselt en met succes gekweekte cellen transfecteert. MetLuc-mRNA wordt verkregen door een in vitro transcriptieproces van een lineair DNA-sjabloon. Een PP-sNp wordt geproduceerd door synthetische peptide/poloxamine te mengen met mRNA-oplossing met behulp van een microfluïdische mixer, waardoor de zelfassemblage van PP-sNp mogelijk is. De lading van PP-sNp wordt vervolgens geëvalueerd door het zetapotentiaal te meten. Ondertussen worden de polydispersiteit en hydrodynamische grootte van PP-sNp nanodeeltjes gemeten met behulp van dynamische lichtverstrooiing. De mRNA/PP-sNp nanodeeltjes worden getransfecteerd in gekweekte cellen en supernatanten uit de celcultuur worden getest op luciferase-activiteit. De representatieve resultaten tonen hun vermogen tot in vitro transfectie aan. Dit protocol kan licht werpen op de ontwikkeling van mRNA-vaccinafgiftesystemen van de volgende generatie.
Introduction
Vaccinatie is aangekondigd als een van de meest efficiënte medische interventies voor het verminderen van de morbiditeit en mortaliteit veroorzaakt door infectieziekten1. Het belang van vaccins is aangetoond sinds de uitbraak van coronavirusziekte 2019 (COVID-19). In tegenstelling tot het traditionele concept van het injecteren van geïnactiveerde of levend verzwakte pathogenen, concentreren state-of-the-art vaccinbenaderingen, zoals vaccins op basis van nucleïnezuur, zich op het behoud van de immuunstimulerende eigenschappen van de doelpathogenen, terwijl de potentiële veiligheidsproblemen in verband met het conventionele geheel-microbiële virus- of in op bacteriën gebaseerde vaccins worden vermeden. Zowel DNA- als RNA (d.w.z. in vitro getranscribeerd boodschapper-RNA, IVT-mRNA) -gebaseerde vaccins vertonen profylactisch tot therapeutisch potentieel tegen een verscheidenheid aan ziekten, waaronder infectieziekten en kankers 2,3. In principe heeft het potentieel van op nucleïnezuur gebaseerde vaccins betrekking op hun productie, werkzaamheid en veiligheid4. Deze vaccins kunnen op een celvrije manier worden vervaardigd om kosteneffectieve, schaalbare en snelle productie mogelijk te maken.
Een enkel vaccin op basis van nucleïnezuur kan coderen voor meerdere antigenen, waardoor het doelwit van talrijke virale varianten of bacteriën met een verminderd aantal inentingen mogelijk wordt en de immuunrespons tegen veerkrachtige pathogenen wordt versterkt 5,6. Bovendien kunnen op nucleïnezuur gebaseerde vaccins het natuurlijke invasieproces van virus- of bacteriële infectie nabootsen, waardoor zowel B-cel- als T-celgemedieerde immuunresponsen worden gebracht. In tegenstelling tot sommige virus- of DNA-gebaseerde vaccins, bieden IVT-mRNA-gebaseerde vaccins een enorm voordeel in termen van veiligheid. Ze kunnen snel het gewenste antigeen in het cytosol tot expressie brengen en zijn niet geïntegreerd in het gastheergenoom, waardoor zorgen over insertionele mutageneseworden weggenomen 7. IVT-mRNA wordt automatisch afgebroken na succesvolle translatie, zodat de kinetiek van de eiwitexpressie gemakkelijk kan worden gecontroleerd 8,9. Gekatalyseerd door de pandemie van het severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2), hebben inspanningen van bedrijven / instellingen over de hele wereld de introductie van vele soorten vaccins op de markt mogelijk gemaakt. Ivt-mRNA-gebaseerde vaccintechnologie toont een groot potentieel en heeft voor het eerst zijn eerder verwachte succes aangetoond, dankzij het snelle ontwerp en het flexibele vermogen om zich binnen enkele maanden aan te passen aan doelantigenen. Het succes van IVT-mRNA-vaccins tegen COVID-19 in klinische toepassingen opende niet alleen een nieuw tijdperk van onderzoek en ontwikkeling van IVT-mRNA-vaccins, maar heeft ook waardevolle ervaring opgedaan voor de snelle ontwikkeling van effectieve vaccins voor het omgaan met uitbraken van infectieziekten10,11.
Ondanks het veelbelovende potentieel van IVT-mRNA-vaccins, blijft de efficiënte intracellulaire afgifte van IVT-mRNA op de plaats van actie (d.w.z. cytoplasma) een belangrijke hindernis vormen12, vooral voor degenen die via de luchtwegen worden toegediend4. IVT-mRNA is inherent een onstabiel molecuul met een extreem korte halfwaardetijd (~ 7 h)13, waardoor IVT-mRNA zeer gevoelig is voor afbraak door het alomtegenwoordige RNase14. De lymfocyten van het aangeboren immuunsysteem hebben de neiging om het erkende IVT-mRNA te verzwelgen in gevallen van in vivo toepassing. Bovendien schaden de hoge negatieve ladingsdichtheid en het grote molecuulgewicht (1 x 104-1 x 106 Da) van IVT-mRNA de effectieve permeatie ervan over de anionische lipide-bilaag van cellulaire membranen15. Daarom is een afgiftesysteem met bepaalde bio-functionele materialen nodig om de afbraak van de IVT-mRNA-moleculen te remmen en cellulaire opnamete vergemakkelijken 16.
Afgezien van een paar uitzonderlijke gevallen waarin naakt IVT-mRNA direct werd gebruikt voor in vivo onderzoek, worden verschillende toedieningssystemen gebruikt om IVT-mRNA naar de therapeutische plaats van actie te brengen17,18. Eerdere studies hebben aangetoond dat slechts enkele IVT mRNA's worden gedetecteerd in cytosol zonder de hulp van een toedieningssysteem19. Er zijn talloze strategieën ontwikkeld om de RNA-afgifte te verbeteren met voortdurende inspanningen in het veld, variërend van protaminecondensatie tot lipideninkapseling20. Lipide nanodeeltjes (LNP's) zijn de meest klinisch geavanceerde onder de mRNA-toedieningsvoertuigen, zoals blijkt uit het feit dat alle goedgekeurde mRNA COVID-19-vaccins voor klinisch gebruik gebruik maken van op LNP gebaseerde toedieningssystemen21. LNP's kunnen echter geen effectieve mRNA-transfectie bemiddelen wanneer de formuleringen worden toegediend via de ademhalingsroute22, wat de toepassing van deze formuleringen opmerkelijk beperkt bij het induceren van mucosale immuunresponsen of het aanpakken van longgerelateerde ziekten zoals cystische fibrose of α1-antitrypsinedeficiëntie. Daarom is het ontwikkelen van een nieuw toedieningssysteem nodig om de efficiënte levering en transfectie van IVT-mRNA in luchtweggerelateerde cellen te vergemakkelijken om deze onvervulde behoefte op te lossen.
Het is bevestigd dat het peptide-poloxamine zelfgeassembleerde nanodeeltjes (PP-sNp) afgiftesysteem de efficiënte transfectie van nucleïnezuren in de luchtwegen van muizen kan bemiddelen23. De PP-sNp hanteert een multifunctionele modulaire ontwerpbenadering, die verschillende functionele modules in de nanodeeltjes kan integreren voor snelle screening en optimalisatie23. De synthetische peptiden en elektrisch neutrale amfifiele blokcopolymeren (poloxamine) in de PP-sNp kunnen spontaan interageren met IVT-mRNA om uniform verdeelde nanodeeltjes te genereren met een compacte structuur en een glad oppervlak23. PP-sNp kan het gentransfectie-effect van IVT-mRNA-moleculen in gekweekte cellen en de luchtwegen van muizen verbeteren23. De huidige studie beschrijft een protocol voor het genereren van PP-sNp bevattend IVT-mRNA dat codeert voor Metridia luciferase (MetLuc-mRNA) (Figuur 1). Gecontroleerd en snel mengen via een microfluïdisch mengapparaat, dat gebruik maakt van het gespreide visgraatmengontwerp, wordt in dit protocol gebruikt. De procedure is eenvoudig uit te voeren en maakt het genereren van PP-sNp met meer uniforme maten mogelijk. Het algemene doel van PP-sNp-productie met behulp van de microfluïdische mixer is om PP-sNp voor mRNA-complexatie op een goed gecontroleerde manier te creëren, waardoor efficiënte en reproduceerbare celtransfectie in vitro mogelijk is. Het huidige protocol beschrijft de voorbereiding, assemblage en karakterisering van PP-sNp met MetLuc-mRNA.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. In vitro transcriptie van chemisch gemodificeerd mRNA
OPMERKING: Het is vereist om nucleasevrije buizen, reagentia, glaswerk, pipetpunten, enz. Te gebruiken, omdat RNases alomtegenwoordig zijn in het milieu, zoals laboratoriumoplossingen, instrumentoppervlakken, haar, huid, stof, enz. Reinig de bankoppervlakken en pipetten grondig voor gebruik en draag handschoenen om RNase-besmetting te voorkomen.
- Voer linearisatie van het DNA-sjabloon uit.
- Synthetiseer het open leesframe (ORF) van Metridia luciferase (MetLuc) geflankeerd door een T7-polymerasepromotor, 5 'onvertaald gebied (UTR), 3'UTR en poly (A) staarten en kloon het in de PUC57-vector, die tot expressie komt in bacteriën (zie Materiaaltabel).
OPMERKING: De coderende sequentie van het DNA-sjabloon is opgenomen in aanvullend bestand 1. - Kweek bacteriën, lyseer de bacteriën en zuiver het plasmide-DNA door de bijbehorende kolom (zie plasmide-DNA-extractiekit in de materiaaltabel).
- Voer een enkele reactie van 50 μL uit die 2 μL BamHI, 2 μL KpnI (zie Tabel van materialen) en 2 μg plasmide-DNA bij 37 °C gedurende 1 uur bevat, en bereik linearisatie van het DNA-sjabloon.
- Synthetiseer het open leesframe (ORF) van Metridia luciferase (MetLuc) geflankeerd door een T7-polymerasepromotor, 5 'onvertaald gebied (UTR), 3'UTR en poly (A) staarten en kloon het in de PUC57-vector, die tot expressie komt in bacteriën (zie Materiaaltabel).
- Voer in vitro transcriptie uit om uncapped-IVT mRNA te genereren.
- Voer mRNA-synthese uit door een enkele reactie van 20 μL met behulp van een T7-transcriptiekit en pseudouridine (zie materiaaltabel): 10 μL (0,8-1 μg) gelineariseerd DNA-sjabloon, 1,5 μL (150 mM) ATP, pseudo-UTP, GTP en CTP, 2 μL 10x transcriptiebuffer, 1 μL T7-enzym en 1 μL nucleasevrij water (NF-water). Meng de bovengenoemde componenten grondig en incubeer gedurende 3 uur bij 37 °C.
- Verwijder het sjabloon-DNA.
- Voeg na het transcriptieproces 1 μL (1 U) DNase (RNase-vrij) toe en incubeer bij 37 °C gedurende 15 min.
- Voer uncapped-IVT mRNA-zuivering uit met behulp van lithiumchlorideprecipitatie.
- Zuiver het niet-afgedekte IVT-mRNA met behulp van lithiumchloride (zie Materiaaltabel) met een werkconcentratie van 10 mM. Voeg 50 μL 10 mM lithiumchloride toe aan 20 μL niet-afgedekte IVT-mRNA-oplossing.
- Meng het volledige volume grondig en koel gedurende 1 uur af op −20 °C. Verzamel het niet-afgetopte IVT-mRNA gedurende 12 minuten bij 12.000 x g, dat routinematig 80-120 μg niet-afgetopt IVT-mRNA produceert uit elke afzonderlijke 20 μL-reactie.
- Voer IVT-mRNA-afdekking uit.
- Voer de IVT-mRNA-afdekking uit met behulp van het dop 1-afdeksysteem (zie Materiaaltabel). Verwijder in het kort de secundaire structuur van 50 μg uncapped-IVT-mRNA door gedurende 10 minuten op 65 °C te verwarmen en koppel vervolgens het 5'-uiteinde van uncapped-IVT-mRNA aan dop 1, die wordt bereid door de m7G-dopstructuur te wijzigen met behulp van 2,5 μL s-adenosylmethionine (SAM) (20 mM) en 4 μL 2'-O-methyltransferase (100 U) in een reactie van 100 μL bij 37 °C gedurende 30-60 min.
- Zuiver 100 μL van het afgedekte IVT-mRNA met behulp van 250 μL lithiumchloride en verdun in 50 μL NF-water.
- Bepaal de zuiverheid en moleculaire grootte van capped-IVT mRNA.
- Meet de concentratie van capped-IVT mRNA met een UV-zichtbare spectrofotometer. Analyseer met behulp van een RNA-marker (zie Tabel van materialen) de moleculaire grootte van capped-IVT-mRNA in een 1% formaldehyde denaturerende agarose-gel die 18% formaldehyde bevat (spanning is 120 V). Zorg ervoor dat het uncapped-IVT-mRNA en capped-IVT-mRNA worden opgeslagen bij −80 °C.
OPMERKING: Het IVT-mRNA werd geacht een goede zuiverheid te hebben in een A260/A280-verhouding van 1,8-2,1 en een A260/A230-verhouding van 2,0 of iets hoger.
- Meet de concentratie van capped-IVT mRNA met een UV-zichtbare spectrofotometer. Analyseer met behulp van een RNA-marker (zie Tabel van materialen) de moleculaire grootte van capped-IVT-mRNA in een 1% formaldehyde denaturerende agarose-gel die 18% formaldehyde bevat (spanning is 120 V). Zorg ervoor dat het uncapped-IVT-mRNA en capped-IVT-mRNA worden opgeslagen bij −80 °C.
2. Generatie van IVT mRNA/PP-sNp
- Bereid poloxamine 704 (T704) stockoplossing door de T704 (zie materiaaltabel) in NF-water op te lossen om een voorraadoplossing van 10 mg / ml te verkrijgen. Bewaar de bereide oplossing bij 4 °C.
OPMERKING: T704 bevat een X-vormige structuur gemaakt van een centrale groep van ethyleendiamine gebonden aan vier ketens van poly (propyleenoxide) (PPO) blokken en poly (ethyleenoxide) (PEO) blokken24. Het molecuulgewicht (Mw) van T704 is 5500. - Bereid de synthetische peptide (sPep, zie Tabel van materialen) stockoplossing door de sPep op te lossen (sequentie: KETWWETWWTEWWTEWKKKKRRRRRKKKKGACSE
RSMNFCG) in NF-water om een 2 mg/ml stamoplossing te verkrijgen en te bewaren bij 4 °C. - Bereid de IVT-mRNA-oplossing door het IVT-mRNA (stap 1) op ijs te ontdooien en kort gedurende 3 s bij 300 x g bij kamertemperatuur te centrifugeren voordat de buis wordt geopend. Verdun de IVT-mRNA-oplossing tot 0,04 μg/μL met NF-water.
OPMERKING: Het wordt aanbevolen om waar mogelijk in een bioveiligheidskast te werken met het IVT-mRNA. - Bereid T704 en sPep mengoplossing door de sPep-oplossing te verdunnen tot 0,555 μg/μL en de T704-oplossing tot 8 μg/μL met NF-water. Incubeer de gemengde oplossing gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur voordat u deze verder gebruikt.
OPMERKING: Bereken de vereiste sPep-component op basis van de gewenste N/P-verhouding. De N/P-verhouding is het totale aantal stikstofresiduen (N) binnen de sPep tot het totale aantal negatief geladen fosfaatgroepen (P) binnen het IVT-mRNA. Bereken de vereiste T704 op basis van de verhouding gewicht/gewicht (g/w) tussen T704 en IVT-mRNA. Het is noodzakelijk dat de N/P-verhouding 5 is en de w/w-verhouding 100. - Bereid de IVT-mRNA/PP-sNp-formulering voor volgens de onderstaande stappen.
- Zuig de IVT-mRNA-oplossing (stap 3) in een spuit van 1 ml, zodat er geen luchtspleten of bellen in de punt van de spuit zitten. Plaats de spuit in één zijde van de patroon naast het roterende blok.
- Vul een spuit van 1 ml met de T704 en sPep mix oplossing (stap 4). Verwijder eventuele luchtbellen of luchtspleten aan de punt van de spuit en plaats de spuit in de andere inlaat van de pomp (zie materiaaltabel).
- Stel de pomp in met een debietverhouding van 1:1 en een totaal debiet van 4-10 ml/min.
OPMERKING: Een totaal debiet van 6 ml/min is optimaal in de hier gepresenteerde onderzoeken. - Plaats een 10 ml RNase-vrije conische buis (zie materiaaltabel) om de gemengde IVT-mRNA/PP-sNp-oplossing aan het einde van het stroompad van het mengapparaat te verzamelen.
- Laat de pomp draaien om het mengen te starten en zorg ervoor dat de parameters correct worden ingevoerd. Nadat de pomp klaar is met draaien gedurende 6 s, verzamelt u het IVT-mRNA / PP-sNp-monster uit de conische buis.
OPMERKING: PP-sNp werden gegenereerd met behulp van een microfluïdische mixer (aanvullende figuur 1). Het apparaat bestaat uit een constante stroompomp, linkapparaat, chip en vast apparaat. In het mengproces levert de constante stroompomp die op de chip is aangesloten vloeistof aan de chip volgens het vooraf ingestelde debiet. De aangesloten constante stroompomp kan worden aangesloten op meerdere ingangskanalen van de chip met een enkel uitgangskanaal. De componenten van het apparaat, inclusief de chip, werden verkregen uit commerciële bronnen en rationeel geassembleerd (zie materiaaltabel). De parameters, zoals het debiet en het volume van de IVT-mRNA-oplossing en de gemengde T704-sPep-oplossing, kunnen verschillen van de parameters die in het huidige protocol worden weergegeven als een andere opstelling wordt gebruikt en dienovereenkomstig moeten worden geoptimaliseerd.
3. Meting van de hydrodynamische diameter en polydispersiteit van IVT-mRNA/PP-sNp
- Verdun een aliquot van de IVT mRNA/PP-sNp oplossing (stap 2) met NF-water om een eindvolume van 1 ml te verkrijgen.
- Meet de hydrodynamische grootte en polydispersiteitsindex (PDI) met behulp van een semi-micro cuvette25. Voeg de IVT-mRNA/PP-sNp-oplossing toe aan het cuvet en plaats deze in de deeltjesgroottemeter (zie Materiaaltabel). Stel een standaard operationele procedure in en klik op Start om de gegevensverzameling te starten.
4. Voorbereiding van de cellen voor transfectie
- Plaat menselijke bronchiale epitheelcellen (16HBE) en een dendritische cellijn (DC2.4) in 96-well-platen met een dichtheid van 3,5 x 104 cellen/put 24 uur voorafgaand aan transfectie. Kweek de cellen in een kweekmedium aangevuld met 10% hitte-geïnactiveerd foetaal runderserum en 1% penicilline/streptomycine.
OPMERKING: De cellen zijn verkregen uit een commerciële bron (zie materiaaltabel). - Incubeer de cellen in een incubator (37 °C en 5% CO2 atmosfeer) gedurende 24 uur om ervoor te zorgen dat de cellen 60% -80% confluent zijn vóór de transfectie.
5. Transfectie van de gekweekte cellen
- Was na het verwijderen van het groeimedium de vergulde cellen met 0,2 ml/put 1x PBS.
- Voeg 170 μL serumvrij kweekmedium toe aan elk putje dat de vergulde celculturen bevat.
- Voeg de IVT-mRNA/PP-sNp-formulering met 0,4 μg MetLuc-mRNA (bereid in stap 2) druppelsgewijs toe met een hoeveelheid van 30 μL/put.
- Incubeer de cellen met de IVT mRNA/PP-sNp formulering bij 37 °C in een bevochtigde 5% CO2-verrijkte atmosfeer gedurende 4 uur.
- Vervang het transfectiemedium door 0,2 ml vers kweekmedium aangevuld met 10% hitte-geïnactiveerd foetaal runderserum en 1% (v/v) penicilline/streptomycine.
OPMERKING: Het foetale runderserum werd gedurende 30 minuten verwarmd bij 56 °C voor inactivering. - Incubeer de getransfecteerde cellen bij 37 °C en in een 5% CO2-verrijkte atmosfeer gedurende 24 uur en verzamel de supernatanten die uit elke put moeten worden gedetecteerd.
6. Analyse van de werkzaamheid van celtransfectie met behulp van metridia luciferase (MetLuc) assay
- Test het supernatant uit elke put voor MetLuc-activiteit met behulp van coelenterazinesubstraat (zie Tabel met materialen) volgens de onderstaande stappen.
- Bereid een verse testoplossing door 1x PBS toe te voegen aan het coelenterazine-substraat (de concentratie coelenterazine is 15 mM).
- Vortex de coelenterazine oplossing voor 10 s voor grondig mengen.
- Voeg 50 μL supernatant (verzameld in stap 5) toe aan een plaat met 96 putten.
- Stel de microplaatlezer (zie Materiaaltabel) in met een leestijd van 1.000 ms voordat u handmatig of via geautomatiseerde injectie 30 μL coelenterazine-oplossing (15 mM) aan elke put toevoegt.
- Klik op Start om het luminescentiesignaal te meten onmiddellijk na het toevoegen van de coelenterazine-oplossing aan het supernatant.
OPMERKING: Het luminescentiesignaal wordt gemeten met behulp van een microplaatlezer en de activiteit ervan wordt uitgedrukt in relatieve lichteenheden. De waarden die worden verkregen uit PBS-getransfecteerde putten worden gebruikt als blanco controles.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Het recombinante plasmide werd verteerd om het gelineariseerde DNA-sjabloon te produceren (figuur 2A). Met behulp van het beschreven protocol kan de T7 in vitro transcriptiekit tot 80-120 μg ongecapituleerd MetLuc-mRNA per 20 μL-reactie en 50-60 μg afgetopt MetLuc-mRNA per 100 μL-reactie produceren. Bij analyse met elektroforese moet intact MetLuc-mRNA met hoge kwaliteit een enkele en duidelijke band vertonen, zoals weergegeven in figuur 2B. Verontreinigingen die vanuit het DNA-sjabloon in de reactie worden geïntroduceerd, kunnen leiden tot RNA-afbraak en een lagere opbrengst.
PP-sNp met het MetLuc-mRNA (MetLuc-mRNA/PP-sNp) werden bereid met behulp van de microfluïdische mengmethode (figuur 1). Tabel 1 toont de gegevens over de fysisch-chemische karakterisering van de MetLuc-mRNA/PP-sNp als voorbeelden. De hydrodynamische straal van het MetLuc-mRNA/PP-sNp kan als correct worden beschouwd als deze ongeveer 70-100 nm bedraagt. Bovendien moet de PDI van de PP-sNp constant zijn en bij voorkeur lager zijn dan 0,2, maar PDI-waarden tot ongeveer 0,3 worden geaccepteerd.
Na succesvolle integratie van MetLuc-mRNA in de PP-sNp, kan de formulering worden geïncubeerd met 16HBE-cellen en een dendritische cellijn (DC2.4), en de transfectie-efficiëntie van MetLuc-mRNA kan worden aangegeven door de luciferase-activiteit binnen het celkweeksupernatant 24 uur na transfectie. Figuur 3 is een typisch voorbeeld van de succesvolle transfectie van MetLuc-mRNA/PP-sNp. Het is duidelijk te zien dat cellen getransfecteerd met MetLuc-mRNA / PP-sNp significant hogere expressie van luciferase vertoonden in vergelijking met die getransfecteerd met commercieel beschikbare lipide-gebaseerde transfectie regent (LP) (zie Tabel van materialen), naakt MetLuc-mRNA (negatieve controle), PBS (blanco controle) of T704-sPep gemengde oplossing (mock control) in 16HBE-cellen. MetLuc-mRNA/PP-sNp vertoonde ook een hogere expressie van luciferase in vergelijking met LP. De gegevens suggereren dat het PP-sNp-afgiftesysteem belangrijk is voor het beschermen van het MetLuc-mRNA tegen afbraak en voor het bevorderen van de transfectie-efficiëntie van het exogene MetLuc-mRNA. Daarom zijn toedieningssystemen zoals PP-sNp over het algemeen essentieel voor IVT-mRNA-transfectiestudies.
Figuur 1: Schematische weergave van de gehele workflow van IVT mRNA/PP-sNp. Het DNA-sjabloon is gekoppeld aan het plasmide door recombinant plasmideconstructie. Het gelineariseerde DNA-sjabloon wordt samengesteld met behulp van restrictie-enzymvertering. In vitro getranscribeerd mRNA (IVT-mRNA) wordt gesynthetiseerd en afgetopt uit het gelineariseerde DNA-sjabloon. De T704-sPep-oplossing bevat T704 en het synthetische peptide (sPep), terwijl de IVT-mRNA-oplossing MetLuc-mRNA bevat. IVT-mRNA en T704-sPep gemengde oplossingen worden gemengd met behulp van een microfluïdische mixer, die MetLuc-mRNA / PP-sNp vormt. Vervolgens wordt de karakterisering van MetLuc-mRNA/PP-sNp uitgevoerd om de deeltjesgrootte en polydispersiteit te bepalen met behulp van een Zetasizer. 16HBE-cellen worden getransfecteerd met MetLuc-mRNA/PP-sNp en de luciferaseactiviteit in het supernatant wordt gemeten om de transfectie-efficiëntie te evalueren. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: De productie van MetLuc-mRNA. (A) Het DNA-sjabloon bevat een T7-polymerasepromotor, een 5'untraslated region (UTR), een open reading frame (ORF) van MetLuc, een 3'UTR, en poly (A) tails. (B) Elektroforese detectie. De witte pijl geeft recombinant plasmide aan. De gele pijl geeft de PUC57-vector aan. De rode pijl geeft het DNA-sjabloon aan voor de in vitro transcriptie van MetLuc-mRNA. De groene pijl geeft niet-afgetopt MetLuc-mRNA aan. De blauwe pijl geeft afgetopt MetLuc-mRNA aan. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Transfectie-efficiëntie van MetLuc-mRNA/PP-sNp in 16HBE- en DC2.4-cellen. MetLuc-mRNA werd getransfecteerd met pp-snp in (A) 16HBE cellen en (B) een dendritische cellijn (DC2.4). De uiteindelijke concentratie van MetLuc-mRNA was 0,02 μg/μL, die van sPep was 0,139 μg/μL en die van T704 was 2 μg/μL in PP-sNp. Commerciële lipide-gebaseerde transfectieregen (LP) werd aangenomen als een positieve controle. De luciferase-activiteit werd 24 uur na transfectie gemeten. Het pbs-behandelde monster werd aangenomen als een blanco controle. De T704-sPep gemengde oplossing werd gebruikt als een mock control. Statistische verschillen werden geanalyseerd met een Student's t-test (nsp ≥ 0,05, * p < 0,05). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| IVT mRNA | N/P (sPep) | w / w (T704) | Grootte (nm) | Pdi | Zèta |
| 17,5 ng/μL | 5 | 100 | 85,12 ± 9,40 | 0,20 ± 0,07 | -13,07 ± 0,47 |
Tabel 1: Fysisch-chemische karakteriseringsgegevens van het MetLuc-mRNA/PP-sNp.
Aanvullende figuur 1: De opstelling van het in-house geprepareerde microfluïdische apparaat dat in de huidige studie wordt gebruikt. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullend bestand 1: De coderende sequentie van het DNA-sjabloon. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het hier beschreven protocol maakt niet alleen de kosteneffectieve en snelle productie van IVT-mRNA-vaccinformuleringen met gedefinieerde eigenschappen mogelijk, maar biedt ook de mogelijkheid om de PP-sNp-formulering aan te passen aan specifieke therapeutische doeleinden, zoals gentherapie. Om de succesvolle generatie van IVT-mRNA/PP-sNp te garanderen, wordt voorgesteld om extra aandacht te besteden aan enkele kritieke stappen. Wanneer u met mRNA werkt, moet u altijd onthouden dat RNase-vrije omstandigheden gedurende het hele proces moeten worden gehandhaafd, omdat IVT-mRNA zeer gevoelig is met betrekking tot afbraak door RNase, zelfs als het IVT-mRNA is bereid met chemische modificatie. Ondertussen moet ook bij het opslaan van de formuleringen worden gezorgd voor een RNase-vrije omgeving. Het wordt aanbevolen om IVT-mRNA/PP-sNp maximaal 1 week bij 2-8 °C te bewaren. De gepresenteerde resultaten tonen aan dat nucleasevrij water effectief is in het succesvol vormen van PP-sNp met een hoge transfectie-efficiëntie. Andere buffers, zoals PBS, zoutoplossing, OptiMEM, enz., Kunnen indien gewenst worden gebruikt. Het wordt aanbevolen om de in vitro transfecties uit te voeren met ivt-mRNA/PP-sNp in een OptiMEM-medium om de levensvatbaarheid van de gekweekte cellen te waarborgen. Als een andere buffer in plaats van nucleasevrij water wordt gekozen om de formulering te bereiden, is het belangrijk om IVT-mRNA te gebruiken met een lage concentratie (minder dan 100 ng / ml); anders hebben de nanodeeltjes de neiging om te worden neergeslagen, wat op zijn beurt een ongeldige formulering maakt. De oorzaak van dit fenomeen is de kationische groep binnen het synthetische peptide. Bovendien kan de sterke positieve ladingsdichtheid van het nanodeeltje het celmembraan destabiliseren, waardoor een significante cytotoxiciteit wordt geïnduceerd. In de vorige studie werd echter aangetoond dat de positieve lading binnen de PP-sNp noodzakelijk is bij het bemiddelen van efficiënte IVT mRNA cellulaire opname, endosoom ontsnapping en succesvolle transfectie23. Daarom is het belangrijk om de positieve lading binnen de PP-sNp aan te passen om een delicaat evenwicht te vinden in termen van efficiëntie en toxiciteit.
Het gepresenteerde protocol kan worden toegepast op verschillende PP-sNp-gebaseerde formuleringen met enkele parameterwijzigingen. Voor de levering van op IVT-mRNA gebaseerde vaccins zijn biofysische eigenschappen zoals deeltjesgrootte en polydispersiteitsindex van cruciaal belang voor de transfectie-efficiëntie en immunogeniciteit van de bereide nanodeeltjes26. De deeltjesgrootte van het IVT-mRNA/PP-sNp in de nanometerschaal maakt een efficiënte overdracht over fysiologische barrières mogelijk en is daardoor belangrijk voor de daaropvolgende in vivo toepassingen. Er is gemeld dat LNP's in het groottebereik van 60-150 nm robuuste immuunresponsen produceren bij niet-menselijke primaten26. Aan de andere kant konden grote nanodeeltjes (bijv. 400-1000 nm) de luchtwegslijmbarrière niet overwinnen wanneer ze werden toegepast voor pulmonale bevalling, omdat, zoals blijkt uit eerdere onderzoeken, de gemiddelde 3-dimensionale mesh-afstand van luchtwegslijmmaasporiën varieert van ongeveer 60-300 nm27,28. Als de gewenste grootte of transfectie-efficiëntie niet wordt bereikt, omvatten enkele tips voor het oplossen van problemen het aanpassen van de hoeveelheid gebruikte poloxamine of synthetische peptidecomponenten. De vorige studie toonde aan dat aanvullende parameters, zoals de hoeveelheid IVT-mRNA die wordt gebruikt voor transfectie, de incubatietijd en de typen en celdichtheid van gekweekte cellen, ook de uitkomst van de transfectie aanzienlijk kunnen beïnvloeden23. Aangezien het targetinggedeelte binnen de PP-sNp de specifieke afgifte van het ingekapselde IVT-mRNA in cellen met gerelateerde receptoren mogelijk maakt, kan vervanging door alternatieve targetingliganden noodzakelijk zijn als de doelcellen worden getransfecteerd met andere typen in plaats van luchtweggerelateerde cellen. Over het algemeen kan het protocol nog steeds worden verbeterd met meer gedetailleerd inzicht en verder onderzoek.
Aangezien het oorspronkelijke IVT-mRNA/PP-sNp in eerste instantie wordt bereid door directe handmatige menging, spelen de capaciteiten van de operator een belangrijke rol bij het beheersen van de kwaliteit van de formulering. Wijzigingen in het proces van het mengen van het IVT-mRNA met de componenten van de PP-sNp kunnen resulteren in grote microdeeltjes in plaats van deeltjes van nanoformaat. De lastigste stap is het mengen van het mRNA en het synthetische peptide, wat op een gecontroleerde manier moet gebeuren. Om de reproduceerbaarheid tussen verschillende batches IVT-mRNA/PP-sNp-formulering te verbeteren, werd een microfluïdische mixer gebruikt omdat screening op lage volumes, hoge snelheid en reproduceerbaarheid belangrijke kenmerken zijn van het gebruik van de microfluïdische methode29. Deze methode toonde een goede reproduceerbaarheid, zonder significante impact op de deeltjesgrootte of de transfectie-efficiëntie waargenomen tussen verschillende batches. Dit is een essentieel criterium voor ivt-mRNA-gebaseerde vaccins om te worden toegepast in klinische toepassingen. In het bijzonder mag de microfluïdische mixer het maximale aantal gebruikers (aanbevolen door de fabrikant) niet overschrijden en moet deze worden gewijzigd tussen formuleringen met verschillende samenstellingen.
Het protocol van IVT-mRNA-transcriptie dat in dit protocol wordt beschreven, kan theoretisch worden gebruikt om elk rapporteiwit / antigeen van belang te bereiden. De Metridia luciferase (MetLuc) werd specifiek toegepast in deze studie omdat het unieke voordelen heeft. De activiteitstest van MetLuc is gemakkelijk uit te voeren met een hoge gevoeligheid omdat MetLuc een intensief bioluminescent signaal kan produceren en het direct in het celmedium kan worden uitgescheiden, waardoor cellysis wordt vermeden. Het is belangrijk op te merken dat MetLuc-expressie in de gekweekte cellen kan worden beïnvloed door vele parameters (bijv. Variërende celaantallen per put en pipetteerfouten, enz.) anders dan de functionaliteit van het MetLuc-mRNA zelf.
Hoewel het huidige protocol is opgesteld voor de levering van het IVT-mRNA-vaccin, kan het ook worden geïmplementeerd voor vaccins of therapeutica die zijn gebaseerd op andere soorten nucleïnezuren, zoals plasmide-DNA (pDNA). Dit proces kan worden aangepast aan synthetische peptide-, nucleïnezuur- en poloxaminecomponentveranderingen voor het ontwikkelen van bepaalde PP-sNp voor verschillende klinische indicaties. Inderdaad, de genoomintegratie van het exogene cystic fibrosis transmembrane transduction regulator (CFTR) gen in het respiratoire epitheelweefsel van CFTR knock-out muizen met het gebruik van een Doornroosje genetische modificatie tool geleverd door een PP-sNp23 werd met succes bereikt. Met betrekking tot therapeutische toepassingen kunnen IVT-mRNA / PP-sNp-formuleringen worden gebruikt als aerosol met behulp van specifieke vernevelingsapparaten voor de genezing van longziekten, zoals α1-antitrypsinedeficiëntie of cystische fibrose30. Het is echter vermeldenswaard dat IVT-mRNA / PP-sNp-formuleringen voor verneveling moeten worden geoptimaliseerd en aangepast, omdat het aërosolvormige IVT-mRNA inefficiënt kan zijn vanwege de schuifkracht die door de vernevelaar wordt gecreëerd en de fragiele aard van IVT-mRNA30. Bovendien is het protocol mogelijk schaalbaar naar grotere volumes met behulp van verschillende microfluïdische mengapparaten, zoals T-junctiemengapparaten en zelfs impingementstralen mengpompen31,32.
Samenvattend introduceert het hier beschreven protocol een reproduceerbare methode voor het formuleren van IVT-mRNA in een PP-sNp-afgiftesysteem, evenals daaropvolgende betrouwbare transfectie in gekweekte cellen. De beschreven methode garandeert een toegankelijke en eenvoudige aanpak voor het produceren van IVT-mRNA/ PP-sNp met behulp van een microfluïdische mixer. De bereide formuleringen met kleine deeltjesgroottes en een lage polydispersiteitsindex kunnen vervolgens worden toegepast op veilig en efficiënt getransfecteerde gekweekte cellen. Dit protocol zal het op PP-sNp gebaseerde toedieningssysteem in staat stellen om beschikbaar te komen voor de academische gemeenschap voor het ontwerpen van nieuwe op IVT mRNA gebaseerde vaccins of therapeutica, terwijl alle genoemde nadelen worden vermeden. Met de flexibele profielen van PP-sNp wordt verwacht dat tal van toekomstige toepassingen zullen worden bereikt met PP-sNp om verschillende therapieën te produceren om verschillende ziekten aan te pakken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (NSFC, Grant No. 82041045 and 82173764), het grote project van Study on Pathogenesis and Epidemic Prevention Technology System (2021YFC2302500) door het Ministerie van Wetenschap en Technologie van China, het Chongqing Talents: Exceptional Young Talents Project (CQYC202005027) en de Natural Science Foundation of Chongqing (cstc2021jcyj-msxmX0136). De auteurs zijn Dr. Xiaoyan Ding dankbaar voor het meten van de hydrodynamische diameter (nm) en polydispersiteitsindex (PDI).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BamHI | Takara | 1010 | |
| cap 1 capping system | Jinan | M082 | |
| Dendritic cell-line | Sigma | SCC142 | |
| DNA sequence | Genescript | ||
| Human bronchial epithelial cells | Sigma | SCC150 | |
| KpnI | Takara | 1068 | |
| LP | Beyotime | C0533 | |
| Lithium chloride | APEXBio | B6083 | |
| Malvern Zetasizer Nano ZS90 | Malvern | NB007605 | |
| Microfluidic chip | ZHONGXINQIHENG | Standard PDMS chip | |
| Microplate readers | ThermoFisher | Varioskan lux | |
| NanoDrop One | ThermoFisher | ND-ONE-W (A30221) | |
| Nuclease-free water | ThermoFisher | AM9932 | |
| OptiMEM | Gibco | 31985070 | |
| Penicillin-streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Pseudouridine | APE×Bio | B7972 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27106 | |
| Quanti-Luc | InvivoGen | Rep-qlc2 | |
| RiboRuler High Range RNA Ladder | ThermoFisher | SM1821 | |
| RNase-free conical tube | Biosharp | BS-100-M | |
| RPMI Medium 1640 | ThermoFisher | C11875500BT | |
| Syringe pump | Chemyx | Fusion 101 | |
| T7 transcription Kit | Jinan | E131 |
References
- Fehervari, Z., Minton, K., Duarte, J. H. Nature milestones in vaccines. Springer Nature. , Available from: https://www.nature.com/collections/hcajdiajij (2020).
- Barbier, A. J., Jiang, A. Y., Zhang, P., Wooster, R., Anderson, D. G. The clinical progress of mRNA vaccines and immunotherapies. Nature Biotechnology. 40 (6), 840-854 (2022).
- Mulligan, M. J., et al. Phase I/II study of COVID-19 RNA vaccine BNT162b1 in adults. Nature. 586 (7830), 589-593 (2020).
- Tang, J., et al. Nanotechnologies in delivery of DNA and mRNA vaccines to the nasal and pulmonary mucosa. Nanomaterials. 12 (2), 226 (2022).
- Freyn, A. W., et al. A multi-targeting, nucleoside-modified mRNA influenza virus vaccine provides broad protection in mice. Molecular Therapy. 28 (7), 1569-1584 (2020).
- Wu, K., et al. Variant SARS-CoV-2 mRNA vaccines confer broad neutralization as primary or booster series in mice. Vaccine. 39 (51), 7394-7400 (2021).
- Chaudhary, N., Weissman, D., Whitehead, K. A. mRNA vaccines for infectious diseases: Principles, delivery and clinical translation. Nature Reviews Drug Discovery. 20, 817-838 (2021).
- Kormann, M. S. D., et al. Expression of therapeutic proteins after delivery of chemically modified mRNA in mice. Nature Biotechnology. 29 (2), 154-157 (2011).
- Tavernier, G., et al. mRNA as gene therapeutic: How to control protein expression. Journal of Controlled Release. 150 (3), 238-247 (2011).
- Walsh, E. E., et al. Safety and immunogenicity of two RNA-based Covid-19 vaccine candidates. The New England Journal of Medicine. 383 (25), 2439-2450 (2020).
- Baden, L. R., et al. Efficacy and safety of the mRNA-1273 SARS-CoV-2 vaccine. The New England Journal of Medicine. 384 (5), 403-416 (2021).
- Guan, S., Rosenecker, J. Nanotechnologies in delivery of mRNA therapeutics using nonviral vector-based delivery systems. Gene Therapy. 24 (3), 133-143 (2017).
- Sharova, L. V., et al. Database for mRNA half-life of 19 977 genes obtained by DNA microarray analysis of pluripotent and differentiating mouse embryonic stem cells. DNA Research. 16 (1), 45-58 (2009).
- Houseley, J., Tollervey, D. The many pathways of RNA degradation. Cell. 136 (4), 763-776 (2009).
- Kowalski, P. S., Rudra, A., Miao, L., Anderson, D. G. Delivering the messenger: Advances in technologies for therapeutic mRNA delivery. Molecular Therapy. 27 (4), 710-728 (2019).
- Sahin, U., Karikó, K., Türeci, Ö MRNA-based therapeutics-developing a new class of drugs. Nature Reviews Drug Discovery. 13, 359-380 (2014).
- Hajj, K. A., Whitehead, K. A. Tools for translation: Non-viral materials for therapeutic mRNA delivery. Nature Reviews Materials. 2, 17056 (2017).
- Deering, R. P., Kommareddy, S., Ulmer, J. B., Brito, L. A., Geall, A. J. Nucleic acid vaccines: Prospects for non-viral delivery of mRNA vaccines. Expert Opinion on Drug Delivery. 11 (6), 885-899 (2014).
- Wadhwa, A., Aljabbari, A., Lokras, A., Foged, C., Thakur, A. Opportunities and challenges in the delivery of mRNA-based vaccines. Pharmaceutics. 12 (2), 102 (2020).
- Hou, X., Zaks, T., Langer, R., Dong, Y. Lipid nanoparticles for mRNA delivery. Nature Reviews Materials. 6 (12), 1078-1094 (2021).
- Sahin, U., et al. COVID-19 vaccine BNT162b1 elicits human antibody and T(H)1 T cell responses. Nature. 586 (7830), 594-599 (2020).
- Azzi, L., et al. Mucosal immune response in BNT162b2 COVID-19 vaccine recipients. EBioMedicine. 75, 103788 (2022).
- Guan, S., et al. Self-assembled peptide-poloxamine nanoparticles enable in vitro and in vivo genome restoration for cystic fibrosis. Nature Nanotechnology. 14 (3), 287-297 (2019).
- Pitard, B., et al. Negatively charged self-assembling DNA/poloxamine nanospheres for in vivo gene transfer. Nucleic Acids Research. 32 (20), 159 (2004).
- Hiroi, T., Shibayama, M. Measurement of particle size distribution in turbid solutions by dynamic light scattering microscopy. Journal of Visualized Experiments. (119), e54885 (2017).
- Hassett, K. J., et al. Impact of lipid nanoparticle size on mRNA vaccine immunogenicity. Journal of Controlled Release. 335, 237-246 (2021).
- Suk, J. S., et al. The penetration of fresh undiluted sputum expectorated by cystic fibrosis patients by non-adhesive polymer nanoparticles. Biomaterials. 30 (13), 2591-2597 (2009).
- Kim, N., Duncan, G. A., Hanes, J., Suk, J. S. Barriers to inhaled gene therapy of obstructive lung diseases: A review. Journal of Controlled Release. 240, 465-488 (2016).
- Liu, Z., Fontana, F., Python, A., Hirvonen, J. T., Santos, H. A. Microfluidics for production of particles: Mechanism, methodology, and applications. Small. 16 (9), 1904673 (2020).
- Guan, S., Darmstädter, M., Xu, C., Rosenecker, J. In vitro investigations on optimizing and nebulization of IVT-mRNA formulations for potential pulmonary-based alpha-1-antitrypsin deficiency treatment. Pharmaceutics. 13 (8), 1281 (2021).
- Shepherd, S. J., Issadore, D., Mitchell, M. J. Microfluidic formulation of nanoparticles for biomedical applications. Biomaterials. 274, 120826 (2021).
- Han, J., et al. A simple confined impingement jets mixer for flash nanoprecipitation. Journal of Pharmaceutical Sciences. 101 (10), 4018-4023 (2012).
