Summary
En selvmontert peptid-poloxamin nanopartikkel (PP-sNp) er utviklet ved hjelp av en mikrofluidisk blandingsanordning for å innkapsle og levere in vitro transkribert messenger RNA. Det beskrevne mRNA/PP-sNp kunne effektivt transfektere dyrkede celler in vitro.
Abstract
In vitro transkriberte messenger RNA (mRNA) vaksiner har vist enormt potensial i kampen mot koronavirussykdommen 2019 (COVID-19) pandemi. Effektive og sikre leveringssystemer må inkluderes i mRNA-vaksinene på grunn av de skjøre egenskapene til mRNA. Et selvmontert peptid-poloxamin nanopartikkel (PP-sNp) genleveringssystem er spesielt utviklet for lungelevering av nukleinsyrer og viser lovende evner til å formidle vellykket mRNA-transfeksjon. Her beskrives en forbedret metode for fremstilling av PP-sNp for å utdype hvordan PP-sNp innkapsler Metridia luciferase (MetLuc) mRNA og vellykket transfekterer dyrkede celler. MetLuc-mRNA oppnås ved en in vitro transkripsjonsprosess fra en lineær DNA-mal. En PP-sNp produseres ved å blande syntetisk peptid / poloxamin med mRNA-løsning ved hjelp av en mikrofluidisk mikser, noe som muliggjør selvmontering av PP-sNp. Ladningen av PP-sNp evalueres deretter ved å måle zetapotensialet. I mellomtiden måles polydispersiteten og den hydrodynamiske størrelsen på PP-sNp nanopartikler ved hjelp av dynamisk lysspredning. mRNA / PP-sNp nanopartikler overføres til dyrkede celler, og supernatanter fra cellekulturen analyseres for luciferaseaktivitet. De representative resultatene viser deres evne til in vitro transfeksjon. Denne protokollen kan kaste lys over utviklingen av neste generasjons mRNA-vaksineleveringssystemer.
Introduction
Vaksinasjon har blitt varslet som et av de mest effektive medisinske tiltakene for å redusere sykelighet og dødelighet forårsaket av smittsomme sykdommer1. Betydningen av vaksiner har blitt demonstrert siden utbruddet av koronavirussykdom 2019 (COVID-19). I motsetning til det tradisjonelle konseptet med å injisere inaktiverte eller levende svekkede patogener, konsentrerer toppmoderne vaksinetilnærminger, for eksempel nukleinsyrebaserte vaksiner, seg om å bevare de immunstimulerende egenskapene til målpatogenene, samtidig som man unngår de potensielle sikkerhetsproblemene forbundet med konvensjonelle helmikrobielle virus- eller i bakteriebaserte vaksiner. Både DNA- og RNA (dvs. in vitro-transkriberte messenger RNA, IVT mRNA)-baserte vaksiner utviser profylaktisk til terapeutisk potensial mot en rekke sykdommer, inkludert smittsomme sykdommer og kreft 2,3. I prinsippet er potensialet til nukleinsyrebaserte vaksiner relatert til produksjon, effekt og sikkerhet4. Disse vaksinene kan produseres på en cellefri måte for å muliggjøre kostnadseffektiv, skalerbar og rask produksjon.
En enkelt nukleinsyrebasert vaksine kan kode flere antigener, noe som muliggjør målet for mange virusvarianter eller bakterier med redusert antall inokulasjoner og styrker immunresponsen mot motstandsdyktige patogener 5,6. Dessuten kan nukleinsyrebaserte vaksiner etterligne den naturlige invasjonsprosessen av virus eller bakteriell infeksjon, og bringe både B-celle- og T-cellemedierte immunresponser. I motsetning til noen virus- eller i DNA-baserte vaksiner, gir IVT mRNA-baserte vaksiner en stor fordel når det gjelder sikkerhet. De kan raskt uttrykke det ønskede antigenet i cytosolen og er ikke integrert i vertsgenomet, og unngår bekymringer for innsettingsmutagenese7. IVT-mRNA nedbrytes automatisk etter vellykket oversettelse, slik at proteinuttrykkskinetikken lett kan kontrolleres 8,9. Katalysert av den alvorlige akutte respiratoriske syndromet coronavirus 2 (SARS-CoV-2) pandemi, har innsats fra bedrifter / institusjoner over hele verden muliggjort utgivelsen til markedet for mange typer vaksiner. IVT mRNA-basert vaksineteknologi viser stort potensial og har for første gang vist sin tidligere forventede suksess, på grunn av sin raske design og fleksible kapasitet til å tilpasse seg målantigener innen flere måneder. Suksessen til IVT mRNA-vaksiner mot COVID-19 i kliniske applikasjoner åpnet ikke bare en ny epoke med IVT mRNA-vaksineforskning og utvikling, men akkumulerte også verdifull erfaring for rask utvikling av effektive vaksiner for å håndtere utbrudd av smittsomme sykdommer10,11.
Til tross for det lovende potensialet til IVT mRNA-vaksiner, fortsetter effektiv intracellulær levering av IVT mRNA til virkningsstedet (dvs. cytoplasma) å utgjøre et stort hinder12, spesielt for de som administreres via luftveiene4. IVT mRNA er iboende et ustabilt molekyl med en ekstremt kort halveringstid (~ 7 t) 13, noe som gjør IVT mRNA svært utsatt for nedbrytning av den allestedsnærværende RNase14. Lymfocyttene i det medfødte immunsystemet har en tendens til å oppsluke det anerkjente IVT mRNA i tilfeller av in vivo-applikasjon . Videre svekker den høye negative ladningstettheten og den store molekylvekten (1 x 104-1 x 106 Da) av IVT mRNA dens effektive gjennomtrenging over det anioniske lipid-dobbeltlaget av cellulære membraner15. Derfor er det nødvendig med et leveringssystem med visse biofunksjonelle materialer for å hemme nedbrytningen av IVT mRNA-molekylene og lette cellulært opptak16.
Bortsett fra noen få unntakstilfeller der naken IVT mRNA ble direkte brukt til in vivo-undersøkelser, brukes forskjellige leveringssystemer for å bære IVT mRNA til det terapeutiske virkningsstedet17,18. Tidligere studier har vist at bare noen få IVT mRNA påvises i cytosol uten hjelp av et leveringssystem19. Det er utviklet mange strategier for å forbedre RNA-leveransen med kontinuerlig innsats i feltet, alt fra protaminkondensasjon til lipidinnkapsling20. Lipid nanopartikler (LNPs) er de mest klinisk avanserte blant mRNA-leveringskjøretøyene, som bevist av det faktum at alle godkjente mRNA COVID-19-vaksiner for klinisk bruk bruker LNP-baserte leveringssystemer21. LNPs kan imidlertid ikke formidle effektiv mRNA-transfeksjon når formuleringene leveres via respiratorisk rute22, noe som bemerkelsesverdig begrenser anvendelsen av disse formuleringene ved å indusere slimhinneimmunresponser eller adressere lungerelaterte sykdommer som cystisk fibrose eller α1-antitrypsinmangel. Derfor er det nødvendig å utvikle et nytt leveringssystem for å lette effektiv levering og transfeksjon av IVT mRNA i luftveisrelaterte celler for å løse dette udekkede behovet.
Det er bekreftet at peptid-poloxamin selvmontert nanopartikkel (PP-sNp) leveringssystem kan formidle effektiv transfeksjon av nukleinsyrer i luftveiene hos mus23. PP-sNp vedtar en multifunksjonell modulær designtilnærming, som kan integrere forskjellige funksjonelle moduler i nanopartikler for rask screening og optimalisering23. De syntetiske peptidene og elektrisk nøytrale amfifile blokk-kopolymerer (poloksamin) i PP-sNp kan spontant interagere med IVT mRNA for å generere jevnt fordelte nanopartikler med en kompakt struktur og glatt overflate23. PP-sNp kan forbedre gentransfeksjonseffekten av IVT mRNA-molekyler i dyrkede celler og luftveiene hos mus23. Denne studien beskriver en protokoll for generering av PP-sNp med IVT mRNA som koder for Metridia luciferase (MetLuc-mRNA) (figur 1). Kontrollert og rask blanding via en mikrofluidisk blandingsanordning, som benytter forskjøvet fiskebensblandingsdesign, benyttes i denne protokollen. Prosedyren er enkel å utføre og tillater generering av PP-sNp med mer ensartede størrelser. Det generelle målet med PP-sNp-produksjon ved hjelp av den mikrofluidiske blanderen er å lage PP-sNp for mRNA-kompleksdannelse på en godt kontrollert måte, og dermed muliggjøre effektiv og reproduserbar celletransfeksjon in vitro. Denne protokollen beskriver forberedelse, montering og karakterisering av PP-sNp som inneholder MetLuc-mRNA.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. In vitro transkripsjon av kjemisk modifisert mRNA
MERK: Det kreves å bruke nukleasfrie rør, reagenser, glassvarer, pipettespisser, etc., fordi RNaser er allestedsnærværende i miljøet, for eksempel laboratorieløsninger, instrumentflater, hår, hud, støv, etc. Rengjør benkflatene og pipettene grundig før bruk, og bruk hansker for å unngå RNase-forurensning.
- Utfør linearisering av DNA-malen.
- Syntetiser den åpne leserammen (ORF) av Metridia luciferase (MetLuc) flankert av en T7-polymerasepromotor, 5 'uoversatt region (UTR), 3'UTR og poly (A) haler og klon den inn i PUC57-vektoren, som uttrykkes i bakterier (se Materialtabell).
MERK: Kodesekvensen til DNA-malen er gitt i tilleggsfil 1. - Kulturbakterier, lyse bakteriene, og rense plasmid-DNA ved den tilsvarende kolonnen (se plasmid DNA-ekstraksjonssett i materialtabellen).
- Utfør en enkelt 50 μL-reaksjon som inneholder 2 μL BamHI, 2 μL KpnI (se Materialtabell) og 2 μg plasmid-DNA ved 37 ° C i 1 time, og oppnå linearisering av DNA-malen.
- Syntetiser den åpne leserammen (ORF) av Metridia luciferase (MetLuc) flankert av en T7-polymerasepromotor, 5 'uoversatt region (UTR), 3'UTR og poly (A) haler og klon den inn i PUC57-vektoren, som uttrykkes i bakterier (se Materialtabell).
- Utfør in vitro transkripsjon for å generere uavkortet-IVT mRNA.
- Utfør mRNA-syntese ved en enkelt 20 μL-reaksjon ved bruk av et T7-transkripsjonssett og pseudouridin (se materialtabell): 10 μL (0,8-1 μg) linearisert DNA-mal, 1,5 μL (150 mM) ATP, pseudo-UTP, GTP og CTP, 2 μL 10x transkripsjonsbuffer, 1 μL T7-enzym og 1 μL nukleasefritt vann (NF-vann). Bland de ovennevnte komponentene grundig og inkuber ved 37 °C i 3 timer.
- Fjern malens DNA.
- Tilsett 1 μL (1 U) DNase (RNase-fri) etter transkripsjonsprosessen og inkuber ved 37 °C i 15 minutter.
- Utfør ikke-avkortet IVT mRNA-rensing ved bruk av litiumkloridutfelling.
- Rens det uavkortede IVT mRNA ved bruk av litiumklorid (se materialtabell) med en arbeidskonsentrasjon på 10 mM. Tilsett 50 μL 10 mM litiumklorid til 20 μL uavkortet IVT mRNA-løsning.
- Bland hele volumet grundig og avkjøl ved -20 °C i 1 time. Samle det uavkortede IVT mRNA i 12 minutter ved 12 000 x g, som rutinemessig produserer 80-120 μg uavkortet-IVT mRNA fra hver enkelt 20 μL-reaksjon.
- Utfør IVT mRNA-kapping.
- Utfør IVT mRNA-kappingen ved hjelp av cap 1-kappesystemet (se materialfortegnelse). Kort sagt, fjern den sekundære strukturen på 50 μg uavkortet-IVT mRNA ved oppvarming ved 65 ° C i 10 minutter, og koble deretter 5 'enden av uavkortet-IVT mRNA med hette 1, som fremstilles ved å modifisere m7G-kappstrukturen ved bruk av 2,5 μL s-adenosylmetionin (SAM) (20 mM) og 4 μL 2'-O-metyltransferase (100 U) i en 100 μL reaksjon ved 37 ° C i 30-60 minutter.
- Rens 100 μL av det avkortede IVT mRNA ved bruk av 250 μL 10 mM litiumklorid og fortynn i 50 μL NF-vann.
- Bestem renheten og molekylstørrelsen til capped-IVT mRNA.
- Mål konsentrasjonen av capped-IVT mRNA med et UV-synlig spektrofotometer. Ved hjelp av en RNA-markør (se Materialtabell), analyser molekylstørrelsen til capped-IVT mRNA i en 1% formaldehyddenaturerende agarosegel som inneholder 18% formaldehyd (spenning er 120 V). Forsikre deg om at ikke-avkortet IVT mRNA og capped-IVT mRNA lagres ved -80 ° C.
MERK: IVT mRNA ble ansett å ha god renhet i et A 260 / A 280-forhold på 1,8-2,1 og et A260 / A 230-forhold på 2,0 eller litt høyere.
- Mål konsentrasjonen av capped-IVT mRNA med et UV-synlig spektrofotometer. Ved hjelp av en RNA-markør (se Materialtabell), analyser molekylstørrelsen til capped-IVT mRNA i en 1% formaldehyddenaturerende agarosegel som inneholder 18% formaldehyd (spenning er 120 V). Forsikre deg om at ikke-avkortet IVT mRNA og capped-IVT mRNA lagres ved -80 ° C.
2. Generering av IVT mRNA/PP-sNp
- Forbered poloksamin 704 (T704) stamløsning ved å oppløse T704 (se materialtabell) i NF-vann for å oppnå en 10 mg/ml stamløsning. Oppbevar den tilberedte oppløsningen ved 4 °C.
MERK: T704 inneholder en X-formet struktur laget av en etylendiamin sentral gruppe bundet til fire kjeder av poly (propylenoksid) (PPO) blokker og poly (etylenoksid) (PEO) blokker24. Molekylvekten (Mw) av T704 er 5500. - Klargjør det syntetiske peptidet (sPep, se Materialtabell) lagerløsning ved å oppløse sPep (sekvens: KETWWETWWTEWWTEWTEWKKKKRRRRRKKKKGACSE
RSMNFCG) i NF-vann for å oppnå en 2 mg/ml stamløsning og oppbevares ved 4 °C. - Forbered IVT mRNA-løsningen ved å tine IVT mRNA (trinn 1) på is og sentrifugere kort tid i 3 s ved 300 x g ved romtemperatur før du åpner røret. Fortynn IVT mRNA-løsningen til 0,04 μg/μL med NF-vann.
MERK: Det anbefales å arbeide i et biosikkerhetsskap når det er mulig med IVT mRNA. - Forbered T704- og sPep-blandingsoppløsningen ved å fortynne sPep-oppløsningen til 0,555 μg/μL og T704-oppløsningen til 8 μg/μL med NF-vann. Inkuber den blandede oppløsningen i 15 minutter ved romtemperatur før videre bruk.
MERK: Beregn den nødvendige sPep-komponenten basert på ønsket N / P-forhold. N / P-forholdet er det totale antall nitrogenrester (N) i sPep til totalt antall negativt ladede fosfatgrupper (P) innenfor IVT mRNA. Beregn ønsket T704 basert på vekt / vekt (w / w) forholdet mellom T704 og IVT mRNA. Det er nødvendig at N/P-forholdet er 5 og w/w-forholdet er 100. - Forbered IVT mRNA/PP-sNp formuleringen ved å følge trinnene nedenfor.
- Trekk IVT mRNA-oppløsningen (trinn 3) inn i en 1 ml sprøyte, slik at det ikke oppstår luftspalter eller bobler i sprøytetuppen. Legg sprøyten i den ene siden av sylinderampullen ved siden av den roterende blokken.
- Fyll en 1 ml sprøyte med T704 og sPep mikseoppløsning (trinn 4). Fjern eventuelle bobler eller luftspalter på sprøytespissen og sett sprøyten inn i det andre innløpet til pumpen (se Materialfortegnelse).
- Still inn pumpen med et strømningsforhold på 1:1 og en total strømningshastighet på 4-10 ml / min.
MERK: En total strømningshastighet på 6 ml/min er optimalt i studiene som presenteres her. - Plasser et 10 ml RNase-fritt konisk rør (se Materialfortegnelse) for å samle den blandede IVT-mRNA/PP-sNp-løsningen på enden av strømningsbanen til blandeanordningen.
- Kjør pumpen for å starte blandingen, og sørg for at parametrene legges inn riktig. Etter at pumpen er ferdig med å kjøre i 6 s, samle IVT-mRNA / PP-sNp-prøven fra det koniske røret.
MERK: PP-sNp ble generert ved hjelp av en mikrofluidisk mikser (supplerende figur 1). Enheten består av en konstant strømningspumpe, koblingsenhet, brikke og fast enhet. I blandingsprosessen leverer den konstante strømningspumpen som er koblet til brikken væske til brikken i henhold til den forhåndsinnstilte strømningshastigheten. Den tilkoblede konstantstrømningspumpen kan kobles til flere inngangskanaler på brikken med en enkelt utgangskanal. Komponentene i enheten, inkludert brikken, ble hentet fra kommersielle kilder og rasjonelt montert (se materialtabell). Parametrene, for eksempel strømningshastighet og volum av IVT mRNA-løsningen og T704-sPep-blandet løsning, kan avvike fra de som vises i gjeldende protokoll hvis noe annet oppsett brukes og må optimaliseres tilsvarende.
3. Måling av hydrodynamisk diameter og polydispersitet av IVT-mRNA/PP-sNp
- Fortynn en aliquot av IVT mRNA / PP-sNp-løsningen (trinn 2) med NF-vann for å oppnå et endelig volum på 1 ml.
- Mål den hydrodynamiske størrelsen og polydispersitetsindeksen (PDI) ved hjelp av en semi-mikro kyvette25. Tilsett IVT mRNA/PP-sNp-løsningen i kyvetten og plasser den i partikkelstørrelsesmåleren (se materialfortegnelse). Sett opp en standard driftsprosedyre og klikk på Start for å starte datainnsamlingen.
4. Forberedelse av cellene for transfeksjon
- Plate humane bronkiale epitelceller (16HBE) og en dendrittisk cellelinje (DC2.4) i 96-brønnplater med en tetthet på 3,5 x 104 celler/brønn 24 timer før transfeksjon. Dyrk cellene i et kulturmedium supplert med 10% varmeinaktivert fosterbovint serum og 1% penicillin / streptomycin.
MERK: Cellene ble hentet fra en kommersiell kilde (se Materialfortegnelse). - Inkuber cellene i en inkubator (37 ° C og 5% CO2 atmosfære) i 24 timer for å sikre at cellene er 60% -80% sammenflytende før transfeksjonen.
5. Transfeksjon av de dyrkede cellene
- Etter å ha fjernet vekstmediet, vask de belagte cellene med 0,2 ml / brønn 1x PBS.
- Tilsett 170 μL serumfritt kulturmedium til hver brønn som inneholder de belagte cellekulturene.
- Tilsett IVT mRNA/PP-sNp formuleringen inneholdende 0,4 μg MetLuc mRNA (fremstilt i trinn 2) dråpevis med en mengde på 30 μL/brønn.
- Inkuber cellene med IVT mRNA/PP-sNp-formuleringen ved 37 °C i en fuktet 5 % CO 2-beriket atmosfære i 4 timer.
- Erstatt transfeksjonsmediet med 0,2 ml friskt kulturmedium supplert med 10% varmeinaktivert føtalt bovint serum og 1% (v / v) penicillin / streptomycin.
MERK: Fosterets bovinserum ble oppvarmet ved 56 °C i 30 minutter for inaktivering. - Inkuber de transfiserte cellene ved 37 ° C og i en 5% CO2-beriket atmosfære i 24 timer og samle supernatantene som skal detekteres fra hver brønn.
6. Analyse av celletransfeksjonseffekt ved bruk av Metridia luciferase (MetLuc) analyse
- Analyser supernatanten fra hver brønn for MetLuc-aktivitet ved bruk av coelenterazinsubstrat (se materialfortegnelse) ved å følge trinnene nedenfor.
- Forbered en ny analyseløsning ved å tilsette 1x PBS til coelenterazinsubstratet (konsentrasjonen av coelenterazin er 15 mM).
- Vortex coelenterazine oppløsning for 10 s for grundig blanding.
- Tilsett 50 μL supernatant (samlet i trinn 5) til en 96-brønnsplate.
- Sett opp mikroplateleseren (se materialfortegnelse) med en lesetid på 1000 ms før du tilsetter 30 μL coelenterazineoppløsning (15 mM) til hver brønn manuelt eller ved automatisk injeksjon.
- Klikk på Start for å måle luminescenssignalet umiddelbart etter tilsetning av coelenterazinoppløsningen til supernatanten.
MERK: Luminescenssignalet måles ved hjelp av en mikroplateleser, og dens aktivitet uttrykkes i relative lysenheter. Verdiene hentet fra PBS-transfiserte brønner vil bli brukt som tomme kontroller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Det rekombinante plasmidet ble fordøyd for å produsere den lineariserte DNA-malen (figur 2A). Ved hjelp av protokollen som er beskrevet, kan T7 in vitro transkripsjonssett produsere opptil 80-120 μg uavkortet MetLuc-mRNA per 20 μL reaksjon og 50-60 μg avkortet MetLuc-mRNA per 100 μL reaksjon. Når analysert med elektroforese, bør intakt MetLuc-mRNA med høy kvalitet vise et enkelt og klart bånd, som vist i figur 2B. Forurensninger introdusert i reaksjonen fra DNA-malen kan resultere i RNA-nedbrytning og lavere utbytte.
PP-sNp som inneholder MetLuc-mRNA (MetLuc-mRNA/PP-sNp) ble fremstilt ved hjelp av den mikrofluidiske blandingsmetoden (figur 1). Tabell 1 viser dataene om den fysisk-kjemiske karakteriseringen av MetLuc-mRNA/PP-sNp som eksempler. Den hydrodynamiske radiusen til MetLuc-mRNA/PP-sNp kan anses som riktig hvis den varierer ca. 70-100 nm. Dessuten må PDI for PP-sNp være konstant og helst være under 0,2, men PDI-verdier opp til ca. 0,3 aksepteres.
Etter vellykket inkorporering av MetLuc-mRNA i PP-sNp, kan formuleringen inkuberes med 16HBE-celler og en dendritisk cellelinje (DC2.4), og transfeksjonseffektiviteten til MetLuc-mRNA kan indikeres av luciferaseaktiviteten i cellekultursupernatanten 24 timer etter transfeksjon. Figur 3 er et typisk eksempel på vellykket transfeksjon av MetLuc-mRNA/PP-sNp. Det kan tydelig ses at celler transfisert med MetLuc-mRNA / PP-sNp viste betydelig høyere uttrykk for luciferase sammenlignet med de som ble transfisert med kommersielt tilgjengelig lipidbasert transfeksjonregent (LP) (se Materialtabell), naken MetLuc-mRNA (negativ kontroll), PBS (blank kontroll) eller T704-sPep blandet løsning (mock control) i 16HBE-celler. MetLuc-mRNA/PP-sNp viste også høyere uttrykk for luciferase sammenlignet med LP. Dataene antyder at PP-sNp-leveringssystemet er viktig for å beskytte MetLuc-mRNA mot nedbrytning og for å fremme transfeksjonseffektiviteten til det eksogene MetLuc-mRNA. Derfor er leveringssystemer som PP-sNp generelt avgjørende for IVT mRNA-transfeksjonsstudier.
Figur 1: Skjematisk fremstilling av hele arbeidsflyten til IVT mRNA/PP-sNp. DNA-malen er knyttet til plasmidet ved rekombinant plasmidkonstruksjon. Den lineariserte DNA-malen er satt sammen ved hjelp av restriksjonsenzymfordøyelse. In vitro transkribert mRNA (IVT mRNA) syntetiseres og avgrenses fra den lineariserte DNA-malen. T704-sPep-løsningen inneholder T704 og det syntetiske peptidet (sPep), mens IVT mRNA-løsningen inneholder MetLuc-mRNA. IVT mRNA og T704-sPep blandede løsninger blandes ved hjelp av en mikrofluidisk mikser, som danner MetLuc-mRNA / PP-sNp. Deretter utføres karakteriseringen av MetLuc-mRNA / PP-sNp for å bestemme partikkelstørrelsen og polydispersiteten ved bruk av en Zetasizer. 16HBE-celler transfekteres med MetLuc-mRNA/PP-sNp, og luciferaseaktiviteten i supernatanten måles for å evaluere transfeksjonseffektiviteten. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Produksjonen av MetLuc-mRNA. (A) DNA-malen inneholder en T7-polymerasepromotor, en 5'untraslated region (UTR), en åpen leseramme (ORF) av MetLuc, en 3'UTR og poly (A) haler. (B) Elektroforesedeteksjon. Den hvite pilen indikerer rekombinant plasmid. Den gule pilen indikerer PUC57-vektoren. Den røde pilen indikerer DNA-malen for in vitro-transkripsjon av MetLuc-mRNA. Den grønne pilen indikerer uavkortet MetLuc-mRNA. Den blå pilen indikerer avkortet MetLuc-mRNA. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Transfeksjonseffektivitet av MetLuc-mRNA/PP-sNp i 16HBE- og DC2.4-celler. MetLuc-mRNA ble transfisert ved hjelp av PP-sNp i (A) 16HBE-celler og (B) en dendrittisk cellelinje (DC2.4). Den endelige konsentrasjonen av MetLuc-mRNA var 0,02 μg/μL, sPep var 0,139 μg/μL, og T704 var 2 μg/μL i PP-sNp. Kommersiell lipidbasert transfeksjonregent (LP) ble tatt i bruk som positiv kontroll. Lucifraseaktiviteten ble målt 24 timer etter transfeksjon. Den PBS-behandlede prøven ble vedtatt som en tom kontroll. T704-sPep blandet løsning ble vedtatt som en hånlig kontroll. Statistiske forskjeller ble analysert med Student t-test (ns p ≥ 0,05, * p < 0,05 ). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| IVT mRNA | N/P (sPep) | w / w (T704) | Størrelse (nm) | Pdi | Zeta |
| 17,5 ng/μL | 5 | 100 | 85.12 ± 9.40 | 0,20 ± 0,07 | -13.07 ± 0,47 |
Tabell 1: Fysisk-kjemiske karakteriseringsdata for MetLuc-mRNA/PP-sNp.
Supplerende figur 1: Oppsettet av den interne forberedte mikrofluidiske enheten som ble brukt i den nåværende studien. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggsfil 1: Kodesekvensen til DNA-malen. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollen beskrevet her tillater ikke bare kostnadseffektiv og rask produksjon av IVT mRNA-vaksineformuleringer med definerte egenskaper, men det gir også muligheten til å tilpasse PP-sNP-formuleringen i henhold til spesifikke terapeutiske formål, for eksempel genterapi. For å sikre en vellykket generering av IVT mRNA/PP-sNp, foreslås det å være ekstra oppmerksom på noen kritiske trinn. Når du arbeider med mRNA, husk alltid at RNase-frie forhold bør opprettholdes gjennom hele prosessen fordi IVT mRNA er svært følsomt med hensyn til nedbrytning av RNase, selv om IVT mRNA er fremstilt med kjemisk modifikasjon. I mellomtiden må et RNase-fritt miljø også sikres ved lagring av formuleringene. Det anbefales å oppbevare IVT mRNA/PP-sNp ved 2-8 °C i inntil 1 uke. Resultatene som presenteres viser at nukleasefritt vann er effektivt for å kunne danne PP-sNp med høy transfeksjonseffektivitet. Andre buffere, som PBS, saltvann, OptiMEM, etc., kan benyttes om ønskelig. Det anbefales å utføre in vitro-transfeksjoner ved bruk av IVT mRNA/PP-sNp i et OptiMEM-medium for å sikre levedyktigheten til de dyrkede cellene. Hvis en annen buffer i stedet for nukleasfritt vann velges for å forberede formuleringen, er det viktig å bruke IVT mRNA med lav konsentrasjon (under 100 ng / ml); Ellers har nanopartiklene en tendens til å bli utfelt, noe som igjen gir en ugyldig formulering. Årsaken til dette fenomenet er den kationiske delen i det syntetiske peptidet. I tillegg kan nanopartikkelens sterke positive ladningstetthet destabilisere cellemembranen, og dermed indusere signifikant cytotoksisitet. Imidlertid ble det demonstrert i den forrige studien at den positive ladningen i PP-sNp er avgjørende for å formidle effektivt IVT mRNA-cellulært opptak, endosomflukt og vellykket transfeksjon23. Som et resultat er det viktig å justere den positive ladningen i PP-sNp for å finne en delikat balanse når det gjelder effektivitet og toksisitet.
Den presenterte protokollen kan brukes på forskjellige PP-sNp-baserte formuleringer med noen parameterendringer. For levering av IVT mRNA-baserte vaksiner er biofysiske egenskaper som partikkelstørrelse og polydispersitetsindeks avgjørende for transfeksjonseffektiviteten og immunogeniteten til de tilberedte nanopartiklene26. Partikkelstørrelsen til IVT mRNA / PP-sNp i nanometerskalaen tillater effektiv overføring over fysiologiske barrierer og er dermed viktig for de påfølgende in vivo-applikasjonene. Det har blitt rapportert at LNP i størrelsesområdet 60-150 nm produserer robuste immunresponser hos ikke-menneskelige primater26. På den annen side kunne store nanopartikler (f.eks. 400-1000 nm) ikke overvinne luftveisslimbarrieren når de ble brukt til lungefødsel fordi, som avslørt av tidligere undersøkelser, varierer den gjennomsnittlige 3-dimensjonale maskeavstanden av luftveisslimnettporer fra ca. 60-300 nm27,28. Hvis ønsket størrelse eller transfeksjonseffektivitet ikke oppnås, er noen tips for å begynne feilsøking å justere mengden poloksamin eller syntetiske peptidkomponenter som brukes. Den forrige studien viste at ytterligere parametere, som mengden IVT mRNA som brukes til transfeksjon, inkubasjonstiden og typer og celletetthet av dyrkede celler, også kunne påvirke transfeksjonsresultatet23. Videre, siden målrettingsdelen i PP-sNp tillater spesifikk levering av det innkapslede IVT mRNA i celler som viser relaterte reseptorer, kan erstatning med alternative målrettingsligander være nødvendig hvis målcellene overføres med andre typer i stedet for luftveisrelaterte celler. Samlet sett kan protokollen fortsatt forbedres med mer detaljert innsikt og videre undersøkelse.
Tatt i betraktning at den opprinnelige IVT mRNA / PP-sNp fremstilles i utgangspunktet ved direkte manuell blanding, spiller operatørens evner en viktig rolle i å kontrollere kvaliteten på formuleringen. Modifikasjoner i prosessen med å blande IVT mRNA med komponentene i PP-sNp kan resultere i store mikropartikler i stedet for nanostørrelsespartikler. Det vanskeligste trinnet er å blande mRNA og det syntetiske peptidet, som må gjøres på en kontrollert måte. For å forbedre reproduserbarheten mellom forskjellige partier IVT mRNA / PP-sNp-formulering, ble en mikrofluidisk mikser vedtatt fordi lavvolumscreening, rask hastighet og reproduserbarhet er viktige egenskaper ved bruk av mikrofluidisk metode29. Denne metoden viste god reproduserbarhet, uten signifikant innvirkning på partikkelstørrelsen eller transfeksjonseffektiviteten observert mellom forskjellige batcher. Dette er et viktig kriterium for IVT mRNA-baserte vaksiner som skal brukes i kliniske applikasjoner. Spesielt bør den mikrofluidiske blanderen ikke overstige maksimalt antall brukere (anbefalt av produsenten) og må endres mellom formuleringer med forskjellige sammensetninger.
Protokollen for IVT mRNA-transkripsjon beskrevet i denne protokollen kan teoretisk brukes til å forberede ethvert reporterprotein / antigen av interesse. Metridia luciferase (MetLuc) ble spesielt brukt i denne studien fordi den har unike fordeler. Aktivitetsanalysen av MetLuc er enkel å utføre med høy følsomhet fordi MetLuc kan produsere et intensivt bioluminescerende signal, og det kan utskilles direkte i cellemediet, og dermed unngå behovet for cellelyse. Det er viktig å merke seg at MetLuc-uttrykket i de dyrkede cellene kan påvirkes av mange parametere (f.eks. varierende celletall per brønn og pipetteringsfeil, etc.) annet enn funksjonaliteten til MetLuc-mRNA selv.
Selv om den nåværende protokollen ble etablert for levering av IVT mRNA-vaksinen, kan den også implementeres for vaksiner eller terapier som er basert på andre typer nukleinsyrer, som plasmid-DNA (pDNA). Denne prosessen kan tilpasses syntetiske peptid-, nukleinsyre- og poloksaminkomponentendringer for å utvikle spesiell PP-sNp for ulike kliniske indikasjoner. Faktisk ble genomintegrasjonen av det eksogene cystisk fibrose transmembrantransduksjonsregulatorgenet (CFTR) i respirasjonsepitelvevet til CFTR knockoutmus med bruk av et Tornerose-genmodifiseringsverktøy levert av en PP-sNp23 vellykket oppnådd. Når det gjelder terapeutiske anvendelser, kan IVT mRNA / PP-sNp-formuleringer brukes som aerosol ved bruk av spesifikke nebuliseringsenheter for kur av lungesykdommer, for eksempel α1-antitrypsinmangel eller cystisk fibrose30. Det er imidlertid verdt å merke seg at IVT mRNA / PP-sNp-formuleringer for forstøvning bør optimaliseres og tilpasses, da aerosolisert IVT mRNA kan være ineffektivt på grunn av skjærekraften skapt av forstøveren og den skjøre naturen til IVT mRNA30. Videre er protokollen muligens skalerbar til større volumer ved hjelp av forskjellige mikrofluidiske blandingsanordninger, for eksempel T-kryssblandingsanordninger og til og med impingement jets blandepumper31,32.
Oppsummert introduserer protokollen som er beskrevet her en reproduserbar metode for å formulere IVT mRNA i et PP-sNp-leveringssystem, samt påfølgende pålitelig transfeksjon i dyrkede celler. Den beskrevne metoden garanterer en tilgjengelig og enkel tilnærming til å produsere IVT mRNA / PP-sNp ved hjelp av en mikrofluidisk mikser. De fremstilte formuleringene med små partikkelstørrelser og lav polydispersitetsindeks kan deretter påføres på trygt og effektivt transfekterte dyrkede celler. Denne protokollen vil gjøre det mulig for det PP-sNp-baserte leveringssystemet å bli tilgjengelig for det akademiske samfunnet for å designe nye IVT mRNA-baserte vaksiner eller terapier, samtidig som alle de nevnte ulempene unngås. Med de fleksible profilene til PP-sNp, forventes mange fremtidige applikasjoner å oppnås med PP-sNp for å produsere forskjellige terapier for å håndtere ulike sykdommer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av National Natural Science Foundation of China (NSFC, Grant No. 82041045 og 82173764), hovedprosjektet i Study on Pathogenesis and Epidemic Prevention Technology System (2021YFC2302500) av departementet for vitenskap og teknologi i Kina, Chongqing Talents: Exceptional Young Talents Project (CQYC202005027), og Natural Science Foundation of Chongqing (cstc2021jcyj-msxmX0136). Forfatterne er takknemlige for Dr. Xiaoyan Ding for å måle hydrodynamisk diameter (nm) og polydispersitetsindeks (PDI).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BamHI | Takara | 1010 | |
| cap 1 capping system | Jinan | M082 | |
| Dendritic cell-line | Sigma | SCC142 | |
| DNA sequence | Genescript | ||
| Human bronchial epithelial cells | Sigma | SCC150 | |
| KpnI | Takara | 1068 | |
| LP | Beyotime | C0533 | |
| Lithium chloride | APEXBio | B6083 | |
| Malvern Zetasizer Nano ZS90 | Malvern | NB007605 | |
| Microfluidic chip | ZHONGXINQIHENG | Standard PDMS chip | |
| Microplate readers | ThermoFisher | Varioskan lux | |
| NanoDrop One | ThermoFisher | ND-ONE-W (A30221) | |
| Nuclease-free water | ThermoFisher | AM9932 | |
| OptiMEM | Gibco | 31985070 | |
| Penicillin-streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Pseudouridine | APE×Bio | B7972 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27106 | |
| Quanti-Luc | InvivoGen | Rep-qlc2 | |
| RiboRuler High Range RNA Ladder | ThermoFisher | SM1821 | |
| RNase-free conical tube | Biosharp | BS-100-M | |
| RPMI Medium 1640 | ThermoFisher | C11875500BT | |
| Syringe pump | Chemyx | Fusion 101 | |
| T7 transcription Kit | Jinan | E131 |
References
- Fehervari, Z., Minton, K., Duarte, J. H. Nature milestones in vaccines. Springer Nature. , Available from: https://www.nature.com/collections/hcajdiajij (2020).
- Barbier, A. J., Jiang, A. Y., Zhang, P., Wooster, R., Anderson, D. G. The clinical progress of mRNA vaccines and immunotherapies. Nature Biotechnology. 40 (6), 840-854 (2022).
- Mulligan, M. J., et al. Phase I/II study of COVID-19 RNA vaccine BNT162b1 in adults. Nature. 586 (7830), 589-593 (2020).
- Tang, J., et al. Nanotechnologies in delivery of DNA and mRNA vaccines to the nasal and pulmonary mucosa. Nanomaterials. 12 (2), 226 (2022).
- Freyn, A. W., et al. A multi-targeting, nucleoside-modified mRNA influenza virus vaccine provides broad protection in mice. Molecular Therapy. 28 (7), 1569-1584 (2020).
- Wu, K., et al. Variant SARS-CoV-2 mRNA vaccines confer broad neutralization as primary or booster series in mice. Vaccine. 39 (51), 7394-7400 (2021).
- Chaudhary, N., Weissman, D., Whitehead, K. A. mRNA vaccines for infectious diseases: Principles, delivery and clinical translation. Nature Reviews Drug Discovery. 20, 817-838 (2021).
- Kormann, M. S. D., et al. Expression of therapeutic proteins after delivery of chemically modified mRNA in mice. Nature Biotechnology. 29 (2), 154-157 (2011).
- Tavernier, G., et al. mRNA as gene therapeutic: How to control protein expression. Journal of Controlled Release. 150 (3), 238-247 (2011).
- Walsh, E. E., et al. Safety and immunogenicity of two RNA-based Covid-19 vaccine candidates. The New England Journal of Medicine. 383 (25), 2439-2450 (2020).
- Baden, L. R., et al. Efficacy and safety of the mRNA-1273 SARS-CoV-2 vaccine. The New England Journal of Medicine. 384 (5), 403-416 (2021).
- Guan, S., Rosenecker, J. Nanotechnologies in delivery of mRNA therapeutics using nonviral vector-based delivery systems. Gene Therapy. 24 (3), 133-143 (2017).
- Sharova, L. V., et al. Database for mRNA half-life of 19 977 genes obtained by DNA microarray analysis of pluripotent and differentiating mouse embryonic stem cells. DNA Research. 16 (1), 45-58 (2009).
- Houseley, J., Tollervey, D. The many pathways of RNA degradation. Cell. 136 (4), 763-776 (2009).
- Kowalski, P. S., Rudra, A., Miao, L., Anderson, D. G. Delivering the messenger: Advances in technologies for therapeutic mRNA delivery. Molecular Therapy. 27 (4), 710-728 (2019).
- Sahin, U., Karikó, K., Türeci, Ö MRNA-based therapeutics-developing a new class of drugs. Nature Reviews Drug Discovery. 13, 359-380 (2014).
- Hajj, K. A., Whitehead, K. A. Tools for translation: Non-viral materials for therapeutic mRNA delivery. Nature Reviews Materials. 2, 17056 (2017).
- Deering, R. P., Kommareddy, S., Ulmer, J. B., Brito, L. A., Geall, A. J. Nucleic acid vaccines: Prospects for non-viral delivery of mRNA vaccines. Expert Opinion on Drug Delivery. 11 (6), 885-899 (2014).
- Wadhwa, A., Aljabbari, A., Lokras, A., Foged, C., Thakur, A. Opportunities and challenges in the delivery of mRNA-based vaccines. Pharmaceutics. 12 (2), 102 (2020).
- Hou, X., Zaks, T., Langer, R., Dong, Y. Lipid nanoparticles for mRNA delivery. Nature Reviews Materials. 6 (12), 1078-1094 (2021).
- Sahin, U., et al. COVID-19 vaccine BNT162b1 elicits human antibody and T(H)1 T cell responses. Nature. 586 (7830), 594-599 (2020).
- Azzi, L., et al. Mucosal immune response in BNT162b2 COVID-19 vaccine recipients. EBioMedicine. 75, 103788 (2022).
- Guan, S., et al. Self-assembled peptide-poloxamine nanoparticles enable in vitro and in vivo genome restoration for cystic fibrosis. Nature Nanotechnology. 14 (3), 287-297 (2019).
- Pitard, B., et al. Negatively charged self-assembling DNA/poloxamine nanospheres for in vivo gene transfer. Nucleic Acids Research. 32 (20), 159 (2004).
- Hiroi, T., Shibayama, M. Measurement of particle size distribution in turbid solutions by dynamic light scattering microscopy. Journal of Visualized Experiments. (119), e54885 (2017).
- Hassett, K. J., et al. Impact of lipid nanoparticle size on mRNA vaccine immunogenicity. Journal of Controlled Release. 335, 237-246 (2021).
- Suk, J. S., et al. The penetration of fresh undiluted sputum expectorated by cystic fibrosis patients by non-adhesive polymer nanoparticles. Biomaterials. 30 (13), 2591-2597 (2009).
- Kim, N., Duncan, G. A., Hanes, J., Suk, J. S. Barriers to inhaled gene therapy of obstructive lung diseases: A review. Journal of Controlled Release. 240, 465-488 (2016).
- Liu, Z., Fontana, F., Python, A., Hirvonen, J. T., Santos, H. A. Microfluidics for production of particles: Mechanism, methodology, and applications. Small. 16 (9), 1904673 (2020).
- Guan, S., Darmstädter, M., Xu, C., Rosenecker, J. In vitro investigations on optimizing and nebulization of IVT-mRNA formulations for potential pulmonary-based alpha-1-antitrypsin deficiency treatment. Pharmaceutics. 13 (8), 1281 (2021).
- Shepherd, S. J., Issadore, D., Mitchell, M. J. Microfluidic formulation of nanoparticles for biomedical applications. Biomaterials. 274, 120826 (2021).
- Han, J., et al. A simple confined impingement jets mixer for flash nanoprecipitation. Journal of Pharmaceutical Sciences. 101 (10), 4018-4023 (2012).
