Summary
En självmonterad peptid-poloxaminnanopartikel (PP-sNp) utvecklas med hjälp av en mikrofluidisk blandningsanordning för att kapsla in och leverera in vitro transkriberat budbärar-RNA. Det beskrivna mRNA / PP-sNp kan effektivt transfektera odlade celler in vitro.
Abstract
In vitro-transkriberade budbärar-RNA -vacciner (mRNA) har visat enorm potential i kampen mot coronavirussjukdomen 2019 (COVID-19) pandemi. Effektiva och säkra leveranssystem måste inkluderas i mRNA -vaccinerna på grund av mRNA -egenskaperna. Ett självmonterat peptid-poloxaminnanopartikel (PP-sNp) genleveranssystem är speciellt utformat för lungleverans av nukleinsyror och visar lovande förmåga att förmedla framgångsrik mRNA-transfektion. Här beskrivs en förbättrad metod för att förbereda PP-sNp för att utveckla hur PP-sNp kapslar in Metridia luciferase (MetLuc) mRNA och framgångsrikt transfekter odlade celler. MetLuc-mRNA erhålls genom en in vitro-transkriptionsprocess från en linjär DNA-mall. En PP-sNp framställs genom att blanda syntetisk peptid/poloxamin med mRNA-lösning med användning av en mikrofluidisk mixer, vilket möjliggör självmontering av PP-sNp. Laddningen av PP-sNp utvärderas därefter genom att mäta zetapotentialen. Under tiden mäts polydispersiteten och den hydrodynamiska storleken på PP-sNp-nanopartiklar med hjälp av dynamisk ljusspridning. mRNA / PP-sNp-nanopartiklarna transfekteras till odlade celler, och supernatanter från cellkulturen analyseras för luciferasaktivitet. De representativa resultaten visar deras förmåga till in vitro-transfektion. Detta protokoll kan belysa utvecklingen av nästa generations mRNA-vaccinleveranssystem.
Introduction
Vaccination har förkunnats som en av de mest effektiva medicinska insatserna för att minska sjukligheten och dödligheten orsakad av infektionssjukdomar1. Vikten av vacciner har visats sedan utbrottet av coronavirussjukdom 2019 (COVID-19). I motsats till det traditionella konceptet att injicera inaktiverade eller levande försvagade patogener koncentreras toppmoderna vaccinmetoder, såsom nukleinsyrabaserade vacciner, på att bevara de immunstimulerande egenskaperna hos målpatogenerna samtidigt som man undviker de potentiella säkerhetsproblemen i samband med de konventionella helmikrobiella virus- eller bakteriebaserade vaccinerna. Både DNA- och RNA -baserade (dvs. in vitro transkriberat budbärar-RNA, IVT mRNA) -baserade vacciner uppvisar profylaktisk till terapeutisk potential mot en mängd olika sjukdomar, inklusive infektionssjukdomar och cancer 2,3. I princip är potentialen hos nukleinsyrabaserade vacciner relaterad till deras produktion, effekt och säkerhet4. Dessa vacciner kan tillverkas på ett cellfritt sätt för att möjliggöra kostnadseffektiv, skalbar och snabb produktion.
Ett enda nukleinsyrabaserat vaccin kan koda för flera antigener, vilket möjliggör målet för många virusvarianter eller bakterier med ett minskat antal inokuleringar och stärker immunsvaret mot fjädrande patogener 5,6. Dessutom kan nukleinsyrabaserade vacciner efterlikna den naturliga invasionsprocessen av virus- eller bakterieinfektion, vilket ger både B-cell- och T-cellmedierade immunsvar. Till skillnad från vissa virus- eller DNA-baserade vacciner erbjuder IVT mRNA-baserade vacciner en enorm fördel när det gäller säkerhet. De kan snabbt uttrycka det önskade antigenet i cytosolen och är inte integrerade i värdgenomet, vilket undanröjer oro för insertional mutagenes7. IVT-mRNA bryts ned automatiskt efter framgångsrik översättning, så dess proteinuttryckskinetik kan enkelt kontrolleras 8,9. Katalyserad av den allvarliga akuta respiratoriska syndromet coronavirus 2 (SARS-CoV-2) pandemi har ansträngningar från företag / institutioner över hela världen möjliggjort frisläppandet på marknaden av många typer av vacciner. IVT mRNA-baserad vaccinteknik visar stor potential och har för första gången visat sin tidigare förväntade framgång tack vare sin snabba design och flexibla förmåga att anpassa sig till alla målantigener inom flera månader. Framgången för IVT mRNA-vacciner mot COVID-19 i kliniska tillämpningar öppnade inte bara en ny era av forskning och utveckling av IVT mRNA-vaccin utan samlade också värdefull erfarenhet för snabb utveckling av effektiva vacciner för att hantera utbrott av infektionssjukdomar10,11.
Trots den lovande potentialen hos IVT mRNA -vacciner fortsätter den effektiva intracellulära leveransen av IVT mRNA till verkningsstället (dvs. cytoplasma) att utgöra ett stort hinder12, särskilt för dem som administreras via luftvägarna4. IVT mRNA är i sig en instabil molekyl med en extremt kort halveringstid (~ 7 h)13, vilket gör IVT mRNA mycket benäget för nedbrytning av det allestädes närvarande RNase14. Lymfocyterna i det medfödda immunsystemet tenderar att uppsluka det erkända IVT-mRNA vid applicering in vivo . Dessutom försämrar den höga negativa laddningstätheten och den stora molekylvikten (1 x 104-1 x 106 Da) av IVT mRNA dess effektiva genomträngning över det anjoniska lipid-dubbelskiktet av cellmembran15. Därför krävs ett leveranssystem med vissa biofunktionella material för att hämma nedbrytningen av IVT-mRNA-molekylerna och underlätta cellulärt upptag16.
Bortsett från några exceptionella fall där naken IVT-mRNA användes direkt för in vivo-undersökningar, används olika leveranssystem för att transportera IVT-mRNA till det terapeutiska verkningsstället17,18. Tidigare studier har visat att endast ett fåtal IVT-mRNA detekteras i cytosol utan hjälp av ett leveranssystem19. Många strategier har utvecklats för att förbättra RNA-leveransen med kontinuerliga ansträngningar inom området, allt från protaminkondensation till lipidinkapsling20. Lipidnanopartiklar (LNP) är de mest kliniskt avancerade bland mRNA-leveransfordonen, vilket bevisas av det faktum att alla godkända mRNA COVID-19-vacciner för klinisk användning använder LNP-baserade leveranssystem21. LNP kan emellertid inte förmedla effektiv mRNA-transfektion när formuleringarna levereras via andningsvägen22, vilket anmärkningsvärt begränsar tillämpningen av dessa formuleringar för att inducera slemhinneimmunsvar eller adressera lungrelaterade sjukdomar såsom cystisk fibros eller α1-antitrypsinbrist. Därför krävs det att utveckla ett nytt leveranssystem för att underlätta effektiv leverans och transfektion av IVT mRNA i luftvägsrelaterade celler för att lösa detta ouppfyllda behov.
Det har bekräftats att peptid-poloxamin självmonterad nanopartikel (PP-sNp) leveranssystem kan förmedla effektiv transfektion av nukleinsyror i luftvägarna hos möss23. PP-sNp antar en multifunktionell modulär designmetod, som kan integrera olika funktionella moduler i nanopartiklarna för snabb screening och optimering23. De syntetiska peptiderna och elektriskt neutrala amfifila blocksampolymererna (poloxamin) inom PP-sNp kan spontant interagera med IVT mRNA för att generera jämnt fördelade nanopartiklar med en kompakt struktur och slät yta23. PP-sNp kan förbättra gentransfektionseffekten av IVT mRNA-molekyler i odlade celler och luftvägarna hos möss23. Denna studie beskriver ett protokoll för att generera PP-sNp innehållande IVT mRNA som kodar metridia luciferas (MetLuc-mRNA) (figur 1). Kontrollerad och snabb blandning via en mikrofluidisk blandningsanordning, som använder den förskjutna sillbensblandningsdesignen, används i detta protokoll. Proceduren är enkel att utföra och möjliggör generering av PP-sNp med mer enhetliga storlekar. Det allmänna målet med PP-sNp-produktion med hjälp av mikrofluidikblandaren är att skapa PP-sNp för mRNA-komplexbildning på ett välkontrollerat sätt, vilket möjliggör effektiv och reproducerbar celltransfektion in vitro. Detta protokoll beskriver beredning, montering och karakterisering av PP-sNp innehållande MetLuc-mRNA.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. In vitro-transkription av kemiskt modifierat mRNA
OBS: Det är nödvändigt att använda nukleasfria rör, reagenser, glasvaror, pipettspetsar etc., eftersom RNaser är allestädes närvarande i miljön, såsom laboratorielösningar, instrumentytor, hår, hud, damm etc. Rengör bänkytorna och pipetterna noggrant före användning och använd handskar för att undvika RNas-kontaminering.
- Utför linjärisering av DNA-mallen.
- Syntetisera den öppna läsramen (ORF) för Metridia luciferas (MetLuc) flankerad av en T7-polymeraspromotor, 5 'oöversatt region (UTR), 3'UTR och poly (A) svansar och klona den till PUC57-vektorn, som uttrycks i bakterier (se materialtabell).
OBS: Kodningssekvensen för DNA-mallen finns i tilläggsfil 1. - Odla bakterier, lysera bakterierna och rena plasmid-DNA med motsvarande kolonn (se plasmid-DNA-extraktionssats i materialförteckningen).
- Utför en enda 50 μl-reaktion som innehåller 2 μl BamHI, 2 μL KpnI (se materialtabell) och 2 μg plasmid-DNA vid 37 °C i 1 timme och uppnå linjärisering av DNA-mallen.
- Syntetisera den öppna läsramen (ORF) för Metridia luciferas (MetLuc) flankerad av en T7-polymeraspromotor, 5 'oöversatt region (UTR), 3'UTR och poly (A) svansar och klona den till PUC57-vektorn, som uttrycks i bakterier (se materialtabell).
- Utför in vitro-transkription för att generera uncapped-IVT mRNA.
- Utför mRNA-syntes med en enda 20 μL-reaktion med användning av ett T7-transkriptionssats och pseudouridin (se materialförteckning): 10 μL (0,8-1 μg) linjäriserad DNA-mall, 1,5 μL (150 mM) ATP, pseudo-UTP, GTP och CTP, 2 μL 10x transkriptionsbuffert, 1 μL T7-enzym och 1 μL nukleasfritt vatten (NF-vatten). Blanda ovannämnda komponenter noggrant och inkubera vid 37 °C i 3 timmar.
- Ta bort mallens DNA.
- Tillsätt 1 μl (1 U) DNas (RNasfritt) efter transkriptionsprocessen och inkubera vid 37 °C i 15 minuter.
- Utför uncapped-IVT mRNA-rening med litiumkloridutfällning.
- Rena det obegränsade IVT-mRNA med litiumklorid (se materialtabell) med en arbetskoncentration på 10 mM. Tillsätt 50 μl 10 mM litiumklorid till 20 μl okapslad IVT mRNA-lösning.
- Blanda hela volymen noggrant och kyla vid −20 °C i 1 timme. Samla upp det obegränsade IVT-mRNA i 12 minuter vid 12 000 x g, som rutinmässigt producerar 80-120 μg okapslat IVT-mRNA från varje enskild 20 μl-reaktion.
- Utför IVT mRNA-kapsling.
- Utför IVT mRNA-kapslingen med cap 1-kapslingssystemet (se Materialförteckning). Kortfattat, ta bort den sekundära strukturen på 50 μg uncapped-IVT mRNA genom att värma vid 65 ° C i 10 min, länka sedan 5'-änden av uncapped-IVT mRNA med lock 1, som bereds genom att modifiera m7G-kapsstrukturen med användning av 2,5 μL s-adenosylmetionin (SAM) (20 mM) och 4 μL 2'-O-metyltransferas (100 U) i en 100 μl reaktion vid 37 ° C i 30-60 min.
- Rena 100 μl av det kapsejsade IVT-mRNA med 250 μl 10 mM litiumklorid och späd i 50 μl NF-vatten.
- Bestäm renheten och molekylstorleken för capped-IVT mRNA.
- Mät koncentrationen av capped-IVT mRNA med en UV-synlig spektrofotometer. Använd en RNA-markör (se materialförteckning), analysera molekylstorleken för capped-IVT mRNA i en 1% formaldehyddenaturerande agarosgel innehållande 18% formaldehyd (spänningen är 120 V). Se till att det obegränsade IVT-mRNA och det begränsade IVT-mRNA lagras vid −80 °C.
OBS: IVT-mRNA ansågs ha god renhet i ett A 260 / A 280-förhållande på 1,8-2,1 och ett A260 / A 230-förhållande på 2,0 eller något högre.
- Mät koncentrationen av capped-IVT mRNA med en UV-synlig spektrofotometer. Använd en RNA-markör (se materialförteckning), analysera molekylstorleken för capped-IVT mRNA i en 1% formaldehyddenaturerande agarosgel innehållande 18% formaldehyd (spänningen är 120 V). Se till att det obegränsade IVT-mRNA och det begränsade IVT-mRNA lagras vid −80 °C.
2. Generering av IVT mRNA / PP-sNp
- Bered poloxamin 704 (T704) stamlösning genom att solubilisera T704 (se materialtabell) i NF-vatten för att erhålla en 10 mg/ml stamlösning. Förvara den beredda lösningen vid 4 °C.
OBS: T704 innehåller en X-formad struktur gjord av en etylendiamin central grupp bunden till fyra kedjor av poly (propylenoxid) (PPO) block och poly (etylenoxid) (PEO) block24. Molekylvikten (Mw) för T704 är 5500. - Bered stamlösningen av den syntetiska peptiden (sPep, se materialförteckningen) genom att solubilisera sPep (sekvens: KETWWETWWTEWWTEWKKKKRRRRRKKKKGACSE
RSMNFCG) i NF-vatten för att erhålla en 2 mg/ml stamlösning och förvara vid 4 °C. - Bered IVT mRNA-lösningen genom att tina IVT-mRNA (steg 1) på is och centrifugera kort i 3 s vid 300 x g vid rumstemperatur innan röret öppnas. Späd IVT mRNA-lösningen till 0,04 μg/μl med NF-vatten.
OBS: Det rekommenderas att arbeta i ett biosäkerhetsskåp när det är möjligt med IVT mRNA. - Bered T704- och sPep-blandningslösningen genom att späda sPep-lösningen till 0,555 μg/μl och T704-lösningen till 8 μg/μl med NF-vatten. Inkubera den blandade lösningen i 15 minuter vid rumstemperatur före vidare användning.
OBS: Beräkna den önskade sPep-komponenten baserat på önskat N / P-förhållande. N/P-förhållandet är det totala antalet kväverester (N) inom sPep till det totala antalet negativt laddade fosfatgrupper (P) inom IVT mRNA. Beräkna erforderlig T704 baserat på förhållandet mellan vikt och vikt (w/w) mellan T704 och IVT mRNA. Det är nödvändigt att N / P-förhållandet är 5 och w / w-förhållandet är 100. - Förbered IVT mRNA / PP-sNp-formuleringen enligt stegen nedan.
- Dra in IVT mRNA-lösningen (steg 3) i en 1 ml spruta och se till att inga luftspalter eller bubblor i sprutspetsen finns. Ladda sprutan i ena sidan av patronen bredvid det roterande blocket.
- Fyll en 1 ml spruta med T704 och sPep blandningslösning (steg 4). Ta bort eventuella bubblor eller luftspalter vid sprutspetsen och sätt sprutan i pumpens andra inlopp (se Materialförteckning).
- Ställ pumpen med ett flödesförhållande på 1:1 och en total flödeshastighet på 4-10 ml/min.
OBS: En total flödeshastighet på 6 ml / min är optimal i de studier som presenteras här. - Placera ett 10 ml RNasfritt koniskt rör (se materialtabell) för att samla upp den blandade IVT-mRNA / PP-sNp-lösningen i slutet av blandningsanordningens flödesväg.
- Kör pumpen för att starta blandningen och se till att parametrarna matas in korrekt. När pumpen är klar i 6 s, samla IVT-mRNA / PP-sNp-provet från det koniska röret.
OBS: PP-sNp genererades med hjälp av en mikrofluidisk mixer (kompletterande figur 1). Enheten består av en konstantflödespump, länkanordning, chip och fast enhet. I blandningsprocessen levererar konstantflödespumpen ansluten till chipet vätska till chipet enligt den förinställda flödeshastigheten. Den anslutna konstantflödespumpen kan anslutas till flera ingångskanaler på chipet med en enda utgångskanal. Komponenterna i anordningen, inklusive chipet, erhölls från kommersiella källor och rationellt monterade (se materialförteckning). Parametrarna, såsom flödeshastighet och volym för IVT mRNA-lösningen och T704-sPep blandad lösning, kan skilja sig från de som visas i det aktuella protokollet om någon annan inställning används och måste optimeras i enlighet därmed.
3. Mätning av den hydrodynamiska diametern och polydispersiteten hos IVT-mRNA/PP-sNp
- Späd en alikvot av IVT mRNA/PP-sNp-lösningen (steg 2) med NF-vatten för att erhålla en slutlig volym på 1 ml.
- Mät den hydrodynamiska storleken och polydispersitetsindexet (PDI) med hjälp av en halvmikrokyvett25. Tillsätt IVT mRNA/PP-sNp-lösningen i kyvetten och placera den i partikelstorleksmätaren (se Materialförteckning). Ställ in en standardprocedur och klicka på Start för att påbörja datainsamlingen.
4. Beredning av cellerna för transfektion
- Platta humana bronkialepitelceller (16HBE) och en dendritisk cellinje (DC2.4) i 96-brunnsplattor med en densitet av 3,5 x 104 celler / brunn 24 h före transfektion. Odla cellerna i ett odlingsmedium kompletterat med 10% värmeinaktiverat fosterserum och 1% penicillin / streptomycin.
OBS: Cellerna erhölls från en kommersiell källa (se materialförteckning). - Inkubera cellerna i en inkubator (37 °C och 5%CO2-atmosfär ) i 24 timmar för att säkerställa att cellerna är 60%-80% sammanflytande före transfektionen.
5. Transfektion av de odlade cellerna
- Efter att ha tagit bort tillväxtmediet, tvätta de pläterade cellerna med 0,2 ml / brunn 1x PBS.
- Tillsätt 170 μl serumfritt odlingsmedium till varje brunn som innehåller de pläterade cellkulturerna.
- Tillsätt IVT mRNA/PP-sNp-formuleringen innehållande 0,4 μg MetLuc mRNA (berett i steg 2) droppvis med en mängd av 30 μl/brunn.
- Inkubera cellerna med IVT mRNA/PP-sNp-formuleringen vid 37 °C i en fuktad 5%CO2-berikad atmosfär i 4 timmar.
- Byt ut transfektionsmediet med 0,2 ml färskt odlingsmedium kompletterat med 10% värmeinaktiverat fosterbovint serum och 1% (v/v) penicillin/streptomycin.
OBS: Fostrets bovina serum upphettades vid 56 °C i 30 minuter för inaktivering. - Inkubera de transfekterade cellerna vid 37 °C och i en 5%CO2-berikad atmosfär i 24 timmar och samla upp supernatanterna som ska detekteras från varje brunn.
6. Analys av celltransfektionseffekt med hjälp av Metridia luciferas (MetLuc) -analys
- Analysera supernatanten från varje brunn för MetLuc-aktivitet med hjälp av coelenterazinsubstrat (se materialtabell) enligt stegen nedan.
- Förbered en ny analyslösning genom att tillsätta 1x PBS till coelenterazinsubstratet (koncentrationen av coelenterazin är 15 mM).
- Vortex coelenterazinlösningen i 10 s för noggrann blandning.
- Tillsätt 50 μl supernatant (samlas i steg 5) till en 96-brunnsplatta.
- Ställ in mikroplattläsaren (se materialförteckningen) med en lästid på 1 000 ms innan du tillsätter 30 μl coelenterazinlösning (15 mM) till varje brunn manuellt eller genom automatisk injektion.
- Klicka på Start för att mäta luminiscenssignalen omedelbart efter tillsats av coelenterazinlösningen till supernatanten.
OBS: Luminiscenssignalen mäts med hjälp av en mikroplattläsare och dess aktivitet uttrycks i relativa ljusenheter. De värden som erhålls från PBS-transfekterade brunnar kommer att användas som blankkontroller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den rekombinanta plasmiden smältes för att producera den linjäriserade DNA-mallen (figur 2A). Med hjälp av det beskrivna protokollet kan T7 in vitro-transkriptionssatsen producera upp till 80-120 μg obegränsad MetLuc-mRNA per 20 μL-reaktion och 50-60 μg täckt MetLuc-mRNA per 100 μL-reaktion. När det analyseras med elektrofores bör intakt MetLuc-mRNA med hög kvalitet visa ett enda och tydligt band, som visas i figur 2B. Föroreningar som införs i reaktionen från DNA-mallen kan leda till RNA-nedbrytning och ett lägre utbyte.
PP-sNp innehållande MetLuc-mRNA (MetLuc-mRNA/PP-sNp) framställdes med användning av den mikrofluidiska blandningsmetoden (figur 1). Tabell 1 visar data om den fysikalisk-kemiska karakteriseringen av MetLuc-mRNA/PP-sNp som exempel. Den hydrodynamiska radien för MetLuc-mRNA / PP-sNp kan anses vara korrekt om den sträcker sig cirka 70-100 nm. Dessutom måste PDI för PP-sNp vara konstant och helst vara under 0,2, men PDI-värden upp till cirka 0,3 accepteras.
Efter att framgångsrikt ha införlivat MetLuc-mRNA i PP-sNp kan formuleringen inkuberas med 16HBE-celler och en dendritisk cellinje (DC2.4), och transfektionseffektiviteten hos MetLuc-mRNA kan indikeras av luciferasaktiviteten inom cellodlingssupernatanten 24 timmar efter transfektion. Figur 3 är ett typiskt exempel på den framgångsrika transfektionen av MetLuc-mRNA/PP-sNp. Det kan tydligt ses att celler transfekterade med MetLuc-mRNA / PP-sNp visade signifikant högre uttryck av luciferas jämfört med de som transfekterades med kommersiellt tillgänglig lipidbaserad transfektionsregent (LP) (se materialtabell), naken MetLuc-mRNA (negativ kontroll), PBS (blankkontroll) eller T704-sPep blandad lösning (mock control) i 16HBE-celler. MetLuc-mRNA / PP-sNp visade också högre uttryck av luciferas jämfört med LP. Data tyder på att PP-sNp-leveranssystemet är viktigt för att skydda MetLuc-mRNA mot nedbrytning och för att främja transfektionseffektiviteten hos det exogena MetLuc-mRNA. Därför är leveranssystem som PP-sNp i allmänhet viktiga för IVT mRNA-transfektionsstudier.
Figur 1: Schematisk representation av hela arbetsflödet för IVT mRNA/PP-sNp. DNA-mallen är kopplad till plasmiden genom rekombinant plasmidkonstruktion. Den linjäriserade DNA-mallen monteras med hjälp av restriktionsenzymsmältning. In vitro transkriberat mRNA (IVT mRNA) syntetiseras och begränsas från den linjäriserade DNA-mallen. T704-sPep-lösningen innehåller T704 och den syntetiska peptiden (sPep), medan IVT mRNA-lösningen innehåller MetLuc-mRNA. IVT mRNA och T704-sPep blandade lösningar blandas med hjälp av en mikrofluidisk mixer, som bildar MetLuc-mRNA / PP-sNp. Därefter utförs karakteriseringen av MetLuc-mRNA / PP-sNp för att bestämma partikelstorleken och polydispersiteten med användning av en Zetasizer. 16HBE-celler transfekteras med MetLuc-mRNA / PP-sNp, och luciferasaktiviteten i supernatanten mäts för att utvärdera transfektionseffektiviteten. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Produktionen av MetLuc-mRNA. (A) DNA-mallen innehåller en T7-polymeraspromotor, en 5'untraslated region (UTR), en öppen läsram (ORF) av MetLuc, en 3'UTR och poly (A) svansar. (B) Detektering av elektrofores. Den vita pilen indikerar rekombinant plasmid. Den gula pilen indikerar PUC57-vektorn. Den röda pilen indikerar DNA-mallen för in vitro-transkription av MetLuc-mRNA. Den gröna pilen indikerar obegränsad MetLuc-mRNA. Den blå pilen indikerar metLuc-mRNA med begränsat gränsvärde. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Transfektionseffektivitet för MetLuc-mRNA / PP-sNp i 16HBE- och DC2.4-celler. MetLuc-mRNA transfekterades med PP-sNp i (A) 16HBE-celler och (B) en dendritisk cellinje (DC2.4). Den slutliga koncentrationen av MetLuc-mRNA var 0,02 μg/μl, den för sPep var 0,139 μg/μl och den för T704 var 2 μg/μl i PP-sNp. Kommersiell lipidbaserad transfektionsregent (LP) antogs som en positiv kontroll. Luciferasaktiviteten mättes 24 timmar efter transfektion. Det PBS-behandlade provet antogs som en blankkontroll. T704-sPep blandade lösning antogs som en mock kontroll. Statistiska skillnader analyserades med ett Students t-test (ns p ≥ 0,05, * p < 0,05). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| IVT mRNA | Ej tillämpligt (sPep) | med vikt (T704) | Storlek (nm) | Pdi | Zeta |
| 17,5 ng/μL | 5 | 100 | 85.12 ± 9.40 | 0,20 ± 0,07 | -13.07 ± 0,47 |
Tabell 1: Fysikalisk-kemiska karakteriseringsdata för MetLuc-mRNA/PP-sNp.
Kompletterande figur 1: Installationen av den egenberedda mikrofluidikanordningen som används i den aktuella studien. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Tilläggsfil 1: DNA-mallens kodningssekvens. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollet som beskrivs här tillåter inte bara kostnadseffektiv och snabb produktion av IVT mRNA-vaccinformuleringar med definierade egenskaper, men det erbjuder också möjligheten att anpassa PP-sNp-formuleringen enligt specifika terapeutiska ändamål, såsom genterapi. För att säkerställa en framgångsrik generering av IVT mRNA / PP-sNp föreslås att man ägnar extra uppmärksamhet åt några kritiska steg. När du arbetar med mRNA, kom alltid ihåg att RNas-fria förhållanden bör bibehållas under hela processen eftersom IVT-mRNA är mycket känsligt med avseende på nedbrytning av RNas, även om IVT-mRNA har framställts med kemisk modifiering. Under tiden måste en RNas-fri miljö också säkerställas vid lagring av formuleringarna. Det rekommenderas att förvara IVT mRNA/PP-sNp vid 2-8 °C i upp till 1 vecka. De presenterade resultaten visar att nukleasfritt vatten är effektivt för att framgångsrikt bilda PP-sNp med hög transfektionseffektivitet. Andra buffertar, såsom PBS, saltlösning, OptiMEM, etc., kan användas om så önskas. Det rekommenderas att utföra in vitro-transfektioner med IVT mRNA / PP-sNp i ett OptiMEM-medium för att säkerställa livskraften hos de odlade cellerna. Om en annan buffert snarare än nukleasfritt vatten väljs för att bereda formuleringen är det viktigt att använda IVT-mRNA med låg koncentration (under 100 ng/ml); annars tenderar nanopartiklarna att fällas ut, vilket i sin tur gör en ogiltig formulering. Orsaken till detta fenomen är den katjoniska delen inom den syntetiska peptiden. Dessutom kan nanopartikelns starka positiva laddningstäthet destabilisera cellmembranet och därmed inducera signifikant cytotoxicitet. Det visades dock i den tidigare studien att den positiva laddningen inom PP-sNp är absolut nödvändig för att förmedla effektivt IVT mRNA-cellulärt upptag, endosomflykt och framgångsrik transfektion23. Som ett resultat är det viktigt att justera den positiva laddningen inom PP-sNp för att hitta en känslig balans när det gäller effektivitet och toxicitet.
Det presenterade protokollet kan tillämpas på olika PP-sNp-baserade formuleringar med vissa parameterändringar. För leverans av IVT mRNA-baserade vacciner är biofysiska egenskaper såsom partikelstorlek och polydispersitetsindex avgörande för transfektionseffektiviteten och immunogeniciteten hos de beredda nanopartiklarna26. Partikelstorleken hos IVT mRNA/PP-sNp i nanometerskalan möjliggör effektiv överföring över fysiologiska barriärer och är därmed viktig för efterföljande in vivo-tillämpningar. Det har rapporterats att LNP i storleksintervallet 60-150 nm producerar robusta immunsvar hos icke-mänskliga primater26. Å andra sidan kunde stora nanopartiklar (t.ex. 400-1000 nm) inte övervinna luftvägsslembarriären när de applicerades för lungleverans eftersom, som avslöjats av tidigare undersökningar, det genomsnittliga 3-dimensionella nätavståndet mellan luftvägsslemnätporerna varierar från cirka 60-300 nm27,28. Om önskad storlek eller transfektionseffektivitet inte uppnås omfattar några tips för att påbörja felsökning att justera mängden poloxamin eller syntetiska peptidkomponenter som används. Den tidigare studien avslöjade att ytterligare parametrar, såsom mängden IVT mRNA som används för transfektion, inkubationstiden och typerna och celldensiteten hos odlade celler, också kan påverka transfektionsresultatet23 avsevärt. Eftersom inriktningsdelen inom PP-sNp möjliggör specifik leverans av det inkapslade IVT-mRNA till celler som visar relaterade receptorer, kan ersättning med alternativa inriktningsligander vara nödvändig om målcellerna transfekteras med andra typer snarare än luftvägsrelaterade celler. Sammantaget kan protokollet fortfarande förbättras med mer detaljerad insikt och ytterligare undersökning.
Med tanke på att den ursprungliga IVT mRNA / PP-sNp framställs initialt genom direkt manuell blandning, spelar operatörens förmågor en viktig roll för att kontrollera formuleringens kvalitet. Modifieringar i processen att blanda IVT-mRNA med komponenterna i PP-sNp kan resultera i stora mikropartiklar snarare än partiklar i nanostorlek. Det svåraste steget är att blanda mRNA och den syntetiska peptiden, vilket måste göras på ett kontrollerat sätt. För att förbättra reproducerbarheten mellan olika satser av IVT mRNA / PP-sNp-formulering antogs en mikrofluidisk mixer eftersom screening med låg volym, snabb hastighet och reproducerbarhet är viktiga egenskaper vid användning av mikrofluidikmetoden29. Denna metod visade god reproducerbarhet, utan någon signifikant inverkan på partikelstorleken eller transfektionseffektiviteten som observerades mellan olika satser. Detta är ett viktigt kriterium för IVT mRNA-baserade vacciner som ska tillämpas i kliniska tillämpningar. I synnerhet bör mikrofluidikblandaren inte överstiga det maximala antalet användare (rekommenderas av tillverkaren) och måste ändras mellan formuleringar med olika kompositioner.
Protokollet för IVT mRNA-transkription som beskrivs i detta protokoll kan teoretiskt användas för att framställa alla reporterproteiner / antigen av intresse. Metridia luciferas (MetLuc) tillämpades specifikt i denna studie eftersom det har unika fördelar. Aktivitetsanalysen av MetLuc är lätt att utföra med hög känslighet eftersom MetLuc kan producera en intensiv bioluminescerande signal, och den kan utsöndras direkt i cellmediet, vilket undviker behovet av celllys. Det är viktigt att notera att MetLuc-uttryck i de odlade cellerna kan påverkas av många parametrar (t.ex. varierande cellnummer per brunn och pipetteringsfel etc.) annat än funktionaliteten hos själva MetLuc-mRNA.
Även om det nuvarande protokollet upprättades för leverans av IVT mRNA-vaccinet, kan det också implementeras för vacciner eller terapier som är baserade på andra typer av nukleinsyror, såsom plasmid-DNA (pDNA). Denna process kan anpassas till syntetiska peptid-, nukleinsyra- och poloxaminkomponentförändringar för att utveckla särskilda PP-sNp för olika kliniska indikationer. Faktum är att genomintegrationen av den exogena cystiska fibrostransmembrantransduktionsregulatorn (CFTR) -genen i andningsepitelvävnaden hos CFTR-knockoutmöss med användning av ett Törnrosa-genetiskt modifieringsverktyg levererat av en PP-sNp23 uppnåddes framgångsrikt. När det gäller terapeutiska tillämpningar kan IVT mRNA / PP-sNp-formuleringar användas som en aerosol med användning av specifika nebuliseringsanordningar för att bota lungsjukdomar, såsom α1-antitrypsinbrist eller cystisk fibros30. Det är dock värt att notera att IVT mRNA / PP-sNp-formuleringar för nebulisering bör optimeras och anpassas, eftersom det aerosoliserade IVT-mRNA kan vara ineffektivt på grund av skjuvkraften som skapas av nebulisatorn och den bräckliga naturen hos IVT mRNA30. Dessutom är protokollet möjligen skalbart till större volymer med hjälp av olika mikrofluidiska blandningsanordningar, såsom T-korsningsblandningsanordningar och till och med impingementstrålar som blandar pumpar31,32.
Sammanfattningsvis introducerar protokollet som beskrivs här en reproducerbar metod för att formulera IVT mRNA i ett PP-sNp-leveranssystem, liksom efterföljande tillförlitlig transfektion i odlade celler. Den beskrivna metoden garanterar ett tillgängligt och enkelt tillvägagångssätt för att producera IVT mRNA / PP-sNp med hjälp av en mikrofluidisk mixer. De beredda formuleringarna med små partikelstorlekar och lågt polydispersitetsindex kan därefter appliceras på säkert och effektivt transfekterade odlade celler. Detta protokoll kommer att göra det möjligt för det PP-sNp-baserade leveranssystemet att bli tillgängligt för det akademiska samfundet för att utforma nya IVT mRNA-baserade vacciner eller terapier samtidigt som alla nämnda nackdelar undviks. Med de flexibla profilerna för PP-sNp förväntas många framtida applikationer uppnås med PP-sNp för att producera distinkta terapier för att hantera olika sjukdomar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av National Natural Science Foundation of China (NSFC, Grant No. 82041045 och 82173764), det stora projektet Study on Pathogenesis and Epidemic Prevention Technology System (2021YFC2302500) av Kinas ministerium för vetenskap och teknik, Chongqing Talents: Exceptional Young Talents Project (CQYC202005027) och Natural Science Foundation of Chongqing (cstc2021jcyj-msxmX0136). Författarna är tacksamma mot Dr. Xiaoyan Ding för att ha mätt den hydrodynamiska diametern (nm) och polydispersitetsindexet (PDI).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BamHI | Takara | 1010 | |
| cap 1 capping system | Jinan | M082 | |
| Dendritic cell-line | Sigma | SCC142 | |
| DNA sequence | Genescript | ||
| Human bronchial epithelial cells | Sigma | SCC150 | |
| KpnI | Takara | 1068 | |
| LP | Beyotime | C0533 | |
| Lithium chloride | APEXBio | B6083 | |
| Malvern Zetasizer Nano ZS90 | Malvern | NB007605 | |
| Microfluidic chip | ZHONGXINQIHENG | Standard PDMS chip | |
| Microplate readers | ThermoFisher | Varioskan lux | |
| NanoDrop One | ThermoFisher | ND-ONE-W (A30221) | |
| Nuclease-free water | ThermoFisher | AM9932 | |
| OptiMEM | Gibco | 31985070 | |
| Penicillin-streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Pseudouridine | APE×Bio | B7972 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27106 | |
| Quanti-Luc | InvivoGen | Rep-qlc2 | |
| RiboRuler High Range RNA Ladder | ThermoFisher | SM1821 | |
| RNase-free conical tube | Biosharp | BS-100-M | |
| RPMI Medium 1640 | ThermoFisher | C11875500BT | |
| Syringe pump | Chemyx | Fusion 101 | |
| T7 transcription Kit | Jinan | E131 |
References
- Fehervari, Z., Minton, K., Duarte, J. H. Nature milestones in vaccines. Springer Nature. , Available from: https://www.nature.com/collections/hcajdiajij (2020).
- Barbier, A. J., Jiang, A. Y., Zhang, P., Wooster, R., Anderson, D. G. The clinical progress of mRNA vaccines and immunotherapies. Nature Biotechnology. 40 (6), 840-854 (2022).
- Mulligan, M. J., et al. Phase I/II study of COVID-19 RNA vaccine BNT162b1 in adults. Nature. 586 (7830), 589-593 (2020).
- Tang, J., et al. Nanotechnologies in delivery of DNA and mRNA vaccines to the nasal and pulmonary mucosa. Nanomaterials. 12 (2), 226 (2022).
- Freyn, A. W., et al. A multi-targeting, nucleoside-modified mRNA influenza virus vaccine provides broad protection in mice. Molecular Therapy. 28 (7), 1569-1584 (2020).
- Wu, K., et al. Variant SARS-CoV-2 mRNA vaccines confer broad neutralization as primary or booster series in mice. Vaccine. 39 (51), 7394-7400 (2021).
- Chaudhary, N., Weissman, D., Whitehead, K. A. mRNA vaccines for infectious diseases: Principles, delivery and clinical translation. Nature Reviews Drug Discovery. 20, 817-838 (2021).
- Kormann, M. S. D., et al. Expression of therapeutic proteins after delivery of chemically modified mRNA in mice. Nature Biotechnology. 29 (2), 154-157 (2011).
- Tavernier, G., et al. mRNA as gene therapeutic: How to control protein expression. Journal of Controlled Release. 150 (3), 238-247 (2011).
- Walsh, E. E., et al. Safety and immunogenicity of two RNA-based Covid-19 vaccine candidates. The New England Journal of Medicine. 383 (25), 2439-2450 (2020).
- Baden, L. R., et al. Efficacy and safety of the mRNA-1273 SARS-CoV-2 vaccine. The New England Journal of Medicine. 384 (5), 403-416 (2021).
- Guan, S., Rosenecker, J. Nanotechnologies in delivery of mRNA therapeutics using nonviral vector-based delivery systems. Gene Therapy. 24 (3), 133-143 (2017).
- Sharova, L. V., et al. Database for mRNA half-life of 19 977 genes obtained by DNA microarray analysis of pluripotent and differentiating mouse embryonic stem cells. DNA Research. 16 (1), 45-58 (2009).
- Houseley, J., Tollervey, D. The many pathways of RNA degradation. Cell. 136 (4), 763-776 (2009).
- Kowalski, P. S., Rudra, A., Miao, L., Anderson, D. G. Delivering the messenger: Advances in technologies for therapeutic mRNA delivery. Molecular Therapy. 27 (4), 710-728 (2019).
- Sahin, U., Karikó, K., Türeci, Ö MRNA-based therapeutics-developing a new class of drugs. Nature Reviews Drug Discovery. 13, 359-380 (2014).
- Hajj, K. A., Whitehead, K. A. Tools for translation: Non-viral materials for therapeutic mRNA delivery. Nature Reviews Materials. 2, 17056 (2017).
- Deering, R. P., Kommareddy, S., Ulmer, J. B., Brito, L. A., Geall, A. J. Nucleic acid vaccines: Prospects for non-viral delivery of mRNA vaccines. Expert Opinion on Drug Delivery. 11 (6), 885-899 (2014).
- Wadhwa, A., Aljabbari, A., Lokras, A., Foged, C., Thakur, A. Opportunities and challenges in the delivery of mRNA-based vaccines. Pharmaceutics. 12 (2), 102 (2020).
- Hou, X., Zaks, T., Langer, R., Dong, Y. Lipid nanoparticles for mRNA delivery. Nature Reviews Materials. 6 (12), 1078-1094 (2021).
- Sahin, U., et al. COVID-19 vaccine BNT162b1 elicits human antibody and T(H)1 T cell responses. Nature. 586 (7830), 594-599 (2020).
- Azzi, L., et al. Mucosal immune response in BNT162b2 COVID-19 vaccine recipients. EBioMedicine. 75, 103788 (2022).
- Guan, S., et al. Self-assembled peptide-poloxamine nanoparticles enable in vitro and in vivo genome restoration for cystic fibrosis. Nature Nanotechnology. 14 (3), 287-297 (2019).
- Pitard, B., et al. Negatively charged self-assembling DNA/poloxamine nanospheres for in vivo gene transfer. Nucleic Acids Research. 32 (20), 159 (2004).
- Hiroi, T., Shibayama, M. Measurement of particle size distribution in turbid solutions by dynamic light scattering microscopy. Journal of Visualized Experiments. (119), e54885 (2017).
- Hassett, K. J., et al. Impact of lipid nanoparticle size on mRNA vaccine immunogenicity. Journal of Controlled Release. 335, 237-246 (2021).
- Suk, J. S., et al. The penetration of fresh undiluted sputum expectorated by cystic fibrosis patients by non-adhesive polymer nanoparticles. Biomaterials. 30 (13), 2591-2597 (2009).
- Kim, N., Duncan, G. A., Hanes, J., Suk, J. S. Barriers to inhaled gene therapy of obstructive lung diseases: A review. Journal of Controlled Release. 240, 465-488 (2016).
- Liu, Z., Fontana, F., Python, A., Hirvonen, J. T., Santos, H. A. Microfluidics for production of particles: Mechanism, methodology, and applications. Small. 16 (9), 1904673 (2020).
- Guan, S., Darmstädter, M., Xu, C., Rosenecker, J. In vitro investigations on optimizing and nebulization of IVT-mRNA formulations for potential pulmonary-based alpha-1-antitrypsin deficiency treatment. Pharmaceutics. 13 (8), 1281 (2021).
- Shepherd, S. J., Issadore, D., Mitchell, M. J. Microfluidic formulation of nanoparticles for biomedical applications. Biomaterials. 274, 120826 (2021).
- Han, J., et al. A simple confined impingement jets mixer for flash nanoprecipitation. Journal of Pharmaceutical Sciences. 101 (10), 4018-4023 (2012).
