Summary
פרוטוקול זה מתאר את הסינתזה של פפטידים מחזוריים החודרים לתאים עם קישורים צולבים ארומטיים ואת הערכת החדירות שלהם על פני מחסומים ביולוגיים.
Abstract
סרטן היה אתגר גדול בבריאות העולמית. עם זאת, המיקרו-סביבה המורכבת של הגידול בדרך כלל מגבילה את הגישה של טיפולים לתאי גידול עמוקים יותר, מה שמוביל להישנות הגידול. כדי להתגבר על החדירה המוגבלת של מחסומים ביולוגיים, פפטידים חודרי תאים (CPPs) התגלו עם יכולת טרנסלוקציה מעולה של הממברנה והתגלו כמובילים מולקולריים שימושיים להעברת מטענים שונים לתאים. עם זאת, CPPs ליניאריים קונבנציונליים מראים בדרך כלל יציבות פרוטאוליטית פגומה, מה שמגביל את החדירות שלהם על פני מחסומים ביולוגיים. לפיכך, הפיתוח של טרנספורטרים מולקולריים חדשניים שיכולים לחדור מחסומים ביולוגיים ולהפגין יציבות פרוטאוליטית משופרת הוא רצוי מאוד כדי לקדם יעילות אספקת תרופות ביישומים ביו-רפואיים. בעבר סינתזנו פאנל של CPPs מחזוריים קצרים עם קישורים צולבים ארומטיים, שהציגו חדירות מעולה בתאים וברקמות סרטניים בהשוואה למקביליהם הליניאריים. כאן, פרוטוקול תמציתי מתואר לסינתזה של פפטיד פוליארגינין R8 מחזורי המסומן פלואורסצנטית ומקבילו הלינארי, כמו גם שלבי מפתח לחקר חדירות התא שלהם.
Introduction
בעשורים האחרונים חלה התקדמות מהירה בפיתוח פפטידים חודרי תאים (CPP) לאספקת תרופות. CPPs נמצאים בשימוש נרחב כמובילים מולקולריים לטיפול במגוון מחלות מסכנות חיים, כולל הפרעות נוירולוגיות1,2, מחלות לב3, סוכרת4, דרמטוזיס5 וסרטן 6,7. מחלת הסרטן נותרה נטל בריאותי עולמי המלווה בשיעור גבוה של תחלואה ותמותה למרות מאמצי מחקר נרחבים8. מכשול רציני לטיפול בסרטן הוא הגישה המוגבלת של טיפולים לתאי גידול עמוקים יותר עקב מחסומים פיזיולוגיים כגון מטריצה חוץ-תאית קומפקטית (ECM), כלי דם גידוליים חריגים, מחסומי ממברנות מרובים ולחץ נוזל אינטרסטיציאלי גבוה (IFP)9. לפיכך, פיתוח CPPs חדשניים עם יכולת מעולה להעביר מטענים מעבר למחסומים ביולוגיים נחשב אסטרטגיה חיונית לטיפול בסרטן10,11.
ניתן לסווג CPPs לקטיון, אמפיפתי והידרופובי במונחים של התכונות הפיזיקוכימיות שלהם12. בין אלה, פפטיד HIV-TAT טעון חיובי ופוליארגינין סינתטי הם בעלי חשיבות רבה במחקר ביו-רפואי ונחקרו בהרחבה כדי להקל על מתן תרופות תוך תאיות13. טונמן ועמיתיו דיווחו כי אורך מינימלי של שמונה ארגינינים חיוני לחדירה יעילה של פפטידים פוליארגינין סינתטיים, בהתבסס על מחקר חדירות תאים שנערך באמצעות פפטידים R3 עד R1214. עם זאת, ל-CPPs אלה יש בדרך כלל זמן מחצית חיים קצר בפלזמה בשל ההידרוליזה המהירה שלהם in vivo. בנוסף, מעט ידוע על אופטימיזציה של המבנה הכימי של CPPs כדי להגדיל את יכולת מחסום הטרנס שלהם, שכן זה מאתגר לחדור קרומי תאים מרובים15. לפיכך, פיתוח של טרנספורטרים מולקולריים חדשניים המסוגלים לחדור מחסומים ביולוגיים רצוי מאוד כדי לשפר את יעילות אספקת התרופות. בשנת 2020, Komin et al.16 גילו CPP בשם CL peptide, המכיל מוטיב סליל (RLLRLLR) וזנב פוליארגינין (R7) לחציית חד-שכבה אפיתלית. קבוצה של גרסאות פפטיד CL סונתזו גם על ידי שינוי התבנית הסלילית. מחקר זה יכול להיות מדריך משמעותי לפיתוח CPPs חדשניים להובלת מטענים מעבר למחסומים ביולוגיים. יתר על כן, דיטריך ועמיתיו ייעלו את חדירות התאים של פפטיד StAX, ועיכבו את מסלול האיתות Wnt/β-catenin על ידי הגדלת ההידרופוביות הכוללת של הפפטידים17.
הגבלה קונפורמטיבית של פפטידים ליניאריים לא מובנים על ידי מחזוריות היא דרך יעילה לשפר את היציבות והחדירות הפרוטאוליטית שלהם18,19,20. החיזוק המבני מגביר את עמידות הפרוטאז של פפטידים מחזוריים, מה שהופך אותם ליציבים יותר ב-vivo בהשוואה למקביליהם הלינאריים. בנוסף, מחזוריות של פפטידים יכולה באופן פוטנציאלי להסוות את עמוד השדרה של הפפטידים הקוטביים על ידי קידום קשרי מימן תוך-מולקולריים, ובכך להגדיל את חדירות הממברנה של הפפטידים21. בשני העשורים האחרונים, שיטות מחזוריות כימוסלקטיביות הפכו לאסטרטגיות יעילות לבניית פפטידים מחזוריים עם ארכיטקטורות שונות, כגון כל-פחמימנים, לקטם, טריאזול, m-xylene, perfluoroaryl, וקישורים צולבים אחרים22,23. המחסום הביולוגי שמטילה המיקרו-סביבה המתוחכמת של הגידול יכול להפחית את חדירת התרופות בגידולים מוצקים24. מצאנו בעבר כי CPPs מחזוריים הפגינו עמידות עדיפה לעיכול אנזימטי על פני עמיתיהם הליניאריים20. יתר על כן, ההידרופוביות הכוללת של הפפטידים היא קריטית לחדירות התאים המשופרת שלהם22. בהתבסס על המחקרים שנדונו לעיל, ניתן לשער כי השילוב של דפוס טעון חיובי, הידרופוביות כללית מוגברת ויציבות פרוטאוליזה משופרת מגביר את החדירות של CPPs על פני מחסומים ביולוגיים. במחקר שנערך לאחרונה, זיהינו שני CPPs מחזוריים עם קישורים ארומטיים במיקומים i ו- i+7 המציגים חדירות משופרת בתאים וברקמות של הגידול בהשוואה למקביליהם הליניאריים15. כאן, פרוטוקול סינתטי תמציתי לסינתזה של CPPs מחזוריים מסומנים פלואורסצנטית ואת השלבים העיקריים כדי לחקור את החדירות שלהם מוצגים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הכנת ציוד
הערה: בצע את כל ההליכים במכסה אדים תפעולי עם ציוד מגן אישי מתאים.
- הרכיבו את מנגנון סינתזת הפפטיד הידני במכסה האדים (איור 1). הניחו את הפקקים התלת-כיווניים (ראו טבלת חומרים) על סעפת הוואקום (ראו טבלת חומרים) והתחברו לחנקן (N2). הקפד לכסות את הפתחים שאינם בשימוש.
- חבר עמוד פוליפרופילן בנפח 10 מ"ל (ראה טבלת חומרים) על הסטופקוק התלת-כיווני. מסננים את תערובת התגובה או הממיסים מעמוד הפוליפרופילן באמצעות נורת פיפטה גומי או ואקום באמצעות מלכודת פסולת.
2. סינתזה של פפטיד R8 ליניארי (FITC-R8) ושל פפטיד R8 מהודק (FITC-sR8-4)
הערה: הפפטידים סונתזו בהתאם לפרוטוקול סטנדרטי של סינתזת פפטיד בשלב מוצק מבוסס FMOC (SPPS)25. 4-(2',4'-Dimethoxypheyl-Fmoc-aminomethyl)-phenoxyacetamido-norleucyl-MBHA שרף (rink amide MBHA שרף, ראה טבלה של חומרים) שימש לאורך כל המחקר.
אזהרה: N, N-דימתילפורממיד (DMF), N, N-דיסופרופילאתילאמין (DIPEA), מורפולין ודיכלורומתאן (DCM) הם כולם חסרי צבע ומזיקים אם שואפים אותם או נספגים דרך העור. אתר הוא דליק מאוד. 1,2-Ethanedithiol (EDT) הוא חומר ריחני במיוחד. חומצה טריפלואורואצטית (TFA) היא קורוזיבי מאוד, והחומציות שלה היא פי 105 מזו של חומצה אצטית. כתוצאה מכך, כל הריאגנטים והכימיקלים אמורים להיות מטופלים באמצעות ציוד מגן במכסה אדים.
- הכינו את השרף לסינתזה פפטידית.
- חישוב מסת השרף הדרושה לסינתזה:מסת שרף (מ"ג) = קנה מידה (mmol / כושר העמסת שרף (mmol / g) × 1,000 (מ"ג / גרם)
הערה: לדוגמה, המסה של שרף MBHA אמיד (0.572 mmol / g) עבור 0.2 mmol = 0.2 mmol / 0.572 mmol / g × 1,000 mg/g = 350 mg. - הוסף 4-5 מ"ל DMF לכמות הנדרשת של שרף והעבר לעמודת פוליפרופילן 10 מ"ל (שלב 1.2) עם N2 עדין מבעבע במשך 30 דקות כדי לנפח את השרף כראוי, ולאחר מכן לנקז את DMF.
- הוסף 4-5 מ"ל של 50% מורפולין/DMF (v/v) לשרף, בעבע בעדינות N2 למשך 30 דקות 2x כדי להסיר את קבוצת N-terminal Fmoc ולאחר מכן לנקז את התערובת. לאחר מכן, שטפו את השרף ביסודיות 3x על ידי הוספת 4-5 מ"ל DMF לעמוד ומבעבעים עם N2 למשך דקה לפחות בכל פעם. המשך לשטוף את השרף עם DCM (3x) ו- DMF (3x) באותו אופן.
- חישוב מסת השרף הדרושה לסינתזה:מסת שרף (מ"ג) = קנה מידה (mmol / כושר העמסת שרף (mmol / g) × 1,000 (מ"ג / גרם)
- בצע צימוד חומצות אמינו המוגנות באמצעות Fmoc כמתואר להלן.
הערה: הצימוד של ארגינין בסינתזה ידנית בקנה מידה של 0.2 mmol מתואר כאן כדוגמה.- להמיס Fmoc-Arg (Pbf)-OH (5 שווה ערך, 648.8 מ"ג) ו-2-(7-Azobenzotriazole)-N, N, N', N'-tetramethyluronium hexafluorophosphate (HATU, 4.9 equiv., 372.6 mg) ב-5 מ"ל DMF בצינור צנטריפוגה.
- הוסף DIPEA (10 שווה ערך, 348.4 μL) כדי להפעיל את תגובת הצימוד ולאחר מכן להעביר את תערובת התגובה לעמוד פוליפרופילן 10 מ"ל עם שרף (מוכן בשלב 2.1.3). לאחר מכן, להתסיס בעדינות את התערובת עם N 2 מבעבע במשך1-2 שעות.
- חזור על תגובת הצימוד (שלב 2.2.1 ושלב 2.2.2) פעם אחת.
- לאחר השלמת הצימוד, סננו את תערובת התגובה ושטפו את השרף ברצף עם DMF, DCM ו-DMF 3x כל אחד למשך דקה אחת לפחות בכל פעם.
- בצע צימוד של כל חומצת אמינו בשלבים מסודרים: הוסף 4-5 מ"ל של 50% מורפולין/DMF (v/v) לשרף, בעבע בעדינות עם N 2 למשך 30 דקות 2x כדי להסיר את קבוצת N α-Fmoc, ולאחר מכן שטוף את השרף (כפי שמוצג בשלב 2.2.4), והמשך לזוג חומצת האמינו הבאה (כפי שמוצג בשלב 2.2.1 ושלב 2.2.2). המשך עם מספר מחזורים של שלב זה כדי להשיג סינתזה של הפפטיד הרצוי.
הערה: ניתן להשהות תהליך זה כאן. מעבים את השרף במתנול ומייבשים את השרף בזרימה רציפה של N2. מכסים את עמוד הפוליפרופילן ולאחר מכן מאחסנים את השרף בטמפרטורה של 4°C למשך מספר ימים (או בטמפרטורה של -20°C לאחסון ארוך יותר). לנפח את השרף עם 4-5 מ"ל של DMF במשך 0.5-1 שעות לפני תחילת סינתזה חדשה. אם ממשיכים ישירות לשלב הבא, אין צורך לעבות את השרף.
- תייג את הפפטידים עם פלואורסצאין איזותיוציאנט (FITC) כמתואר להלן.
- שלבו את הבטא-אלנין כספייסר לסימון FITC באותו תהליך המשמש לצימוד חומצות אמינו בשלב 2.2.
- בצע תיוג FITC של פפטידים על השרף על ידי הוספת תערובת של FITC (5 equiv.), DIPEA (10 equiv.), ו- DMF לעמוד הפוליפרופילן ותגובה בחושך במשך 8 שעות.
- לסינתזה של FITC-sR8-4, בצע מחזוריות של הפפטיד הליניארי כמתואר להלן.
- הוסף תערובת של TFA/triisopropylsilane (TIS)/DCM (3/5/92, v/v/v) לעמוד הפוליפרופילן למשך 2 דקות כדי להסיר באופן סלקטיבי את קבוצת ההגנה Cys (Trt) ולאחר מכן לנקז את התערובת. חזור על ההליך לעיל עד שהפתרון הצהבהב הופך לחסר צבע כדי להסיר לחלוטין את קבוצת ההגנה Trt.
- לאחר מכן, בצע שטיפות רציפות של השרף עם DMF ו- DCM לפחות 3x. לאחר מכן, יש להמיס 4,4'-bis(bromomethyl)biphenyl (2 equiv.) ב-DMF עם DIPEA (4 equiv.), להוסיף אותו לעמודה, ולהגיב במשך 4 שעות.
- לבקע את הפפטידים כמתואר: לאחר השלמת סינתזת הפפטידים, לשטוף את השרף עם 4-5 מ"ל של מתנול פעמיים במשך 5 דקות כל אחד ולייבש אותו עם זרימה רציפה של N2. טפלו בשרף עם קוקטייל מחשוף יעיל TFA/TIS/H 2 O (95/2.5/2.5, v/v/v), או TFA/TIS/EDT/H 2 O (92.5/2.5/2.5/2.5, v/v/v/v) לפפטידים המכילים ציסטאין, תוך שימוש בכ-1 מ"ל קוקטייל מחשוף לכל 100 מ"ג שרף. טפל בשרף הקשור לפפטיד במשך 2-3 שעות כדי לבקע את הפפטיד ולאחר מכן הסר את ה- TFA בזהירות עם זרם של N2.
- כדי לקבל את הפפטידים הגולמיים, הוסף 4-5 מ"ל של אתר דיאתיל להכנת הפפטיד השסוע כדי לזרז את הפפטידים הגולמיים והצנטריפוגה ב -10,000 × גרם למשך 4 דקות. יש להשליך בזהירות את הסופרנאטנט ולייבש את הפפטיד באוויר למשך 3 דקות במכסה אדים יעיל.
- ניתוח הפפטידים: המסת פפטיד גולמי בקנה מידה קטן (שנותק מכ-10 מ"ג של שרף הקשור לפפטידים) ב-800 מיקרוליטר של אצטוניטריל (ACN)/H2O (1/1, v/v) ולאחר מכן ניתוח באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים בפאזה הפוכה (RP-HPLC) וספקטרומטריית מסה כרומטוגרפית נוזלית (LC-MS) (ראה טבלת חומרים).
- לטהר את הפפטידים באמצעות RP-HPLC ו-LC-MS.
- יש להמיס 50 מ"ג של מוצר פפטיד גולמי ב-4 מ"ל ACN/H2O (1/1, v/v), ולהזריק את התמיסה למערכת RP-HPLC המצוידת בטור C18 (4.6 מ"מ x 150 מ"מ, גודל נקבוביות: 120 Å, גודל חלקיקים: 4 מיקרומטר; ראו טבלת חומרים). יש להקפיד את הפפטיד באמצעות פאזה ניידת המכילה 0.1% TFA/H2O (v/v) ו-ACN, עם שיפוע של 10% עד 90% ACN במשך 30 דקות. פפטידים קונבנציונליים התגלו ב-220 ננומטר ופפטידים מסומנים ב-FITC ב-494 ננומטר.
- אסוף את השברים המתאימים לשיא הפפטיד העיקרי כפי שזוהה על ידי טרשת נפוצה, ולאחר מכן בצע ליופיליזציה של שברי הפפטיד הרצויים. אחסנו את הפפטיד המטוהר בטמפרטורה של -20°C.
הערה: m/z שנמצא של FITC-R8 מטוהר הוא כדלקמן: [M + 3 H]3+: 576.63; [ז + 4 שעות] 4+: 432.72; [ז + 5 שעות] 5+: 346.39; [ז + 6 שעות] 6+: 288.85. m/z שנמצא של FITC-sR8-4 מטוהר הם כדלקמן: [M + 3 H]3+: 704.74; [ז + 4 שעות] 4+: 528.77; [ז + 5 שעות] 5+: 423.34; [ז + 6 שעות] 6+: 352.91. תנאים אנליטיים של MS: מכשיר: ESI (הטיית בדיקה: +4.5 kV; גלאי: 1.2 kV); זרימת גז נבולייזר: 1.5 ליטר לדקה; קו התמוססות מעוקל (CDL): −20 V; טמפרטורת CDL: 250 °C; טמפרטורת בלוק: 400 °C; ספיקה: 0.2 מ"ל/דקה; שלב נייד: 50% H2O / 50% ACN.
3. כימות הפפטידים המסומנים ב-FITC
- להמיס כמות קטנה של פפטיד מטוהר ב-DMSO כתמיסת מלאי (למשל, 40 μmol/mL).
- מדוד את הספיגה ב-494 ננומטר (A 494) של 2 מיקרוליטר של תמיסת המלאיב-498 מיקרומטר של 10 מילימטר פוספט חוצץ מלוחים (1x PBS, pH 7.4) עם צלחת מיקרוטיטר (ראה טבלת חומרים) באמצעות קורא מיקרו-צלחות רב-טכנולוגי (ראה טבלת חומרים). מקדם הדילול הוא 500 μL / 2 μL = 250, ואורך הנתיב של צלחת המיקרוטיטר הוא 0.5 מ"מ.
- חשב את ריכוז תמיסת המניות באמצעות הנוסחה הבאה:
ריכוז (mM) = A494 × גורם דילול / 0.05 (cm) / 77,000 (cm−1· M−1) × 1,000 (mM·M−1) - התאימו לדילול תקין כך שהערך הנמדד A494 יהיה בין 0.1 ל-1.0.
הערה: יש לחזור על המדידות מספר פעמים כדי להבטיח שהריכוז הנמדד מדויק. מקדם הכחדה של 77,000 ס"מ−1· M−1 נובע מקבוצת FITC.
4. יציבות פפטידים בסרום בקר עוברי (FBS)
- לדגור על הפפטיד בריכוז של 100 מיקרומטר עם 250 μL של 25% FBS/H2O (v/v) ב 37 ° C. לאחר הדגירה במשך 0 שעות, 1 שעות, 2 שעות ו -4 שעות, קח 10 μL aliquots ולאחר מכן הוסף 150 μl של 12% חומצה trichloroacetic מומס ב H2O/ACN (1/3, v/v) כדי לזרז את חלבוני הסרום.
- צנטריפוגה את הדגימות ב 10,000 × גרם במשך 5 דקות ולנתח את supernatant באמצעות HPLC (כמתואר בשלב 2.8) כדי לקבוע את מידת השפלת פפטידים.
- חשב את היחס בין שטח השיא ב- 1 שעות, 2 שעות ו- 4 שעות לזה שב- 0 שעות כדי לקבל את החלק של פפטיד לא מפורק בזמן המתאים. התוצאה היא ממוצע של שלוש דגימות מקבילות.
5. ספיגה תאית של הפפטידים
- הדמיה מיקרוסקופית פלואורסצנטית
- מניחים מכסה עגול לתוך צלחת של 12 בארות. לאחר מכן, חסן 1 x 105 תאים באופן אחיד על כיסויים ותרבית לילה עם 2 מ"ל של מדיום. הסר את המדיום ולשטוף את התאים 3x עם 1 מ"ל של PBS.
הערה: במחקר זה, תאי HeLa ותאי 4T1 גודלו בתרבית במדיום הנשר המעובד של דולבקו (DMEM, ראה טבלת חומרים) בתוספת 10% FBS באינקובטור לח של 37 מעלות צלזיוס המכיל 5% CO2. - לדגור על התאים עם 1 מ"ל של 3 מיקרומטר פפטידים מסומנים FITC ב- DMEM ללא FBS למשך שעה אחת ב- 37 ° C. לאחר מכן, להסיר את המדיום המכיל פפטיד ולשטוף את התאים 3x עם 1 מ"ל של PBS.
- מכתימים את התאים עם 1 מ"ל של Hoechst 33258 למשך 15 דקות. התבוננו בהפנמה של כל פפטיד באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי (ראו טבלת חומרים) באותה עוצמת פלואורסצנטיות וזמן חשיפה.
הערה: ההגדרות הבאות שימשו עבור מיקרוסקופ פלואורסצנטי. מטרה: Plan-Apochromat: 63 x/1.40 שמן DIC M27; ערוץ 1 עבור FITC: מסנן עירור: 450-490 ננומטר, מסנן פליטה: 500-550 ננומטר, זמן חשיפה: 230 ms; ערוץ 2 עבור Hoechst 33258: מסנן עירור: 335-383 ננומטר, מסנן פליטה: 420-470 ננומטר, זמן חשיפה: 27 מטר.
- מניחים מכסה עגול לתוך צלחת של 12 בארות. לאחר מכן, חסן 1 x 105 תאים באופן אחיד על כיסויים ותרבית לילה עם 2 מ"ל של מדיום. הסר את המדיום ולשטוף את התאים 3x עם 1 מ"ל של PBS.
- ניתוח ציטומטריית זרימה
- חסן 5 x 105 תאי HeLa באופן אחיד בצלחות 12 בארות ובתרבית ב- DMEM למשך 24 שעות ב 37 ° C. לאחר מכן, להסיר את המדיום ולשטוף את התאים 3x עם 1 מ"ל של PBS.
- לדגור על התאים עם 1 מ"ל של 3 מיקרומטר פפטידים מסומנים FITC ב- DMEM ללא FBS למשך שעה אחת ב- 37 ° C. הסר את התווך המכיל פפטידים, נתק את התאים עם טריפסין 0.25% (w/v) ו- 0.53 mM EDTA ב- PBS למשך 5 דקות, ולאחר מכן אסוף את התאים באמצעות צנטריפוגה ב- 306 × גרם למשך 4 דקות. לשטוף את גלולת התא עם PBS.
- לדגור על התאים עם 1 מ"ל של 0.05% (w/v) טריפאן כחול PBS במשך 3 דקות כדי להרוות את הפלואורסצנטיות הקשורה לפני השטח, ולבצע ניתוח כמותי של פלואורסצנטיות תוך תאית באמצעות ציטומטר זרימה (ראה טבלת חומרים).
הערה: הגדרות ציטומטריית זרימה: עירור: 488 ננומטר, פליטה: 530 ננומטר. כחול טריפאן יכול גם להרוות את הפלואורסצנטיות של תאים מתים ולעזור להבחין בין תאים חיים למתים במהלך ניתוח ספיגת פפטידים. - טפל ובדוק תאי 4T1 באמצעות ציטומטריית זרימה בהתאם לאותו פרוטוקול המתואר עבור תאי HeLa. אסוף 5 x 105 תאים לכל דגימה והגדר שלוש דגימות מקבילות לכל קבוצה.
6. חקר חדירת הפפטידים מתא לתא באמצעות מודלים של טרנסוול
- לחסן 1 x 10 5 תאי HeLa ב 2 מ"ל של DMEM בתא 12 בארות עם תוספת צלחת תרבית רקמה (ראה טבלת חומרים) ולדגור במשך 24 שעות באינקובטור לחות 37 מעלות צלזיוס המכיל5% CO2. לאחר מכן, להסיר את המדיום לדגור את התאים בתאים עם 1 מ"ל של 10 מיקרומטר FITC-R8 או FITC-sR8-4 (מטוהר באמצעות HPLC) DMEM ללא FBS במשך 1 שעות.
- הסר את המדיום המכיל את הפפטידים ושטוף את התאים 3x עם 1 מ"ל של PBS. הוסף 1 מ"ל של DMEM טרי ללא FBS לתאים ולאחר מכן לדגור במשותף על תאי HeLa בתא עם צלחת תרבית הרקמה להוסיף עם תאי HeLa על הכיסויים העגולים בתחתית במשך 2 שעות.
- תקן את תאי HeLa על הכיסויים העגולים עם 2.5% גלוטראלדהיד למשך 15 דקות ולאחר מכן הכתים את התאים עם DAPI למשך 15 דקות. לאחר מכן, התבוננו בתאי HeLa על הכיסויים תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי. טפל ובדוק תאי 4T1 באמצעות אותו פרוטוקול המשמש לתאי HeLa.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
בפרוטוקול זה הוצג הליך סינתטי להגבלת הפוליארגינין R8 הליניארי לצורתו המחזורית. ה-SPPS בוצע באופן ידני באמצעות מכשיר פשוט (איור 1). התהליך הסינתטי המפורט של SPPS מוצג באיור 2. בקצרה, השרף התנפח מספיק, ואחריו הגנה על קבוצת ההגנה N α-Fmoc. לאחר מכן, חומצת האמינו המוגנת N α-Fmoc עוגנה על השרף עד להשלמת הרכבת הפפטיד (שלבים 1-4 באיור 2). לאחר מכן, הפפטידים הגסים נחתכו מהשרף על-ידי קוקטייל המחשוף (שלב 5 באיור 2). FITC שימש לסימון הפפטידים כדי לסנתז CPPs מחזוריים המסומנים באופן פלואורסצנטי ולעקוב אחר חדירותם על פני מחסומים ביולוגיים. לאחר מכן, קבוצות ההגנה על טריטיל של ציסטאין היו מוגנות באופן סלקטיבי על השרף, ואחריו מחזוריות פפטיד עם 4,4'-bis(bromomethyl)biphenyl cross-link (איור 3A). ספקטרום HPLC ו-MS של FITC-R8 ו-FITC-sR8-4 מוצג באיור 3B. זמן השימור של FITC-sR8-4 היה ארוך משמעותית מזה של האנלוגי הליניארי, מה שמצביע על הידרופוביות כוללת משופרת של הפפטיד לאחר מחזוריות עם הקישור הצולב. יתר על כן, כפי שניתן לראות באיור 3C, R8 מחזורי נשאר 77.3% שלם לאחר הדגירה עם 25% FBS במשך 4 שעות, בעוד מקבילו הליניארי היה מפורק ברובו, דבר המצביע על יציבות פרוטאוליטית משופרת של פפטיד R8 מחזורי. במחקרים מבוססי תאים עוקבים, תאים שטופלו ב-R8 מחזורי עם קישור צולב ארומטי הציגו פלואורסצנטיות תוך-תאית גבוהה יותר מאלה שטופלו במקבילו הליניארי, כפי שהודגם על-ידי הדמיית מיקרוסקופ פלואורסצנטי של תאים חיים (איור 4A). תוצאות דומות התקבלו בניתוח ציטומטריית זרימה (איור 4B). כדי להמשיך ולחקור אם R8 מחזורי מעניק חדירה משופרת מתא לתא, נעשה שימוש במודלים של טרנסוול כדי לדמות את חדירות המחסום של הפפטידים משכבת תא אחת לאחרת. R8 המחזורי הראה בבירור חדירה גבוהה יותר של מחסום טרנס מאשר הפפטיד הליניארי R8, כפי שמצוין על-ידי עלייה משמעותית בפלואורסצנטיות התוך-תאית (איור 4C). לסיכום, הפפטיד R8 המחזורי הפגין חדירות עדיפה על פני מחסומים ביולוגיים על פני מקבילו הלינארי.
איור 1: הגדרת ציוד עבור מנגנון סינתזת הפפטיד הידני. עמוד פוליפרופילן 10 מ"ל מוגדר על סעפת הוואקום באמצעות שסתום עצירה תלת-כיווני. N2 משמש לתסיסה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: הליך כללי של סינתזת פפטיד בשלב מוצק Fmoc (SPPS). חומצת אמינו מוגנת N α-Fmoc מעוגנת לשרף 4-(2',4'-Dimethoxypheyl-Fmoc-aminomethyl)-phenoxyacetamido-norleucyl-MBHA (שרף MBHA rink amide) (שלב 1), ואחריו הסרת הגנה על קבוצות ההגנה Nα-Fmoc של חומצות האמינו (שלב 2) וצימוד חומצות אמינו לאחר מכן (שלב 3). שלב 2 ושלב 3 חוזרים על עצמם מספר פעמים כדי לסנתז את הפפטיד הרצוי (שלב 4). לאחר השלמת הסינתזה, מוסיפים קוקטייל מחשוף כדי להסיר את השרשרת הצדדית המגנה על קבוצות ולבקע את הפפטיד הרצוי מהשרף (שלב 5). קיצורים: DMF = N, N-dimethylformamide; DCM = dichloromethane; HATU = 2-(7-Azobenzotriazole)-N, N, N', N'-tetramethyluronium hexafluorophosphate; DIPEA = N, N-diisopropylethylamine; TFA = חומצה trifluoroacetic. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: סינתזה של פפטיד R8 ליניארי עם תווית FITC (FITC-R8) ופפטיד R8 מהודק (FITC-sR8-4) באמצעות סינתזת פפטיד בשלב מוצק (SPPS). (A) דיאגרמה סכמטית של הסינתזה של FITC-R8 ו-FITC-sR8-4. (B) ספקטרום HPLC ו-MS (כניסה) של FITC-R8 ו-FITC-sR8-4. (C) יציבות של FITC-R8 ו-FITC-sR8-4 בנוכחות 25% FBS. פפטיד שלם (%) מתייחס לחלק של פפטיד לא מפורק. נתון זה שונה משי ואחרים 15. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: חדירה של פפטיד R8 ליניארי (FITC-R8) ושל פפטיד R8 מהודק (FITC-sR8-4). (A) תמונות מיקרוסקופ פלואורסצנטי של תאים חיים של תאי HeLa ותאי 4T1 לאחר דגירה של שעה אחת עם 3 מיקרומטר FITC-R8 ו-FITC-sR8-4. FITC (ירוק), Hoechst (כחול). סרגל קנה מידה = 20 מיקרומטר. (B) פלואורסצנטיות ממוצעת יחסית (ביחס לפפטיד R8 ליניארי), ממוצע ± s.d., ו- n = 3; (C) חדירה מתא לתא של FITC-R8 ו-FITC-sR8-4 במודל טרנסוול באמצעות תאי HeLa. תמונות מיקרוסקופ פלואורסצנטי של תאים חיים (סרגל קנה מידה = 20 מיקרומטר), ופלואורסצנטיות ממוצעת יחסית (ביחס לפפטיד R8 ליניארי), ממוצעות ± s.d. ו- n = 3. ** P < 0.01, *** P < 0.001. נתון זה שונה משי ואחרים 15. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הייצוב הכימי של הפפטידים על ידי שילוב אילוצי קונפורמציה הוכח כאסטרטגיה יעילה לשיפור היציבות והחדירות התאית של הפפטיד26. בפרוטוקול זה, מתואר הליך שלב אחר שלב לסינתזה של CPPs מחזוריים עם קישורים צולבים ארומטיים והערכת החדירות שלהם על פני מחסומים ביולוגיים. בהשוואה לקישורים הצולבים הידרופיליים לקטם או טריאזול22,27, שילוב של קישורים צולבים ארומטיים (המשמשים במחקר זה) משפר את ההידרופוביות הכוללת של CPPs, ובכך מגדיל באופן משמעותי את חדירות התא שלהם. מצד שני, מחזוריות פפטידית יכולה להיות מושגת בקלות באמצעות תגובות החלפה עם ציסטאין ללא צורך בזרזים מתכתיים כלשהם. בפרוטוקול זה, המחזוריות של CPPs בוצעה על שרף; עם זאת, יעילות המחזוריות תלויה גם ברצפים ובאורכים הספציפיים של הפפטידים עקב השפעות סטריות, אשר עלולות לגרום להיווצרות תוצר לוואי דימרי28. במקרה כזה, שימוש בשרף עם כושר העמסה נמוך יותר יהיה מועיל. בנוסף, מומלץ גם למחזורי פפטידים ספציפיים אלה תחת ריכוזים מדוללים בשלבהתמיסה 29.
יש כמה נקודות קריטיות בפרוטוקול הזה. ראשית, קוקטייל המחשוף TFA/TIS/EDT/H 2 O (92.5/2.5/2.5/2.5, v/v/v/v) משמש למחשוף של פפטידים המכילים ציסטאין למניעת חמצון של קבוצת סולפידריל. שנית, מומלץ לבצע מחקר ראשוני בקנה מידה קטן כדי לקבל את מצב המחשוף המתאים. הזמן האופטימלי הדרוש כדי לנתק את הפפטידים מהשרף הוא 2-3 שעות, כאשר זמן מחשוף ארוך יותר (יותר מ -5 שעות) נוטה לייצר יותר תוצרי לוואי לא מזוהים. סינתזת הפפטיד יכולה להיות מנוטרת על ידי LC-MS כדי לייעל את זמן המחשוף. שלישית, תיוג FITC צריך להיעשות בחושך כדי למנוע מרווה פלואורסצנטית.
יתר על כן, יש להשתמש בכחול טריפאן כדי להרוות את הפלואורסצנטיות הקשורה לפני השטח מכיוון שניתוח ציטומטריית זרימה אינו יכול להבחין בפלואורסצנטיות תוך תאית או קשורה לפני השטח. זה יעזור לכמת באופן ספציפי את הפפטיד המופנם על ידי התאים הסרטניים27. בנוסף, מכיוון שפפטידים קטיוניים עלולים לגרום גם לליזה30 לא ספציפית של הממברנה, ניתן לבצע גם פעילות המוליטית וכדאיות התא כדי להעריך את הרעילות של CPPs מחזוריים.
CPPs מחזוריים מהווים את אחד הכלים היעילים להעברת תרופות לכיבוש מחסומים ביולוגיים. עם זאת, האינטראקציה בין הממברנות וההפרעה של CPPs קטיוניים מובילים בדרך כלל לציטוטוקסיות פוטנציאלית לא ספציפית31. מאמצים נוספים יוקדשו להבנת מנגנון החדירה המפורט, אשר אמור לסייע בגילוי הדור הבא של CPPs מחזוריים לחדור מחסומים ביולוגיים עם ציטוטוקסיות מינימלית. מכשירי CPP פעילים ויציבים אלה טומנים בחובם הבטחה גדולה לשיפור הטיפול במחלות מסכנות חיים חשובות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין מה לחשוף.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכת על ידי הקרן למדעי הטבע של סין (21708031), הקרן למדע פוסט-דוקטורט בסין (BX20180264, 2018M643519), וקרנות המחקר הבסיסיות לאוניברסיטאות המרכזיות (2682021ZTPY075).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,2-ethanedithiol | Aladdin | K1722093 | stench |
| 2-(7-Azobenzotriazole)-N,N,N',N'-tetramethyluronium hexafluorophosphate (HATU) | HEOWNS | A-0443697 | |
| 4,4'-bis(bromomethyl)biphenyl | TCI | B1921 | |
| 4T1 cells | ATCC | 4T1 cells were cultured in DMEM medium supplemented with 10% FBS (Hyclone) in a 37 °C humidified incubator containing 5% CO2. | |
| Acetonitrile | Adamas | 1484971 | toxicity |
| Dichloromethane | Energy | W330229 | skin harmful |
| Diethyl ether | Aldrich | 673811 | flammable |
| Dimethyl sulfoxide | Beyotime | ST038 | skin harmful |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | ||
| Electrospray Ionization Mass Spectrometer | Waters | G2-S Tof | |
| Ethylene Diamine Tetraacetic Acid (EDTA) | BioFroxx | 1340 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | HyClone | ||
| Flow cytometer | Beckman Coulter | CytoFLEX | |
| Fluorescein isothiocyanate isomer (FITC) | Energy | E0801812500 | |
| Fluorescent microscope | Carl Zeiss | Axio Observer 7 | |
| Fmoc-Arg(Pbf)-OH | HEOWNS | F-81070 | |
| Fmoc-Cys(Trt)-OH | GL Biochem | GLS201115-35202 | |
| Fmoc-βAla-OH | Adamas | 51341C | |
| HeLa cells | ATCC | HeLa cells were cultured in DMEM supplemented with 10% FBS (Hyclone) in a 37 °C humidified incubator containing 5% CO2. | |
| High-Performance Liquid Chromatography | Agilent | Agilent 1260 | |
| High-Performance Liquid Chromatography column | Agilent | Poroshell EC-C18 120, 4.6 × 150 mm (pore size 120 Å, particle size 4 μm) | |
| Lyophilizer | SP Scientific | Vir Tis | |
| Methanol | Aldrich | 9758 | toxicity |
| Microtiter plate | Thermo μdrop plate | N12391 | |
| Morpholine | HEOWNS | M99040 | irritant |
| Multi-technology microplate reader | Thermo | VARIOSKAN LUX | |
| N,N-Diisopropylethylamine | HEOWNS | E-81416 | irritant |
| N,N-Dimethyl formamide | Energy | B020051 | harmful to skin |
| Poly-Prep column | Bio-Rad | 7321010 | polypropylene chromatography columns |
| Rink Amide MBHA resin (0.572 mmol/g) | GL Biochem | GLS180301-49101 | |
| Three-way stopcocks | Bio-Rad | 7328107 | |
| Tissue culture plate insert | LABSELECT | 14211 | |
| Trifluoroacetic acid | HEOWNS | T63278 | corrosive |
| Triisopropylsilane | HEOWNS | T-0284475 | |
| Trypsin | BioFroxx | 1004 | |
| Vacuum manifold | Promega | A7231 |
References
- Zhang, L., et al. Brain-targeted dual site-selective functionalized poly(β-amino esters) delivery platform for nerve regeneration. Nano Letters. 21 (7), 3007-3015 (2021).
- Park, T. E., et al. Enhanced BBB permeability of osmotically active poly(mannitol-co-PEI) modified with rabies virus glycoprotein via selective stimulation of caveolar endocytosis for RNAi therapeutics in Alzheimer's disease. Biomaterials. 38, 61-71 (2015).
- Bian, J., et al. Effect of cell-based intercellular delivery of transcription factor GATA4 on ischemic cardiomyopathy. Circulation Research. 100 (11), 1626-1633 (2007).
- He, H., et al. The use of low molecular weight protamine chemical chimera to enhance monomeric insulin intestinal absorption. Biomaterials. 34 (31), 7733-7743 (2013).
- Kim, D., et al. A specific STAT3-binding peptide exerts antiproliferative effects and antitumor activity by inhibiting STAT3 phosphorylation and signaling. Cancer Research. 74 (8), 2144-2151 (2014).
- Yang, Y., et al. PEGylated liposomes with NGR ligand and heat-activable cell-penetrating peptide-doxorubicin conjugate for tumor-specific therapy. Biomaterials. 35 (14), 4368-4381 (2014).
- Wei, Y., et al. Intracellular paclitaxel delivery facilitated by a dual-functional CPP with a hydrophobic hairpin tail. ACS Applied Materials and Interfaces. 13 (4), 4853-4860 (2021).
- Vasan, N., Baselga, J., Hyman, D. M. A view on drug resistance in cancer. Nature. 575 (7782), 299-309 (2019).
- Cong, Y., et al. Microenvironment-induced in situ self-assembly of polymer-peptide conjugates that attack solid tumors deeply. Angewandte Chemie International Edition. 131 (14), 4680-4685 (2019).
- Blanco, E., Shen, H., Ferrari, M. Principles of nanoparticle design for overcoming biological barriers to drug delivery. Nature Biotechnology. 33 (9), 941-951 (2015).
- Tian, Y., Zhou, S. Advances in cell-penetrating peptides and their functionalization of polymeric nanoplatforms for drug delivery. Wiley Interdisciplinary Reviews. Nanomedicine and Nanobiotechnology. 13 (2), 1-12 (2021).
- Milletti, F. Cell-penetrating peptides: Classes, origin, and current landscape. Drug Discovery Today. 17 (15-16), 850-860 (2012).
- Turner, J. J., et al. Cell-penetrating peptide conjugates of peptide nucleic acids (PNA) as inhibitors of HIV-1 Tat-dependent trans-activation in cells. Nucleic Acids Research. 33 (21), 6837-6849 (2005).
- Tunnemann, G., et al. Live-cell analysis of cell penetration ability and toxicity of oligo-arginines. Journal of Peptide Science. 14 (4), 469-476 (2008).
- Shi, M., et al. Stapling of short cell-penetrating peptides for enhanced tumor cell-and-tissue dual-penetration. Chemical Communications. 58 (14), 2299-2302 (2022).
- Komin, A., et al. A peptide for transcellular cargo delivery: Structure-function relationship and mechanism of action. Journal of Controlled Release. 324, 633-643 (2020).
- Dietrich, L., et al. Cell permeable stapled peptide inhibitor of Wnt signaling that targets β-catenin protein-protein interactions. Cell Chemical Biology. 24 (8), 958-968 (2017).
- Tian, Y., et al. Stapling of unprotected helical peptides via photo-induced intramolecular thiol-yne hydrothiolation. Chemical Science. 7 (5), 3325-3330 (2016).
- De Araujo, A. D., et al. Comparative α-helicity of cyclic pentapeptides in water. Angewandte Chemie International Edition. 53 (27), 6965-6969 (2014).
- Chu, Q., et al. Towards understanding cell penetration by stapled peptides. Medicinal Chemistry Communications. 6 (1), 111-119 (2015).
- Bock, J. E., Gavenonis, J., Kritzer, J. A. Getting in shape: Controlling peptide bioactivity and bioavailability using conformational constraints. ACS Chemical Biology. 8 (3), 488-499 (2013).
- Tian, Y., et al. Effect of stapling architecture on physiochemical properties and cell permeability of stapled α-helical peptides: A comparative study. ChemBioChem. 18 (21), 2087-2093 (2017).
- White, C. J., Yudin, A. K. Contemporary strategies for peptide macrocyclization. Nature Chemistry. 3 (7), 509-524 (2011).
- Jain, R. K. Normalization of tumor vasculature: An emerging concept in antiangiogenic therapy. Science. 307 (5706), 58-62 (2005).
- Patgiri, A., Menzenski, M. Z., Mahon, A. B., Arora, P. S. Solid-phase synthesis of short α-helices stabilized by the hydrogen bond surrogate approach. Nature Protocols. 5 (11), 1857-1865 (2010).
- Baek, S., et al. Structure of the stapled p53 peptide bound to Mdm2. Journal of the American Chemical Society. 134 (1), 103-106 (2012).
- Traboulsi, H., et al. Macrocyclic cell penetrating peptides: A study of structure-penetration properties. Bioconjugate Chemistry. 26 (3), 405-411 (2015).
- Tian, Y., et al. A proline-derived transannular N-cap for nucleation of short α-helical peptides. Chemical Communications. 52 (59), 9275-9278 (2016).
- Muppidi, A., et al. Rational design of proteolytically stable, cell-permeable peptide-based selective Mcl-1 inhibitors. Journal of the American Chemical Society. 134 (36), 14734-14737 (2012).
- Wiradharma, N., et al. Synthetic cationic amphiphilic α-helical peptides as antimicrobial agents. Biomaterials. 32 (8), 2204-2212 (2011).
- Jones, A. T., Sayers, E. J. Cell entry of cell penetrating peptides: Tales of tails wagging dogs. Journal of Controlled Release. 161 (2), 582-591 (2012).
