Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

जैविक बाधाओं के बढ़े हुए प्रवेश के लिए चक्रीय सेल-पेनिट्रेटिंग पेप्टाइड्स का निर्माण

Published: September 19, 2022 doi: 10.3791/64293
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Sichuan Engineering Research Center for Biomimetic Synthesis of Natural Drugs, School of Life Science and Engineering, Southwest Jiaotong University

Summary

यह प्रोटोकॉल सुगंधित क्रॉस-लिंक के साथ चक्रीय सेल-पेनिट्रेटिंग पेप्टाइड्स के संश्लेषण और जैविक बाधाओं में उनकी पारगम्यता के मूल्यांकन का वर्णन करता है।

Abstract

कैंसर वैश्विक स्वास्थ्य में एक बड़ी चुनौती रहा है। हालांकि, जटिल ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट आम तौर पर गहरे ट्यूमर कोशिकाओं तक चिकित्सीय पहुंच को सीमित करता है, जिससे ट्यूमर पुनरावृत्ति होती है। जैविक बाधाओं के सीमित प्रवेश पर विजय प्राप्त करने के लिए, सेल-पेनिट्रेटिंग पेप्टाइड्स (सीपीपी) को उत्कृष्ट झिल्ली स्थानांतरण क्षमता के साथ खोजा गया है और कोशिकाओं में विभिन्न कार्गो पहुंचाने के लिए उपयोगी आणविक ट्रांसपोर्टरों के रूप में उभरे हैं। हालांकि, पारंपरिक रैखिक सीपीपी आम तौर पर प्रोटियोलिटिक स्थिरता से समझौता करते हैं, जो जैविक बाधाओं में उनकी पारगम्यता को सीमित करता है। इस प्रकार, नवीन आणविक ट्रांसपोर्टरों का विकास जो जैविक बाधाओं को भेद सकता है और बढ़ी हुई प्रोटियोलिटिक स्थिरता प्रदर्शित कर सकता है, बायोमेडिकल अनुप्रयोगों में दवा वितरण दक्षता को बढ़ावा देने के लिए अत्यधिक वांछित है। हमने पहले सुगंधित क्रॉसलिंक के साथ लघु चक्रीय सीपीपी के एक पैनल को संश्लेषित किया है, जिसने अपने रैखिक समकक्षों की तुलना में कैंसर कोशिकाओं और ऊतकों में बेहतर पारगम्यता प्रदर्शित की है। यहां, फ्लोरोसेंटली लेबल चक्रीय पॉलीआर्जिनिन आर 8 पेप्टाइड और इसके रैखिक समकक्ष के संश्लेषण के लिए एक संक्षिप्त प्रोटोकॉल का वर्णन किया गया है, साथ ही साथ उनकी सेल पारगम्यता की जांच के लिए महत्वपूर्ण कदम भी हैं।

Introduction

पिछले कुछ दशकों में दवा वितरण के लिए सेल-पेनिट्रेटिंग पेप्टाइड्स (सीपीपी) के विकास में तेजी से प्रगति देखी गई है। सीपीपी का व्यापक रूप से जीवन-धमकाने वाली बीमारियों की एक श्रृंखला के उपचार के लिए आणविक ट्रांसपोर्टरों के रूप में उपयोग किया गया है, जिसमें न्यूरोलॉजिकल विकार 1,2, हृदय रोग 3, मधुमेह4, डर्मेटोसिस5 और कैंसर 6,7 शामिल हैं। व्यापक अनुसंधान प्रयासों के बावजूद रुग्णता और मृत्यु दर की उच्च दर के साथ कैंसर एक वैश्विक स्वास्थ्य बोझ बना हुआहै। कैंसर के इलाज के लिए एक गंभीर बाधा शारीरिक बाधाओं जैसे कॉम्पैक्ट बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम), असामान्य ट्यूमर वाहिका, कई झिल्ली बाधाओं और उच्च अंतरालीय द्रव दबाव (आईएफपी) 9 के कारण गहरी ट्यूमर कोशिकाओं के लिए चिकित्सीय की सीमित पहुंच है। इस प्रकार, जैविक बाधाओं के पार कार्गो वितरित करने की बेहतर क्षमता के साथ नए सीपीपी विकसित करनाकैंसर के उपचार के लिए एक आवश्यक रणनीति माना जाता है।

सीपीपी को उनके भौतिक रासायनिक गुणों के संदर्भ में धनिक, एम्फीपैथिक और हाइड्रोफोबिक सीपीपी में वर्गीकृत किया जा सकताहै। इनमें से, सकारात्मक रूप से चार्ज किए गए एचआईवी-टीएटी पेप्टाइड और सिंथेटिक पॉलीआर्जिनिन बायोमेडिकल अनुसंधान में काफी महत्व रखते हैं और इंट्रासेल्युलर दवा वितरणकी सुविधा के लिए बड़े पैमाने पर अध्ययन किया गया है। टुनेमैन एट अल ने बताया कि सिंथेटिक पॉलीआर्जिनिन पेप्टाइड्स के कुशल सेल प्रवेश के लिए आठ आर्जिनिन की न्यूनतम लंबाई आवश्यक है, जो आर 3 से आर 12 पेप्टाइड्स14 का उपयोग करके किए गए सेल पारगम्यता अध्ययन पर आधारित है। हालांकि, इन सीपीपी में आमतौर पर विवो में उनके तेजी से हाइड्रोलिसिस के कारण कम प्लाज्मा आधा जीवन होता है। इसके अलावा, सीपीपी की रासायनिक संरचना के अनुकूलन के बारे में बहुत कम जाना जाता है ताकि उनकी ट्रांस-बैरियर क्षमता बढ़ सके क्योंकि कई कोशिका झिल्ली15 में प्रवेश करना चुनौतीपूर्ण है। इस प्रकार, जैविक बाधाओं को भेदने में सक्षम नए आणविक ट्रांसपोर्टरों का विकास दवा वितरण दक्षता को बढ़ाने के लिए दृढ़ता से वांछित है। 2020 में, कोमिन एट अल.16 ने सीएल पेप्टाइड नामक एक सीपीपी की खोज की, जिसमें उपकला मोनोलेयर को पार करने के लिए एक हेलिक्स मोटिफ (आरएलएलआरएलआर) और एक पॉलीआर्जिनिन पूंछ (आर 7) शामिल है। हेलिकल पैटर्न को बदलकर सीएल पेप्टाइड वेरिएंट का एक सेट भी संश्लेषित किया गया था। यह अन्वेषण जैविक बाधाओं के पार कार्गो के वितरण के लिए नए सीपीपी के विकास के लिए एक महत्वपूर्ण मार्गदर्शिका हो सकती है। इसके अलावा, डाइटरिच एट अल ने स्टैक्स पेप्टाइड की सेल पारगम्यता को अनुकूलित किया, पेप्टाइड्स17 की समग्र हाइड्रोफोबिसिटी को बढ़ाकर डब्ल्यूएनटी / β-कैटेनिन सिग्नलिंग मार्ग को रोक दिया।

साइक्लाइजेशन द्वारा असंरचित रैखिक पेप्टाइड्स का विरूपण प्रतिबंध उनकी प्रोटियोलिटिक स्थिरता और पारगम्यता 18,19,20 को बढ़ाने का एक प्रभावी तरीका है। संरचनात्मक सुदृढीकरण चक्रीय पेप्टाइड्स के प्रोटीज प्रतिरोध को बढ़ाता है, जिससे वे अपने रैखिक समकक्षों की तुलना में विवो में अधिक स्थिर हो जाते हैं। इसके अलावा, पेप्टाइड्स का साइक्लाइजेशन इंट्रामोलेक्यूलर हाइड्रोजन बॉन्डिंग को बढ़ावा देकर ध्रुवीय पेप्टाइड बैकबोन को संभावित रूप से मुखौटा कर सकता है, इस प्रकार पेप्टाइड्स21 की झिल्ली पारगम्यता को बढ़ा सकता है। पिछले दो दशकों में, केमोसेलेक्टिव साइक्लाइजेशन विधियां विभिन्न आर्किटेक्चर के साथ चक्रीय पेप्टाइड्स के निर्माण के लिए प्रभावी रणनीतिबन गई हैं, जैसे कि ऑल-हाइड्रोकार्बन, लैक्टम, ट्रायज़ोल, एम-जाइलीन, परफ्लोरोएरिल, और अन्य क्रॉस-लिंक22,23। परिष्कृत ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट द्वारा लगाए गए जैविक अवरोध ठोस ट्यूमर24 में दवाओं के प्रवेश को कम कर सकते हैं। हमने पहले पाया है कि चक्रीय सीपीपी ने अपने रैखिक समकक्षों20 पर एंजाइमेटिक पाचन के लिए बेहतर प्रतिरोध प्रदर्शित किया। इसके अलावा, पेप्टाइड्स की समग्र हाइड्रोफोबिसिटी उनकी बढ़ी हुई सेल पारगम्यता22 के लिए महत्वपूर्ण है। ऊपर चर्चा किए गए अध्ययनों के आधार पर, जैविक बाधाओं में सीपीपी की पारगम्यता को बढ़ाने के लिए सकारात्मक रूप से चार्ज किए गए पैटर्न, ऊंचा समग्र हाइड्रोफोबिसिटी और बढ़ी हुई प्रोटियोलिसिस स्थिरता के संयोजन की परिकल्पना की जा सकती है। हाल के एक अध्ययन में, हमने पदों I और i + 7 पर सुगंधित क्रॉसलिंक के साथ दो चक्रीय CPPs की पहचान की जो उनके रैखिक समकक्षों15 की तुलना में ट्यूमर कोशिकाओं और ऊतकों में बेहतर पारगम्यता प्रदर्शित करते हैं। यहां, फ्लोरोसेंटली लेबल चक्रीय सीपीपी के संश्लेषण के लिए एक संक्षिप्त सिंथेटिक प्रोटोकॉल और उनकी पारगम्यता की जांच करने के लिए महत्वपूर्ण कदम प्रस्तुत किए गए हैं।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. उपकरण तैयार करना

नोट: उपयुक्त व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण के साथ एक ऑपरेटिंग फ्यूम हुड में सभी प्रक्रियाओं को पूरा करें।

  1. फ्यूम हुड में मैनुअल पेप्टाइड संश्लेषण तंत्र को इकट्ठा करें (चित्रा 1)। वैक्यूम मैनिफोल्ड पर तीन-तरफा स्टॉपकॉक ( सामग्री की तालिका देखें) रखें ( सामग्री की तालिका देखें) और नाइट्रोजन (एन2) से कनेक्ट करें। अप्रयुक्त इनलेट्स को कैप करना सुनिश्चित करें।
  2. तीन-तरफा स्टॉपकॉक पर 10 एमएल पॉलीप्रोपाइलीन कॉलम ( सामग्री की तालिका देखें) संलग्न करें। रबर पिपेट बल्ब या अपशिष्ट जाल के माध्यम से वैक्यूम का उपयोग करके पॉलीप्रोपाइलीन कॉलम से प्रतिक्रिया मिश्रण या सॉल्वैंट्स को निकालें।

2. एफआईटीसी-लेबल रैखिक आर 8 पेप्टाइड (एफआईटीसी-आर 8) और एफआईटीसी-लेबल स्टेपल आर 8 पेप्टाइड (एफआईटीसी-एसआर 8-4) का संश्लेषण

नोट: पेप्टाइड्स को एक मानक एफएमओसी-आधारित ठोस-चरण पेप्टाइड संश्लेषण (एसपीपीएस) प्रोटोकॉल25 के अनुसार संश्लेषित किया गया था। पूरे अध्ययन में 4-(2', 4'-डाइमेथोक्सीफील-एफएमओसी-एमिनोमिथाइल)-फेनोक्सीसेटामिडो-नॉरल्यूसिल-एमबीए राल (रिंक एमाइड एमबीए राल, सामग्री की तालिका देखें) का उपयोग किया गया था।

चेतावनी: एन, एन-डाइमिथाइलफॉर्मामाइड (डीएमएफ), एन, एन-डाइसोप्रोपिलेथिलमाइन (डीआईपीईए), मोर्फोलिन, और डाइक्लोरोमेथेन (डीसीएम) सभी रंगहीन हैं और त्वचा के माध्यम से साँस लेने या अवशोषित होने पर हानिकारक हैं। ईथर बेहद ज्वलनशील है। 1,2-एथेनडिथिओल (ईडीटी) एक विशेष रूप से गंधयुक्त पदार्थ है। ट्राइफ्लोरोएसेटिक एसिड (टीएफए) अत्यधिक संक्षारक है, और इसकी अम्लता एसिटिक एसिड की तुलना में 105 गुना है। नतीजतन, सभी अभिकर्मकों और रसायनों को फ्यूम हुड में सुरक्षात्मक उपकरणों का उपयोग करके निपटाया जाना चाहिए।

  1. पेप्टाइड संश्लेषण के लिए राल तैयार करें।
    1. संश्लेषण के लिए आवश्यक राल के द्रव्यमान की गणना करें: राल का द्रव्यमान (मिलीग्राम) = स्केल (mmol) / राल लोडिंग क्षमता (mmol / g) × 1,000 (mg / g)
      नोट: उदाहरण के लिए, 0.2 mmol = 0.2 mmol / 0.572 mmol / g के लिए रिंक एमाइड MBHA राल (0.572 mmol / g) का द्रव्यमान 1,000 मिलीग्राम / जी × 350 मिलीग्राम ।
    2. राल की आवश्यक मात्रा में 4-5 एमएल डीएमएफ जोड़ें और राल को पर्याप्त रूप से सूजन करने के लिए 30 मिनट के लिए कोमल एन 2 बुदबुदाहट के साथ 10 एमएल पॉलीप्रोपाइलीन कॉलम (चरण1.2 ) में स्थानांतरित करें, और फिर डीएमएफ को सूखा दें।
    3. राल में 50% मोर्फोलिन/डीएमएफ (वी/वी) का 4-5 एमएल जोड़ें, एन-टर्मिनल एफएमओसी समूह को हटाने के लिए 30 मिनट 2x के लिए धीरे-धीरे एन 2 को बुलबुला करें, और फिर मिश्रण को छान लें। इसके बाद, कॉलम में 4-5 एमएल डीएमएफ जोड़कर राल को अच्छी तरह से 3 गुना धो लें और हर बार कम से कम 1 मिनट के लिए एन2 के साथ बुदबुदाएं। राल को डीसीएम (3x) और DMF (3x) के साथ उसी तरह धोना जारी रखें।
  2. नीचे वर्णित के रूप में एफएमओसी-संरक्षित अमीनो एसिड युग्मन करें।
    नोट: 0.2 mmol स्केल मैनुअल संश्लेषण में आर्गिनिन के युग्मन को यहां एक उदाहरण के रूप में वर्णित किया गया है।
    1. एक सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में डीएमएफ के 5 एमएल में एफएमओसी-आर्ग (पीबीएफ) -ओएच (5 इक्विव, 648.8 मिलीग्राम) और 2-(7-एज़ोबेंजोट्रिज़ोल)-एन, एन, एन', एन-टेट्रामेथिल्यूरोनियम हेक्साफ्लोरोफॉस्फेट (एचएटीयू, 4.9 इक्विव, 372.6 मिलीग्राम) को घोलें।
    2. युग्मन प्रतिक्रिया को सक्रिय करने के लिए DIPEA (10 equiv., 348.4 μL) जोड़ें और फिर प्रतिक्रिया मिश्रण को राल के साथ 10 एमएल पॉलीप्रोपाइलीन कॉलम में स्थानांतरित करें (चरण 2.1.3 में तैयार)। फिर, 1-2 घंटे के लिए एन2 बुदबुदाहट के साथ मिश्रण को धीरे से उत्तेजित करें।
    3. युग्मन प्रतिक्रिया (चरण 2.2.1 और चरण 2.2.2) को एक बार दोहराएं।
    4. युग्मन के पूरा होने के बाद, प्रतिक्रिया मिश्रण को छान लें और राल को डीएमएफ, डीसीएम और डीएमएफ 3x के साथ हर बार कम से कम 1 मिनट के लिए क्रमिक रूप से धोएं।
    5. आदेशित चरणों में प्रत्येक एमिनो एसिड का युग्मन करें: राल में 50% मोर्फोलिन / डीएमएफ (वी / वी) का 4-5 एमएल जोड़ें, एन α-एफएमओसी समूह को हटाने के लिए 30 मिनट 2 एक्स के लिए एन 2 के साथ धीरे से बुलबुला करें, फिर राल को धोएं (जैसा कि चरण 2.2.4 में दिखाया गया है), और अगले एमिनो एसिड को जोड़ने के लिए आगे बढ़ें (जैसा कि चरण 2.2.1 और चरण 2.2.2 में दिखाया गया है)। वांछित पेप्टाइड के संश्लेषण को प्राप्त करने के लिए इस चरण के कई चक्रों के साथ आगे बढ़ें।
      नोट: इस प्रक्रिया को यहां रोका जा सकता है। राल को मेथनॉल के साथ संघनित करें और एन 2 के निरंतर प्रवाह के साथ राल कोसुखाएं। पॉलीप्रोपाइलीन कॉलम को कैप करें और फिर राल को कुछ दिनों के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें (या लंबे भंडारण के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर)। एक नया संश्लेषण शुरू करने से पहले राल को 0.5-1 घंटे के लिए 4-5 एमएल डीएमएफ के साथ सूजन लें। यदि सीधे अगले चरण में आगे बढ़ते हैं, तो राल को संघनित करने की कोई आवश्यकता नहीं है।
  3. नीचे वर्णित के रूप में फ्लोरेसिन आइसोथियोसाइनेट (एफआईटीसी) के साथ पेप्टाइड्स को लेबल करें।
    1. चरण 2.2 में अमीनो एसिड युग्मन के लिए उपयोग की जाने वाली प्रक्रिया का उपयोग करके एफआईटीसी लेबलिंग के लिए एक स्पेसर के रूप में बीटा-एलानिन को जोड़ा जाए।
    2. पॉलीप्रोपाइलीन कॉलम में एफआईटीसी (5 इक्विव), डीआईपीईए (10 इक्विव) और डीएमएफ के मिश्रण को जोड़कर और 8 घंटे के लिए अंधेरे में प्रतिक्रिया करके राल पर पेप्टाइड्स की एफआईटीसी लेबलिंग करें।
  4. एफआईटीसी-एसआर 8-4 के संश्लेषण के लिए, रैखिक पेप्टाइड का साइक्लाइजेशन करें जैसा कि नीचे वर्णित है।
    1. साइस (टीआरटी) सुरक्षा समूह को चुनिंदा रूप से हटाने के लिए पॉलीप्रोपाइलीन कॉलम में 2 मिनट के लिए टीएफए / ट्राईसोप्रोपिलसिलेन (टीआईएस)/डीसीएम (3/5/92, वी / वी / वी) का मिश्रण जोड़ें, और फिर मिश्रण को निकालें। उपरोक्त प्रक्रिया को तब तक दोहराएं जब तक कि टीआरटी सुरक्षा समूह को पूरी तरह से हटाने के लिए पीला घोल रंगहीन न हो जाए।
    2. इसके बाद, डीएमएफ और डीसीएम के साथ राल के अनुक्रमिक वॉश कम से कम 3x करें। बाद में, डीएमएफ में डीआईपीईए (4 इक्विव) के साथ 4,4'-बीआईएस (ब्रोमोमिथाइल) बाइफिनाइल (2 इक्विव) को भंग करें, इसे कॉलम में जोड़ें, और 4 घंटे के लिए प्रतिक्रिया करें।
  5. वर्णित पेप्टाइड्स को छोड़ दें: पेप्टाइड संश्लेषण के पूरा होने के बाद, राल को 4-5 एमएल मेथनॉल के साथ 5 मिनट के लिए दो बार धोएं और इसे एन 2 के निरंतर प्रवाह के साथसुखाएं। प्रति 100 मिलीग्राम राल के लिए लगभग 1 एमएल क्लीवेज कॉकटेल का उपयोग करके, सिस्टीन युक्त पेप्टाइड्स के लिए राल को एक प्रभावी क्लीवेज कॉकटेल टीएफए / टीआईएस / एच2ओ (95/2.5/2.5/2.5/2.5, वी / वी / वी / वी ) के साथ राल का इलाज करें। पेप्टाइड को छोड़ने के लिए 2-3 घंटे के लिए पेप्टाइड-बाउंड राल का इलाज करें और फिर एन 2 की धारा के साथ टीएफए को सावधानीपूर्वक हटादें।
  6. कच्चे पेप्टाइड्स प्राप्त करने के लिए, 4 मिनट के लिए 10,000 × ग्राम पर कच्चे पेप्टाइड्स और सेंट्रीफ्यूज को अवक्षेपित करने के लिए क्लीवर पेप्टाइड तैयारी में 4-5 एमएल डायथाइल ईथर जोड़ें। सुपरनैटेंट को सावधानीपूर्वक छोड़ दें और पेप्टाइड को 3 मिनट के लिए एक प्रभावी फ्यूम हुड में हवा में सुखाएं।
  7. पेप्टाइड्स का विश्लेषण: एसिटोनिट्राइल (एसीएन)/एच2ओ (1/1, वी/वी) के 800 μL में एक छोटे पैमाने पर क्रूड पेप्टाइड (लगभग 10 मिलीग्राम पेप्टाइड-बाउंड राल से क्लीवर) को भंग करें और फिर रिवर्स-फेज उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी (आरपी-एचपीएलसी) और तरल क्रोमैटोग्राफी-मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एलसी-एमएस) का उपयोग करके विश्लेषण करें ( सामग्री की तालिका देखें)।
  8. आरपी-एचपीएलसी और एलसी-एमएस का उपयोग करके पेप्टाइड्स को शुद्ध करें।
    1. 50 मिलीग्राम कच्चे पेप्टाइड उत्पाद को एसीएन / एच2ओ (1/1, वी / वी) के 4 एमएल में घोलें, और सी 18 कॉलम (4.6 मिमी x 150 मिमी, छिद्र आकार: 120 ए, कण आकार: 4 μm; सामग्री की तालिका देखें) से लैस आरपी-एचपीएलसी प्रणाली में घोल इंजेक्ट करें। 30 मिनट में 10% से 90% एसीएन की ढाल के साथ 0.1% टीएफए / एच2ओ (वी / वी) और एसीएन युक्त मोबाइल चरण का उपयोग करके पेप्टाइड का उपयोग करें। पारंपरिक पेप्टाइड्स को 220 एनएम पर और एफआईटीसी-लेबल पेप्टाइड्स को 494 एनएम पर पाया गया था।
    2. एमएस द्वारा पहचाने गए प्रमुख पेप्टाइड शिखर के अनुरूप अंशों को इकट्ठा करें, और फिर वांछित पेप्टाइड अंशों को लियोफिलाइज़ करें। शुद्ध पेप्टाइड को -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
      नोट: शुद्ध एफआईटीसी-आर 8 के पाए गए एम / जेड निम्नानुसार हैं: [एम + 3 एच]3 +: 576.63; [M + 4 H] 4+: 432.72; [एम + 5 एच] 5+: 346.39; [M + 6 H] 6+: 288.85. शुद्ध एफआईटीसी-एसआर 8-4 के पाए गए एम / जेड इस प्रकार हैं: [एम + 3 एच]3 +: 704.74; [M + 4 H] 4+: 528.77; [एम + 5 एच] 5+: 423.34; [M + 6 H] 6+: 352.91. एमएस विश्लेषणात्मक स्थितियां: उपकरण: ईएसआई (जांच पूर्वाग्रह: +4.5 केवी; डिटेक्टर: 1.2 केवी); नेब्युलाइज़र गैस प्रवाह: 1.5 एल / घुमावदार विघटन रेखा (सीडीएल): -20 वी; सीडीएल तापमान: 250 डिग्री सेल्सियस; ब्लॉक तापमान: 400 डिग्री सेल्सियस; प्रवाह दर: 0.2 एमएल / मोबाइल चरण: 50% एच2ओ / 50% एसीएन।

3. एफआईटीसी-लेबल पेप्टाइड्स का परिमाणीकरण

  1. स्टॉक समाधान के रूप में डीएमएसओ में शुद्ध पेप्टाइड की एक छोटी मात्रा को भंग करें (उदाहरण के लिए, 40 μmol / mL)।
  2. मल्टी-टेक्नोलॉजी माइक्रोप्लेट रीडर (सामग्री की तालिका देखें) के साथ माइक्रोटिटर प्लेट (सामग्री की तालिका देखें) के साथ 10 एमएम फॉस्फेट बफर्ड खारा (1x PBS, pH 7.4) के 498 μL में स्टॉक समाधान के 2 μL के494 nm (A 494) पर अवशोषण को मापें। कमजोर पड़ने का कारक 500 μL / 2 μL = 250 है, और माइक्रोटिटर प्लेट की पथ लंबाई 0.5 मिमी है।
  3. निम्न सूत्र का उपयोग करके स्टॉक समाधान की एकाग्रता की गणना करें:
    एकाग्रता (mM) = A494 × कमजोर पड़ने का कारक / 0.05 (सेमी) / 77,000 (सेमी −1 · M-1) × 1,000 (mM.M-1)
  4. एक उचित कमजोर पड़ने के लिए समायोजित करें ताकि मापा गया ए494 मान 0.1 और 1.0 के बीच हो।
    नोट: माप को कई बार दोहराया जाना चाहिए ताकि यह सुनिश्चित हो सके कि मापा एकाग्रता सटीक है। 77,000 सेमी-1 का विलोपन गुणांक · एम -1 एफआईटीसी समूह से उत्पन्न होता है।

4. भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) में पेप्टाइड्स की स्थिरता

  1. पेप्टाइड को 37 डिग्री सेल्सियस पर 25% एफबीएस/एच 2ओ (वी/वी) के 250 μL के साथ 100 μM की सांद्रता पर इनक्यूबेट करें। 0 घंटे, 1 घंटे, 2 घंटे और 4 घंटे तक इनक्यूबेट करने के बाद, 10 μL एलिकोट लें और फिर सीरम प्रोटीन को अवक्षेपित करने के लिए H 2 O/ACN (1/3, v/v) में घुले12% ट्राइक्लोरोएसेटिक एसिड का 150 μl जोड़ें।
  2. 5 मिनट के लिए 10,000 × ग्राम पर नमूनों को सेंट्रीफ्यूज करें और पेप्टाइड गिरावट की सीमा निर्धारित करने के लिए एचपीएलसी (जैसा कि चरण 2.8 में वर्णित है) का उपयोग करके सुपरनैटेंट का विश्लेषण करें।
  3. इसी समय अवक्रमित पेप्टाइड के अंश को प्राप्त करने के लिए 1 घंटे, 2 घंटे और 4 घंटे पर पीक क्षेत्र के अनुपात की गणना 0 घंटे पर करें। परिणाम तीन समानांतर नमूनों का औसत है।

5. पेप्टाइड्स का सेलुलर उत्थान

  1. फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपिक इमेजिंग
    1. एक गोल कवरस्लिप को 12-वेल प्लेट में रखें। फिर, 1 x 105 कोशिकाओं को समान रूप से कवरलिप्स पर टीका लगाएं और 2 एमएल माध्यम के साथ रात भर कल्चर करें। माध्यम को हटा दें और कोशिकाओं को 1 एमएल पीबीएस के साथ 3x धो लें।
      नोट: इस अध्ययन में, हेला कोशिकाओं और 4 टी 1 कोशिकाओं को डलबेको के संशोधित ईगल मीडियम (डीएमईएम, सामग्री की तालिका देखें) में 5% सीओ2 युक्त 37 डिग्री सेल्सियस ह्यूमिडिफाइड इनक्यूबेटर में 10% एफबीएस के साथ पूरक किया गया था।
    2. 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए एफबीएस-मुक्त डीएमईएम में 3 3 एसएम एफआईटीसी-लेबल पेप्टाइड्स के 1 एमएल के साथ कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें। बाद में, पेप्टाइड युक्त माध्यम को हटा दें और कोशिकाओं को 1 एमएल पीबीएस के साथ 3x धो लें।
    3. कोशिकाओं को 15 मिनट के लिए होचस्ट 33258 के 1 एमएल के साथ दाग दें। एक ही प्रतिदीप्ति तीव्रता और एक्सपोजर समय के साथ एक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप ( सामग्री की तालिका देखें) का उपयोग करके प्रत्येक पेप्टाइड के आंतरिककरण का निरीक्षण करें।
      नोट: फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी के लिए निम्नलिखित सेटिंग्स का उपयोग किया गया था। उद्देश्य: प्लान-एपोक्रोमैट: 63 x / 1.40 तेल डीआईसी एम 27; एफआईटीसी के लिए चैनल 1: उत्तेजना फिल्टर: 450-490 एनएम, उत्सर्जन फिल्टर: 500-550 एनएम, एक्सपोज़र समय: 230 एमएस; होचस्ट 33258 के लिए चैनल 2: उत्तेजना फिल्टर: 335-383 एनएम, उत्सर्जन फिल्टर: 420-470 एनएम, एक्सपोज़र समय: 27 एमएस।
  2. फ्लो साइटोमेट्री विश्लेषण
    1. 5 x 105 हेला कोशिकाओं को समान रूप से 12-वेल प्लेटों में टीका लगाएं और डीएमईएम में 37 डिग्री सेल्सियस पर 24 घंटे के लिए कल्चर करें। बाद में, माध्यम को हटा दें और कोशिकाओं को 1 एमएल पीबीएस के साथ 3x धो लें।
    2. 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए एफबीएस-मुक्त डीएमईएम में 3 3 एसएम एफआईटीसी-लेबल पेप्टाइड्स के 1 एमएल के साथ कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें। पेप्टाइड युक्त माध्यम को हटा दें, 5 मिनट के लिए पीबीएस में 0.25% (डब्ल्यू / वी) ट्रिप्सिन और 0.53 एमएम ईडीटीए के साथ कोशिकाओं को अलग करें, और फिर 4 मिनट के लिए 306 × ग्राम पर सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा कोशिकाओं को इकट्ठा करें। सेल पेलेट को पीबीएस के साथ धो लें।
    3. सतह-बाध्य प्रतिदीप्ति को बुझाने के लिए पीबीएस में 0.05% (डब्ल्यू / वी) ट्रिपैन ब्लू के 1 एमएल के साथ कोशिकाओं को 3 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें, और प्रवाह साइटोमीटर का उपयोग करके इंट्रासेल्युलर फ्लोरेसेंस का मात्रात्मक विश्लेषण करें ( सामग्री की तालिका देखें)।
      नोट: फ्लो साइटोमेट्री सेटिंग्स: उत्तेजना: 488 एनएम, उत्सर्जन: 530 एनएम। ट्रिपैन ब्लू मृत कोशिकाओं की प्रतिदीप्ति को भी बुझा सकता है और पेप्टाइड अपटेक के विश्लेषण के दौरान जीवित / मृत कोशिकाओं को अलग करने में मदद कर सकता है।
    4. हेला कोशिकाओं के लिए वर्णित समान प्रोटोकॉल का पालन करते हुए फ्लो साइटोमेट्री का उपयोग करके 4 टी 1 कोशिकाओं का इलाज और परख करें। प्रति नमूना 5 x 105 कोशिकाओं को इकट्ठा करें और प्रति समूह तीन समानांतर नमूने सेट करें।

6. ट्रांसवेल मॉडल का उपयोग करके पेप्टाइड्स के सेल-टू-सेल प्रवेश की खोज

  1. एक ऊतक संवर्धन प्लेट सम्मिलित (सामग्री की तालिका देखें) के साथ 12-वेल कक्ष में डीएमईएम के 2 एमएल में 1 x 105 हेला कोशिकाओं को टीका लगाएं और 5% सीओ 2 वाले 37 डिग्री सेल्सियस ह्यूमिडिफाइड इनक्यूबेटर में24 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें। बाद में, माध्यम को हटा दें और कक्षों में कोशिकाओं को 1 घंटे के लिए एफबीएस-मुक्त डीएमईएम में 10 μM FITC-R8 या FITC-sR8-4 (HPLC का उपयोग करके शुद्ध) के 1 एमएल के साथ इनक्यूबेट करें।
  2. पेप्टाइड्स युक्त माध्यम को हटा दें और कोशिकाओं को 1 एमएल पीबीएस के साथ 3x धोएं। कक्षों में ताजा एफबीएस-मुक्त डीएमईएम के 1 एमएल जोड़ें और फिर कक्ष में हेला कोशिकाओं को 2 घंटे के लिए नीचे गोल कवरलिप्स पर हेला कोशिकाओं के साथ ऊतक संवर्धन प्लेट के साथ जोड़कर सह-इनक्यूबेट करें।
  3. हेला कोशिकाओं को 2.5% ग्लूटाराल्डिहाइड के साथ गोल कवरलिप्स पर 15 मिनट के लिए ठीक करें और फिर 15 मिनट के लिए डीएपीआई के साथ कोशिकाओं को दाग दें। फिर, प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप के तहत कवरलिप्स पर हेला कोशिकाओं का निरीक्षण करें। हेला कोशिकाओं के लिए उपयोग किए जाने वाले समान प्रोटोकॉल का उपयोग करके 4 टी 1 कोशिकाओं का इलाज और परख करें।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

इस प्रोटोकॉल में, रैखिक पॉलीआर्जिनिन आर 8 को इसके चक्रीय रूप में बाधित करने के लिए एक सिंथेटिक प्रक्रिया प्रस्तुत की गई थी। एसपीपीएस को एक सरल उपकरण (चित्रा 1) का उपयोग करके मैन्युअल रूप से आयोजित किया गया था। एसपीपीएस की विस्तृत सिंथेटिक प्रक्रिया चित्रा 2 में दिखाया गया है। संक्षेप में, राल पर्याप्त रूप से सूज गया था, इसके बाद एनα-एफएमओसी रक्षक समूह का डीप्रोटेक्शन किया गया था। फिर, एन α-एफएमओसी-संरक्षित अमीनो एसिड को पेप्टाइड असेंबली (चित्रा 2 में चरण 1-4) के पूरा होने तक राल पर लंगर डाला गया था। फिर, क्रूड पेप्टाइड्स को क्लीवेज कॉकटेल (चित्रा 2 में चरण 5) द्वारा राल से निकाल दिया गया था। एफआईटीसी का उपयोग पेप्टाइड्स को फ्लोरोसेंटली लेबल चक्रीय सीपीपी को संश्लेषित करने और जैविक बाधाओं में उनकी पारगम्यता को ट्रैक करने के लिए किया गया था। इसके बाद, सिस्टीन के ट्राइटाइल रक्षक समूहों को राल पर चुनिंदा रूप से संरक्षित किया गया था, इसके बाद 4,4'-बीआईएस (ब्रोमोमिथाइल) बाइफिनाइल क्रॉस-लिंक (चित्रा 3 ए) के साथ पेप्टाइड साइक्लाइजेशन किया गया था। एफआईटीसी-आर 8 और एफआईटीसी-एसआर 8-4 के एचपीएलसी और एमएस स्पेक्ट्रा को चित्रा 3 बी में दिखाया गया है। एफआईटीसी-एसआर 8-4 का अवधारण समय रैखिक एनालॉग की तुलना में काफी लंबा था, जो हाइड्रोफोबिक क्रॉस-लिंक के साथ साइक्लाइजेशन के बाद पेप्टाइड की बढ़ी हुई समग्र हाइड्रोफोबिसिटी का संकेत देता है। इसके अलावा, जैसा कि चित्रा 3 सी में दिखाया गया है, चक्रीय आर 8 4 घंटे के लिए 25% एफबीएस के साथ इनक्यूबेशन के बाद 77.3% बरकरार रहा, जबकि इसका रैखिक समकक्ष ज्यादातर अवक्रमित था, जो चक्रीय आर 8 पेप्टाइड की बढ़ी हुई प्रोटियोलिटिक स्थिरता का सुझाव देता है। बाद के सेल-आधारित अध्ययनों में, एरोमैटिक क्रॉसलिंक के साथ चक्रीय आर 8 के साथ इलाज की गई कोशिकाओं ने अपने रैखिक समकक्ष के साथ इलाज किए गए लोगों की तुलना में उच्च इंट्रासेल्युलर फ्लोरेसेंस का प्रदर्शन किया, जैसा कि लाइव-सेल फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी इमेजिंग (चित्रा 4 ए) द्वारा प्रदर्शित किया गया है। इसी तरह के परिणाम प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण (चित्रा 4 बी) के साथ प्राप्त किए गए थे। आगे की जांच करने के लिए कि क्या चक्रीय आर 8 सेल-टू-सेल प्रवेश को बढ़ाता है, ट्रांसवेल मॉडल का उपयोग पेप्टाइड्स की बाधा पारगम्यता को एक सेल परत से दूसरे में अनुकरण करने के लिए किया गया था। चक्रीय आर 8 ने स्पष्ट रूप से रैखिक आर 8 पेप्टाइड की तुलना में उच्च ट्रांस-बैरियर प्रवेश का प्रदर्शन किया, जैसा कि इंट्रासेल्युलर फ्लोरेसेंस (चित्रा 4 सी) में उल्लेखनीय वृद्धि से संकेत मिलता है। संक्षेप में, चक्रीय आर 8 पेप्टाइड ने अपने रैखिक समकक्ष पर जैविक बाधाओं में बेहतर पारगम्यता का प्रदर्शन किया।

Figure 1
चित्रा 1: मैनुअल पेप्टाइड संश्लेषण तंत्र के लिए उपकरण सेटअप। तीन-तरफा स्टॉप वाल्व का उपयोग करके वैक्यूम मैनिफोल्ड पर एक 10 एमएल पॉलीप्रोपाइलीन कॉलम स्थापित किया जाता है। एन2 का उपयोग आंदोलन के लिए किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: एफएमओसी ठोस-चरण पेप्टाइड संश्लेषण (एसपीपीएस) की सामान्य प्रक्रिया। एक एन α-एफएमओसी-संरक्षित अमीनो एसिड को 4-(2', 4'-डाइमेथॉक्सीफाइल-एफएमओसी-एमिनोमिथाइल)-फेनोक्सीसिटामिडो-नॉरल्यूसिल-एमबीए राल (रिंक एमाइड एमबीए राल) (चरण 1) में लंगर डाला जाता है, इसके बाद अमीनो एसिड (चरण 2) और बाद में एमिनो एसिड युग्मन (चरण 3)के एन α-एफएमओसी सुरक्षा समूहों की रक्षा होती है। चरण 2 और चरण 3 को वांछित पेप्टाइड (चरण 4) को संश्लेषित करने के लिए कई बार दोहराया जाता है। संश्लेषण के पूरा होने के बाद, साइड चेन प्रोटेक्टिंग समूहों को हटाने और राल से वांछित पेप्टाइड को छोड़ने के लिए एक क्लीवेज कॉकटेल जोड़ा जाता है (चरण 5)। संक्षेप: डीएमएफ = एन, एन-डाइमिथाइलफॉर्मामाइड; डीसीएम = डाइक्लोरोमेथेन; एचएटीयू = 2-(7-एज़ोबेंज़ोट्रायज़ोल)-एन, एन, एन', एन-टेट्रामेथिल्यूरोनियम हेक्साफ्लोरोफॉस्फेट; डीआईपीईए = एन, एन-डाइसोप्रोपिलेथिलमाइन; टीएफए = ट्राइफ्लोरोएसिटिक एसिड। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: ठोस-चरण पेप्टाइड संश्लेषण (एसपीपीएस) का उपयोग करके एफआईटीसी-लेबल रैखिक आर 8 पेप्टाइड (एफआईटीसी-आर 8) और एफआईटीसी-लेबल स्टेपल आर 8 पेप्टाइड ( एफआईटीसी-एसआर 8-4) का संश्लेषण। (बी) एफआईटीसी-आर 8 और एफआईटीसी-एसआर 8-4 के एचपीएलसी और एमएस स्पेक्ट्रा (इनसेट)। (ग) 25% एफबीएस की उपस्थिति में एफआईटीसी-आर8 और एफआईटीसी-एसआर8-4 की स्थिरता। बरकरार पेप्टाइड (%) अवक्रमित पेप्टाइड के अंश को संदर्भित करता है। इस आंकड़े को शी एट अल.15 से संशोधित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्रा 4: एफआईटीसी-लेबल रैखिक आर 8 पेप्टाइड (एफआईटीसी-आर 8) और एफआईटीसी-लेबल स्टेपल आर 8 पेप्टाइड (एफआईटीसी-एसआर 8-4) का प्रवेश। (ए) 1 घंटे के बाद हेला कोशिकाओं और 4 टी 1 कोशिकाओं की लाइव-सेल फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी छवियां 3 μM FITC-R8 और FITC-sR8-4 के साथ इनक्यूबेशन। एफआईटीसी (हरा), होचस्ट (नीला)। स्केल बार = 20 μm. (B) सापेक्ष माध्य प्रतिदीप्ति (रैखिक R8 पेप्टाइड के संबंध में), माध्य ± s.d., और n = 3; (ग) हेला कोशिकाओं का उपयोग करते हुए ट्रांसवेल मॉडल में एफआईटीसी-आर8 और एफआईटीसी-एसआर8-4 का सेल-टू-सेल प्रवेश। लाइव-सेल फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी छवियां (स्केल बार = 20 μm), और सापेक्ष माध्य प्रतिदीप्ति (रैखिक R8 पेप्टाइड के संबंध में), माध्य ± s.d., और n = 3। ** पी < 0.01, *** पी < 0.001। इस आंकड़े को शी एट अल.15 से संशोधित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

संवहन बाधाओं को शामिल करके पेप्टाइड्स का रासायनिक स्थिरीकरण पेप्टाइड26 की स्थिरता और सेल पारगम्यता में सुधार के लिए एक प्रभावी रणनीति साबित हुई है। इस प्रोटोकॉल में, सुगंधित क्रॉस-लिंक के साथ चक्रीय सीपीपी के संश्लेषण और जैविक बाधाओं में उनकी पारगम्यता के मूल्यांकन के लिए एक चरण-दर-चरण प्रक्रिया का वर्णन किया गया है। हाइड्रोफिलिक लैक्टम या ट्रायज़ोल क्रॉस-लिंक22,27 की तुलना में, सुगंधित क्रॉस-लिंक (इस अध्ययन में उपयोग किया जाता है) का समावेश सीपीपी की समग्र हाइड्रोफोबिसिटी में सुधार करता है, जिससे उनकी सेल पारगम्यता में काफी वृद्धि होती है। दूसरी ओर, पेप्टाइड साइक्लाइजेशन को किसी भी धातु उत्प्रेरक की आवश्यकता के बिना सिस्टीन के साथ प्रतिस्थापन प्रतिक्रियाओं के माध्यम से आसानी से प्राप्त किया जा सकता है। इस प्रोटोकॉल में, राल पर सीपीपी का चक्रीकरण आयोजित किया गया था; हालांकि, साइक्लाइजेशन दक्षता स्टेरिक प्रभावों के कारण पेप्टाइड्स के विशिष्ट अनुक्रमों और लंबाई पर भी निर्भर करती है, जिसके परिणामस्वरूप एक डिमेरिक बायप्रोडक्ट28 का गठन हो सकता है। ऐसे मामले में, कम लोडिंग क्षमता वाले राल का उपयोग करना सहायक होगा। इसके अलावा, समाधान चरण29 में पतला सांद्रता के तहत इन विशिष्ट पेप्टाइड्स को साइक्लाइज करने की भी सिफारिश की जाती है।

इस प्रोटोकॉल में कुछ महत्वपूर्ण बिंदु हैं। सबसे पहले, क्लीवेज कॉकटेल टीएफए / टीआईएस / ईडीटी / एच2ओ (92.5/2.5/2.5/2.5/2.5, वी / वी / वी / वी ) का उपयोग सल्फहाइड्रील समूह के ऑक्सीकरण को रोकने के लिए सिस्टीन युक्त पेप्टाइड्स के दरार के लिए किया जाता है। दूसरा, उचित दरार की स्थिति प्राप्त करने के लिए एक छोटे पैमाने पर प्रारंभिक अध्ययन करने का सुझाव दिया जाता है। राल से पेप्टाइड्स को छोड़ने के लिए आवश्यक इष्टतम समय 2-3 घंटे है, जिसमें अधिक अज्ञात उपोत्पादों का उत्पादन करने के लिए लंबे क्लीवेज समय (5 घंटे से अधिक) होता है। दरार के समय को अनुकूलित करने के लिए पेप्टाइड संश्लेषण की निगरानी एलसी-एमएस द्वारा की जा सकती है। तीसरा, फ्लोरेसेंस शमन से बचने के लिए एफआईटीसी लेबलिंग अंधेरे में की जानी चाहिए।

इसके अलावा, ट्रिपैन ब्लू का उपयोग सतह-बाध्य प्रतिदीप्ति को बुझाने के लिए किया जाना चाहिए क्योंकि प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण इंट्रासेल्युलर या सतह-बाध्य प्रतिदीप्ति को अलग नहीं कर सकता है। यह विशेष रूप से कैंसर कोशिकाओं द्वारा आंतरिक पेप्टाइड को निर्धारित करने में मददकरेगा। इसके अलावा, जैसा कि धनिक पेप्टाइड्स गैर-विशिष्ट झिल्ली लाइसिस30 का कारण बन सकते हैं, चक्रीय सीपीपी की विषाक्तता का मूल्यांकन करने के लिए हेमोलिटिक गतिविधि और सेल व्यवहार्यता भी आयोजित की जा सकती है।

चक्रीय सीपीपी जैविक बाधाओं को जीतने के लिए प्रभावी दवा वितरण वाहनों में से एक का गठन करते हैं। हालांकि, कैनेसिक सीपीपी की झिल्ली बातचीत और गड़बड़ी आम तौर पर संभावित गैर-विशिष्ट साइटोटॉक्सिसिटी31 का कारण बनती है। आगे के प्रयास विस्तृत प्रवेश तंत्र को समझने के लिए समर्पित होंगे, जो न्यूनतम साइटोटॉक्सिसिटी के साथ जैविक बाधाओं को भेदने के लिए चक्रीय सीपीपी की अगली पीढ़ी की खोज में सहायता करनी चाहिए। ये अत्यधिक सक्रिय और स्थिर सीपीपी महत्वपूर्ण जीवन-धमकी देने वाली बीमारियों के उपचार में सुधार के लिए बहुत वादा करते हैं।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

यह काम चीन के प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (21708031), चीन पोस्टडॉक्टरल साइंस फाउंडेशन (बीएक्स 20180264, 2018 एम 643519), और केंद्रीय विश्वविद्यालयों के लिए मौलिक अनुसंधान निधि (2682021 जेडटीपीवाई075) द्वारा समर्थित है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1,2-ethanedithiol Aladdin K1722093 stench
2-(7-Azobenzotriazole)-N,N,N',N'-tetramethyluronium hexafluorophosphate (HATU) HEOWNS A-0443697
4,4'-bis(bromomethyl)biphenyl TCI B1921
4T1 cells ATCC 4T1 cells were cultured in DMEM medium supplemented with 10% FBS (Hyclone) in a 37 °C humidified incubator containing 5% CO2.
Acetonitrile  Adamas 1484971 toxicity
Dichloromethane Energy W330229 skin harmful
Diethyl ether Aldrich 673811 flammable
Dimethyl sulfoxide Beyotime ST038 skin harmful
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) Gibco
Electrospray Ionization Mass Spectrometer Waters G2-S Tof
Ethylene Diamine Tetraacetic Acid (EDTA) BioFroxx 1340
Fetal bovine serum (FBS) HyClone
Flow cytometer Beckman Coulter CytoFLEX
Fluorescein isothiocyanate isomer (FITC) Energy E0801812500
Fluorescent microscope Carl Zeiss Axio Observer 7
Fmoc-Arg(Pbf)-OH HEOWNS F-81070
Fmoc-Cys(Trt)-OH GL Biochem GLS201115-35202
Fmoc-βAla-OH Adamas 51341C
HeLa cells ATCC HeLa cells were cultured in DMEM supplemented with 10% FBS (Hyclone) in a 37 °C humidified incubator containing 5% CO2.
High-Performance Liquid Chromatography Agilent Agilent 1260
High-Performance Liquid Chromatography column Agilent Poroshell EC-C18 120, 4.6 × 150 mm (pore size 120 Å, particle size 4 μm)
Lyophilizer SP Scientific Vir Tis
Methanol Aldrich 9758 toxicity
Microtiter plate Thermo μdrop plate N12391
Morpholine HEOWNS M99040 irritant
Multi-technology microplate reader Thermo VARIOSKAN LUX
N,N-Diisopropylethylamine HEOWNS E-81416 irritant
N,N-Dimethyl formamide Energy B020051 harmful to skin
Poly-Prep column Bio-Rad 7321010 polypropylene chromatography columns
Rink Amide MBHA resin (0.572 mmol/g) GL Biochem GLS180301-49101
Three-way stopcocks Bio-Rad 7328107
Tissue culture plate insert LABSELECT 14211
Trifluoroacetic acid HEOWNS T63278 corrosive
Triisopropylsilane HEOWNS T-0284475
Trypsin BioFroxx 1004
Vacuum manifold Promega A7231

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Zhang, L., et al. Brain-targeted dual site-selective functionalized poly(β-amino esters) delivery platform for nerve regeneration. Nano Letters. 21 (7), 3007-3015 (2021).
  2. Park, T. E., et al. Enhanced BBB permeability of osmotically active poly(mannitol-co-PEI) modified with rabies virus glycoprotein via selective stimulation of caveolar endocytosis for RNAi therapeutics in Alzheimer's disease. Biomaterials. 38, 61-71 (2015).
  3. Bian, J., et al. Effect of cell-based intercellular delivery of transcription factor GATA4 on ischemic cardiomyopathy. Circulation Research. 100 (11), 1626-1633 (2007).
  4. He, H., et al. The use of low molecular weight protamine chemical chimera to enhance monomeric insulin intestinal absorption. Biomaterials. 34 (31), 7733-7743 (2013).
  5. Kim, D., et al. A specific STAT3-binding peptide exerts antiproliferative effects and antitumor activity by inhibiting STAT3 phosphorylation and signaling. Cancer Research. 74 (8), 2144-2151 (2014).
  6. Yang, Y., et al. PEGylated liposomes with NGR ligand and heat-activable cell-penetrating peptide-doxorubicin conjugate for tumor-specific therapy. Biomaterials. 35 (14), 4368-4381 (2014).
  7. Wei, Y., et al. Intracellular paclitaxel delivery facilitated by a dual-functional CPP with a hydrophobic hairpin tail. ACS Applied Materials and Interfaces. 13 (4), 4853-4860 (2021).
  8. Vasan, N., Baselga, J., Hyman, D. M. A view on drug resistance in cancer. Nature. 575 (7782), 299-309 (2019).
  9. Cong, Y., et al. Microenvironment-induced in situ self-assembly of polymer-peptide conjugates that attack solid tumors deeply. Angewandte Chemie International Edition. 131 (14), 4680-4685 (2019).
  10. Blanco, E., Shen, H., Ferrari, M. Principles of nanoparticle design for overcoming biological barriers to drug delivery. Nature Biotechnology. 33 (9), 941-951 (2015).
  11. Tian, Y., Zhou, S. Advances in cell-penetrating peptides and their functionalization of polymeric nanoplatforms for drug delivery. Wiley Interdisciplinary Reviews. Nanomedicine and Nanobiotechnology. 13 (2), 1-12 (2021).
  12. Milletti, F. Cell-penetrating peptides: Classes, origin, and current landscape. Drug Discovery Today. 17 (15-16), 850-860 (2012).
  13. Turner, J. J., et al. Cell-penetrating peptide conjugates of peptide nucleic acids (PNA) as inhibitors of HIV-1 Tat-dependent trans-activation in cells. Nucleic Acids Research. 33 (21), 6837-6849 (2005).
  14. Tunnemann, G., et al. Live-cell analysis of cell penetration ability and toxicity of oligo-arginines. Journal of Peptide Science. 14 (4), 469-476 (2008).
  15. Shi, M., et al. Stapling of short cell-penetrating peptides for enhanced tumor cell-and-tissue dual-penetration. Chemical Communications. 58 (14), 2299-2302 (2022).
  16. Komin, A., et al. A peptide for transcellular cargo delivery: Structure-function relationship and mechanism of action. Journal of Controlled Release. 324, 633-643 (2020).
  17. Dietrich, L., et al. Cell permeable stapled peptide inhibitor of Wnt signaling that targets β-catenin protein-protein interactions. Cell Chemical Biology. 24 (8), 958-968 (2017).
  18. Tian, Y., et al. Stapling of unprotected helical peptides via photo-induced intramolecular thiol-yne hydrothiolation. Chemical Science. 7 (5), 3325-3330 (2016).
  19. De Araujo, A. D., et al. Comparative α-helicity of cyclic pentapeptides in water. Angewandte Chemie International Edition. 53 (27), 6965-6969 (2014).
  20. Chu, Q., et al. Towards understanding cell penetration by stapled peptides. Medicinal Chemistry Communications. 6 (1), 111-119 (2015).
  21. Bock, J. E., Gavenonis, J., Kritzer, J. A. Getting in shape: Controlling peptide bioactivity and bioavailability using conformational constraints. ACS Chemical Biology. 8 (3), 488-499 (2013).
  22. Tian, Y., et al. Effect of stapling architecture on physiochemical properties and cell permeability of stapled α-helical peptides: A comparative study. ChemBioChem. 18 (21), 2087-2093 (2017).
  23. White, C. J., Yudin, A. K. Contemporary strategies for peptide macrocyclization. Nature Chemistry. 3 (7), 509-524 (2011).
  24. Jain, R. K. Normalization of tumor vasculature: An emerging concept in antiangiogenic therapy. Science. 307 (5706), 58-62 (2005).
  25. Patgiri, A., Menzenski, M. Z., Mahon, A. B., Arora, P. S. Solid-phase synthesis of short α-helices stabilized by the hydrogen bond surrogate approach. Nature Protocols. 5 (11), 1857-1865 (2010).
  26. Baek, S., et al. Structure of the stapled p53 peptide bound to Mdm2. Journal of the American Chemical Society. 134 (1), 103-106 (2012).
  27. Traboulsi, H., et al. Macrocyclic cell penetrating peptides: A study of structure-penetration properties. Bioconjugate Chemistry. 26 (3), 405-411 (2015).
  28. Tian, Y., et al. A proline-derived transannular N-cap for nucleation of short α-helical peptides. Chemical Communications. 52 (59), 9275-9278 (2016).
  29. Muppidi, A., et al. Rational design of proteolytically stable, cell-permeable peptide-based selective Mcl-1 inhibitors. Journal of the American Chemical Society. 134 (36), 14734-14737 (2012).
  30. Wiradharma, N., et al. Synthetic cationic amphiphilic α-helical peptides as antimicrobial agents. Biomaterials. 32 (8), 2204-2212 (2011).
  31. Jones, A. T., Sayers, E. J. Cell entry of cell penetrating peptides: Tales of tails wagging dogs. Journal of Controlled Release. 161 (2), 582-591 (2012).

Tags

वापसी मुद्दा 187 सेल-पेनिट्रेटिंग पेप्टाइड चक्रीय पेप्टाइड जैविक बाधा सेल पारगम्यता
जैविक बाधाओं के बढ़े हुए प्रवेश के लिए चक्रीय सेल-पेनिट्रेटिंग पेप्टाइड्स का निर्माण
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Fang, D., Wang, R., Yu, X., Tian, Y. … More

Fang, D., Wang, R., Yu, X., Tian, Y. Construction of Cyclic Cell-Penetrating Peptides for Enhanced Penetration of Biological Barriers. J. Vis. Exp. (187), e64293, doi:10.3791/64293 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter