Summary
Denne protokollen beskriver syntesen av sykliske cellepenetrerende peptider med aromatiske tverrbindinger og evalueringen av deres permeabilitet over biologiske barrierer.
Abstract
Kreft har vært en stor utfordring i global helse. Imidlertid begrenser det komplekse tumormikromiljøet generelt terapiens tilgang til dypere tumorceller, noe som fører til tilbakefall av svulster. For å erobre den begrensede penetrasjonen av biologiske barrierer, har cellepenetrerende peptider (CPP) blitt oppdaget med utmerket membrantranslokasjonsevne og har dukket opp som nyttige molekylære transportører for å levere forskjellige laster inn i celler. Imidlertid viser konvensjonelle lineære CPP-er generelt kompromittert proteolytisk stabilitet, noe som begrenser permeabiliteten på tvers av biologiske barrierer. Dermed er utviklingen av nye molekylære transportører som kan trenge gjennom biologiske barrierer og utvise forbedret proteolytisk stabilitet sterkt ønsket for å fremme legemiddelleveringseffektivitet i biomedisinske applikasjoner. Vi har tidligere syntetisert et panel av korte sykliske CPP med aromatiske tverrbindinger, som viste overlegen permeabilitet i kreftceller og vev sammenlignet med deres lineære kolleger. Her er en kortfattet protokoll beskrevet for syntesen av det fluorescerende merkede sykliske polyarginin R8-peptidet og dets lineære motstykke, samt viktige trinn for å undersøke cellepermeabiliteten.
Introduction
De siste tiårene har vært vitne til raske fremskritt i utviklingen av cellepenetrerende peptider (CPP) for legemiddellevering. CPP har blitt mye brukt som molekylære transportører for behandling av en rekke livstruende sykdommer, inkludert nevrologiske lidelser1,2, hjertesykdommer3, diabetes4, dermatose5 og kreft 6,7. Kreft er fortsatt en global helsebyrde ledsaget av høy sykelighet og dødelighet til tross for omfattende forskningsinnsats8. En alvorlig hindring for behandling av kreft er terapeutikkens begrensede tilgang til dypere tumorceller på grunn av fysiologiske barrierer som kompakt ekstracellulær matrise (ECM), unormal tumorvaskulatur, flere membranbarrierer og høyt interstitielt væsketrykk (IFP)9. Utvikling av nye CPP-er med overlegen evne til å levere last på tvers av biologiske barrierer anses derfor som en viktig strategi for kreftbehandling10,11.
CPP kan kategoriseres i kationiske, amfipatiske og hydrofobe CPP når det gjelder deres fysisk-kjemiske egenskaper12. Blant disse er det positivt ladede HIV-TAT-peptidet og det syntetiske polyargininet av stor betydning i biomedisinsk forskning og har blitt grundig studert for å lette intracellulær legemiddellevering13. Tunnemann et al. rapporterte at en minimumslengde på åtte argininer er avgjørende for effektiv cellepenetrasjon av de syntetiske polyargininpeptidene, basert på en cellepermeabilitetsstudie utført ved bruk av R3 til R12-peptider14. Imidlertid har disse CPP-ene generelt korte halveringstider i plasma på grunn av deres raske hydrolyse in vivo. I tillegg er lite kjent om optimalisering av den kjemiske strukturen til CPP for å øke deres transbarriereevne, da det er utfordrende å trenge gjennom flere cellemembraner15. Dermed er utviklingen av nye molekylære transportører som er i stand til å trenge gjennom biologiske barrierer, sterkt ønsket for å forbedre legemiddelleveringseffektiviteten. I 2020 oppdaget Komin et al.16 et CPP kalt CL-peptid, som inneholder et helixmotiv (RLLRLLR) og en polyargininhale (R7) for å krysse epitelmonolaget. Et sett med CL-peptidvarianter ble også syntetisert ved å endre det spiralformede mønsteret. Denne utforskningen kan være en betydelig veiledning for utviklingen av nye CPP-er for levering av last over biologiske barrierer. Videre optimaliserte Dietrich et al. cellepermeabiliteten til StAX-peptidet, og hemmet Wnt / β-catenin-signalveien ved å øke den totale hydrofobisiteten til peptidene17.
Konformasjonsbegrensning av ustrukturerte lineære peptider ved syklisering er en effektiv måte å forbedre deres proteolytiske stabilitet og permeablitet18,19,20. Den strukturelle forsterkningen øker proteasemotstanden til sykliske peptider, noe som gjør dem mer stabile in vivo sammenlignet med deres lineære kolleger. I tillegg kan sykliseringen av peptider potensielt maskere den polare peptidryggraden ved å fremme intramolekylær hydrogenbinding, og dermed øke membranpermeabiliteten til peptidene21. I løpet av de siste to tiårene har kjemoselektive sykliseringsmetoder blitt effektive strategier for konstruksjon av sykliske peptider med forskjellige arkitekturer, som all-hydrokarbon, laktam, triazol, m-xylen, perfluoroaryl og andre tverrbindinger22,23. Den biologiske barrieren pålagt av det sofistikerte tumormikromiljøet kan redusere penetrasjonen av legemidler i faste svulster24. Vi har tidligere funnet at de sykliske CPP-ene viste overlegen motstand mot enzymatisk fordøyelse over sine lineære kolleger20. Videre er den totale hydrofobisiteten til peptidene kritisk for deres forbedrede cellepermeabilitet22. Basert på studiene diskutert ovenfor, kan kombinasjonen av et positivt ladet mønster, forhøyet total hydrofobicitet og forbedret proteolysestabilitet antas å øke permeabiliteten til CPP på tvers av biologiske barrierer. I en nylig studie identifiserte vi to sykliske CPP med aromatiske tverrbindinger i posisjon i og i + 7 som viser forbedret permeabilitet i tumorceller og vev sammenlignet med deres lineære kolleger15. Her presenteres en kortfattet syntetisk protokoll for syntese av fluorescerende merkede sykliske CPP og de viktigste trinnene for å undersøke deres permeabilitet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Forberedelse av utstyr
MERK: Utfør alle prosedyrene i en avtrekkshette med egnet personlig verneutstyr.
- Monter det manuelle peptidsynteseapparatet i avtrekksdekselet (figur 1). Plasser treveis stoppekraner (se materialfortegnelse) på vakuummanifolden (se materialfortegnelse) og koble til nitrogenet (N2). Sørg for å sette lokk på de ubrukte innløpene.
- Fest en 10 ml polypropylenkolonne (se materialfortegnelse) på de treveis stoppekranene. Tøm reaksjonsblandingen eller løsningsmidlene fra polypropylenkolonnen ved hjelp av en gummipipettepære eller et vakuum via en avfallsfelle.
2. Syntese av FITC-merket lineært R8-peptid (FITC-R8) og FITC-merket stiftet R8-peptid (FITC-sR8-4)
MERK: Peptidene ble syntetisert i henhold til en standard Fmoc-basert fastfase peptidsyntese (SPPS) protokoll25. 4-(2',4'-Dimethoxypheyl-Fmoc-aminomethyl)-fenoxyacetamido-norleucyl-MBHA harpiks (rink amide MBHA harpiks, se tabell over materialer) ble brukt gjennom hele studien.
FORSIKTIG: N, N-dimetylformamid (DMF), N, N-diisopropyletylamin (DIPEA), morfolin og diklormetan (DCM) er alle fargeløse og er skadelige ved innånding eller absorbert gjennom huden. Eter er ekstremt brannfarlig. 1,2-etanedithiol (EDT) er et spesielt luktende stoff. Trifluoreddiksyre (TFA) er sterkt etsende, og surheten er 10,5 ganger den for eddiksyre. Derfor skal alle reagenser og kjemikalier håndteres ved hjelp av verneutstyr i en avtrekkshette.
- Forbered harpiksen for peptidsyntese.
- Beregn massen av harpiks som trengs for syntesen: Masse harpiks (mg) = skala (mmol) / harpiks lastekapasitet (mmol / g) × 1,000 (mg / g)
MERK: For eksempel massen av rink amide MBHA harpiks (0,572 mmol / g) for 0,2 mmol = 0,2 mmol / 0,572 mmol / g × 1,000 mg / g = 350 mg. - Tilsett 4-5 ml DMF til ønsket mengde harpiks og overfør til 10 ml polypropylenkolonne (trinn 1.2) med mild N2 boblende i 30 minutter for å svelle harpiksen tilstrekkelig, og tøm deretter DMF.
- Tilsett 4-5 ml 50% morfolin / DMF (v / v) til harpiksen, boble forsiktig N2 i 30 min 2x for å fjerne den N-terminale Fmoc gruppen, og tøm deretter blandingen. Etterpå vasker du harpiksen grundig 3x ved å tilsette 4-5 ml DMF i kolonnen og boble med N2 i minst 1 min hver gang. Fortsett å vaske harpiksen med DCM (3x) og DMF (3x) på samme måte.
- Beregn massen av harpiks som trengs for syntesen: Masse harpiks (mg) = skala (mmol) / harpiks lastekapasitet (mmol / g) × 1,000 (mg / g)
- Utfør Fmoc-beskyttet aminosyrekobling som beskrevet nedenfor.
MERK: Koblingen av arginin i en 0,2 mmol skala manuell syntese er beskrevet her som et eksempel.- Oppløs Fmoc-Arg (Pbf)-OH (5 ekviv., 648,8 mg) og 2-(7-azobenzotriazol)-N, N, N', N'-tetrametyluroniumheksafluorofosfat (HATU, 4,9 ekviV., 372,6 mg) i 5 ml DMF i et sentrifugerør.
- Tilsett DIPEA (10 ekviv., 348,4 μL) for å aktivere koblingsreaksjonen og overfør deretter reaksjonsblandingen til 10 ml polypropylenkolonnen med harpiks (fremstilt i trinn 2.1.3). Deretter beveges blandingen forsiktig med N 2 boblende i1-2 timer.
- Gjenta koblingsreaksjonen (trinn 2.2.1 og trinn 2.2.2) én gang.
- Etter at koblingen er fullført, tøm reaksjonsblandingen og vask harpiksen sekvensielt med DMF, DCM og DMF 3x hver i minst 1 min hver gang.
- Utfør kobling av hver aminosyre i bestilte trinn: Tilsett 4-5 ml 50% morfolin / DMF (v / v) til harpiksen, boble forsiktig med N 2 i 30 min 2x for å fjerne N α-Fmoc gruppen, vask deretter harpiksen (som vist i trinn 2.2.4), og fortsett å koble neste aminosyre (som vist i trinn 2.2.1 og trinn 2.2.2). Fortsett med flere sykluser av dette trinnet for å oppnå syntese av ønsket peptid.
MERK: Denne prosessen kan settes på pause her. Kondenser harpiksen med metanol og tørk harpiksen med en kontinuerlig strøm av N2. Sett lokk på polypropylenkolonnen og oppbevar harpiksen ved 4 °C i noen dager (eller ved -20 °C for lengre oppbevaring). Svell harpiksen med 4-5 ml DMF i 0,5-1 time før du starter en ny syntese. Hvis du går videre til neste trinn, er det ikke nødvendig å kondensere harpiksen.
- Merk peptidene med fluoresceinisotiocyanat (FITC) som beskrevet nedenfor.
- Par beta-alanin som et mellomrom for FITC-merking ved hjelp av samme prosess som brukes til aminosyrekobling i trinn 2.2.
- Utfør FITC-merking av peptider på harpiksen ved å tilsette en blanding av FITC (5 ekviv.), DIPEA (10 ekviv.) og DMF til polypropylenkolonnen og reagere i mørket i 8 timer.
- For syntese av FITC-sR8-4, utfør syklisering av det lineære peptidet som beskrevet nedenfor.
- Tilsett en blanding av TFA/triisopropylsilan (TIS)/DCM (3/5/92, v/v/v) til polypropylenkolonnen i 2 minutter for selektivt å fjerne beskyttelsesgruppen Cys (Trt), og tøm deretter blandingen. Gjenta prosedyren ovenfor til den gulaktige oppløsningen blir fargeløs for å fjerne Trt beskyttelsesgruppen helt.
- Deretter utfører sekvensielle vasker av harpiksen med DMF og DCM minst 3x. Etterpå løser du opp 4,4'-bis(brometyl)bifenyl (2 ekviv.) i DMF med DIPEA (4 ekvivalenter), legger den til kolonnen og reagerer i 4 timer.
- Klipp peptidene som beskrevet: Etter ferdigstillelse av peptidsyntese, vask harpiksen med 4-5 ml metanol to ganger i 5 minutter hver og tørk den med en kontinuerlig strøm av N2. Behandle harpiksen med en effektiv spaltningscocktail TFA / TIS / H 2 O (95/2.5 / 2.5, v / v / v), eller TFA / TIS / EDT / H 2 O (92.5/ 2.5 / 2.5 / 2.5, v / v / v / v) for peptider som inneholder cysteiner, ved bruk av ca. 1 ml spaltningscocktail for per 100 mg harpiks. Behandle peptidbundet harpiks i 2-3 timer for å spalte peptidet og fjern deretter TFA forsiktig med en strøm av N2.
- For å oppnå de rå peptidene, tilsett 4-5 ml dietyleter til det spaltede peptidpreparatet for å utfelle de rå peptidene og sentrifugen ved 10.000 × g i 4 minutter. Kast supernatanten forsiktig og lufttørk peptidet i 3 minutter i en effektiv avtrekkshette.
- Analyse av peptidene: Oppløs et småskala råpeptid (spaltet fra ca. 10 mg peptidbundet harpiks) i 800 μL acetonitril (ACN)/H2O(1/1, v/v) og analyser deretter med omvendt fase høyytelsesvæskekromatografi (RP-HPLC) og væskekromatografi-massespektrometri (LC-MS) (se materialliste).
- Rens peptidene ved hjelp av RP-HPLC og LC-MS.
- Løs opp 50 mg råpeptidprodukt i 4 ml ACN/H2O (1/1, v/v), og injiser oppløsningen i et RP-HPLC-system utstyrt med en C18-kolonne (4,6 mm x 150 mm, porestørrelse: 120 Å, partikkelstørrelse: 4 μm; se materialfortegnelse). Elmindre peptidet ved hjelp av en mobil fase inneholdende 0,1% TFA/H2O (v/v) og ACN, med en gradient på 10% til 90% ACN over 30 min. Konvensjonelle peptider ble detektert ved 220 nm og FITC-merkede peptider ved 494 nm.
- Samle fraksjonene som tilsvarer den store peptidtoppen som identifisert av MS, og lyofiliser deretter de ønskede peptidfraksjonene. Oppbevar det rensede peptidet ved -20 °C.
MERK: De funnet m / z av renset FITC-R8 er som følger: [M + 3 H] 3 +: 576,63; [M + 4 H] 4+: 432,72; [M + 5 H] 5+: 346,39; [M + 6 H] 6+: 288,85. De funnet m / z av renset FITC-sR8-4 er som følger: [M + 3 H] 3 +: 704,74; [M + 4 H] 4+: 528,77; [M + 5 H] 5+: 423,34; [M + 6 H] 6+: 352,91. MS analytiske betingelser: instrument: ESI (sondeskjevhet: +4,5 kV; detektor: 1,2 kV); forstøvergassstrøm: 1,5 l / min; buet oppløsningslinje (CDL): -20 V; CDL temperatur: 250 ° C; blokktemperatur: 400 °C; strømningshastighet: 0,2 ml / min; mobil fase: 50% H2O / 50% ACN.
3. Kvantifisering av de FITC-merkede peptidene
- Løs opp en liten mengde renset peptid i DMSO som stamløsning (f.eks. 40 μmol/ml).
- Mål absorbansen ved 494 nm (A 494) på 2 μL av stamløsningen i498 μL 10 mM fosfatbufret saltvann (1x PBS, pH 7,4) med en mikrotiterplate (se materialfortegnelse) ved hjelp av en multiteknologisk mikroplateleser (se materialfortegnelse). Fortynningsfaktoren er 500 μL / 2 μL = 250, og banelengden til mikrotiterplaten er 0,5 mm.
- Beregn konsentrasjonen av stamløsningen ved å bruke følgende formel:
Konsentrasjon (mM) = A494 × fortynningsfaktor / 0,05 (cm) / 77 000 (cm−1· M−1) × 1000 (mM·M−1) - Juster til en riktig fortynning slik at den målte A494-verdien er mellom 0,1 og 1,0.
MERK: Målingene bør gjentas flere ganger for å sikre at den målte konsentrasjonen er nøyaktig. Utryddelseskoeffisienten på 77 000 cm−1· M-1 oppstår fra FITC-gruppen .
4. Stabilitet av peptider i føtalt bovint serum (FBS)
- Inkuber peptidet i en konsentrasjon på 100 μM med 250 μL på 25 % FBS/H2O (v/v) ved 37 °C. Etter inkubering i 0 timer, 1 time, 2 timer og 4 timer, ta 10 μL alikoter og tilsett deretter 150 μl 12% trikloreddiksyre oppløst iH2O / ACN (1/3, v / v) for å utfelle serumproteinene.
- Sentrifuger prøvene ved 10 000 × g i 5 minutter og analyser supernatanten ved hjelp av HPLC (som beskrevet i trinn 2.8) for å bestemme omfanget av peptidnedbrytning.
- Beregn forholdet mellom toppområdet ved 1 time, 2 timer og 4 timer til det ved 0 timer for å oppnå fraksjonen av uforringet peptid på tilsvarende tidspunkt. Resultatet er gjennomsnittet av tre parallelle prøver.
5. Cellulært opptak av peptidene
- Fluorescens mikroskopisk avbildning
- Plasser et rundt deksel i en 12-brønns plate. Deretter inokulerer 1 x 105 celler jevnt på dekksedler og kultur over natten med 2 ml medium. Fjern mediet og vask cellene 3x med 1 ml PBS.
MERK: I denne studien ble HeLa-celler og 4T1-celler dyrket i Dulbeccos modifiserte ørnemedium (DMEM, se materialtabell) supplert med 10% FBS i en 37 ° C fuktet inkubator inneholdende 5% CO2. - Inkuber cellene med 1 ml 3 μM FITC-merkede peptider i FBS-fri DMEM i 1 time ved 37 °C. Fjern deretter det peptidholdige mediet og vask cellene 3x med 1 ml PBS.
- Farg cellene med 1 ml Hoechst 33258 i 15 minutter. Observer internaliseringen av hvert peptid ved hjelp av et fluorescensmikroskop (se materialtabell) med samme fluorescensintensitet og eksponeringstid.
MERK: Følgende innstillinger ble brukt til fluorescensmikroskopi. Mål: Plan-Apochromat: 63 x / 1.40 Olje DIC M27; Kanal 1 for FITC: eksitasjonsfilter: 450-490 nm, utslippsfilter: 500-550 nm, eksponeringstid: 230 ms; Kanal 2 for Hoechst 33258: eksitasjonsfilter: 335-383 nm, utslippsfilter: 420-470 nm, eksponeringstid: 27 ms.
- Plasser et rundt deksel i en 12-brønns plate. Deretter inokulerer 1 x 105 celler jevnt på dekksedler og kultur over natten med 2 ml medium. Fjern mediet og vask cellene 3x med 1 ml PBS.
- Analyse av flowcytometri
- Inokuler 5 x 105 HeLa-celler jevnt i 12-brønnsplater og kultur i DMEM i 24 timer ved 37 °C. Fjern deretter mediet og vask cellene 3x med 1 ml PBS.
- Inkuber cellene med 1 ml 3 μM FITC-merkede peptider i FBS-fri DMEM i 1 time ved 37 °C. Fjern det peptidholdige mediet, dissosiere cellene med 0,25% (w / v) trypsin og 0,53 mM EDTA i PBS i 5 minutter, og samle deretter cellene ved sentrifugering ved 306 × g i 4 minutter. Vask cellepelleten med PBS.
- Inkuber cellene med 1 ml 0,05 % (w/v) trypanblått i PBS i 3 minutter for å slukke overflatebundet fluorescens, og utfør kvantitativ analyse av intracellulær fluorescens ved hjelp av et flowcytometer (se materialfortegnelse).
MERK: Flowcytometriinnstillinger: eksitasjon: 488 nm, utslipp: 530 nm. Trypanblå kan også slukke fluorescensen i døde celler og bidra til å skille levende/døde celler under analyse av peptidopptak. - Behandle og analysere 4T1-celler ved hjelp av flowcytometri etter samme protokoll som beskrevet for HeLa-celler. Samle 5 x 105 celler per prøve og sett opp tre parallelle prøver per gruppe.
6. Utforskning av celle-til-celle-penetrasjonen av peptidene ved hjelp av transbrønnmodeller
- Inokuler 1 x 10 5 HeLa-celler i 2 ml DMEM i et 12-brønns kammer med en vevskulturplateinnsats (se materialfortegnelse) og inkuber i 24 timer i en 37 °C fuktet inkubator inneholdende5% CO2. Fjern deretter mediet og inkuber cellene i kamrene med 1 ml 10 μM FITC-R8 eller FITC-sR8-4 (renset ved bruk av HPLC) i FBS-fri DMEM i 1 time.
- Fjern mediet som inneholder peptidene og vask cellene 3x med 1 ml PBS. Tilsett 1 ml fersk FBS-fri DMEM til kamrene og deretter co-inkubere HeLa-cellene i kammeret med vevskulturplatinnsatsen med HeLa-cellene på de runde dekslene nederst i 2 timer.
- Fest HeLa-cellene på de runde dekslene med 2,5% glutaraldehyd i 15 minutter og flekk deretter cellene med DAPI i 15 minutter. Deretter observerer du HeLa-cellene på dekslene under et fluorescensmikroskop. Behandle og analyser 4T1-celler ved å bruke samme protokoll som den som brukes til HeLa-celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I denne protokollen ble en syntetisk prosedyre for å begrense den lineære polyarginin R8 i sin sykliske form presentert. SPPS ble utført manuelt med et enkelt apparatur (figur 1). Den detaljerte syntetiske prosessen med SPPS er vist i figur 2. Kort tid var harpiksen tilstrekkelig svulmet, etterfulgt av debeskyttelse av N α-Fmoc beskyttelsesgruppen. Deretter ble den N α-Fmoc-beskyttede aminosyren forankret på harpiksen til fullføringen av peptidsamlingen (trinn 1-4 i figur 2). Deretter ble de rå peptidene spaltet fra harpiksen av spaltningscocktailen (trinn 5 i figur 2). FITC ble brukt til å merke peptidene for å syntetisere fluorescerende merkede sykliske CPP og spore deres permeabilitet over biologiske barrierer. Deretter ble de tritylbeskyttende gruppene av cysteiner selektivt debeskyttet på harpiksen, etterfulgt av peptidsyklisering med 4,4'-bis(brometyl)bifenyl-tverrbinding (figur 3A). HPLC- og MS-spektrene til FITC-R8 og FITC-sR8-4 er vist i figur 3B. Retensjonstiden for FITC-sR8-4 var vesentlig lengre enn for den lineære analogen, noe som indikerer økt total hydrofobisitet av peptidet etter syklisering med den hydrofobe tverrbindingen. Videre, som vist i figur 3C, forblir den sykliske R8 77,3% intakt etter inkubasjon med 25% FBS i 4 timer, mens dens lineære motstykke for det meste ble degradert, noe som tyder på forbedret proteolytisk stabilitet av det sykliske R8-peptidet. I de påfølgende cellebaserte studiene viste celler behandlet med syklisk R8 med aromatisk tverrbinding høyere intracellulær fluorescens enn de som ble behandlet med dets lineære motstykke, som demonstrert ved levende cellefluorescensmikroskopiavbildning (figur 4A). Tilsvarende resultater ble oppnådd med flowcytometrianalyse (figur 4B). For ytterligere å undersøke om syklisk R8 gir forbedret celle-til-celle-penetrasjon, ble transbrønnmodeller brukt til å simulere barrierepermeabiliteten til peptidene fra ett cellelag til et annet. Det sykliske R8 viste tydelig høyere transbarrierepenetrasjon enn det lineære R8-peptidet, som indikert ved en signifikant økning i den intracellulære fluorescensen (figur 4C). For å oppsummere viste det sykliske R8-peptidet overlegen permeabilitet over biologiske barrierer over sin lineære motpart.
Figur 1: Utstyrsoppsett for det manuelle peptidsynteseapparatet. En 10 ml polypropylenkolonne settes opp på vakuummanifolden ved hjelp av en treveis stoppventil. N2 brukes til agitasjon. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Generell prosedyre for Fmoc fastfase peptidsyntese (SPPS). En N α-Fmoc-beskyttet aminosyre er forankret til 4-(2',4'-Dimethoxypheyl-Fmoc-aminomethyl)-fenoxyacetamido-norleucyl-MBHA harpiks (rink amide MBHA harpiks) (trinn 1), etterfulgt av debeskyttelse av Nα-Fmoc beskyttende grupper av aminosyrene (trinn 2) og påfølgende aminosyrekobling (trinn 3). Trinn 2 og trinn 3 gjentas flere ganger for å syntetisere ønsket peptid (trinn 4). Etter ferdigstillelse av syntese tilsettes en spaltningscocktail for å fjerne sidekjedens beskyttende grupper og spalte det ønskede peptidet fra harpiksen (trinn 5). Forkortelser: DMF = N, N-dimetylformamid; DCM = diklormetan; HATU = 2-(7-Azobenzotriazol)-N, N, N', N'-tetrametyluroniumheksafluorofosfat; DIPEA = N, N-diisopropyletylamin; TFA = trifluoreddiksyre. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Syntese av FITC-merket lineært R8-peptid (FITC-R8) og FITC-merket stiftet R8-peptid (FITC-sR8-4) ved bruk av fastfase peptidsyntese (SPPS). (A) Skjematisk diagram over syntesen av FITC-R8 og FITC-sR8-4. (B) HPLC- og MS-spektra (innfelt) av FITC-R8 og FITC-sR8-4. (C) Stabilitet av FITC-R8 og FITC-sR8-4 i nærvær av 25% FBS. Intakt peptid (%) refererer til fraksjonen av unedbrutt peptid. Denne figuren er modifisert fra Shi et al.15. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Penetrasjon av FITC-merket lineært R8-peptid (FITC-R8) og FITC-merket stiftet R8-peptid (FITC-sR8-4). (A) Levende cellefluorescensmikroskopibilder av HeLa-celler og 4T1-celler etter 1 time inkubasjon med 3 μM FITC-R8 og FITC-sR8-4. FITC (grønn), Hoechst (blå). Skala bar = 20 μm. (B) Relativ gjennomsnittlig fluorescens (med hensyn til det lineære R8-peptidet), gjennomsnittlig ± s.d. og n = 3; (C) Celle-til-celle-penetrasjon av FITC-R8 og FITC-sR8-4 i en transwell-modell ved bruk av HeLa-celler. Levende cellefluorescensmikroskopibilder (skala bar = 20 μm), og relativ gjennomsnittlig fluorescens (med hensyn til det lineære R8-peptidet), gjennomsnittlig ± s.d. og n = 3. ** P < 0,01, *** P < 0,001. Denne figuren er modifisert fra Shi et al.15. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den kjemiske stabiliseringen av peptider ved å inkorporere konformasjonsbegrensninger har vist seg å være en effektiv strategi for å forbedre stabiliteten og cellepermeabiliteten til peptidet26. I denne protokollen er en trinnvis prosedyre beskrevet for syntese av sykliske CPP med aromatiske tverrbindinger og evaluering av deres permeabilitet over biologiske barrierer. Sammenlignet med de hydrofile laktam- eller triazol-tverrbindingene22,27, forbedrer inkorporeringen av aromatiske tverrbindinger (brukt i denne studien) den totale hydrofobisiteten til CPP-ene, og øker dermed cellepermeabiliteten betydelig. På den annen side kan peptidsyklisering lett oppnås gjennom substitusjonsreaksjoner med cysteiner uten å kreve metallkatalysatorer. I denne protokollen ble sykliseringen av CPP-ene utført på harpiks; Sykliseringseffektiviteten avhenger imidlertid også av de spesifikke sekvensene og lengdene av peptidene på grunn av steriske effekter, noe som kan resultere i dannelsen av et dimert biprodukt28. I et slikt tilfelle vil det være nyttig å bruke en harpiks med lavere lastekapasitet. I tillegg anbefales det også å syklisere disse spesifikke peptidene under fortynnede konsentrasjoner i løsningsfase29.
Det er noen kritiske punkter i denne protokollen. Først brukes spaltningscocktailen TFA / TIS / EDT / H 2 O (92,5/ 2,5 / 2,5 / 2,5, v / v / v / v) for spaltning av cysteinholdige peptider for å forhindre oksidasjon av sulfhydrylgruppen. For det andre foreslås det å utføre en småskala forstudie for å oppnå riktig spaltningsbetingelse. Den optimale tiden som kreves for å spalte peptidene fra harpiksen er 2-3 timer, med en lengre spaltningstid (mer enn 5 timer) som har en tendens til å produsere flere uidentifiserte biprodukter. Peptidsyntesen kan overvåkes av LC-MS for å optimalisere spaltningstiden. For det tredje bør FITC-merking gjøres i mørket for å unngå fluorescensslukking.
Videre bør trypanblått brukes til å slukke overflatebundet fluorescens, da flowcytometrianalyse ikke kan skille intracellulær eller overflatebundet fluorescens. Dette vil bidra til å spesifikt kvantifisere peptidet internalisert av kreftcellene27. I tillegg, da kationiske peptider også kan forårsake ikke-spesifikk membranlyse30, kan hemolytisk aktivitet og celle levedyktighet også utføres for å evaluere toksisiteten til de sykliske CPP-ene.
Sykliske CPP-er utgjør et av de effektive legemiddelleveringskjøretøyene for å erobre biologiske barrierer. Imidlertid fører membraninteraksjonen og forstyrrelsen av kationiske CPP generelt til potensiell uspesifikk cytotoksisitet31. Videre innsats vil bli viet til å forstå den detaljerte penetrasjonsmekanismen, som skal hjelpe oppdagelsen av neste generasjon sykliske CPP for å trenge gjennom biologiske barrierer med minimal cytotoksisitet. Disse svært aktive og stabile CPP-ene holder stort løfte om å forbedre behandlingen av viktige livstruende sykdommer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet støttes av Natural Science Foundation of China (21708031), China Postdoctoral Science Foundation (BX20180264, 2018M643519) og Fundamental Research Funds for the Central Universities (2682021ZTPY075).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,2-ethanedithiol | Aladdin | K1722093 | stench |
| 2-(7-Azobenzotriazole)-N,N,N',N'-tetramethyluronium hexafluorophosphate (HATU) | HEOWNS | A-0443697 | |
| 4,4'-bis(bromomethyl)biphenyl | TCI | B1921 | |
| 4T1 cells | ATCC | 4T1 cells were cultured in DMEM medium supplemented with 10% FBS (Hyclone) in a 37 °C humidified incubator containing 5% CO2. | |
| Acetonitrile | Adamas | 1484971 | toxicity |
| Dichloromethane | Energy | W330229 | skin harmful |
| Diethyl ether | Aldrich | 673811 | flammable |
| Dimethyl sulfoxide | Beyotime | ST038 | skin harmful |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | ||
| Electrospray Ionization Mass Spectrometer | Waters | G2-S Tof | |
| Ethylene Diamine Tetraacetic Acid (EDTA) | BioFroxx | 1340 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | HyClone | ||
| Flow cytometer | Beckman Coulter | CytoFLEX | |
| Fluorescein isothiocyanate isomer (FITC) | Energy | E0801812500 | |
| Fluorescent microscope | Carl Zeiss | Axio Observer 7 | |
| Fmoc-Arg(Pbf)-OH | HEOWNS | F-81070 | |
| Fmoc-Cys(Trt)-OH | GL Biochem | GLS201115-35202 | |
| Fmoc-βAla-OH | Adamas | 51341C | |
| HeLa cells | ATCC | HeLa cells were cultured in DMEM supplemented with 10% FBS (Hyclone) in a 37 °C humidified incubator containing 5% CO2. | |
| High-Performance Liquid Chromatography | Agilent | Agilent 1260 | |
| High-Performance Liquid Chromatography column | Agilent | Poroshell EC-C18 120, 4.6 × 150 mm (pore size 120 Å, particle size 4 μm) | |
| Lyophilizer | SP Scientific | Vir Tis | |
| Methanol | Aldrich | 9758 | toxicity |
| Microtiter plate | Thermo μdrop plate | N12391 | |
| Morpholine | HEOWNS | M99040 | irritant |
| Multi-technology microplate reader | Thermo | VARIOSKAN LUX | |
| N,N-Diisopropylethylamine | HEOWNS | E-81416 | irritant |
| N,N-Dimethyl formamide | Energy | B020051 | harmful to skin |
| Poly-Prep column | Bio-Rad | 7321010 | polypropylene chromatography columns |
| Rink Amide MBHA resin (0.572 mmol/g) | GL Biochem | GLS180301-49101 | |
| Three-way stopcocks | Bio-Rad | 7328107 | |
| Tissue culture plate insert | LABSELECT | 14211 | |
| Trifluoroacetic acid | HEOWNS | T63278 | corrosive |
| Triisopropylsilane | HEOWNS | T-0284475 | |
| Trypsin | BioFroxx | 1004 | |
| Vacuum manifold | Promega | A7231 |
References
- Zhang, L., et al. Brain-targeted dual site-selective functionalized poly(β-amino esters) delivery platform for nerve regeneration. Nano Letters. 21 (7), 3007-3015 (2021).
- Park, T. E., et al. Enhanced BBB permeability of osmotically active poly(mannitol-co-PEI) modified with rabies virus glycoprotein via selective stimulation of caveolar endocytosis for RNAi therapeutics in Alzheimer's disease. Biomaterials. 38, 61-71 (2015).
- Bian, J., et al. Effect of cell-based intercellular delivery of transcription factor GATA4 on ischemic cardiomyopathy. Circulation Research. 100 (11), 1626-1633 (2007).
- He, H., et al. The use of low molecular weight protamine chemical chimera to enhance monomeric insulin intestinal absorption. Biomaterials. 34 (31), 7733-7743 (2013).
- Kim, D., et al. A specific STAT3-binding peptide exerts antiproliferative effects and antitumor activity by inhibiting STAT3 phosphorylation and signaling. Cancer Research. 74 (8), 2144-2151 (2014).
- Yang, Y., et al. PEGylated liposomes with NGR ligand and heat-activable cell-penetrating peptide-doxorubicin conjugate for tumor-specific therapy. Biomaterials. 35 (14), 4368-4381 (2014).
- Wei, Y., et al. Intracellular paclitaxel delivery facilitated by a dual-functional CPP with a hydrophobic hairpin tail. ACS Applied Materials and Interfaces. 13 (4), 4853-4860 (2021).
- Vasan, N., Baselga, J., Hyman, D. M. A view on drug resistance in cancer. Nature. 575 (7782), 299-309 (2019).
- Cong, Y., et al. Microenvironment-induced in situ self-assembly of polymer-peptide conjugates that attack solid tumors deeply. Angewandte Chemie International Edition. 131 (14), 4680-4685 (2019).
- Blanco, E., Shen, H., Ferrari, M. Principles of nanoparticle design for overcoming biological barriers to drug delivery. Nature Biotechnology. 33 (9), 941-951 (2015).
- Tian, Y., Zhou, S. Advances in cell-penetrating peptides and their functionalization of polymeric nanoplatforms for drug delivery. Wiley Interdisciplinary Reviews. Nanomedicine and Nanobiotechnology. 13 (2), 1-12 (2021).
- Milletti, F. Cell-penetrating peptides: Classes, origin, and current landscape. Drug Discovery Today. 17 (15-16), 850-860 (2012).
- Turner, J. J., et al. Cell-penetrating peptide conjugates of peptide nucleic acids (PNA) as inhibitors of HIV-1 Tat-dependent trans-activation in cells. Nucleic Acids Research. 33 (21), 6837-6849 (2005).
- Tunnemann, G., et al. Live-cell analysis of cell penetration ability and toxicity of oligo-arginines. Journal of Peptide Science. 14 (4), 469-476 (2008).
- Shi, M., et al. Stapling of short cell-penetrating peptides for enhanced tumor cell-and-tissue dual-penetration. Chemical Communications. 58 (14), 2299-2302 (2022).
- Komin, A., et al. A peptide for transcellular cargo delivery: Structure-function relationship and mechanism of action. Journal of Controlled Release. 324, 633-643 (2020).
- Dietrich, L., et al. Cell permeable stapled peptide inhibitor of Wnt signaling that targets β-catenin protein-protein interactions. Cell Chemical Biology. 24 (8), 958-968 (2017).
- Tian, Y., et al. Stapling of unprotected helical peptides via photo-induced intramolecular thiol-yne hydrothiolation. Chemical Science. 7 (5), 3325-3330 (2016).
- De Araujo, A. D., et al. Comparative α-helicity of cyclic pentapeptides in water. Angewandte Chemie International Edition. 53 (27), 6965-6969 (2014).
- Chu, Q., et al. Towards understanding cell penetration by stapled peptides. Medicinal Chemistry Communications. 6 (1), 111-119 (2015).
- Bock, J. E., Gavenonis, J., Kritzer, J. A. Getting in shape: Controlling peptide bioactivity and bioavailability using conformational constraints. ACS Chemical Biology. 8 (3), 488-499 (2013).
- Tian, Y., et al. Effect of stapling architecture on physiochemical properties and cell permeability of stapled α-helical peptides: A comparative study. ChemBioChem. 18 (21), 2087-2093 (2017).
- White, C. J., Yudin, A. K. Contemporary strategies for peptide macrocyclization. Nature Chemistry. 3 (7), 509-524 (2011).
- Jain, R. K. Normalization of tumor vasculature: An emerging concept in antiangiogenic therapy. Science. 307 (5706), 58-62 (2005).
- Patgiri, A., Menzenski, M. Z., Mahon, A. B., Arora, P. S. Solid-phase synthesis of short α-helices stabilized by the hydrogen bond surrogate approach. Nature Protocols. 5 (11), 1857-1865 (2010).
- Baek, S., et al. Structure of the stapled p53 peptide bound to Mdm2. Journal of the American Chemical Society. 134 (1), 103-106 (2012).
- Traboulsi, H., et al. Macrocyclic cell penetrating peptides: A study of structure-penetration properties. Bioconjugate Chemistry. 26 (3), 405-411 (2015).
- Tian, Y., et al. A proline-derived transannular N-cap for nucleation of short α-helical peptides. Chemical Communications. 52 (59), 9275-9278 (2016).
- Muppidi, A., et al. Rational design of proteolytically stable, cell-permeable peptide-based selective Mcl-1 inhibitors. Journal of the American Chemical Society. 134 (36), 14734-14737 (2012).
- Wiradharma, N., et al. Synthetic cationic amphiphilic α-helical peptides as antimicrobial agents. Biomaterials. 32 (8), 2204-2212 (2011).
- Jones, A. T., Sayers, E. J. Cell entry of cell penetrating peptides: Tales of tails wagging dogs. Journal of Controlled Release. 161 (2), 582-591 (2012).
